JP2004538265A - α−ケト酸誘導体を使用して３−セファロスポラン酸誘導体を製造する方法 - Google Patents

Abstract

セファロスポラン酸誘導体を製造する方法であって、
式ＩＩＩの３−チオール化セファロスポリンＣ化合物
【表４５】

を、式IVの３−チオール化−α−ケトアジピル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体
【表４６】

に、酵素によって、転換するステップから成り、
ここで、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を有する複素環基である、
ことを特徴とする方法。
式ＩＶの化合物が、セファロスポリンＣ抗生物質およびその誘導体の製造に使用される。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−ラクタム抗生物質の製造に使用される３−セファロスポリンＣ誘導体を製造する方法に関する。より詳しくは、本発明は、α−ケト酸中間体を使用して、３−アセトキシメチル−７−アミノ−セフ−３−エム−カルボン酸の３−チオール化誘導体（３−チオール化−７−ＡＣＡ）を製造する、酵素による方法に関する。α−ケト酸またはα−オキソ酸は重要な生物薬剤学化合物である。
【背景技術】
【０００２】
必須アミノ酸のオキソ酸は、機能性食品として（Ｐｓｚｃｏｌａ，ＤＥ，Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２，３０，１９９８）、また窒素蓄積疾患の治療のための治療剤として（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．Ｓｕｐｐｌ．２７，Ｓ１３６，１９８９；Ｂｕｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４４，１２８８，１９９４）、重要性を高めつつある。もう一つの重要な用途は、セファロスポリンＣ（３−アセトキシメチル−７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド）セフ−３−エム−４−カルボン酸）からの、７−アミノセファロスポラン酸の製造（Ｓａｖｉｄｇｅ，ＴＡ；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ｐ１７１，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４）である。この転換は、ＤＥ ３４４７０２３号明細書（Ｈｏｅｃｈｓｔ）に記載されているように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｓ ＡＴＣＣ ９９４５からのＤ−アミノ酸トランスアミナーゼによって実施することができ、該酵素は、セファロスポリンＣをα−ケト酸によってα−ケトアジピル−７−ＡＣＡと、対応するＤ−α−アミノ酸とに転換する。この転換は、アミノ基転移反応であり、過酸化水素の放出なしで、セファロスポリンＣのアミノ基が非酸化的にケト基に転換される。しかし、ＥＰ ０３１５７８６号明細書に述べられているように、前記酵素の活性は低い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
３−チオール化−７−ＡＣＡセファロスポラン酸誘導体を製造する化学的な方法は、公知である（ＵＳ ３，３６７，９３３号、ＢＥ ７１８，８２４号）が、いくつかの欠点があり、たとえば低温反応条件、高価で毒性の溶剤または試薬の使用、および工業的規模での工程実施を困難にする中間体の化学的不安定性、などの欠点がある。
【０００４】
７−ＡＣＡにいたる化学的方法の欠点を克服するために、代替法として、セファロスポリンＣの酵素による開裂が提案されている。セファロスポリンＣの７´−アミノアジピン側鎖の直接的一ステップ除去が、特異性のセファロスポリンアシラーゼの使用によって可能である（ＦＲ ２，２４１，５５７号、ＵＳ ４，７７４，１７９号、ＥＰ ２８３，２４８号、ＷＯ ９５１２６８０号、ＷＯ ９６１６１７４号）。しかし、これらの方法は、ＵＳ ５，２９６，３５８号明細書に述べられているように、再現性がないことが多く、また低収率と長い反応時間という特性を有する。この方法（セファスポリンＣの７−ＡＣＡへの一ステップでの転換）の工業的応用はいまのところまだ報告されていない（Ｐａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，１，１９９８）。
【０００５】
他方、セファロスポリンＣを二つの酵素ステップによって７−ＡＣＡに転換する方法は、工業的な見地から重要である。第一段階は、いろいろな供給源（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、ＧＢ １，２７２，７６９号；Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ、ＥＰ ０，５１７，２００号；またはＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｒｉ Ｍ−０７１８，ＥＰ ０，３６４，２７５号）からのＤ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｅ．Ｃ． １．４．３．３、以下ＤＡＡＯと略記する）を使用することから成る。ＤＡＡＯは、分子酸素の存在下で、セファロスポリンＣのＤ−５−アミド−カルボキシペンタノイル側鎖を酸化して、７β−（５−カルボキシ−５−オキソペンタ−アミド）−セフ−３−エム−カルボン酸（または、α−ケトアジピル−７−アミノセファロスポラン酸、以下ではα−ケトアジピル−７−ＡＣＡと略記する）と過酸化水素とを生成する。この過酸化水素は、α−ケトアジピル−７−ＡＣＡから化学的にカルボキシル基を除去して７β−（４−カルボキシブタンアミド）−セフ−３−エム−４−カルボン酸（または、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸、以下では「ＧＬ−７−ＡＣＡ」と略記する）にする。
【０００６】
第二段階においては、ＧＬ−７−ＡＣＡに対して特異性のあるアシラーゼすなわちグルタリル−７−アシラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．３）が使用される。このアシラーゼは、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて過剰に発現したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓタイプの微生物のアシラーゼ（ＵＳ ３，９６０，６６２号、ＥＰ ０４９６９９３号）であり、ＧＬ−７−ＡＣＡからアシル基を除去して、７−アミノ−セフ−３−エム−４−カルボン酸（または７−アミノセファロスポラン酸、以下では「７−ＡＣＡ」と略記する）にする。
【０００７】
この二ステップの、７−ＡＣＡを得るための酵素による方法は、すでに工業的規模で使用されている（Ｃｏｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４６，５１０，１９９５）。
【０００８】
酵素による方法におけるもう一つの進展がＥＰ ０８４６６９５に記載されており、この方法においては、固体グルタリル−７−ＡＣＡが、一つのイオウまたは酸素原子を有するかまたは有しない、少なくとも一つの窒素を有する複素環基と、反応させられて、３−修飾グルタリル−７−ＡＣＡが生成される。これらの３−誘導体は、対応する３−複素環チオメチル−７−ＡＣＡ誘導体に、酵素転換される。
【０００９】
この手順は酵素−化学−酵素（ＥＣＥ）法と名づけることができる。というのは、分離されたＧＬ−７−ＡＣＡが可溶化セファロスポリンＣのバイオ転換によって得られ、次にＧＬ−７−ＡＣＡが複素環チオールと反応し、最後に３−複素環チオ誘導体がＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼによって酵素処理されるからである。ＷＯ ９５３５０２０号明細書に記載されているように、この方法の問題点は、ＧＬ−７−ＡＣＡの分離が必要であるということであり、ＧＬ−７−ＡＣＡは水溶性が大きいため、この方法には技術的な困難が伴い、また費用がかかる。
【００１０】
もう一つの問題は、残留複素環チオールによる生体触媒の“失活（ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ）”のため、酵素がわずか２、３回しか再使用できないということである。この失活効果は、使用されたチオールの一つ、５−メチル−１，３，４−チアジアゾール−２−チオール（ＭＭＴＤ）に関して詳しく報告されている（Ｗｏｎ ｅｔ ａｌ，Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６９，１，１９９８）。
【００１１】
無細胞抽出液からのＤ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｄ−ＡＡＯ）を用いるか（ＧＢ １，２７２，７６９号、Ｇｌａｘｏ）、またはイーストＴｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓもしくはＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ（ＥＰ ０５１７２００号）のトルエン活性化（透過性にした（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓｅｄ））細胞（ＧＢ １，３８５，６８５号）内のＤ−アミノ酸オキシダーゼを用いるかして、有気性の条件下で、セファロスポリンＣのＤ−アジパミド側鎖を酸化脱アミノすることによりα−ケトアジピル−７−ＡＣＡを得ることが、報告されている。この反応においては、分子酸素が電子アクセプターとして作用して、過酸化水素に転換され、この過酸化水素は、α−ケトアジピル−７−ＡＣＡと化学反応し、そのカルボキシル基を除去してグルタリル−７−ＡＣＡを生じる。前記イーストの場合に生成される大量のカタラーゼが存在する場合、過酸化水素は、分解して、水と分子酸素になり、α−ケトアジピル−７−ＡＣＡとグルタリル−７−ＡＣＡとの混合物が生じる。α−ケトアジピル−７−ＡＣＡは非常に不安定で（ＧＢ １，３８５，６８５号）、急速に分解して未知の生成物を生じ、したがって、イーストおよび菌株（ｓｔｒａｉｎ）によるが、グルタリル−７−ＡＣＡの収率が９０〜９５％から６０〜７０％に低下する（Ｐａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，１，１９９８；Ｒｉｅｔｈａｒｓｔ，Ｗ．ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｅｒｔ，Ａ，Ｃｈｉｍｉａ ５３，６００，１９９９）。そのため、工業的な応用はまだ報告されていない。
【００１２】
したがって、３−チオール化−７−ＡＣＡセファロスポラン酸誘導体の工業的規模での製造のための効率的な改良された方法が必要である。さらに、重要な生物薬剤学的化合物である安定なα−ケト酸誘導体の単離が有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、
セファロスポラン酸誘導体を製造する方法であって、
式ＩＩＩの３−チオール化セファロスポリンＣ化合物
【化２０】
を、式ＩＶの３−チオール化−α−ケトアジピル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体
【化２１】
に、酵素によって、転換するステップから成り、
ここで、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を有する複素環基である、
ことを特徴とする方法、
が提供される。
【００１４】
好ましくは、式ＩＩＩの化合物は、固定化酵素系によって、式ＩＶの化合物に、酵素転換される。もっとも好ましくは、この酵素系は同時固定化（ｃｏ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよびカタラーゼから成る。
【００１５】
好ましくは、酵素による転換は、分子酸素の存在下で、絶対圧１〜５ｂａｒ、ｐＨ６．５〜８．０、温度１５〜３０℃において、３０〜１８０分の時間にわたって実施される。
【００１６】
好ましくは、この方法は、反応混合物から、酵素系を、好ましくはろ過によって、分離するステップを含む。
【００１７】
本発明の一つの実施態様においては、この方法は、式ＩＶの化合物を精製するステップを含む。
【００１８】
もっとも好ましくは、式ＩＶの化合物は吸着カラムを用いて精製される。好ましくは、酵素は、適当な架橋剤により、適当な固体担体に同時固定化される。酵素は、生体触媒としての使用に適した寸法の結晶の形とすることができる。
【００１９】
好ましくは、酵素プロセスは、酵素を基質水溶液中に分散維持して実施される。好ましくは、酵素プロセスは、カラム中で実施される。もっとも好ましくは、この方法は酵素を再使用のために回収するステップを含む。
【００２０】
本発明の一つの実施態様においては、式ＩＶの化合物は、有用な誘導体を得るための連続プロセスにおいて、精製なしで使用される。
【００２１】
