DE69119216T2

DE69119216T2 - Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporinsäure und Derivate

Info

Publication number: DE69119216T2
Application number: DE69119216T
Authority: DE
Inventors: Stefano Cambiaghi; Sergio Tomaselli; Roberto Verga
Original assignee: Antibioticos SpA
Current assignee: Olon SpA
Priority date: 1990-12-21
Filing date: 1991-12-18
Publication date: 1996-09-05
Anticipated expiration: 2011-12-19
Also published as: JP2851021B2; JPH05211890A; EP0496993B1; IT9022514A0; US5424196A; IT1252308B; IE914462A1; KR920012454A; CA2058216C; CA2058216A1; KR0180934B1; DE69119216D1; EP0496993A1; IE75201B1; ES2086470T3; IT9022514A1; ATE137535T1

Description

ERFINDUNGSGEBIET

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zu einer enzymatischen Herstellung von 7-Aminocephalosporansäuren oder Derivaten des Cephalosporin C oder seinen Derivaten. Insbesondere betrifft das Verfahren eine Umwandlung des Cephalosporin C oder seinen Derivaten und Salzen zu 7-Aminocephalosporansäure oder ihren Derivaten in einem zweistufigen enzymatischen Prozeß mit auf einer festen Matrix immobilisierten Enzymen. 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) ist bekanntermaßen eine wichtige Zwischenstufe bei der Herstellung von Antibiotika der Cephalosporinfamilie.
Die Umsetzung von Cephalosporin C zu 7-ACA ist seit einiger Zeit bekannt und kann entweder in einem chemischen Hydrolyseverfahren (siehe belgisches Patent 615955) oder in einem enzymatischen Verfahren durchgeführt werden. Das chemische Verfahren beinhaltet die Verwendung von sehr toxischen und schädlichen Reaktanten (chlorierte Lösungsmittel, Chlorsilane, Dimethylanilin) und strenge Verfahrensbedingungen (sehr niedrige Temperaturen von -50ºC).
Die bekannten enzymatischen Verfahren kann man in zwei Gruppen einteilen, nämlich in jene, bei dem man den Prozeß in einem einzigen Schritt unter Verwendung eines Enzyms in der Form einer bei Cephalosporin C aktiven Acylase, die man beispielsweise aus einer Pseudomonas-Kultur (EP 275901) erhält, durchführt, und in jene, die in zwei Stufen durchgeführt werden.
In letzterem Verfahren umfaßt die erste Stufe die enzymatische Umsetzung von Cephalosporin C zu Glutaryl-7-aminocephalosporansäure unter Einsatz von D-Aminosäureoxidase (DAO; EC-1.4.3.3), die man aus Kulturen verschiedener Mikroorganismen wie Trigonopsis variabilis, Aspergillus, Penicillium, Neurospora, Pseudomonas, Cephalosporium erhält, wie dies in den Patenten BE 736934, DT 2219454, FR 2133927, JP 52.125696 und JP 52.128295 beschrieben ist.
In der zweiten Stufe hydrolysiert man das zuvor beschriebene Glutarylderivat zu 7-ACA mittels einer spezifischen Acylase, die man aus Comamonas, Pseudomonas (GB 1 490 634) oder Arthrobacter (JP 52.128293) Bakteriumkulturen erhält.
Gegenüber den bekannten zweistufigen Verfahren bedeutet das erfindungsgemäße Verfahren einen innovativen technischen Fortschritt angesichts der beträchtlichen Ausbeuten, die man erhält. Dieser Vorteil wird erzielt durch die Übernahme besonderer Hilfsmittel und Verfahrensbedingungen und durch die Verwendung von hoch-selektiven, gereinigten und auf festen, im Reaktionsmedium unlöslichen Matrizen immobilisierten Enzymen.
Das Verfahren kann wie folgt beschrieben werden: ERSTE STUFE: immobilisiertes DAO Sauerstoff ZWEITER SCHRITT: Gl-7-ACA-Acylase
worin R -OCOCH&sub3;, -H, -OH, -OCONH&sub2; ist.

ERFINDUNGSGEMÄSSES VERFAHREN

Erfindungsgemäß werden bei der enzymatischen Umsetzung keine Enzyme in der Form einer Zellmasse oder wäßrigen Lösung eingesetzt, sondern man transformiert anstelle dessen die Enzyme in eine immobilisierte feste Form, die im wäßrigen Medium unlöslich ist, und sich besonders für die industrielle Umsetzung von Cephalosporin C zu 7-Aminocephalosporansäure (R = -OCOCH&sub3;) eignet.
In folge der Unlöslichkeit im Reaktionsmedium haben immobilisierte Enzyme den Vorteil, sich leicht aus dem Reaktionsmedium rückgewinnen zu lassen und mehrfach verwendbar zu sein, wobei dies eine notwendige und unverzichtbare Bedingung für ein industrielles Verfahren ist.
Ein weiterer wichtiger industrieller Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, daß die leichte Rückgewinnbarkeit des Enzyms aus der Reaktionsmasse nicht nur die Rückgewinnung des Endprodukts vereinfacht, sondern es auch ermöglicht, die Reaktionslösung, die in der ersten Stufe erhalten wird, direkt in die zweite Stufe einzusetzen. Diese Vorteile ermöglichen es daher, das Verfahren kontinuierlich mit einem einzigen Flüssigkeitsstrom von einer enzymatischen Stufe zur anderen durchzuführen.

