KR920012454A - 7-아미노세팔로스포란 산 및 이의 유도체를 제조하는 효소적방법 - Google Patents

7-아미노세팔로스포란 산 및 이의 유도체를 제조하는 효소적방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음

Description

7-아미노세팔로스포란 산 및 이의 유도체를 제조하는 효소적 방법
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 본 발명의 고정화된 DAO효소의 안정성 실험 결과이다. 제2도는 포스페이트 완충액중에서의 DAO의 안정성 실험 결과이다. 제3도는 고정화된 DAO의 시간에 따른 활성을 나타내는 그래프이다.

Claims (12)

1a) 로도토룰라 그라실리스(Rhodotorula gracilis) ATCC 26217 세포 페이스트를 용해시켜, 수성 분산액으로부터 D-아미노산 옥시다제(DAO)를 분리하여 크로마토르래피에 의해 정제하고, 수성 매질에 불용성이고, 가능하게는 적합한 이작용성 제제에 의해 효소 단백질과 가교결합을 형성하기에 적합한 작용기를 함유하는 불활성 교체 지지체상에 정제된 효소를 고정화시키며, 1b) 1a)에서 수득된 고정화된 효소를 세팔로스포린 C 또는 이의 유도체(Ⅰ)의 20내지 60g/ℓ농도의 수용액과 접촉시켜 pH 7내지 8 및 20 내지 30℃의 온도에서 산소 또는 대기중에서 상기 화합물을 산화적으로 탈아민화시키고, 1c) 수성반응 혼합물로 부터 지지된 효소를 분리하고, 케토아디필세팔로스포란산이 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산으로 전환되는데 필요한 화학양론적 양과 동량 또는 과량의 과산화수소를 상기 혼합물에 가하며, 1d) 피루브산 또는 이의 염 또는 알칼리성 설파이트와 같은 적합한 환원제를 용액에 가함으로써 과량의 과산화수소를 제거하고, 1e) 21 내지 28℃의 온도에서 호기적 조건하에 발효시키고, 세포체를 용해시키며, DEAE 수지상에서 크로마토그래피로 정제하여, 수성 매질에 불용성이고, 가능하게는 적합한 이작용성 제제에 의해 효소 단백질과 가교결합을 형성하기에 적합한 작용기를 함하는 불활성 고체 지지체상에 정제된 효소를고정화시키는 단계로,G1-7-ACA 아실라제의 생산자인 아시비토박티(Acinetobacter)중의 어떠한 미생물로부터 분리한 G1-7-ACA 아실라제 유전자를 클론시킨 β-락타마제 비생성 에스케리챠 클라이 컬렉션 균주로부터 수득한 유전자 조작된 미생물 배양물로부터 효소 G1-7-ACA 이실라제를 생성시키며, 1f) 1e)에서 수득한 고정화된 효소를 를루타릴-7-아미노세팔로스포란산 또는 이의 유도체(Ⅱ)의 10 내지 30g/ℓ 수용액과 접촉시켜 pH7 내지 9 및 20 내지 30℃의 온도에서 상기 화합물을 탈아실화시키는 단계로 이루어짐을 특징으로 하여, 세팔로스포란계 화합물(Ⅰ)에 대해 활성형태이고 방해 효소(interfering enzymes)를 거의 함유하지 않는, 로드토룰라그라실리스 ATCC 26217 배양물로부터 수득한 효소 D-아미노산 옥시다제(DAO)를 통해 세팔로스포린 화합물(Ⅰ)을 글루타릴유도체(Ⅱ)로 전환기키고, 유전자 조작된 β-락타마제 비생성 미생물로부터 생성된 효소 글루타릴-7-ACA 아실라제를 통해 글루타릴 유도체(Ⅱ)를 7-아미노세팔로스포란산(Ⅲ)으로 연속적으로 변형 (transformation)시켜 세팔로스포린 C 또는 이의 유도체로부터 7-아미노세팔로스포란산 또는 이의 유도체를 제조하는 효소적 방법.
상기식에서, R은 -OCOCH3, -H, -OH 또는 -OCONH2이다.
제1항에 있어서, G1-7-ACA 아실라제의 생산자인 아시네토박터 중의 어떠한 미생물로부터의 상기 효소의 유전자가 클론되는, β-락타마제 비생성 에스케리챠 콜라이 P-3 균주(등록번호 NCIMB 40432)로부터의 미생물 에스케리챠 콜라이 P-3(pJC 200)(등록번호 NCIMB 40433)을 사용하여 효소 G1-7-ACA 아실라제의 제조 (단계 1e)를 수행하는 방법.
제2항에 있어서, 단계 1e)에서 사용된 G1-7-ACA 아실라제의 유전자가 아시네토박터종(등록번호 ATCC 53891)으로부터 분리되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1e)가, G1-7-ACA 아실라제의 생산자의 아시네토박터종의 어떠한 미생물로부터의 상기 효소에 대한 유전자가 클론된 β-락타마제 비생성 이.콜라이의 ATCC 9637의 자손인 이,클라이ATCC9637(pJC 200)의 사용을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 아시네토박터 종의 미생물이 ATCC 53891인 방법.
제1항에 있어서, 단계 1a) 및 1e)가 DEAE 수지상에서 크로마토그래피에 의해 효소 DAO및 G1-7-ACA 아실라제를 정제시킴을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, 효소 DAO 및 G1-7-ACA 아실라제의 고정화에 관련된 단계 1a) 및 1e) 가 a) 아민 타입의, 거대망상 이온교환수지(예: Duolite A 365, Duolite A 7, Duolite A 568, Amberlite IRA 900), b) Eupergit C 타입의, 에폭사이드 결합 작용기가 있는 폴리아크릴 수지, c) UOP IPS-200 타입의, 폴리아민 글루타르알데하이드로 함침된 무기 매트릭스를 지난 수지 유형의 지지체상에서 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1a) 및 1e)가 효소 고정화를 위한 가교결합제로서 글루타르알데하이드를 사용함을 특징으로 하는 하는 방법.
제1항내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 단계 1b) 가 고정화된 효소를 기질 수용액 중 분산액으로 유지시켜 수행되는 방법.
제1항내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 단계 1b) 가 컬럼 중에 배열된 고정화된 효소상에 기질 수용액을 통과시킴으로써 수행되는 방법.
제1항내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 단계 1f) 가 고정화된 효소를 기질 수용액 중 분산액으로 유지시켜 수행되는 방법.
제1항내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 단계 1f) 가 컬럼 중에 배열된 고정화된 효소상에 기질 수용액을 통과시킴으로써 수행되는 방법.
※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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