好ましくは、式ＩＩＩおよびＩＶの化合物のＲ基は、少なくとも一つの窒素原子と随意の一つのイオウまたは酸素原子とを有する複素環基である。もっとも好ましくは、Ｒは、チエニル、ジアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、またはこれらの任意の誘導体、好ましくは５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル、１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル、もしくは１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イルから成るグループの一つ以上から選択される複素環基である。
【００２２】
本発明は、本発明の方法によって製造される式ＩＶの３−チオール化−α−ケトアジピル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体を提供する。
【００２３】
本発明は、
式
【化２２】
を有する、すなわち、式ＩＶにおいて、Ｒが１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イルである化合物、
を提供する。
【００２４】
本発明は、
式
【化２３】
を有する、すなわち、式ＩＶにおいて、Ｒが１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イルである化合物を提供する。
【００２５】
本発明は、また、セファロスポリンＣ抗生物質の製造のための方法での中間体としての式ＩＶの化合物の使用あるいは用途（ｕｓｅ）をも提供する。
【００２６】
本発明は、また、セファロスポリンＣ抗生物質の製造のための方法における、式
【化２４】
を有する、すなわち、式ＩＶにおいて、Ｒが５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イルである中間体化合物の使用あるいは用途、
をも提供する。
【００２７】
本発明は、さらに、
本発明のセファロスポラン酸誘導体を製造する方法であって、
式ＩＶの化合物を酵素によって転換させて、式Ｉの化合物
【化２５】
を生成させるステップを含み、
式Ｉにおいて、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基であり、Ｒ₁とＲ₂が両方とも水素原子であるか、またはこれらの一つが水素原子であり、他がアシルドナーである、
ことを特徴とする方法、
を提供する。
【００２８】
好ましくは、式ＩＶの化合物が、グルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼを用いて、酵素転換させられて、式Ｉの化合物が生成され、もっとも好ましくは、酵素による処理は、温度約２０℃、ｐＨ６．５〜８．０で実施される。好ましくは、酵素は、適当な架橋剤によって適当な固体担体に固定化される。
【００２９】
好ましくは、酵素は、生体触媒としての使用に適した寸法の結晶の形である。
【００３０】
本発明の一つの実施態様においては、酵素による処理は、該酵素を基質水溶液中に分散維持して実施される。好ましくは、酵素プロセスはカラム中で実施される。もっとも好ましくは、本発明の方法は、再使用のために酵素を回収するステップを含む。
【００３１】
本発明は、また、セファロスポリンＣ誘導体の製造のための方法における中間体としての式Ｉの化合物の使用をも提供する。
【００３２】
本発明は、さらに、
３−チオール化セファロスポラン酸誘導体を製造する方法であって、
式ＩＩＩの化合物
【化２６】
を、式ＩＶの３−チオール化−α−ケトアジピル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体
【化２７】
に、酵素によって転換させ、
式ＩＶの化合物を酵素によって転換させて、式Ｉの３−チオール化７−ＡＣＡ
化合物
【化２８】
を生成させる、
各ステップから成り、
前記各式において、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基であり、Ｒ₁とＲ₂が両方とも水素原子であるか、またはこれらの一つが水素原子であり、他がアシルドナーである、
ことを特徴とする方法、
を提供する。
【００３３】
本発明の一つの実施態様においては、式ＩＩＩの化合物は、固定化酵素系によって、一つのステップで式Ｉの化合物に酵素転換される。もっとも好ましく
は、酵素系は、固定化グルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼの存在下の同時固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼという組合せから成る。好ましくは、酵素による処理は、温度約２０℃、ｐＨ６．５〜８．０で実施される。もっとも好ましくは、酵素は、適当な架橋剤によって適当な固体担体に同時固定化される。
【００３４】
好ましくは、酵素は、生体触媒としての使用に適した寸法の結晶の形である。
【００３５】
もっとも好ましくは、酵素プロセスは、該酵素を基質水溶液中に分散維持して実施される。
【００３６】
好ましくは、酵素プロセスはカラム中で実施される。もっとも好ましくは、この方法は、再使用のために酵素を回収するステップを含む。
【００３７】
本発明の一つの実施態様においては、式ＩＩＩの化合物は、有用な誘導体を得るための連続プロセスにおいて、精製なしで使用される。
【００３８】
本発明は、また、
セファロスポラン酸誘導体を製造する方法であって、
セファロスポリンＣを、一般式ＩＩのチオール化合物
Ｒ−ＳＨ ＩＩ
と反応させて、式ＩＩＩの３−チオール化セファロスポリン化合物
【化２９】
を生成させ、
式ＩＩＩの化合物の生成後に、過剰な式ＩＩのチオールを除去する、
各ステップから成り、
前記各式において、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を有する複素環基である、
ことを特徴とする方法、
をも提供する。
【００３９】
本発明の一つの実施態様においては、過剰なチオールは陰イオン交換樹脂への吸着によって除去される。好ましくは、陰イオン交換樹脂は架橋アクリルコポリマー構造を有する微孔質樹脂である。もっとも好ましくは、陰イオン交換樹脂は８％の架橋結合を含むチアルキルベンジルアンモニウム官能基から成る。この樹脂は、クロリド、ヒドロキシ、ホスフェート、またはアセテートサイクル（ｃｙｃｌｅ）内にあることができる。
【００４０】
本発明のもう一つの実施態様においては、過剰なチオールは結晶化によって除去される。好ましくは、この結晶化は酸性ｐＨで実施される。
【００４１】
本発明のさらに別の実施態様においては、過剰なチオールは、結晶化とそれに続く陰イオン交換樹脂による吸着とによって除去される。
【００４２】
好ましくは、セファロスポリンＣは水性媒質中にある。もっとも好ましくは、セファロスポリンＣはセファロスポリンＣ濃厚溶液の形である。
【００４３】
好ましくは、反応は、ｐＨ５．５〜８．０、温度６０〜８０℃で、１〜８時間にわたって実施される。もっとも好ましくは、反応は、ｐＨ約６．０、温度約６５℃で実施される。
【００４４】
本発明の一つの実施態様においては、チオール化合物は１〜５ｍｏｌ／（１ｍｏｌのセファロスポリンＣ）の量だけ存在する。
【００４５】
好ましくは、Ｒは少なくとも一つの窒素原子と随意の一つのイオウまたは酸素原子とを含む複素環基である。もっとも好ましくは、Ｒは、チエニル、ジアゾリル、チアゾリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、トリアジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、またはこれらの誘導体、好ましくは５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル、１−メチル−テトラゾル−５−イル、もしくは１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イルの一つ以上から選択される複素環基である。
【００４６】
本発明は、
式ＩＩＩの化合物
【化３０】
であって、
Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基である、
ことを特徴とする化合物、
を提供する。
【００４７】
本発明は、
式
【化３１】
の化合物、すなわち式ＩＩＩにおいて、Ｒが５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イルであることを特徴とする化合物、
を提供する。
【００４８】
さらに、本発明は、
式
【化３２】
の化合物、すなわち式ＩＩＩにおいて、Ｒが１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−チアジン−３−イルであることを特徴とする化合物、
を提供する。
【００４９】
本発明は、また、セファロスポリンＣ誘導体の製造のための方法における中間体としての式ＩＩＩの化合物の使用あるいは用途をも提供する。
【００５０】
本発明の一つの実施態様においては、
セファロスポラン酸誘導体を製造する方法であって、
前述の方法によって得られる、式ＩＩＩの３−チオール化セファロスポリンＣ化合物
【化３３】
を、式ＩＶの３−チオール化−α−ケトアジピル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体
【化３４】
に、酵素によって、転換するステップから成り、
ここで、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を有する複素環基である、
ことを特徴とする方法、
が提供される。
【００５１】
本発明の一つの実施態様においては、
この方法が、さらに、
式ＩＶの３−チオール化α−ケトアジピル７−ＡＣＡ化合物
【化３５】
を酵素によって転換させて、式Ｉの３−チオール化７−ＡＣＡ化合物
【化３６】
を生成させるステップを含み、
前記各式において、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基であり、Ｒ₁とＲ₂が両方とも水素原子であるか、またはこれらの一つが水素原子であり、他がアシルドナーである。
【００５２】
本発明のもう一つの実施態様においては、
セファロスポラン酸誘導体を製造する方法であって、
式ＩＶの化合物
【化３７】
を酵素によって転換させて、式Ｉの化合物
【化３８】
を生成させるステップを含み、
前記各式において、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基であり、Ｒ₁とＲ₂が両方とも水素原子であるか、またはこれらの一つが水素原子であり、他がアシルドナーである、
ことを特徴とする方法、
が提供される。
【００５３】
好ましくは、式ＩＶの化合物をグルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼによって酵素転換させて式Ｉの化合物を生成させる。
【００５４】
もっとも好ましくは、式Ｉ、ＩＩＩ、およびＩＶの化合物は、固体の形である
か、または該化合物の非毒性塩の形である。
【００５５】
本発明は、
セファロスポリンＣ抗生物質およびその誘導体を製造する方法であって、
上で定めた式ＩＩＩ、ＩＶ、およびＩの化合物を生成させ、
そのあと、該化合物を酵素処理する、
ことから成ることを特徴とする方法、
を提供する。
【００５６】
抗生物質は、セファゾリン、セファゼドン、セフォペラゾン、セファマンドール、セファトリアジン、セフォティアム、およびセフトリアクソンのうち一つ以上のものとすることができる。
【００５７】
ここでの発見によれば、同時固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼ系の存在下で、３−チオール化セファロスポリンＣ誘導体を酵素処理して、α−ケト酸誘導体にすることができる。これらのα−ケト酸誘導体は単離したときに安定であるということがわかった。したがって、一ステップまたは二つの連続酵素ステップによる、３−チオール化−７−ＡＣＡ誘導体を得るための新しい改良された方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
本発明は、セファロスポリンＣから式Ｉの化合物を製造する改良された効率的な方法に関する。
【化３９】
この式において、Ｒは少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基であり、Ｒ₁とＲ₂は両方とも水素原子であるか、またはこれらの一つは水素原子であり、他はアシルドナーである。
【００５９】
本発明の方法は、新しい安定なα−ケトアジピル−７−ＡＣＡ誘導体中間体の生成に関する。あるいは、本発明は、中間体の生成なしで一回の単容器反応で実施することもできる。
【００６０】
ここでの意外な発見によれば、セファロスポリンＣの３−チオール化誘導体はカタラーゼの存在下でのＤ−アミノ酸オキシダーゼによる酵素処理反応のための非常に良い基質である。
【００６１】
式ＩＩＩの３−チオール化−セファロスポリンＣ誘導体
【化４０】