ERSTE STUFE: OXIDATIVE DEAMINIERUNG ZU GLUTARYLDERIVAT

Die erste Verfahrensstufe in der erfindungsgemäßen Umsetzung der Cephalosporanverbindung (I) beruht auf der Verwendung einer besonders spezifischen D-Aminosäureoxidase (DAO) zur oxidativen Deaminierung der D-Aminoadipinkette.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Enzym wird aus Rhodotorula gracilis ATCC 26217 Kulturen erhalten.
Man isoliert das Enzym aus einer durch Fermentation erhaltenen Kultur, reinigt es von störenden Enzymen und unterzieht es einem Immobilisierungsverfahren, um eine in einem wäßrigen Medium unlösliche Form zu erhalten und seine Stabilität zu erhöhen.
Man führt die enzymatische Umsetzung der Verbindung (I) zum Glutarylderivat (II) in einer wäßrigen Lösung durch, wobei man unter Zugabe basischer Reagenzien einen geeigneten pH-Wert aufrechterhält.
Der pH kann von 7 bis 8,5 variieren. Wegen der Instabilität von Cephalosporanverbindungen im alkalischen Milieu ist es jedoch vorzuziehen beim pH 7,5 zu arbeiten. Die Reaktionstemperatur kann von 20 bis 30ºC variieren und beträgt normalerweise 25ºC.
Die enzymatische Umsetzung muß in Gegenwart von Luft oder Sauerstoff ausgeführt werden, indem man diese Gase in die wäßrige Lösung einleitet. Der Gasfluß kann von 0,5 bis 1 Volumen/Lösungsvolumen/min variieren.
Die Konzentration des anfänglichen Substrats (I) kann von 20 bis 100 g/l variieren. Im Sonderfall des Cephalosporin C kann man das kristallisierte Natrium- oder Kaliumsalz verwenden, oder man macht alternativ direkten Gebrauch von den gereinigten Lösungen, wie man sie aus der Rückgewinnung der Fermentationsbrühe vor dem abschließenden Kristallisationsschritt erhält.
Man verwendet das erfindungsgemäße immobilisierte Enzym in feiner granularer Form und hält es durch mechanisches Rühren oder mit Hilfe eines Luft- oder Sauerstofftstroms in Suspension. Alternativ kann man die Umsetzung in einem kontinuierlichen Verfahren durchführen, indem man eine Perkolationsäule mit dem immobilisierten Enzym belädt und eine mit Sauerstoff gesättigte Substratlösung bei einem Konstanten pH von 7,5 hindurchleitet.
Abhängig von den Verfahrensbedingungen liegt die zur vollständigen Umwandlung benötigte Zeit in der Größenordnung von 0,5 bis 3 Stunden. Die Ausbeute bei der Umsetzung zum Glutarylderivat ist hoch und beträgt normalerweise um die 90 %. Nach Abschluß der Reaktion enthält das Produkt noch etwas 5-Ketoadipyl-7-aminocephaosporansäure (IV):
die nicht zum gewünschten Glutarylderivat (II) umgesetzt wurde, worin R -OCOCH&sub3;, -H, -OH, -OCONH&sub2; ist.
Man kann dieses Ketoadipylderivat (IV) erfindungsgemäß weiter zum Glutarylderivat (II) umsetzen, indem man zu der wäßrigen Reaktionslösung nach der Abtrennung des immobilisierten DAO-Enzyms eine bezüglich der zu transformierenden Verbindung stöchiometrische Menge an H&sub2;O&sub2; gibt, und diese bei einer Temperatur von 20 bis 25ºC über einen Zeitraum von zwischen 10 und 15 Minuten reagieren läßt. Um die Reaktionszeit zu verringern kann man einen Überschuß an H&sub2;O&sub2; verwenden. Der H&sub2;O&sub2;-Überschuß wird dann mit mittels eines geeigneten Reduktionsmittels wie Brenztraubensäure oder ihren Salzen oder alkalischen Sulfiten eliminiert, bevor man zur nächsten Stufe übergeht.
Die praktisch vollständige Eliminierung der Verbindung (IV) führt nicht nur zu einer abschließenden Ausbeute von ungefähr 95 % Glutarylderivat, sondern bedeutet auch einen großen Vorteil für die nachfolgende enzymatische Hydrolyse. Bei dieser hydrolysiert Gl-7-ACA-Acylase spezifisch Glutarylderivate, wobei die Ketoadipylderivate (IV) nicht erkannt werden und dann als unerwünschte Verunreinigung im Endprodukt zurückbleiben.
Wie bereits erwähnt, ist ein Aspekt der Erfindung die Verwendung eines von Rhodotorula gracilis ATCC 26217 produzierten DAO-Enzyms. Dieses ist ein FAD-abhängiges Enzym (Flavoprotein) endozellulärer Natur wie jenes, das man von Trigonopsis variabilis, der in der technischen Literatur am häufigsten zitierten Quelle, erhalten kann. Die von Rhodotorula gracilis produzierte DAO ist jedoch durch eine stabilere Bindung zum FAD gekennzeichnet, wie man an der niedrigen Dissoziationskonstante, d. h. 2,2 x 10&supmin;&sup8; M erkennt.
Die von Rhodotorula gracilis produzierte DAO unterscheidet sich nicht nur in den physiko-chemischen Eigenschaften des enzymatischen Proteins, sondern auch im Inhibitorsatz und der Spezifität, bei als Substrat eingesetzten D-Aminosäuren erheblich [Pilone Simonetta M. et al., Eur. J. Biochem., 180, 199 (1989); Kubicek-Pranz E.M. et al., J. of Appl. Biochem., 7, 104 (1985)].
Insbesondere weist die DAO von Rhodotorula gracilis eine exzellente Spezifität für Cephalosporin C mit Km- und Vmax-Werten, die denen sehr ähnlich sind, die man beim D-Alanin antrifft, welches das spezifische Substrat für dieses Enzym ist.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es das D-Aminosäureoxidase-Enzym aus Rhodotorula gracilis Kulturen durch eine einfache Säulenfraktionierung in gereinigter Form und praktisch frei von Katalase, Esterase und β-Lactamase zu erhalten, d. h. frei von den Enzymen, die normalerweise in rohen DAO-Lösungen zugegen sind, und die bei der enzymatischen Umwandlung von Cephalosporin C zu Glutaryl-7-aminocephalosporansäure dadurch stören, daß:
- Katalase die H&sub2;O&sub2;-Aktivität zerstört mit der Folge, daß die Decarboxylierung blockiert und die Reaktion zu Ketoadipylderivaten gestoppt wird;
- Esterase in Verbindungen des Typs (I), in denen R = OCOCH&sub3; zu der Bildung von unerwünschten Desacetylderivaten führt.;
- β-Lactamase, den β-Lactamring unter Zerstörung der Cephalosporanstruktur hydrolysiert.
Die auf diese Weise erhaltenen DAO-Lösungen sind daher hinsichtlich Reinheit und katalytischer Funktionalität wertvoll, sind aber, wie im Falle aller DAOs, in Lösung nicht sehr stabil und sind in dieser Form von geringem industriellem Interesse. Die erfindungsgemäß erhaltenen immobilisierten Formen weisen jedoch eine sehr hohe Stabilität auf und sind bei der Herstellung von Glutaryl-7-aminocephalosporansäure von industriellem Wert.
In diesem Zusammenhang soll auf das Stabilitätsdiagramm für immobilisiertes DAO in Fig. 1 im Vergleich zu dem der Fig. 2 für das Enzym in wäßriger Lösung verwiesen werden.
Das erfindungsgemäß immobilisierte DAO behält darüber hinaus eine hohe Aktivität unter den Verfahrensbedingungen der oxidativen Deaminierung von Cephalosporin C oder seinen Derivaten über einen langen Zeitraum und daher für eine Vielzahl von Durchgängen bei. In diesem Zusammenhang sollte man auf das Diagramm der Fig. 3 Bezug nehmen, das die Aktivität (als Prozentsatz der Anfangsaktivität) aufgetragen gegen Stundeneinsatz im enzymatischen Verfahren bei 25ºC und einem pH von 7,5 zeigt.
Die Verwendung des erfindungsgemäß von Rhodotorula gracilis erhaltenen DAO-Enzyms in gereinigter Form ist daher wesentlich für den Erhalt von Glutaryl-7-aminocephalosporansäurelösungen, die sich insbesondere zum Einsatz als solche ohne weitere Reinigung im nachfolgenden enzymatischen Verfahren in Gegenwart von Acylase eignen.
Die Herstellung des für die erste Stufe der vorliegenden Erfindung erforderlichen immobilisierten Enzyms beruht im wesentlichen auf den folgenden Verfahrensschritten:
1 - Fermentierung, um Rhodotorula gracilis ATCC 26217 Zellen zu produzieren;
2 - Extraktion und Reinigung des D-Aminosäureoxidase-Enzyms aus den Rhodotorula gracilis Zellen;
3 - Immobilisierung der D-Aminosäureoxidase auf wasserunlöslichen festen Matrizes;

1 - FERMENTIERUNG VON RHODOTORULA GRACILIS ATCC 26217

Rhodotorula gracilis wird in einer aeroben Fermentierung kultiviert. Die Bestandteile der Kulturlösung sind im allgemeinen jene, die man zur Hefenproduktion verwendet, wobei man Stickstoffquellen wie D- und DL-Aminosäuren, Peptonen, Hefenextrakten, Maislaugen (corn steep liquor), etc.; Kohlenstoffquellen wie Glucose, Saccharose, Maltose und Rüben- und Zuckerrohrmolassen; und Mineralsalze wie Natriumchlorid, Kalziumchlorid, Zinksulfat, Magnesiumsulfat, etc. umsetzt. Eine besonders geeignete Kulturflüssigkeit zur Produktion von Rhodotorula gracilis Zellen, mit einem hohen DAO- Enzymgehalt hat die folgenden Zusammensetzungsgrenzen:
NaCl 0,5 - 1 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 1 - 2 g/l
MgSO&sub4; 0,5 - 1 g/l
CaCl&sub2; 0,2 - 0,3 g/l
ZnSO&sub4; 0,001 - 0,002 g/l
FeCl&sub3; 0,002 - 0,003 g/l
Maislauge (corn steep liquor) 0,5 - 1 g/l
Glucose (oder Maltose) 20 - 30 g/l
D-Alanin (oder DL-Alanain) 4 - 8 g/l
Man führt die Fermentierung aus, indem man das Medium bei 120ºC sterilisiert und auf 30ºC abkühlt, und dann das Okulum in der Form einer vegetativen Kultur von Rhodotorula gracilis zugibt. Man rührt die Kultur bei 24 bis 32ºC und belüftet sie bei einem auf eine Rate von 0,5 bis 1 Volumina/Flüssigkeitsvolumen/min eingestellten Luftstrom. Durch die Zugabe nicht- stickstoffhaltiger Basen wird der pH des Mediums zwischen 4 und 6,5, vorzugsweise bei 5 gehalten. Die Dauer der Fermentierung kann von 24 bis 48 Stunden variieren, abhängig von Verfahrensbedinungen wie Zusammensetzung des Kulturmediums, Rühren und Temperatur.

2 - EXTRAKTION UND REINIGUNG

Die aus Rhodotorula gracilis erhaltene D-Aminosäureoxidase ist ein endozelluläres Enzym.
Nach Beendigung der Fermentierung wird die Kulturflüssigkeit daher zentrifugiert, um den stofflichen Anteil abzutrennen und zurückzugewinnen.
Die Zellpaste wird erneut in Wasser suspendiert, auf einen pH von 6 bis 9 (vorzugsweise 8) durch die Zugabe von NaOH gebracht und mit physikalischen Mitteln (Schalleinwirkung) oder durch eine chemische Behandlung (Zugabe von Tensiden und nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln) einer Lysis unterzogen.
Ein bevorzugtes Verfahren ist es, die Zellpaste in einem bei pH 8 gepufferten Medium (vorzugsweise Phosphatpuffer unter Zugabe kleiner Mengen eines alkalischen Bisulphits und eines kationischen Tensids wie Cetylpyridiniumchlorid) zu resuspendieren und die Suspension mehrfach durch eine Presse bei 500 bar oder durch eine Kugelmühle zu führen.
Das Zellysat wird dann aufgeflockt, durch Zentrifugieren geklärt, durch Ultrafiltration konzentriert und durch Zugabe von Ammoniumsulfat ausgesalzt. Der ausgesalzte Niederschlag, der D-Aminosäureoxidase enthält, wird mittels Filtration abgetrennt und in einer Pufferlösung bei pH 8 resuspendiert.
Auf diese Weise erhält man eine Lösung die aus Rohenzym mit geringen Begleitanteilen störender Enzyme, d. h. Katalase, Esterase und β-Lactamase besteht. Das Rohenzym wird dann mittels bekannter Verfahren gereinigt.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Reinigung des so erhaltenen Enzyms ist die chromatographische Fraktionierung in einer Säule mit einem Ionenaustauscherharz, das die Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppe als ionisierbare Funktion aufweist, wie beispielsweise Sepharose (Pharmacia), Trisacryl (IBF), Toyoperl (Toso Haas) mit 25 mM Phosphatpuffer des pHs 8.
Die störenden Enzyme, insbesondere die Esterase, werden von dem Harz der Säule zurückgehalten, während die somit gereinigte DAO direkt ins Eluat übergeht.
Man erhält auf diese Weise ein Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 15 bis 20 U/mg des Proteins, frei von unerwünschter katalytischer Aktivität. Die so gereinigte DAO ist bei 4ºC 6 Tage und bei -20 C mindestens 6 Monate stabil und kann direkt im Immobilisierungsverfahren eingesetzt werden.