がセファロスポリンＣから製造される。セファロスポリンＣ溶液は精製または粗製の形のものとすることができる。このセファロスポリンＣは、セファロスポリンＣの任意の非毒性塩の形とすることができる。
【００６２】
３´位の求核置換反応（ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ３’ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）が、複素環チオールと任意の非毒性セファロスポリンＣ塩とを水に溶解させた水性媒質中で、水溶性塩、たとえばアルカリ金属水酸化物、水酸化アンモニウム、または好ましくはアルカリ金属炭酸塩もしくは重炭酸塩、を形成する塩基性化合物の添加によって実施される。一般に、前記のようにして生成される塩のほかに、任意の市販のセファロスポリンＣ塩と複素環チオールとを、本発明の方法において、方法の基本構成を変更することなく使用することができる。
【００６３】
複素環チオールとセファロスポリンＣとを別々の反応容器内でまたは一緒に溶解させたあと、両反応物を同じ反応器内で混合するが、その前または後に、溶液をｐＨ値５．５〜７．０で約６５〜８０℃の温度に加熱する。
【００６４】
反応が開始したら、温度とｐＨをそれぞれ好ましくは約６５℃と６．０に、約１〜４時間にわたって維持する。
【００６５】
複素環チオール／セファロスポリンＣのモル比は、反応の収率に関して重要な変数であり、使用するそれぞれの複素環チオールに対して最適化しなければならない。このモル比は、１．０〜４．０であり、好ましくは約４である。
【００６６】
ここでの観察によれば、これらのモル比において、セファロスポリンＣは、チオールを含まないセファロスポリンＣ溶液の場合に比して、きわめて安定で、少ししかβ−ラクタム環分解を起こさない。チオールを含まない場合、セファロスポリンＣは、８０℃で、４０分以内に完全に分解する。
【００６７】
セファロスポリンＣの濃度が初期量の２％を下回ったら、反応混合物を、強鉱酸（ｓｔｒｏｎｇ ｍｉｎｅｒａｌ ａｃｉｄｓ）たとえばハロゲン化水素または酸素酸による、ｐＨの３．０〜５．５好ましくは約５．２への酸性化ありまたはなしで、約２〜１０℃の温度に冷却する。
【００６８】
この酸性化ステップにより、場合によっては、複素環チオールの結晶化が起こり、新たな反応のための再使用の可能性も与えられる。
【００６９】
式ＩＩＩの化合物が生成されたら、過剰なチオール基を選択的に除去することにより、式ＩＩＩのセファロスポリンＣ誘導体を、非常に低濃度の（＜０．２ｍｇ／ｍｌ）の複素環チオールしか含まない、非常に高い純度で得ることができる。強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−４００（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ製）による高度に選択的な除去手順を使用する。この方法はいくつかの利点を有する。この方法により、式ＩＩＩの化合物を、次の工程ステップにおいて、酵素の失活なしで基質として使用することができる。したがって、酵素を反復使用することができる。さらに、この方法は、毒性試薬の使用を必要とせず、また中間体の分離を必要としないため、連続工程で実施することができる。
【００７０】
いろいろな樹脂といろいろなタイプのクロマトグラフィーとが、工業的規模で使用できる。
【００７１】
吸着、親水性−疎水性相互作用、陽イオン交換、および陰イオン交換にもとづいて、四種類の樹脂に分けて、いくつかの樹脂を試験した。吸着に関して試験したすべての樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−７６１、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ７ＨＰ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ １６ＨＰ、およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４）は、同様の結果を与え、溶出液は２２〜３８％の複素環チオールを含んでいた。疎水性−親水性相互作用樹脂Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０は、チオールを保持していなかった（＜５％）。同様な状況は、陽イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標） ＩＲＣ−５０、ＩＲ−１２０、およびＩＲ−２００に関しても見られた。しかし、陰イオン交換体は、弱陰イオン交換体（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−９３）の場合、５７〜６０％複素環チオールの最高の結合能力を有することがわかった。
【００７２】
ここでの観察によれば、８％の架橋結合を含むトリアルキルベンジルアンモニウム官能基を有する強微孔質（ゲルタイプＩ）陰イオン（塩基性）交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−４００が、最高の複素環チオール結合（９２〜９８％）と３´位複素環チオメチルセファロスポリンＣ誘導体の小さな結合（２〜１５％、第一サイクルでは１５％よりも小で、その後のサイクルでは５％よりも小）を与えた。
【００７３】
そのような微孔質樹脂はいくつかの利点を与える。これらの樹脂は、あまり壊れやすくなく、取扱いにそれほど注意する必要がなく、また大きな負荷能力を有する。これらの樹脂は不連続気孔を有しないので、溶質イオンは、粒子を通って拡散して交換部位と相互作用する。前記樹脂の総交換能力は、１．４ｍｅｑ／ｍｌの程度である。
【００７４】
ここでの意外な発見によれば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−４００は、セファロスポリンＣの３´−複素環チオメチル誘導体に対しては、グルタリル−７−ＡＣＡおよび７−ＡＣＡの同じ誘導体に対してよりも、小さな結合能力を有する。実際、ＭＭＴＤによって製造されたグルタリル−７−ＡＣＡの３´−複素環チオメチル誘導体は、カラムに７６．３％のレベルで結合した。同じ結果は、ＭＭＴＤによる、７−ＡＣＡの３´−複素環チオメチル誘導体の場合にも見られ、この誘導体は、カラムに９２．７％のレベルで結合した。これら三つの同類β−ラクタム化合物に対するＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−４００の予想外の挙動は、グルタリル−７−ＡＣＡおよび７−ＡＣＡと異なり、セファロスポリンＣの側鎖の５位にイオン化可能なアミノ基が存在することによると考えられる。
【００７５】
本発明の方法による複素環チオールの除去は、カラムからの溶出液を修飾セファロスポリンＣの分離なしで酵素処理に使用することができるため、工業的規模の場合に特に有利であり、このやり方は、不純物がカラムに束縛されていてβ−ラクタム誘導体が水によって簡単に溶出するため、セファロスポリン中間体の分野に対して新しいコンセプトをもたらすものである。
【００７６】
β−ラクタム誘導体が溶出された（＜５％が束縛されて残留している）ならば、一般に、カラムを、いろいろな量の有機溶剤好ましくは１０〜２０％のアセトニトリルを含む強鉱酸たとえばハロゲン化水素の１．５Ｎ溶液によって再生させる。溶出液のチオール濃度が０．２ｍｇ／ｍｌよりも大きい場合、３Ｎ ＨＣｌと４０％のアセトニトリルとによる強力な再生を実施することができる。あるいは、１．５Ｍ ＨＣｌと１．０Ｎ ＮａＯＨとによる再生も可能である。
【００７７】
複素環チオールの溶出後、このチオールを濃縮して再使用する。次のサイクルの前に、カラムを脱イオン水ですすいで、過剰な再生剤を除去する。最初の層体積のすすぎは、再生に使用する流量で実施すべきである。あとは吸着流量で実施する。
【００７８】
式ＩＩＩの化合物は、固定化酵素系によって、式ＩＶの新しい安定なα−ケトアジピル−７−ＡＣＡ誘導体に酵素転換される。
【化４１】
ここで、Ｒは、少なくとも一つの窒素原子を含み、一つのイオウまたは酸素原子を含むかまたは含まない複素環基である。
【００７９】
同じ固体担体に同時固定化した酵素（Ｄ−ＡＡＯとカタラーゼ）の使用により、別々の担体による場合よりも、より十分な過酸化水素除去が可能になる。両酵素からなる生体触媒は、反応媒質から容易に回収することができ、何回も繰返し使用することができる。これは、工業的なプロセスの場合、必要欠くべからざる特性である。
【００８０】
本発明のもう一つの工業的な利点は、強陰イオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標） ＩＲＡ−４００、Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ製）によるクロマトグラフィーのあと、式ＩＩＩの化合物を含む化学溶液を、同時固定化酵素を含む酵素反応器に運ぶのが容易である、ということである。そのため、工程を、セファロスポリンＣから化合物ＩＶまで、単一の液体流で連続的に実施することができる。
【００８１】
酵素による処理段階は、下記のようないくつかのやり方で実施することができる。
１）過剰な複素環チオールの除去と固定化Ｄ−ＡＡＯによるアミノ基酸化除去とのない化学反応。これらの条件下では、化合物ＩＶが全β−ラクタムの約３５〜４０％まで蓄積し、これは、非修飾セファロスポリンＣを使用する場合に生成されるα−ケトアジピル−７−ＡＣＡの５〜１０％の蓄積よりも大きい。これは、化合物ＩＶの安定性を示している。
２）上記１）と同じであるが、カタラーゼを含む。これらの条件下では、化合物ＩＶの濃度が、溶液中の全β−ラクタムの７０〜７５％に達し、３−チオール化グルタリル−７−ＡＣＡ（Ｔ´Ｘ´Ｇ）の濃度は１０％よりも小である。しかし、固定化酵素およびカタラーゼは、高濃度（１ｍｇ／ｍｌ以上）の複素環チオールの存在のために、２、３サイクル以内に失活してしまう。
３）イオン交換クロマトグラフィーによる過剰な複素環チオールの除去と、同じ固体担体へのＤ−ＡＡＯとカタラーゼとの同時固定化とによる、化学反応。これらの条件下では、化合物ＩＶは、使用ｐＨによるが、全β−ラクタムの約８０〜９０％蓄積する。ｐＨ約６．５の場合、化合物ＩＶは安定性が高く、蓄積は９０％に達するが、Ｄ−ＡＡＯは活性が小さい（大量の生体触媒が必要である）。ｐＨ７．２５付近では、酵素はより活性であるが、化合物ＩＶは安定性が低く、蓄積は８０％である。好ましいｐＨは、６．７５であり、この場合には、Ｄ−ＡＡＯ活性の最小限の低下と、化合物ＩＶの良好な安定性とが得られる。
【００８２】
前記のことからわかるように、手順３）が他よりも有利であるが、二つの酵素（Ｄ−ＡＡＯとカタラーゼ）を同時固定化して良好な生体触媒を得るためには、いくつかのパラメータを考慮する必要がある。
ａ）二つの酵素の供給源。本発明におけるＤ−ＡＡＯは微生物のスペインコレクション（ＣＥＣＴ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｓｐａｉｎ）から得られたＴｒｉｇｏｎｏｐｓｓ ｖａrｉａｂｉｌｉｓ ＣＢＳ ４０９１ から得られる。このイーストを、Ｄ−ＡＡＯを生じる条件下で成長させ（Ｋｕｂｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７；１０４；１９８５）、酵素を、Ｓｚｗｊｃｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．７，１，１９８５）が述べているような、３０〜５５％の硫酸アンモニウム分別によって精製した。アミノ酸オキシダーゼは、また、Ｒｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ由来のものとすることもできる。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ由来のカタラーゼを、商業的供給源（Ｆｌｕｋａ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）から得ることができるが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌａｓ ｎｉｇｅｒ由来のものとすることもできる。