3 - IMMOBILISIERUNG DER D-AMINOSÄUREOXIDASE

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, die D-Aminosäureoxidase auf festen Trägern, im allgemeinen kommerziellen Ionenaustauscherharzen zu immobilisieren.
Die Immobilisierung von Enzymen auf Ionenaustauschharzen ist seit langem bekannt, ist jedoch nie für die von Rhodotorula gracilis produzierte DAO beschrieben oder untersucht worden.
Folgende Matrices werden in der vorliegenden Erfindung verwendet:
- stark basische Harze einer makroretikularen Polystyrolstruktur mit quartärer Aminfunktion wie z. B. Amberlite IRA 900 (Röhm und Haas);
- schwach-basische Harze einer makroretikularen Polystyrolstruktur mit primärer Aminofunktion wie z. B. Duolite A 365 (Röhm und Haas);
- Harze mittlerer Basizität mit polykondensierter Phenolformaldehydstruktur mit sekundärem und tertiärem Amin als funktionellen Gruppen wie z. B. Duolite A 568 oder Duolite A 7 (Röhm und Haas);
Gemäß der vorliegenden Erfindung puffert man diese Harztypen bei pH 6 bis 9, vorzugsweise bei pH 8 mit 0,1 M Phosphatpuffer. Zum gepufferten Harz gibt die Lösung eines bifunktionellen Agens, das in der Lage ist Crosslinks zwischen dem enzymatischen Protein und der funktionalisierten Matrix auszubilden. Geeignete bifunktionelle Agenzien sind aliphatische Dialdehyde wie Glutaraldehyd und Malonaldehyd. Normalerweise verwendet man eine Glutaraldehydlösung in einem Phsophatpuffer mit dem pH 7 bis 9, im allgemeinen 8, bei einer Konzentration von 1 bis 4 %, im allgemeinen 2 %. Nach 15 bis 60 Minuten bei einer Temperatur von zwischen 4ºC und 30ºC, vorzugsweise 30 Minuten bei 20ºC trennt man die überstehende Flüssigkeit durch Dekantieren ab und gibt die DAO-Enzymlösung mit einem pH von 6 bis 9, vorzugsweise 8, in 25 mM Phosphatpuffer zu dem feuchten Harz. Nach einer Kontaktzeit von 2 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von 4 bis 20ºC, normaleweise 12 Stunden bei 4ºC, trennt man das Harz mit dem immobilisierten Enzym durch Filtrieren ab.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Immobilisierung von DAO auf:
- Matrices mit Polyacrylstruktur und insbesondere mit terminalen Epoxidgruppen wie z. B. Eupergit C (Röhm-Pharma);
- anorganische Matrices wie poröses Aluminiumoxid, das mit einem Komplex aus Polyethylenimin und Glutaraldehyd imprägniert wird, wie z. B. UOP IPS-200 (UOP-USA).
Die Tabelle 1 zeigt die Charakteristika der erfindungsgemäß verwendeten Matrizen, ihre Bindungskapazität und die Aktivität des immobilisierten DAOs.
Für jede Matrix werden drei Immobilisierungstests aufgeführt, die mit zunehmender Enzymmenge durchgeführt wurden, um vollständige Sättigung des Trägers zu erreichen. Bei gesättigtem Träger liegt die beste Aktivität nach der Bindung in der Größenordnung von 50 bis 75 U/g (feucht).
Normalerweise werden 200 U pro Gramm feuchtem Träger gebunden, damit die Anbindung vollständig ist, wobei die Aktivität nach dem Binden ca. 40 bis 50 U/g (feucht) ist und die Funktionalität hinsichtlich der Aktivität des immobilisierten Enzyms als Prozentsatz der Aktivität des entsprechenden freien Enzyms 20 bis 30 % beträgt.
Der große Vorteil der immobilisierten DAO ist ihre Stabilität, die es gestattet, sie für mehr als 200 Stunden bei Umwandlung von Cephalosporanverbindungen des Typs (I) zu Glutarylderivaten (II) im enzymatischen Prozeß bei 25ºC, pH 7,5, zu verwenden (siehe Fig. 3).

MESSUNG DER D-AMINOSÄUREOXIDASE (DAO)-AKTIVITÄT

Man bestimmt die Aktivität der D-Aminosäureoxidase über die Messung der H&sub2;O&sub2;-Menge, die bei der Einwirkung des Enzyms auf das Substrat D-Alanin in 100 mM mit Sauerstoff gesättigtem Phosphatpuffer bei pH 7,5 und 37ºC entsteht.
Das H&sub2;O&sub2; wird über die modifizierte Trinder-Reaktion (J. Clin. Path., 22, 246, 1969) unter Verwendung eines Reaktanten auf Peroxidbasis, 4-Aminophenazon und 2,4-Dichlorophenolsulfonat kinetisch bestimmt. Die sich bildende rote Farbe (Chinonimin) ist proportional zu dem im Test entwickelten Peroxid und wird spektrophotometrisch bei 510 nm gemessen.
Eine Einheit D-Aminosäureoxidase ist die Enzymmenge (frei oder immobilisiert), die unter den im Verfahren verwendeten Bedingungen 1 µmol H&sub2;O&sub2; pro Minute produziert.

MESSUNG DES PROTEINS

Der Proteingehalt der enzymatischen Lösungen wird spektrophotometrisch nach dem Bradford-Verfahren gemessen (Anal. Biochm. 72, 248, 1976), wobei Coomassie Brilliant Blue G250 gegenüber der Standard-Rinderalbuminkurve verwendet wird.