ｂ）使用する固体担体。酵素を固定化するのに、いくつかの担体を使用することができる。もっとも普通のものは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ ９００（第四アミン官能基を有する強塩基性ポリスチレン樹脂）、Ｄｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ａ３６５（第一官能基を有する弱塩基性ポリスチレン樹脂）、Ｄｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ａ５６８（中程度の塩基性の縮重合フェノールホルムアルデヒド樹脂）、ＢｒＣＮ^-活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ビニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、およびＥｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ（登録商標）（ポリアクリル構造を土台とするもので、特にオキシラン末端基を有する）である。Ｅｕｐｅｒｇｉｔのうち、市販されている二種類がＣとＣ２５０Ｌである（Ｒoｈｍ Ｐｈａｒｍａ）。後者のタイプが、高分子量酵素の結合のために特に適当である。オキシラン基の含有率が、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃにおける０．９３％に比して、少なくとも０．３６％であるからである。このＣ２５０Ｌタイプは、工業的な生体触媒工程に使用した場合、顕著な特性を示す。担体の形態、すなわちその狭い粒子寸法分布（２００μｍ）と高い機械的安定性とが、撹拌タンク反応器における良好な特性のもとである。このタイプは、撹拌システムにおいて機械的に破壊されず、また反応サイクルの終わりにおけるろ過が迅速かつ非常に簡単に実施される。ｐＨとイオン強度との変化が基質（ｍａｔｒｉｘ）の膨潤に影響を与えない。さらに、このＥｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ２５０Ｌは、これまで固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよびカタラーゼの固定化に使用されたことがない。
ｃ）カタラーゼ単位／Ｄ−ＡＡＯ単位の比。この比は、通常１００よりも大きいが、効率的な過酸化水素の除去のために、好ましくは約１５００である。一単位のＤ−ＡＡＯは、ｐＨ８．０、２５℃で、基質としてセファロスポリンＣを使用したとき、一分あたり１μｍｏｌのＯ₂を分解する酵素の量であると定義される。一単位のカタラーゼは、ｐＨ７．０、２５℃で、一分あたり１μｍｏｌの過酸化水素を分解する酵素の量であると定義される。
ｄ）同時固定化の手順。いくつかの固定化プロトコルが使用できる。本発明で選択する一つの手順は、Ｌ−α−グリセロールホスフェートオキシダーゼをカタラーゼと同時固定化する、Ｃｒａｍｅｒ ａｎｄ Ｓｔｅｃｋｈａｍ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４５，１４６４５，１９９７）による方法を改変したものである。通常、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ内で、１００ｍｇのＥｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ（登録商標）２５０Ｌを、１．５ｍｌの共役（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）緩衝液（１．０Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．０）に懸濁させる。次に、１０〜４０ＵのＤ−ＡＡＯと１０〜２０ｋＵのカタラーゼ（Ｆｌｕｋａ，ｃａｔ♯６０６３４）を、ゆっくりと加える。この混合物を穏やかにゆすりながら、１６ｈ間定温放置する。固定化手順のあと、ビーズをガラスフリットによって分離し、４℃の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０を使用して、数回洗浄する。
【００８３】
同時固定化が終了したら、化合物ＩＩＩの化合物ＩＶへの酵素による転換を、化合物ＩＩＩを約０．００１６〜０．００４ｍｏｌ含み、複素環チオールを０．２ｍｇ／ｍｌよりも少なく含む水溶液を用いて実施する。この溶液は、３−チオール化セファロスポリンＣ（化合物ＩＩＩ）とセファロスポリンＣの３アセトキシ基の求核置換に使用された複素環チオールの残留物とを含む溶液を、強陰イオン交換体たとえばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）のカラムに通すことにより、得られる。この溶出液のｐＨは、セファロスポリン（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ）化合物が塩基性ｐＨ値では不安定であるため、約６．５〜８．０好ましくは６．７５に調節される。
【００８４】
前述のような化合物ＩＩＩを含む溶液を、同時固定化Ｄ−ＡＡＯ／カタラーゼ（通常２０〜４０Ｕ／ｇのＤ−ＡＡＯと通常１０〜３０ｋＵ／ｇのカタラーゼ）を含む湿潤Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ２５０Ｌを入れたバイオリアクターに投入する。反応温度は、１５〜３５℃に固定することができ、通常は２０℃に固定する。
【００８５】
酸化によるアミノ基除去に必要な分子酸素を、約４００ｒｐｍの適当な機械的撹拌を加えながら、底部ディフューザーから、０．０１〜１体積／溶液体積／分（ｖｖｍ）、好ましくは０．１ｖｖｍの流量で、溶液内に吹き込む。このバイオリアクター構成は、固定化酵素を含むろ過カラムの場合、化合物ＩＶの収率を低下させる分子酸素拡散の問題を避けるために好ましい。ｐＨは、自動滴定器を用いて、高濃度有機または無機塩基溶液好ましくは３Ｍアンモニアの添加により、６．７５に滴定する。
【００８６】
転換は、ＨＰＬＣによって制御し、化合物ＩＩＩの転換率が９７％よりも大きくなったとき、反応を停止させ、溶液をろ過する。この転換に必要な時間は、作業条件によって変わるが、０．５〜３時間の程度であり、通常は約１時間である。
【００８７】
必要な場合には、化合物ＩＶの分離を、酵素反応で使用したものと同じ塩基により上記溶液のｐＨを約４．５〜６．０好ましくは５．０に低下させて、吸着樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２を充填したカラムに投入することによって、実施する。化合物ＩＶの溶出は、一時間あたり２〜３層体積の流量の水によって行う。ＨＰＬＣ純度９０〜９５％よりも大の、化合物ＩＶを含む画分を、保存し、凍結乾燥する。
【００８８】
次に、式ＩＶの化合物を、グルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼによる酵素処理により、式Ｉの化合物に転換する。
【００８９】
セファロスポリンＣから式Ｉの化合物を製造する本発明の方法は、一回の一容器反応によっても実施することができる。この場合、式ＩＩＩの化合物を含む陰イオン交換カラムからのろ液を、グルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼの存在下で、Ｄ−ＡＡＯとカタラーゼとを含む固定化酵素系によって、式Ｉの化合物に酵素転換する。このようにして製造された式Ｉの化合物のＨＰＬＣ純度は、約９５％であった。この工程は容易かつ効率的に実施される。
【００９０】
本発明の二つの実施態様（一容器または二ステップ）により、３−チオール化−７−ＡＣＡ誘導体が容易かつ経済的に製造される。これらの化合物は、たとえばペニシリンＧアシラーゼによる後続の酵素処理により、半合成β−ラクタム抗生物質の製造に使用することができる。これらのβ−ラクタム構成物質の例としては、セファゾリン、セファゼドン、セフォペラゾン、セファマンドール、セファトリアジン、セフォティアム、およびセフトリアクソンの一つ以上を挙げることができる。
【００９１】
下記の実施例は本発明の説明を意図するものであるが、本発明の一般性を限定するものではない。
【００９２】
実施例１〜５は、セファロスポリンＣからの、式ＩＩＩの３−チオール化−７−ＡＣＡ誘導体の製造を示す。
【００９３】
実施例６〜８は、式ＩＩＩの３−チオール化セファロスポリンＣ誘導体から、式ＩＶの３−チオール化α−ケトアジピル−７−ＡＣＡ誘導体を製造する、酵素による方法を示す。
【００９４】
実施例９〜１１は、式ＩＩＩの３−チオール化誘導体から、式ＩＶの安定なα−ケトアジピル−７−ＡＣＡ誘導体の生成を経由して、式Ｉの３−チオール化−７−ＡＣＡ誘導体（ＴＸＡ）を製造する、酵素による方法を示す。
【００９５】
実施例１２〜１４は、一ステップ（一容器）で、式ＩＩＩの３−チオール化誘導体から、式Ｉの３−チオール化−７−ＡＣＡ誘導体を製造する、酵素による方法を示す。
【実施例１】
【００９６】
７−β−（５−アミノ−カルボキシペンタンアミド）−３−（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル チオメチル）−３−セフェム−４−カルボン酸（ＴＤＣ）の製造。
【００９７】
６００ｍｌの脱イオン水を入れたガラス内張り反応器に、３１．７３ｇ（０．２４ｍｏｌ）の２−メルカプト−５−メチル−１，３，４−チアジアゾール（ＭＭＴＤ）を加え、撹拌しながら、この反応器を約６５℃の温度に加熱した。混合物のｐＨを、約１０ｇの炭酸ナトリウムの添加により、約６．０に調節した。
【００９８】
別のガラス内張りフラスコで、３３．２３ｇのナトリウムセファロスポリンＣ（７５％遊離酸、０．０６ｍｏｌ）を２００ｍｌの水に溶解させることによって、ナトリウムセファロスポリンＣの濃厚溶液（ＨＰＬＣによる純度９８％）を作った。ＭＭＴＤが溶解してから、このセファロスポリンＣ濃厚溶液を加えて、混合物を約６５℃で２４０分撹拌した。このとき、セファロスポリンＣ濃度が２％よりも低くなるまで、反応速度を制御した。下記の反応速度が観察された。
【００９９】
【表１】
【０１００】
次に、反応混合物を約４℃に冷却した。この温度で、過剰なＭＭＴＤの結晶化が開始した。撹拌（１５０ｒｐｍ）しながら、３７％の塩酸（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｃｉｄ）により、ｐＨを５．２まで酸性化し、結晶化を完了させるために、ゆっくりと撹拌（５０ｒｐｍ）しながら、６０分放置した。
【０１０１】
沈殿したＭＭＴＤをろ過し、減圧下、３５℃で乾燥した。２３ｇの回収ＭＭＴＤが得られ（ＨＰＬＣによる純度９９％）、回収率は約９５％であった。
【０１０２】
０．０４２ｍｏｌのＴＤＣとＭＭＴＤ０．０１６ｍｏｌとを含むろ液（８２５ｍｌ）のｐＨを、３Ｍのアンモニアによって７．２５に調節し、２０ｍｌ／ｍｉｎの流量の脱イオン水で覆われた、クロリドサイクル内にあるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−４００カラム（層体積＝１８０ｍｌ）に投入した。投入のあと、投入ＴＤＣの９７％（ＨＰＬＣによる純度９４％）が回収されるまで、カラムを脱イオン水（約１００ｍｌ）で洗浄した。流出液のｐＨは、約５．４であり、３Ｍのアンモニアにより中和して７．０にした。残留ＭＭＴＤは０．０００９ｍｏｌ（＜０．２ｍｇ／ｍｌ）であり、これは、ｐＨの減少による結晶化後の残留ＭＭＴＤの６％よりも少ない。この低レベルのＭＭＴＤ（化学反応後のもとのＭＭＴＤの１％よりも小）により、ＴＤＣの酵素処理が可能になる。
【０１０３】
通常、カラムを１０％のアセトニトリルを含む１ｌの１．５Ｍ ＨＣｌで再生してから、２ｌの脱イオン水で洗浄してすすぎ、過剰な再生がなされないようにした。必要であれば（ＭＭＴＤ＞０．２ｍｇ／ｍｌ）、樹脂を、４０％のアセトニトリルを含む、１ｌの３Ｍ ＨＣｌを用いて強再生することができる。あるいは、１．５Ｍ ＨＣｌと１．０Ｎ ＮａＯＨとによる再生も可能である。
【０１０４】
ｐＨ５．０のＴＤＣ溶液の特性をさらに調べるために、該溶液を、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２吸着カラムに投入し、該カラムを水で洗浄した。洗浄後、樹脂に水による溶出処理を行い、２５ｍｌの部分をいくつか保存した。９８．５％（ＨＰＬＣによる）ＴＤＣを含む画分を、凍結乾燥し、分析して下記の結果を得た。
【０１０５】
生成物Ｃ₁₇Ｈ₂₀Ｎ₅Ｏ₆Ｓ₃・２Ｈ₂Ｏ（ＴＤＣ）の元素分析結果
計算：Ｃ ３７．４２、Ｈ ４．４３、Ｎ １２．８４、Ｓ １７．６３
実験：Ｃ ３７．２７、Ｈ ４．３、Ｎ １３．１１、Ｓ １７．５１
【０１０６】
【化４２】
【実施例２】
【０１０７】
比較例：いろいろなカラムにおける、７−β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド）−３−（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル チオメチル）−３−セフェム−４−カルボン酸の製造
【０１０８】
ＴＤＣ誘導体を実施例１のようにして製造し、該誘導体を含むろ液を、いろいろなタイプの樹脂に投入した。
【０１０９】
カラム使用の第一サイクルにおける１００ｍｌの水での洗浄後、下記のデータが得られた。
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−４００が最善の結果を与えた。ＴＤＣの大量の溶出が見られ、ＭＭＴＤの溶出は少ない。他の陰イオン交換カラムを使用すると、ＭＭＴＤも大量に溶出する。他の陰イオン交換体は、チオールとＴＤＣ双方の大量の結合を示した。
【実施例３】
【０１１２】
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−４００に対するＴＤＣの特異性
【０１１３】
グルタリル−７−ＡＣＡと７−ＡＣＡとを出発原料として使用し、実施例１のようにして、グルタリル−７−ＡＣＡ誘導体（ＴＤＧ）と７−ＡＣＡ誘導体（７−ＴＤＡ）を製造した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−４００のろ液から下記のデータが得られた。
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