ZWEITE STUFE: DEACYLIERUNG DES GLUTARYLDERIVATS

Die zweite Stufe bei der Umwandlung von Cephalosporin C oder seinen Derivaten und Salzen zu 7-Aminocephalosporansäure oder ihren Derivaten, beruht auf der Verwendung einer spezifischen immobilisierten Acylase, um die Deacylierung des Glutarylderivats (II) zu katalysieren.
Dieses Enzym, was im folgenden als Gl-7-ACA-Acylase (Glutaryl-7-ACA- Acylase) bezeichnet wird, wird von Kulturen gentechnisch hergestellter Mikroorganismen produziert, die man von nicht-β-Lactamase-produzierenden Escherichia coli Kollektionsstämmen erhält, in welche das Gl-7-ACA-Acylasegen, das aus irgendeinem Mikroorganismus der Acinetobacter-Spezies, dem Produzent des Enzyms, isoliert wurde, geklont wurde.
Die Gewinnung dieser Mikroorganismen über die rekombinante DNA-Technik ist der Gegenstand der spanischen Patentanmeldung Nr. 9002109 vom 3. August 1990 im Namen der Antibioticos S.A., die mit der Anmelderin der vorliegenden Patentanmeldung Antibioticos S.p.A. vergesellschaftet ist. Zur Produktion von Gl-7-ACA-Acylase besonders geeignete Mikroorganismen sind: E. Coli ATCC 9637 (p JC 200) und E. Coli P-3 (p JC 200), Registriernummer NCIMB 40433, jeweils Abkömmlinge von E. Coli ATCC 9637 und E. Coli P-3, Reg. NCIBM Nr. 40432, in welche das Gl-7-ACA-Acylasegen, das man beispielsweise aus dem Mikroorganismus Acinetobacter ATCC 53891, dem Produzenten dieses Enzyms, erhält, geklont wurde.
Die Optimierung der Fermentierungsbedingungen mit diesem Mikroorganismus hat es ermöglicht, eine hohe Produktivität von Gl-7-ACA-Acylase ohne β- Lactamase und mit nur geringen Mengen an Esterase zu erhalten.
Die Gl-7-ACA-Acylase wird erfindungsgemäß mittels Säulenchromatographie von der Esterase gereinigt, und das gereinigte Enzym auf festen Matrices immobilisiert.
Die enzymatische Reaktion kann wie folgt schematisch dargestellt werden: immobilisierte Gl-7-ACA-Acylase
worin R -OCOCH&sub3;, -H, -OH, -OCONH&sub2; ist.
In dieser zweiten Stufe verwendet man die wäßrige Lösung des Glutarylderivats (II), das man in der ersten Stufe erhält, direkt als Substrat, da bei der gegebenen hohen Selektivität im ersten Umwandlungsschritt keine vorangehende Reinigung erforderlich ist.
Die Konzentration des Glutarylderivats (II) in der Lösung kann von 10 bis 30g/l variieren.
Man führt die enzymatische Umwandlung durch, indem man die Lösung des Glutarylderivats (II) mit dem auf dem festen Träger immobilisierten Gl-7- ACA-Acylaseenzym bei einer Betriebstemperatur zwischen 20 und 35ºC in Kontakt bringt. Während des Betriebs wird der pH in der Glutarylderivatlösung zwischen 7 und 9, vorzugsweise bei ungefähr 8, durch die Zugabe von anorganischen oder organischen Basen wie Ammoniumhydroxid, alkalischen Hydroxiden, aliphatischen Aminen sowie Triethylamin oder Pufferlösungen vom alkalischen Phosphattyp gehalten.
Die Dauer der Umwandlung kann von 30 bis 120 Minuten in Abhängigkeit von den Betriebsbedingungen variieren.
Man die kann die enzymatische Umwandlung diskontinuierlich durchführen, indem man das immobilisierte Enzym in der Lösung des Glutarylderivats (II) in Dispersion hält.
Ein bevorzugtes Verfahren ist es, eine Säule (oder mehrere in Serie betriebene Säulen) mit dem Enzymträger zu beladen und die Substratlösung kontinuierlich durch diese zu führen.
Die 7-Aminocephalosporansäure oder ihre Derivate werden von der Reaktionslösung, erhalten durch Kristallisation, abgetrennt, nachdem man in Abhängigkeit vom isoelektrischen Punkt des Endprodukts auf einen sauren pH von 3 bis 3,5 mit anorganischen Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure einstellt.
Eine wichtige Innovation gegenüber dem Stand der Technik besteht darin, daß das Enzym abgesehen davon, daß man es in sehr reiner Form erhält, nicht in Gestalt einer Zellmasse oder wäßrigen Lösung verwendet, sondern es in eine immobilisierte, feste, in wäßrigem Milieu unlösliche Form umwandelt, die sich besonders für die industrielle Umsetzung von Glutaryl- 7-aminocephalosporansäure zu 7-ACA eignet.
Aufgrund der Unlöslichkeit im Reaktionsmedium hat das immobilisierte Enzym den Vorteil, daß man es leicht aus dem Reaktionsmedium rückgewinnen und viele Male verwenden kann, wobei dies eine notwendige und unverzichtbare Bedingung für ein industrielles Verfahren ist.
All diese Vorteile ermöglichen es, das Verfahren entweder absatzweise in einem Rührreaktor mit einem in Suspension gehaltenen Enzym zu betreiben oder mit Festbettsäulen durchzuführen, über die man die in der ersten Stufe direkt erhaltene Glutaryl-7-aminocephalosporansäure kontinuierlich führt.
Ein weiterer wichtiger industrieller Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in der Tatsache, daß die Leichtigkeit, mit der man das Enzym aus der Reaktionsmasse abtrennt, auch die Rückgewinnung des Endprodukts vereinfacht. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der immobilisierten Gl-7-ACA- Acylase erzielt man ferner die folgenden wichtigen Vorteile:
- die hohe Selektivität des immobilisierten Enzyms führt zu hohen Umsätzen und Ausbeuten, im allgemeinen in der Größenordnung von 80 bis 90 %, die zu einem Endprodukt hoher Reinheit führen und somit keine aufwendigen Reinigungsverfahren erforderlich machen;
- im Gegensatz zu Enzymen in der Gestalt einer Zellpaste oder wäßrigen Lösung entläßt das immobilisierte Enzym aufgrund seine Unlöslichkeit keine Verunreinigungen in das Reaktionsmedium, die zur Färbung oder einer Verringerung der Ausbeute des Endprodukts führen könnten.
Die erfindungsgemäße Herstellung der Gl-7-ACA-Acylase, unter Verwendung von Kulturen von mit der rekombinanten DNA-Technik erhaltenen Mikroorganismen, umfaßt die folgenden Arbeitsschritte.
1) Das Klonen des Gens für die Gl-7-ACA-Acylase in nicht-β-Lactamase- produzierenden E. coli, gemäß dem folgenden üblichen Schema:
a) das Herstellen von Plasmiden;
b) das Herstellen des DNA-Donors, der die genetische Information bezüglich der Produktion von Gl-7-ACA-Acylase enthält;
c) das Einfügen der DNA-Donor-Fragmente in die Plasmide des Punkts a);
d) das Selektieren der Trägerplasmide für das Gl-7-ACA-Acylasegen;
e) das Konstruieren des endgültigen Vektors;
f) das Transformieren der nicht-β-Lactamase-produzieren E. coli Stämme mit dem Vektor des Punkts e).

2) FERMENTIERUNG DES IN 1) ERHALTENEN MIKROORGANISMUS

Die geklonten E. coli werden in einer aeroben Fermentierung kultiviert. Man stellt das Medium unter Verwendung von Kohlenstoffquellen wie Glucose, Saccharose, Stärke, etc; Stickstoffquellen wie Aminosäuren, Proteinhydrolysaten, Hefeextrakten, Maislauge (corn steep liquor), Soyamehl; und Mineralsalze wie Natriumchlorid, Kaliumphosphaten, etc. her.
Man führt die Fermentierung durch, nachdem man die Flüssigkeit bei 120ºC sterilisiert und auf 21 bis 28ºC abkühlt, und dann Chloramphenicol in einer Menge von 30 mg/l steril zugibt.
Man gibt die vegetative Kultur des Mikroorganismus zu dem sterilen Chloramphenicol-enthaltenden Medium.
Man belüftet die Kultur, welche bei einer Temperatur von 21 bis 28ºC unter Rühren gehalten wird, indem man Luft mit einer Rate von 0,5 bis 1 Volumen/Flüssigkeitsvolumen/min einleitet.
Eine typische Zusammensetzung des Flüssigmediums im experimentellen Bereich ist beispielsweise folgende:
Natriumglutamat 3 - 8 g/l
KH&sub2;PO&sub4; 0,5 - 1,5 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 3,1 - 8,4 g/l
Kollagenhydrolysat 15 - 15 g/l
Maislauge (corn steep liquor) 1 - 5 g/l
Glucose 10 - 25 g/l
Hefeextrakt 1 - 3 g/l
Chloramphenicol 20 - 40 mg/l
Um 3000 U/l Gl-7-ACA-Acylase zu erhalten, beträgt die Fermentierungszeit in Abhängigkeit von den Arbeitsbedingungen 24 bis 72 Stunden.

3) EXTRAKTION UND REINIGUNG DES Gl-7-ACA-ACYLASEENZYMS

Gl-7-ACA-Acylase ist ein endozelluläres Enzym. Nach der Fermentierung wird die Kulturflüssigkeit zentrifugiert und die Zellen einer chemischen Behandlung (Zugabe von wasserunlöslichen Lösungsmitteln und Tensiden) oder physikalischen Behandlung (Presse oder Kugelmühle) zur Lysis der Zellmembran unterzogen.
Ein bevorzugtes Verfahren ist es, die Zellmasse in einer durch Zugabe von alkalischen Phosphaten bei pH 8 gepufferten wäßrigen Lösung zu resuspendieren und sie dann einer Lysis in einer Manton-Gaulin-Presse bei 500 bis 600 bar zu unterziehen. Durch Zugabe kationischer Polyelektrolyte flockt man das Zellysat aus und rezentrifugiert es dann.
Man reinigt die geklärte Rohenzym-haltige Flüssigkeit durch Ultrafiltration, Aussalzen und Extraktion mit in der wäßrigen Phase unlöslichen Lösungsmitteln.
Eine bevorzugte Technik ist es, die geklärte Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren durch eine Säule, die ein Ionenaustauscherharz mit der Diethylaminoethylgruppe als ionisierbarer Funktion (DEAE-Typ) enthält, direkt zu reinigen.
Ein Chromatographieharz, das sich als sehr effektiv erwiesen hat, ist Sepharose DEAE-Fast-Flow (Pharmacia). Beim Eluieren mit skalaren Mengen von Natriumchlorid kann man die Gl-7-ACA-Acylase in besonders reiner Form, frei von Esterase, erhalten.
Die auf diese Weise erhaltene gereinigte Gl-7-ACA-Acylase ist sehr stabil. Sie zeigt weder nach 10 Tagen bei 25ºC noch nach 1 Monat bei 4ºC (siehe Fig. 4) Aktivitätsverlust.

4) IMMOBILISIERUNG DES Gl-7-ACA-ACYLASEENZYMS

Das Verfahren besteht darin, dieses Enzym auf festen Trägern wie künstlichen Polymeren und anorganischen Materialien, die in dem bei der Umsetzung des Glutarylderivats (II) zu 7-Aminocephalosporansäure (III) verwendeten wäßrigen Milieu unlöslich sind, zu immobilsieren.
Zur Immobilisierung der Acylase geeignete Harze sind solche mit einem makroretikularen stark basischen Polystyrolstrukturtyp wie z. B. Amberlite 900 und Amberlite 904 oder Phenolformaldehydharze mit sekundären oder tertiären Amino-funktionellen Gruppen wie z. B. Duolite A 7 und Duolite A 568.
Erfindungsgemäß bringt man das Enzym in Kontakt mit dem Harz, immobilisierte es darauf und stabilisiert es mit einem bifunktionellen Agens vom Typ aliphatischer Dialdehyd wie z. B. Glutaraldehyd über Cross-Link-Bindungen zwischen dem enzymatischen Protein und der Matrix.
Andere zur Immobilisierung der Acylase geeignete Harze haben einer Polyacrylstruktur, die mit Divinylbenol vernetzt und mit primären Aminogruppen funktionalisiert ist, wie z. B. Duolite A 365. Man hat Gl-7-ACA-Acylase auch auf Acrylharzen mit Epoxiden als funktionellen Gruppen wie z. B. Eupergit C (Röhm Pharma) oder auf anorganischen Trägern wie Aluminiumoxid und insbesondere mit einem Polyethylenimin/Glutaraldehydkomplex imprägnierten Aluminiumoxid wie z. B. UOP IPS-200 (UOP-USA) immobilisiert.
Tabelle 2 zeigt die Hauptcharakteristika der verwendeten Matrices und die entsprechenden Immobilisierungskennwerte.
In dem gewählten Bereich von 10 bis 20 U Enzym pro Gramm feuchter Träger ist die Anbindung praktisch vollständig und die Funktionalität des immobilisierten Enzyms beträgt 70 bis 80 %, ausgedrückt als Prozent Aktivität des freien Enzyms.
Normalerweise bindet man 20 U Gl-7-ACA-Acylase pro Gramm Träger, um das günstigste Immobilisierungsverhältnis und nach dem Binden eine ausreichende Aktivität zu erhalten, um bei der Umwandlung der Glutarylderivate zu 7-Aminocephalosporansäuren eine gute Verfahrensführung zu gewährleisten.
Wie der Graph der Fig. 5 zeigt, ist die immobilsierte Gl-7-ACA-Acylase bei 4º und 25ºC sehr stabil. Sie kann bei der Umsetzung von Cephalosporanverbindungen des Typs (II) (Glutarylderivaten) zu jenen des Typs (III) (7- ACA oder Derivaten) für mehr als 200 Verfahrensstunden verwendet werden, wie man anhand des Graphen der Fig. 6 erkennt.

MESSUNG DER Gl-7-ACA-ACYLASEAKTIVITÄT

Man bestimmt die Aktivität der Gl-7-ACA-Acylase durch Messung der Hydrolyserate des Glutaryl-7-ACAs zu 7-ACA in 0,1 M (pH 7,8) Phosphatpuffer bei 37ºC. Das 7-ACA wird nach dem modifizierten Bulasingham-Verfahren (Biochem. Biophys. Acta, 276, 250, 1972) spektrophotometrisch gegen eine Standardkurve bestimmt, indem man bei 410 nm die gelbe Farbe (Schiff'sche Base), die sich mit dem Reagens p-Dimethylaminobenzaldehyd bildet, mißt.
Eine Einheit Acylase wird als die Enzymmenge (in Lösung oder immobilisiert) definiert, die unter den Verfahrensbedingungen 1 µmol 7-ACA in 1 Minute produziert.
Die folgenden Beispiele und Herstellungsverfahren sind angegeben, um die Ausführung der ersten und der zweiten Stufe des erfindungsgemäßen enzymatischen Verfahrens zu erläutern.

BEISPIEL 1

HERSTELLUNG VON D-AMINOSÄUREOXIDASE MIT EINER RHODOTORULA GRACILIS ATCC 26217 KULTUR

Ein 100-l-Fermenter wird mit 70 l Kulturlösung der folgenden Zusammensetzung gefüllt:
NaCl 0,5 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 1,5 g/l
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 1 g/l
CaCl&sub2; 0,25 g/l
ZnSO&sub4; 0,002 g/l
FeCl&sub3; 0,003 g/l
Glucose 25 g/l
D-Alanin 7 g/l
Das Medium wird mit 2N H&sub2;SO&sub4; auf den pH 5,6 gebracht, 20 Minuten bei 120ºC sterilisiert und auf 30ºC abgekühlt. Man okuliert mit einer vegetativen Kultur von Rhodotorula gracilis ATCC 26217 und fermentiert 28 Stunden bei 30ºC unter Rühren bei 200 Upm und einer Luftzufuhr von 0,5/1/1/min. Man läßt den pH während der Fermentierung von selbst auf 5 fallen, wo er dann unter automatischer Zugabe von 10%iger NaOH konstant gehalten wird.
Bei beendigter Fermentierung erhält man 72 l Kulturlösung mit OD&sub6;&sub6;&sub0; = 39 und einer D-Aminosäureoxidase-Aktivität von 4600 U/l. Die Lösung wird bei 5000 g in einer Westfalia-Kammer zentrifugiert.
Man erhält 3,1 kg Zellpaste (Feuchtigkeit ungefähr 80 %), die 320000 U D-Aminosäureoxidase entsprechen.