ＴＤＣの場合と異なり、ＴＤＧとＴＤＡは、どちらもＭＭＴＤと同様に、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−４００に結合したままになると思われる。
【実施例４】
【０１１６】
７−β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド）−３−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＺＣ）の製造
【０１１７】
６００ｍｌの脱イオン水を入れたガラス内張り反応器に、２８．１６ｇ（０．２４ｍｏｌ）の５−メルカプト−１−メチルテトラゾール（ＭＭＴＺ）を加え、撹拌しながら、この反応器を約７０℃の温度に加熱した。混合物のｐＨを、約１２ｇの炭酸ナトリウムの添加により、約５．７〜５．８に調節した。
【０１１８】
別のガラス内張りフラスコで、３３．２３ｇのナトリウムセファロスポリンＣ（７５％遊離酸、０．０６ｍｏｌ、ＨＰＬＣによる純度９８％）を２００ｍｌの水に溶解させることによって、ナトリウムセファロスポリンＣの濃厚溶液を作った。ＭＭＴＺが溶解してから、このセファロスポリンＣ濃厚溶液を加えて、混合物を約７０℃で１２０分撹拌した。このとき、セファロスポリンＣ濃度が３％よりも低くなるまで、反応速度を制御した。
【０１１９】
【表４】
【０１２０】
反応混合物を約４℃に冷却したが、ｐＨを低下させた場合でも、過剰なＭＭＴＺの結晶化は開始しなかった。ＭＭＴＺからのＴＺＣ誘導体０．０４ｍｏｌとＭＭＴＺ０．１９ｍｏｌとを含む溶液のｐＨを、３Ｍのアンモニアによって７．２５に調節し、２０ｍｌ／ｍｉｎの流量の脱イオン水で覆われた、クロリドサイクル内にあるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−４００カラム（層体積＝１５０ｍｌ）に投入した。カラムの第一パスのあと、残留ＭＭＴＺは初期値の１３％よりも多かった（０．０３２ｍｏｌ）。
【０１２１】
そのため、溶出液を、上記と同じ条件の別のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−４００（層体積＝６０ｍｌ）カラムに投入し、ＭＭＴＺの濃度を低下させた。
【０１２２】
投入のあと、投入ＴＺＣの９７％（ＨＰＬＣによる純度８７％）が回収されるまで、カラムを脱イオン水（約９０ｍｌ）で洗浄した。流出液のｐＨは、約５．４であり、３Ｍのアンモニアにより中和して７．０にした。残留ＭＭＴＺの濃度は０．００１３ｍｏｌであり、これは、化学反応後のもとのＭＭＴＺの１％よりも少ない。ＭＭＴＺのこの低レベルのため、酵素の失活なしで前記誘導体を酵素処理することが可能になる。
【０１２３】
カラムを１０％のアセトニトリルを含む１ｌの１．５Ｍ ＨＣｌで再生してから、２ｌの脱イオン水で洗浄してすすぎ、過剰な再生がなされないようにした。あるいは、１．５Ｍ ＨＣｌと１．０Ｎ ＮａＯＨとによる再生も可能である。
【実施例５】
【０１２４】
７−β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド）−３−［（１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＴＣ）の製造
【０１２５】
６００ｍｌの脱イオン水を入れたガラス内張り反応器に、３７．９６ｇ（０．２４ｍｏｌ）の２，５−ジヒドロ−３−メルカプト−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン（以下、ＴＴＺと略記する）を加え、撹拌しながら、この反応器を約７５℃の温度に加熱した。混合物のｐＨを、約１２ｇの炭酸ナトリウムの添加により、約６．７に調節した。
【０１２６】
別のガラス内張りフラスコで、３３．２３ｇのナトリウムセファロスポリンＣ（７５％遊離酸、０．０６ｍｏｌ、ＨＰＬＣによる純度９８％）を２００ｍｌの水に溶解させることによって、ナトリウムセファロスポリンＣの濃厚溶液を作った。ＴＴＺが溶解してから、このセファロスポリンＣ濃厚溶液を加えて、混合物を約７５℃で７５分撹拌した。このとき、セファロスポリンＣ濃度が２％よりも低くなるまで、反応速度を制御した。
【０１２７】
【表５】
【０１２８】
反応混合物を約４℃に冷却したが、ｐＨを低下させた場合でも、過剰なＴＴＺの結晶化は開始しなかった。０．０３６ｍｏｌのＴＴＣと０．１９ｍｏｌのＴＴＺとを含む溶液のｐＨを、３Ｍのアンモニアによって７．２５に調節し、２０ｍｌ／ｍｉｎの流量の脱イオン水で覆われた、クロリドサイクル内にあるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−４００カラム（層体積＝２０９ｍｌ）に投入した。第一カラム後、残留ＴＴＺは０．０１５ｍｏｌであった。
【０１２９】
そのため、溶出液を、上記と同じ条件の別のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−４００カラム（層体積同じ）に投入し、ＴＴＺの濃度を低下させた。
【０１３０】
投入のあと、投入ＴＴＣの６０％（ＨＰＬＣによる純度９０％）が回収されるまで、カラムを脱イオン水（約１２０ｍｌ）で洗浄した。流出液のｐＨは、約５．４であり、３Ｍのアンモニアにより中和して７．０にした。残留ＴＴＺの濃度は０．０００９６ｍｏｌであり、これは、化学反応後のもとのＴＴＺの１％よりも少ない。ＴＴＺのこのレベルのため、酵素の失活なしで誘導体を酵素処理することが可能になる。
【０１３１】
カラムを１０％のアセトニトリルを含む１ｌの１．５Ｍ ＨＣｌで再生してから、２ｌの脱イオン水で洗浄してすすぎ、過剰な再生がなされないようにした。あるいは、１．５Ｍ ＨＣｌと１．０Ｎ ＮａＯＨとによる再生も可能である。
【実施例６】
【０１３２】
７β−（５−カルボキシ−５−オキソペンタアミド）−３−［（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）−チオメチル］セファロスポラン酸（ＴＤＫ）の製造
【０１３３】
０．００３５ｍｏｌの７β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタアミド）−３−［５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル］−チオメチル］セファロスポラン酸（ＴＤＣ）（ＨＰＬＣ純度９４．３％）と、０．２ｍｇ／ｍｌよりも少ない２−メルカプト−５−メチル−１，３，４−チアゾアゾール（ＭＭＴＤ）とを含む、強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００からのろ液（８０ｍｌ）を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ６．７５に調節した。
【０１３４】
このＴＤＣ溶液を、同時固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼ系（１１．７７ＵのＤＡＡＯ／ｇと１５ｋＵのカタラーゼ／ｇ）を含む３０．７６ｇの湿潤Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ２５０Ｌを入れた０．１２５ｌの撹拌ガラス容器に投入した。
【０１３５】
転換は、２０℃、４００ｒｐｍで、底部ディフューザーから絶対圧１ｂａｒの流量０．１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの酸素流を送りながら、実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、６．７５になるように滴定した。
【０１３６】
転換を、逆相カラムＮｕｃｌｅｏｓｉｌ １２０ ３−Ｃ１８ １２５×８×４ｍｍによるＨＰＬＣによって制御した。移動相は、１ｍｌ／ｍｉｎの、４％のアセトニトリルを含むｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ａｃｅｔａｔｅ ａｍｍｏｎｉｕｍ）であり、また２６０ｎｍ検出を行う。７．０分で、ＴＤＣが現れ、８．５分で、ＴＤＫ、１１．５分で、３−チオール化グルタリル−７−ＡＣＡ中間体（ＴＤＧ）が現れた。
【０１３７】
反応混合物から酵素を除いた代表サンプルを採取した。得られた結果を、全β−ラクタムに対する百分率で、下記の表に示す。
【０１３８】
【表６】
【０１３９】
残留ＴＤＣの割合が３％よりも小さくなったとき、反応を停止させ、反応溶液をろ過した。
【０１４０】
ＴＤＫを分離するために、得られた溶液を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ５．０に調節し、４０ｇの吸着樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２（６８．７ｍｌの層体積）を充填したカラムを通過させた。溶出は、流量２００ｍｌ／ｈ（約３層体積／時間）の水によって実施した。純度９５％以上（ＨＰＬＣ）のＴＤＫを含む２５ｍｌの画分を保存し、凍結乾燥して、目標生成物を固体の形で得て、分析に供した。溶出プロセスのあと、吸着剤表面を、２層体積の再生溶液（２５％メタノール水溶液、３層体積／時間の流量）によって再活性化させた。カラムが再使用できるようにするために、この溶液をカラムから除去した。過剰な水（約１５層体積）による平衡化（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）により、カラムは再使用できるようになる。
【０１４１】
【化４３】
【実施例７】
【０１４２】
７β−（５カルボキシ−５−オキソペンタンアミド）−３−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＺＫ）の製造
【０１４３】
０．００３９ｍｏｌの７−（５´−アミドアジパミド）−３−［１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル］−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＺＣ）（ＨＰＬＣ純度９０．１％）と、０．２ｍｇ／ｍｌよりも少ない５−メルカプト−１−メチルテトラゾール（ＭＭＴＺ）とを含む、強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００からのろ液（１００ｍｌ）を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ６．７５に調節した。
【０１４４】
このＴＺＣ溶液を、同時固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼ系（１１．７７ＵのＤＡＡＯ／ｇと１５ｋＵのカタラーゼ／ｇ）を含む３０．７６ｇの湿潤Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ２５０Ｌを入れた０．１２５ｌの撹拌ガラス容器に投入した。
【０１４５】
転換は、２０℃、４００ｒｐｍで、底部ディフューザーから絶対圧１ｂａｒの流量０．１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの酸素流を送りながら、実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、６．７５になるように滴定した。
【０１４６】
転換を、逆相カラムＮｕｃｌｅｏｓｉｌ １２０ ３−Ｃ１８ １２５×８×４ｍｍによるＨＰＬＣによって制御した。移動相は、１ｍｌ／ｍｉｎの、４％のアセトニトリルを含むｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸アンモニウムであり、また２６０ｎｍ検出を行う。３．０分で、ＴＺＣが現れ、３．６分で、ＴＺＫ、４．６分で、３−チオール化グルタリル−７−ＡＣＡ中間体（ＴＺＧ）が現れた。
【０１４７】
反応混合物から酵素を除いた代表サンプルを採取した。得られた結果を、全β−ラクタムに対する百分率で、下記の表に示す。
【０１４８】
【表７】
【０１４９】
残留ＴＺＣの割合が３％よりも小さくなったとき、反応を停止させ、反応溶液をろ過した。
【０１５０】
ＴＺＫを分離するために、得られた溶液を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ５．０に調節し、４０ｇの吸着樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２（６８．７ｍｌの層体積）を充填したカラムを通過させた。溶出は、流量２００ｍｌ／ｈ（約３層体積／時間）の水によって実施した。純度９３％以上（ＨＰＬＣ）のＴＺＫを含む２５ｍｌの画分を保存し、あとで凍結乾燥して、目標生成物を固体の形で得て、分析に供した。溶出プロセスのあと、吸着剤表面を、２層体積の再生溶液（２５％メタノール水溶液、３層体積／時間の流量）によって再活性化させた。カラムが再使用できるようにするために、この溶液をカラムから除去した。過剰な水（約１５層体積）による平衡化により、カラムは再使用できるようになる。
【０１５１】
【化４４】
【実施例８】
【０１５２】
７β−（５カルボキシ−５−オキソペンタンアミド）−３−［（１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＴＫ）の製造
【０１５３】
０．００１６ｍｏｌの７β−（５−アミノ５−カルボキシペンタアミド）−３−［（１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＴＣ）（ＨＰＬＣ純度８９．８６％）と、０．２ｍｇ／ｍｌよりも少ない２，５−ジヒドロ−３−メルカプト−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン（ＴＴＺ）とを含む、強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００からのろ液（５０ｍｌ）を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ６．７５に調節した。
【０１５４】
このＴＴＣ溶液を、同時固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼ系（１１．７７ＵのＤＡＡＯ／ｇと１５ｋＵのカタラーゼ／ｇ）を含む３０．７６ｇの湿潤Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ２５０Ｌを入れた０．１２５ｌの撹拌ガラス容器に投入した。
【０１５５】
転換は、２０℃、４００ｒｐｍで、底部ディフューザーから絶対圧１ｂａｒの流量０．１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの酸素流を送りながら、実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、６．７５になるように滴定した。
【０１５６】
転換を、カラムＥｃｌｉｐｓｅ（登録商標）ＸＤＢ−Ｃ８ ５μｍ ４．６×１５０ｍｍによるＨＰＬＣによって制御した。移動相は、１ｍｌ／ｍｉｎの、１０ｍＭ ＴＢＨＳ（硫酸水素テトラブチルアンモニウム）と１５ｍＭのリン酸二水素カリウムとを含む３５％メタノールであり、また２６０ｎｍ検出を行う。２．６分で、ＴＴＣが現れ、５．５分で、３−チオール化グルタリル−７−ＡＣＡ中間体（ＴＴＧ）が現れ、６．６分で、ＴＴＫが現れた。
【０１５７】
反応混合物から酵素を除いた代表サンプルを採取した。得られた結果を、全β−ラクタムに対する百分率で、下記の表に示す。
【０１５８】
【表８】
【０１５９】
残留ＴＴＣの割合が３％よりも小さくなったとき、反応を停止させ、反応溶液をろ過した。
【０１６０】
ＴＴＫを分離するために、得られた溶液を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ５．０に調節し、４０ｇの吸着樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２（６８．７ｍｌの層体積）を充填したカラムを通過させた。溶出は、流量２００ｍｌ／ｈ（約３層体積／時間）の水によって実施した。純度９０％以上（ＨＰＬＣ）のＴＴＫを含む２５ｍｌの画分を保存し、あとで凍結乾燥して、目標生成物を固体の形で得て、分析に供した。溶出プロセスのあと、吸着剤表面を、２層体積の再生溶液（２５％メタノール水溶液、３層体積／時間の流量）によって再活性化させた。カラムが再使用できるようにするために、この溶液をカラムから除去した。過剰な水（約１５層体積）による平衡化により、カラムは再使用できるようになる。
【０１６１】
【化４５】
【実施例９】
【０１６２】
７−アミノ−３−［（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＤＡ）の合成
【０１６３】
０．００１１ｍｏｌの７β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタアミド）−３−［（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）−チオメチル］セファロスポラン酸（以下、ＴＤＣと略記する）（ＨＰＬＣ純度９４．０１％）と、０．２ｍｇ／ｍｌよりも少ない２−メルカプト−５−メチル−１，３，４−チアジアゾル（ＭＭＴＤ）とを含む、強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００からのろ液（５０ｍｌ）を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ６．７５に調節した。
【０１６４】
このＴＤＣ溶液を、同時固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼ系（２５ＵのＤＡＡＯ／ｇと３０ｋＵのカタラーゼ／ｇ）を含む１６ｇの湿潤Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ２５０Ｌを入れた０．１２５ｌの撹拌ガラス容器に投入した。
【０１６５】
転換は、２０℃、４００ｒｐｍで、底部ディフューザーから絶対圧１ｂａｒの流量０．１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの酸素流を送りながら、実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、６．７５になるように滴定した。
【０１６６】
転換を、逆相カラムＥｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ８ １５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ×５μｍによるＨＰＬＣによって制御した。移動相は、１ｍｌ／ｍｉｎの、１０ｍＭ 硫酸水素テトラブチルアンモニウムと１５ｍＭのリン酸二水素カリウムとを含むｐＨ６．５の３５％メタノールであり、また２６０ｎｍ検出を行う。３．０分で、ＴＤＣが、１０．９分で、ＴＤＫが、８．１分で、ＴＤＧが、それぞれ現れた。
【０１６７】
反応混合物から酵素を除いた代表サンプルを採取した。得られた結果を、全β−ラクタムに対する百分率で、下記の表に示す。
【０１６８】
【表９】
【０１６９】
残留ＴＤＣの割合が３％よりも小さくなったとき、反応を停止させ、ＨＰＬＣ純度８８．２７％のＴＤＫを含む反応溶液をろ過し、３ＭのアンモニアによってｐＨを７．２５に調節した。
【０１７０】
このＴＤＫ溶液を、２３ｇの湿潤グルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼ（８７Ｕ／ｇ）を入れた０．１２５ｌの撹拌ガラス容器に投入した。転換は、２０℃、４００ｒｐｍ、絶対圧１ｂａｒで実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、７．２５になるように滴定した。
【０１７１】
転換を、前記条件下で、ＨＰＬＣによって制御した。４．１分で、ＴＤＡが現れた。反応混合物から酵素を除いた代表サンプルを採取した。得られた結果を、全β−ラクタムに対する百分率で、下記の表に示す。
【０１７２】
【表１０】
【０１７３】
残留ＴＤＫの割合が３％よりも小さくなったとき、反応を停止させた。反応溶液は、ＨＰＬＣ純度８８．５９％のＴＤＡを含んでいた。
【実施例１０】
【０１７４】
７−アミノ−３−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＺＡ）の合成
【０１７５】
０．００１９５ｍｏｌの７β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタアミド）−３−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）−チオメチル］セファロスポラン酸（ＴＺＣ）（ＨＰＬＣ純度９１．７４％）と、０．２ｍｇ／ｍｌよりも少ない５−メルカプト−１−メチルテトラゾール（ＭＭＴＺ）とを含む、強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００からのろ液（５０ｍｌ）を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ６．７５に調節した。
【０１７６】
このＴＺＣ溶液を、同時固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼ系（２５ＵのＤＡＡＯ／ｇと３０ｋＵのカタラーゼ／ｇ）を含む１６ｇの湿潤Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ２５０Ｌを入れた０．１２５ｌの撹拌ガラス容器に投入した。
【０１７７】
転換は、２０℃、４００ｒｐｍで、底部ディフューザーから絶対圧１ｂａｒの流量０．１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの酸素流を送りながら、実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、６．７５になるように滴定した。
【０１７８】
転換を、逆相カラムＥｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ８ １５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ×５μｍによるＨＰＬＣによって制御した。移動相は、１ｍｌ／ｍｉｎの、１０ｍＭ 硫酸水素テトラブチルアンモニウムと１５ｍＭのリン酸二水素カリウムとを含むｐＨ６．５の３５％メタノールであり、また２６０ｎｍ検出を行う。２．１分で、ＴＺＣが、５．０分で、ＴＺＫが、４．３分で、ＴＺＧが、それぞれ現れた。
【０１７９】
反応混合物から酵素を除いた代表サンプルを採取した。得られた結果を、全β−ラクタムに対する百分率で、下記の表に示す。
【０１８０】
【表１１】
【０１８１】
残留ＴＺＣの割合が３％よりも小さくなったとき、反応を停止させ、ＨＰＬＣ純度８２．４２％のＴＺＫを含む反応溶液をろ過し、３ＭのアンモニアによってｐＨを７．２５に調節した。
【０１８２】
このＴＺＫ溶液を、２３ｇの湿潤グルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼ（８７Ｕ／ｇ）を入れた０．１２５ｌの撹拌ガラス容器に投入した。転換は、２０℃、４００ｒｐｍ、絶対圧１ｂａｒで実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、７．２５になるように滴定した。
【０１８３】
転換を、前記条件下で、ＨＰＬＣによって制御した。２．５分で、ＴＺＡが現れた。反応混合物から酵素を除いた代表サンプルを採取した。得られた結果を、全β−ラクタムに対する百分率で、下記の表に示す。
【０１８４】
【表１２】
【０１８５】
残留ＴＺＫの割合が３％よりも小さくなったとき、反応を停止させた。反応溶液は、ＨＰＬＣ純度８０．７７％のＴＺＡを含んでいた。
【実施例１１】
【０１８６】
７−アミノ−３−［（１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＴＡ）の合成
【０１８７】
０．００１４ｍｏｌの７β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタアミド）−３−［（１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（以下、ＴＴＣと略記する）（ＨＰＬＣ純度９２．２％）と、０．２ｍｇ／ｍｌよりも少ない２，５−ジヒドロ−３−メルカプト−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン（ＴＴＺ）とを含む、強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００からのろ液（５０ｍｌ）を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ６．７５に調節した。
【０１８８】
このＴＴＣ溶液を、同時固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼ系（２５ＵのＤＡＡＯ／ｇと３０ｋＵのカタラーゼ／ｇ）を含む１６ｇの湿潤Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ２５０Ｌを入れた０．１２５ｌの撹拌ガラス容器に投入した。
【０１８９】
転換は、２０℃、４００ｒｐｍで、底部ディフューザーから絶対圧１ｂａｒの流量０．１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの酸素流を送りながら、実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、６．７５になるように滴定した。
【０１９０】
転換を、逆相カラムＥｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ８ １５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ×５μｍによるＨＰＬＣによって制御した。移動相は、１ｍｌ／ｍｉｎの、１０ｍＭ 硫酸水素テトラブチルアンモニウムと１５ｍＭのリン酸二水素カリウムとを含むｐＨ６．５の３５％メタノールであり、また２６０ｎｍ検出を行う。２．４分で、ＴＴＣが、６．１分で、ＴＴＫが、５．５分で、ＴＴＧが、それぞれ現れた。
【０１９１】