BEISPIEL 2

EXTRAKTION UND REINIGUNG DER D-AMINOSÄUREOXIDASE

1 kg der nach Beispiel 1 erhaltenen Zellpaste (103000 U DAO) werden in 3 l 25 mM (pH 8) Phosphatpuffer, der 0,5 g/l Natriummetabisulfit und 0,5 g/l Cetylpyridiniumchlorid enthält, dispergiert.
Man kühlt die Suspension auf 4ºC ab und leitet sie durch eine Manton- Gauli-Presse bei 550 bar.
Durch Zugabe von 20 ml kationischem Polyelektrolyt (Nymco 2045C) wird das homogenisierte Produkt (4,3 l) ausgeflockt. Das Flockulat wird durch Filtern über Hyflo geklärt. Das geklärte Produkt (4,9 l) wird bei 4ºC mittels Ultrafiltration durch eine Polysulfonmembran des MG 30000 konzentriert.
Zum durch Ultrafiltration erhaltenen Konzentrat (0,750 l) werden 262 g Ammoniumsulfat gegeben.
Der Niederschlag wird von der überstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren getrennt und in 300 ml 25 mM (pH 8) Phosphatpuffer, der 0,5 g/l Natriummetabisulfit enthält, wieder aufgelöst.
Die Lösung (320 ml) wird mittels Ultrafiltration durch eine Membran des MG 30000 diafiltriert.
Das Diafiltrat (340 ml) enthält das rohe DAO in einer Konzentration von 224 U/ml.
Man reinigt die D-Aminosäureoxidase, indem man die Lösung des rohen Enzyms durch eine Sepharose DEAE-Fast-Flow-Säule (Bettvolumen 800 ml, ∅ 5 cm, Höhe 40 cm) gibt und diese mit dem gleichen 25 mM (pH 8) Phosphatpuffer eluiert. Das DAO wird vom Harz nicht zurückgehalten, sondern in seinem Vormarsch nur verlangsamt, und geht in das Eluat über.
Die störenden Enzyme, insbesondere die Esterase werden mit 25 mM (pH 8> Puffer nicht eluiert und nur während der Regenerierung der Säule mit 0,5 M NaCl freigesetzt.
Die gereinigte D-Aminosäureoxidase wird in einem Volumen von 1230 ml bei einer Aktivität von 52 U/ml und einer spezifischen Aktivität von 19 U/mg Protein gesammelt.
Die Gesamtausbeute bei der Reinigung beträgt 62 %, entsprechend einem Gesamtwert von 63920 U.
Die gereinigten D-Aminosäureoxidase ist bei 4ºC mindestens 6 Tage und bei -20ºC mindestens 6 Monate stabil.

BEISPIEL 3

IMMOBILISIERUNG DER D-AMINOSÄUREOXIDASE AUF DUOLITE A 365

35 g Duolite A 365 Harz mit einer Partikelgröße von 100 bis 200 µm werden mit 0,5 l 100 mM (pH 8) Kaliumphosphatpuffer behandelt. Nach 15-minütigem Rühren wird der pH durch die nachfolgenden Zugaben von 10%iger H&sub3;PO&sub4; (6 ml) eingestellt. Wenn der pH konstant bei 8 liegt, entfernt man die überstehende Flüssigkeit durch Filtration. Man gibt 400 ml 2%igem Glutaraldehyd in 25 mM (pH 8) Kaliumphosphatpuffer zu dem feuchten Harz. Man läßt dieses bei einer Temperatur von 20 bis 25ºC 30 Minuten Rühren und trennt danach die überstehende Flüssigkeit durch Filtration ab und erhält eine feuchte feste Masse.
386 ml der wie in Beispiel 2 gereinigten D-Aminosäureoxidaselösung (52 U/ml; 19 U/mg Protein) werden zu der feuchten aktivierten Harzmasse gegeben. Man hält das System bei 4ºC 12 Stunden unter schwachem Rühren. Die Ausbeute der Immobilisierung, berechnet auf die Konzentration des aufgewendeten Überstands, beträgt 100 %
Man filtriert das Produkt ab und wäscht die feuchte Masse mit 0,5 M NaCl in 25 mM (pH 8) Kaliumphosphatpuffer und dann mit 25 mM (pH 7,5) Kaliumphosphatpuffer.
Man erhält 103 g immobiliserte D-Aminosäureoxidase mit einer Aktivität von 48 U/g feuchtem Produkt.

BEISPIEL 4

IMMOBILISIERUNG DER D-AMINOSÄUREOXIDASE AUF EUPERGIT C

4,5 g Eupergit C (150 µm) werden unter Rühren zu 120 ml auf 4ºC abgekühltem 1 M (pH 8) Kaliumphosphatpuffer gegeben, gefolgt von 55 ml der in Beispiel 2 erhaltenen D-Aminosäureoxidaselösung (58 U/ml; 17 U/mg Protein). Man hält das System 2 Stunden unter schwachem Rühren bei 4ºC und gewinnt das Produkt durch Filtration. Man erhält schließlich 15,7 g feuchter D-Aminosäureoxidase, immobilisiert auf Eupergit C, mit einer Aktivität von 58 U/g feuchtem Produkt.

BEISPIEL 5

IMMOBILISIERUNG VON D-AMINOSÄUREOXIDASE AUF UOP IPS-200

80 ml der wie in Beispiel 2 gereinigten D-Aminosäureoxidaselösung (45 U/ml; 17 U/mg Proteine) werden mit 80 ml 1 M (pH 7,5) Kaliumphosphatpuffer verdünnt.
Die Lösung wird mit 600 ml/Stunden 4 Stunden lang durch eine Säule (∅ 2 cm, Höhe 8 cm) im Kreis geführt, die 20 g UOP IPS-200 enthält. Danach sind 91 % der D-Aminosäureoxidaseaktivität immobilisiert. Man erhält 19 g der abfiltrierten feuchten Masse mit einer Aktivität von 21 U/g.