反応混合物から酵素を除いた代表サンプルを採取した。得られた結果を、全β−ラクタムに対する百分率で、下記の表に示す。
【０１９２】
【表１３】
【０１９３】
残留ＴＴＣの割合が３％よりも小さくなったとき、反応を停止させ、ＨＰＬＣ純度９０．０％のＴＴＫを含む反応溶液をろ過し、３ＭのアンモニアによってｐＨを７．２５に調節した。
【０１９４】
このＴＴＫ溶液を、２３ｇの湿潤グルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼ（８７Ｕ／ｇ）を入れた０．１２５ｌの撹拌ガラス容器に投入した。転換は、２０℃、４００ｒｐｍ、絶対圧１ｂａｒで実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、７．２５になるように滴定した。
【０１９５】
転換を、前記条件下で、ＨＰＬＣによって制御した。２．９分で、ＴＴＡが現れた。反応混合物から酵素を除いた代表サンプルを採取した。得られた結果を、全β−ラクタムに対する百分率で、下記の表に示す。
【０１９６】
【表１４】
【０１９７】
残留ＴＴＫの割合が３％よりも小さくなったとき、反応を停止させた。反応溶液は、ＨＰＬＣ純度７８．４０％のＴＴＡを含んでいた。
【実施例１２】
【０１９８】
７−アミノ−３−［（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＤＡ）の単一ステップでの合成
【０１９９】
０．００１４ｍｏｌの７β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタアミド）−３−［（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）−チオメチル］セファロスポラン酸（以下ではＴＤＣと略記する）（ＨＰＬＣ純度９５．４１％）と、０．２ｍｇ／ｍｌよりも少ない２−メルカプト−５−メチル−１，３，４−チアジアゾール（ＭＭＴＤ）とを含む、強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００からのろ液（５０ｍｌ）を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ７．２５に調節した。
【０２００】
このＴＤＣ溶液を、同時固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼ系（２５ＵのＤＡＡＯ／ｇと３０ｋＵのカタラーゼ／ｇ）を含む１６ｇの湿潤Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ２５０Ｌと２３ｇの湿潤グルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼ（８７Ｕ／ｇ）とを入れた０．１２５ｌの撹拌ガラス容器に投入した。
【０２０１】
転換は、２０℃、４００ｒｐｍで、底部ディフューザーから絶対圧１ｂａｒの流量０．１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの酸素流を送りながら、実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、７．２５になるように滴定した。
【０２０２】
転換を、逆相カラムＥｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ８ １５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ×５μｍによるＨＰＬＣによって制御した。移動相は、１ｍｌ／ｍｉｎの、１０ｍＭ 硫酸水素テトラブチルアンモニウムと１５ｍＭのリン酸二水素カリウムとを含むｐＨ６．５の３５％メタノールであり、また２６０ｎｍ検出を行う。３．０分で、ＴＤＣが、１０．９分で、ＴＤＫが、８．１分で、ＴＤＧが、４．１分でＴＤＡが、それぞれ現れた。
【０２０３】
反応混合物から酵素を除いた代表サンプルを採取した。得られた結果を、全β−ラクタムに対する百分率で、下記の表に示す。
【０２０４】
【表１５】
【０２０５】
残留ＴＤＫの割合が３％よりも小さくなったとき、反応を停止させた。反応溶液は、ＨＰＬＣ純度９５．１３％のＴＤＡを含んでいた。
【実施例１３】
【０２０６】
７−アミノ−３−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＺＡ）の単一ステップでの合成
【０２０７】
０．００１９５ｍｏｌの７β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタアミド）−３−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）−チオメチル］セファロスポラン酸（以下、ＴＺＣと略記する）（ＨＰＬＣ純度９３．５５％）と、０．２ｍｇ／ｍｌよりも少ない５−メルカプト−１−メチルテトラゾール（ＭＭＴＺ）とを含む、強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００からのろ液（５０ｍｌ）を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ７．２５に調節した。
【０２０８】
このＴＺＣ溶液を、同時固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼ系（２５ＵのＤＡＡＯ／ｇと３０ｋＵのカタラーゼ／ｇ）を含む１６ｇの湿潤Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ２５０Ｌと２３ｇの湿潤グルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼ（８７Ｕ／ｇ）とを入れた０．１２５ｌの撹拌ガラス容器に投入した。
【０２０９】
転換は、２０℃、４００ｒｐｍで、底部ディフューザーから絶対圧１ｂａｒの流量０．１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの酸素流を送りながら、実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで７．２５になるように滴定した。
【０２１０】
転換を、逆相カラムＥｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ８ １５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ×５μｍによるＨＰＬＣによって制御した。移動相は、１ｍｌ／ｍｉｎの、１０ｍＭ 硫酸水素テトラブチルアンモニウムと１５ｍＭのリン酸二水素カリウムとを含むｐＨ６．５の３５％メタノールであり、また２６０ｎｍ検出を行う。２．１分で、ＴＺＣが、５．０分で、ＴＺＫが、４．３分で、ＴＺＧが、２．５分で、ＴＺＡが、それぞれ現れた。
【０２１１】
反応混合物から酵素を除いた代表サンプルを採取した。得られた結果を、全β−ラクタムに対する百分率で、下記の表に示す。
【０２１２】
【表１６】
【０２１３】
残留ＴＺＫの割合が３％よりも小さくなったとき、反応を停止させた。反応溶液は、ＨＰＬＣ純度７８．１７％のＴＺＡを含んでいた。
【実施例１４】
【０２１４】
７−アミノ−３−［（１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＴＡ）の単一ステップでの合成
【０２１５】
０．００１６ｍｏｌの７β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタアミド）−３−［（１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（以下、ＴＴＣと略記する）（ＨＰＬＣ純度９１．１％）と、０．２ｍｇ／ｍｌよりも少ない２，５−ジヒドロ−３−メルカプト−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン（ＴＴＺ）とを含む、強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００からのろ液（５０ｍｌ）を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ７．２５に調節した。
【０２１６】
このＴＴＣ溶液を、同時固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼ系（２５ＵのＤＡＡＯ／ｇと３０ｋＵのカタラーゼ／ｇ）を含む１６ｇの湿潤Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ２５０Ｌと２３ｇの湿潤グルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼ（８７Ｕ／ｇ）とを入れた０．１２５ｌの撹拌ガラス容器に投入した。
【０２１７】
転換は、２０℃、４００ｒｐｍで、底部ディフューザーから絶対圧１ｂａｒの流量０．１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの酸素流を送りながら、実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、７．２５になるように滴定した。
【０２１８】
転換を、逆相カラムＥｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ８ １５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ×５μｍによるＨＰＬＣによって制御した。移動相は、１ｍｌ／ｍｉｎの、１０ｍＭ 硫酸水素テトラブチルアンモニウムと１５ｍＭのリン酸二水素カリウムとを含むｐＨ６．５の３５％メタノールであり、また２６０ｎｍ検出を行う。２．４分で、ＴＴＣが、６．１分で、ＴＴＫが、５．５分で、ＴＴＧが、２．９分で、ＴＴＡが、それぞれ現れた。
【０２１９】
反応混合物から酵素を除いた代表サンプルを採取した。得られた結果を、全β−ラクタムに対する百分率で、下記の表に示す。
【０２２０】
【表１７】
【０２２１】
残留ＴＴＫの割合が３％よりも小さくなったとき、反応を停止させた。反応溶液は、ＨＰＬＣ純度８８．６９％のＴＴＡを含んでいた。
【０２２２】
本発明は、前記実施形態に限定されるものではなく、前記実施形態は細部においては変更することができる。

Claims (65)

1. セファロスポラン酸誘導体を製造する方法であって、
   式ＩＩＩの３−チオール化セファロスポリンＣ化合物
   を、式ＩＶの３−チオール化−α−ケトアジピル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体
   に、酵素によって、転換するステップから成り、
   ここで、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を有する複素環基である、
   ことを特徴とする方法。
2. 式ＩＩＩの化合物が、固定化酵素系によって、式ＩＶの化合物に、酵素転換されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 酵素系が同時固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよびカタラーゼから成ることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 酵素による転換が、分子酸素の存在下で、絶対圧１〜５ｂａｒ、ｐＨ６．５〜８．０、温度１５〜３０℃において、３０〜１８０分の時間にわたって、実施されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 反応混合物から、酵素系を、好ましくはろ過によって、分離するステップを含むことを特徴とする請求項１から４の中のいずれか１つに記載の方法。
6. 式ＩＶの化合物を精製するステップを含むことを特徴とする請求項１から５の中のいずれか１つに記載の方法。
7. 式ＩＶの化合物が吸着カラムを用いて精製されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. 酵素が、適当な架橋剤により、固体担体に同時固定化されることを特徴とする請求項１から７の中のいずれか１つに記載の方法。
9. 酵素が、生体触媒としての使用に適した寸法の結晶の形であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 酵素プロセスが、酵素を基質水溶液中に分散維持して実施されることを特徴とする請求項１から９の中のいずれか１つに記載の方法。
11. 酵素プロセスが、カラム中で実施されることを特徴とする請求項１から１０の中のいずれか１つに記載の方法。
12. 酵素を再使用のために回収するステップを含むことを特徴とする請求項１から１１の中のいずれか１つに記載の方法。
13. 式IVの化合物が、有用な誘導体を得るための連続プロセスにおいて、精製なしで使用されることを特徴とする請求項１から１２の中のいずれか１つに記載の方法。
14. Ｒが、少なくとも一つの窒素原子と随意の一つのイオウまたは酸素原子とを有する複素環基であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
15. Ｒが、チエニル、ジアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、またはこれらの任意の誘導体、好ましくは５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル、１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル、もしくは１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イルから成るグループの一つ以上から選択される複素環基であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 請求項１から１５の中のいずれか１つに記載の方法によって製造されることを特徴とする式ＩＶの３−チオール化−α−ケトアジピル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体。
17. 式
    を有する、すなわち、式ＩＶにおいて、Ｒが１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イルであることを特徴とする化合物。
18. 式
    を有する、すなわち、式ＩＶにおいて、Ｒが１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イルであることを特徴とする化合物。
19. セファロスポリンＣ抗生物質の製造のための方法での中間体としての式ＩＶの化合物の使用。
20. セファロスポリンＣ抗生物質の製造のための方法における、式
    を有する、すなわち、式ＩＶにおいて、Ｒが５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イルである中間体化合物の使用。
21. 請求項１から１８の中のいずれか１つに記載の、セファロスポラン酸誘導体を製造する方法であって、
    式ＩＶの化合物を酵素によって転換させて、式Ｉの化合物
    を生成させるステップを含み、
    式Ｉにおいて、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基であり、Ｒ₁とＲ₂が両方とも水素原子であるか、またはこれらの一つが水素原子であり、他がアシルドナーである、
    ことを特徴とする方法。
22. 式ＩＶの化合物が、グルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼを用いて、酵素転換させられて、式Ｉの化合物が生成されることを特徴とする請求項２１に記載の
    方法。
23. 酵素による処理が、温度約２０℃、ｐＨ６．５〜８．０で実施されることを特徴とする請求項２１または２２に記載の方法。
24. 酵素が、適当な架橋剤によって適当な固体担体に固定化されることを特徴とする請求項２１から２３の中のいずれか１つに記載の方法。
25. 酵素が、生体触媒としての使用に適した寸法の結晶の形であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
26. 酵素による処理が、該酵素を基質水溶液中に分散維持して実施されることを特徴とする請求項２１から２５の中のいずれか１つに記載の方法。
27. 酵素プロセスがカラム中で実施されることを特徴とする請求項２１から２６の中のいずれか１つに記載の方法。
28. 再使用のために酵素を回収するステップを含むことを特徴とする請求項２１から２７の中のいずれか１つに記載の方法。
29. セファロスポリンＣ誘導体の製造のための方法における中間体としての式Ｉ
    の化合物の使用。
30. ３−チオール化セファロスポラン酸誘導体を製造する方法であって、
    式ＩＩＩの化合物
    を、式ＩＶの３−チオール化−α−ケトアジピル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体
    に、酵素によって転換させ、
    式ＩＶの化合物を酵素によって転換させて、式Ｉの３−チオール化７−ＡＣＡ
    化合物
    を生成させる、
    各ステップから成り、
    前記各式において、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基であり、Ｒ₁とＲ₂が両方とも水素原子であるか、またはこれらの一つが水素原子であり、他がアシルドナーである、
    ことを特徴とする方法。
31. 式ＩＩＩの化合物が、固定化酵素系によって、一つのステップで式Ｉの化合
    物に酵素転換されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
32. 酵素系が、固定化グルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼの存在下の同時固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼという組合せから成ることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
33. 酵素による処理が、温度約２０℃、ｐＨ６．５〜８．０で実施されることを特徴とする請求項３０から３２の中のいずれか１つに記載の方法。
34. 酵素が、適当な架橋剤によって適当な固体担体に同時固定化されることを特徴とする請求項３０から３３の中のいずれか１つに記載の方法。
35. 酵素が、生体触媒としての使用に適した寸法の結晶の形であることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
36. 酵素プロセスが、該酵素を基質水溶液中に分散維持して実施されることを特徴とする請求項３０から３５の中のいずれか１つに記載の方法。
37. 酵素プロセスがカラム中で実施されることを特徴とする請求項３０から３６の中のいずれか１つに記載の方法。
38. 再使用のために酵素を回収するステップを含むことを特徴とする請求項３０から３７の中のいずれか１つに記載の方法。
39. 式ＩＩＩの化合物が、有用な誘導体を得るための連続プロセスにおいて、精製なしで使用されることを特徴とする請求項３０から３８の中のいずれか１つに記載の方法。
40. セファロスポラン酸誘導体を製造する方法であって、
    セファロスポリンＣを、一般式ＩＩのチオール化合物
    Ｒ−ＳＨ ＩＩ
    と反応させて、式ＩＩＩの３−チオール化セファロスポリン化合物
    を生成させ、
    式ＩＩＩの化合物の生成後に、過剰な式ＩＩのチオールを除去する、
    各ステップから成り、
    前記各式において、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を有する複素環基である、
    ことを特徴とする方法。
41. 過剰なチオールが陰イオン交換樹脂への吸着によって除去されることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
42. 陰イオン交換樹脂が架橋アクリルコポリマー構造を有する微孔質樹脂であることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
43. 陰イオン交換樹脂が８％の架橋結合を含むチアルキルベンジルアンモニウム官能基から成ることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
44. 樹脂が、クロリド、ヒドロキシ、ホスフェート、またはアセテートサイクル内にあることを特徴とする請求項４１または４２に記載の方法。
45. 過剰なチオールが結晶化によって除去されることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
46. 結晶化が酸性ｐＨで実施されることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
47. 過剰なチオールが、結晶化とそれに続く陰イオン交換樹脂による吸着とによって除去されることを特徴とする請求項４０から４６の中のいずれか１つに記載の方法。
48. セファロスポリンＣが水性媒質中にあることを特徴とする請求項４０から４７の中のいずれか１つに記載の方法。
49. セファロスポリンＣがセファロスポリンＣ濃厚溶液の形であることを特徴とする請求項４０から４８の中のいずれか１つに記載の方法。
50. 反応が、ｐＨ５．５〜８．０、温度６０〜８０℃で、１〜８時間にわたって実施されることを特徴とする請求項４０から４９の中のいずれか１つに記載の方法。
51. 反応が、ｐＨ約６．０、温度約６５℃で実施されることを特徴とする請求項４０から５０の中のいずれか１つに記載の方法。
52. チオール化合物が１〜５ｍｏｌ／（１ｍｏｌのセファロスポリンＣ）の量だけ存在することを特徴とする請求項４０から５１の中のいずれか１つに記載の方法。
53. Ｒが少なくとも一つの窒素原子と随意の一つのイオウまたは酸素原子とを含む複素環基であることを特徴とする請求項４０から５２の中のいずれか１つに記載の方法。
54. Ｒが、チエニル、ジアゾリル、チアゾリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、トリアジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、またはこれらの誘導体、好ましくは５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル、１−メチル−テトラゾル−５−イル、もしくは１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イルの一つ以上から選択される複素環基であることを特徴とする請求項４０から５３の中のいずれか１つに記載の方法。
55. 式ＩＩＩの化合物
    であって、
    請求項４０から５４の中のいずれか１つに記載の方法によって得られる、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基である、
    ことを特徴とする化合物。
56. 式
    の化合物、すなわち式ＩＩＩにおいて、Ｒが５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イルであることを特徴とする化合物。
57. 式
    の化合物、すなわち式ＩＩＩにおいて、Ｒが１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−チアジン−３−イルであることを特徴とする化合物。
58. セファロスポリンＣ誘導体の製造のための方法における中間体としての式ＩＩＩの化合物の使用。
59. セファロスポラン酸誘導体を製造する方法であって、
    請求項４０から５４の中のいずれか１つに記載の方法によって得られる、式ＩＩＩの３−チオール化セファロスポリンＣ化合物
    を、式ＩＶの３−チオール化−α−ケトアジピル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体
    に、酵素によって、転換するステップから成り、
    ここで、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を有する複素環基である、
    ことを特徴とする方法。
60. 式ＩＶの３−チオール化α−ケトアジピル７−ＡＣＡ化合物
    を酵素によって転換させて、式Ｉの３−チオール化７−ＡＣＡ化合物
    を生成させるステップを含み、
    前記各式において、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基であり、Ｒ₁とＲ₂が両方とも水素原子であるか、またはこれらの一つが水素原子であり、他がアシルドナーである、
    ことを特徴とする請求項５９に記載の方法。
61. セファロスポラン酸誘導体を製造する方法であって、
    式ＩＶの化合物
    を酵素によって転換させて、式Ｉの化合物
    を生成させるステップを含み、
    前記各式において、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基であり、Ｒ₁とＲ₂が両方とも水素原子であるか、またはこれらの一つが水素原子であり、他がアシルドナーである、
    ことを特徴とする方法。
62. 式ＩＶの化合物をグルタリル−７−ＡＣＡ アシラーゼによって酵素転換させて式Ｉの化合物を生成させることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
63. 式Ｉ、ＩＩＩ、およびＩＶの化合物が、固体の形であるか、または該化合物の
    非毒性塩の形であることを特徴とする請求項１から６２の中のいずれか１つに記載の方法。
64. セファロスポリンＣ抗生物質およびその誘導体を製造する方法であって、
    請求項１から６３の中のいずれか１つに定められている式ＩＩＩ、ＩＶ、およびＩの化合物を生成させ、
    そのあと、該化合物を酵素処理する、
    ことから成ることを特徴とする方法。
65. 抗生物質が、セファゾリン、セファゼドン、セフォペラゾン、セファマンドール、セファトリアジン、セフォティアム、およびセフトリアクソンであることを特徴とする請求項６４に記載の方法。