BEISPIEL 6

UMWANDLUNG VON CEPHALOSPORIN C ZU GLUTARYL-7-ACA MIT AUF DUOLITE A 365 IMMOBILISIERTER D-AMINOSÄUREOXIDASE

A) DISKONTINUIERLICHE UMSETZUNG

Man löst 66 g Cephalosporin-C-Natriumsalzdihydrat (Reinheit 90,9 %) in 2 l (pH 8) Kaliumphosphatpuffer mit der Konzentration 25 mM, der 0,5 g Natriummetabisulfit enthält. Die Cephalosporin-C-Lösung wird in einen 3-l-Reaktor mit 150 g feuchter D-Aminosäureoxidase, die wie in Beispiel 3 auf Duolite A 365 immobilisiert wurde, überführt.
Das Inkubieren führt man bei 25ºC unter leichtem Rühren durch, wobei Sauerstoff mit 1 Vol/Vol/min durch einen Verteiler am Boden fließt.
Durch die automatische Zugabe von 5%igem Ammoniak wird der pH bei 7,5 gehalten. Nach 75 Minuten ist das Cephalosporin C vollständig umgesetzt. Die Prozentuale Zusammensetzung der Umwandlungsprodukte des Cephalosporins ist:
Glutaryl-7-ACA 90,1 %
Ketoadipyl-7-ACA 6,2 %
Glutaryl-7-ACA-Desacetyl 1,1 %
Glutaryl-7-ACA-Desacetoxy 0,9 %
Glutaryl-7-ACA-Sulfoxid 0,8 %
Andere β-Lactame 0,9 %
Um den Rest Ketoadipyl-7-ACA zu Glutaryl-7-ACA umzusetzen, trennt man die nach der Inkubation erhaltene Lösung von der immobilisierten Enzymmasse durch Filtration ab. Man gibt unter Rühren für jeden Liter des Filtrats 10 ml 3,5%iges Wasserstoffperoxid zu. Man beläßt die Mischung 15 Minuten bei 25ºC und gibt dann 0,5 g Natriumpyruvat zu.
Die prozentuale Zusammensetzung nach Abschluß der Behandlung ist:
Glutaryl-7-ACA 95,5 %
Ketoadipyl-7-ACA 0,1 %
Glutaryl-7-ACA-Desacetyl 1,1 %
Glutaryl-7-ACA-Desacetoxy 0,9 %
Glutaryl-7-ACA-Sulfoxid 1,5 %
Andere β-Lactame 0,9 %
Die Enzymladung wurde in 100 Zyklen über Zeitperioden von 75 bis 120 Minuten getestet.
Die Gesamtproduktion betrug 4760 g Glutaryl-7-ACA, was 31,7 g Glutaryl-7-ACA pro g immobilisiertem Enzym entspricht.

B) KONTINUIERLICHE UMSETZUNG IN SÄULE

Eine 15-g/l-Lösung von Cephalosporin C, in der Form des Natriumsalzdihydrats, in 0,1 M (pH 8) Phosphatpuffer wurde mit einer Geschwindigkeit von 1 l/Stunde durch 5 Säulen (∅ 40 mm) geführt, die jeweils 100 g (150 ml sichtbares Volumen) auf Duolite A 365 immobilisierte DAO (siehe Beispiel 3) enthielten.
Das Gesamtsystem, welches kontinuierlich mit in Serie verbundenen Säulen operiert, wird auf eine Temperatur von 25ºC kontrolliert und durch die Zuführung von Sauerstoff nach jeder Säule bei 3 bar gehalten.
Am Ausgang der fünften Säule beträgt der Cephalosporin-C-Rückstand ungefähr 1 % und die Umsetzung zu Glutaryl-7-ACA 92 % des stöchiometrischen Wertes (11,2 g/l).

BEISPIEL 7

UMWANDLUNG VON CEPHALOSPORIN C ZU GLUTARYL-7-ACA MIT AUF EUPERGIT C IMMOBILISIERTER D-AMINOSÄUREOXIDASE

2 l der wie in Beispiel 6 hergestellten Cephalosporin-C-Lösung werden mit 150 g auf Eupergit C immobilisierter D-Aminosäureoxidase (wie in Beispiel 4) inkubiert. Die Inkubation wird bei 25ºC in einem Sauerstoffstrom durchgeführt.
Nach 60 Minuten bei pH 7,5 ist das Cephalosporin C vollständig umgewandelt bei einer Glutaryl-7-ACA-Ausbeute von 91 % und einer Ketoadipyl-7- ACA-Ausbeute von 5,8 %.
Man trennt die Lösung von den immobilisierten Enzymen durch Filtration ab.
1 l des Filtrats wird mit 10 ml 3,5%igem Wasserstoffperoxid und nach 15 Minuten mit 0,25 g Natriummetabisulfit behandelt.
Die Endzusammensetzung des Umwandlungsprodukts ist:
Glutaryl-7-ACA 96,1 %
Glutaryl-7-ACA-Desacetyl 0,9 %
Glutaryl-7-ACA-Desacetoxy 0,7 %
Glutaryl-7-ACA-Sulfoxid 0,8 %
Andere β-Lactame 1,5 %
Die Enzymladung wurde in 100 Zyklen getestet. die Gesamtproduktion betrug 4700 g Glutaryl-7-ACA, was 31 g/g immobilisiertes Enzym entspricht.

BEISPIEL 8

UMWANDLUNG VON CEPHALOSPORIN C ZU GLUTARYL-7-ACA MIT AUF UOP IPS-200 IMMOBILISIERTER D-AMINOSÄUREOXIDASE

6,57 g Cephalosporin-C-Natriumsalzdihydrat (Reinheit 91,3 %) werden in 200 ml Wasser gelöst. Man gibt 0,68 g KH&sub2;PO&sub4; und 0,1 g Natriummetabisulfit zu der Lösung und korrigiert den pH auf 7,5 mit 5%iger NaOH.
Diese Cephalosporinlösung wird durch eine Temperatur-kontrollierte (25ºC) Säule, die 20 g auf UOP IPS-200 immobilisierter D-Aminosäureoxidase enthält (∅ 3 cm; Höhe 4 cm; Bettvolumen 28 ml) gepumpt. Man erhält eine Flußrate von 50 ml/min aufrecht. Das Eluat der Säule wird in einem Gefäß gesammelt und über einen Sauerstoffverteiler belüftet, auf den pH 7,5 gebracht und 2 Stunden im Kreis geführt.
Nach 2 Stunden Kreislauf ist die Umsetzung des Cephalosporin C vollständig.
Man behandelt die Lösung (100 ml) mit 1 ml 3,5%igem H&sub2;O&sub2; und danach 15 Minuten mit 50 mg Natriumpyruvat.
Die prozentuale Zusammensetzung der Umwandlungsproduktes ist:
Glutaryl-7-ACA 93,4 %
Glutaryl-7-ACA-Desacetyl 1,8 %
Glutaryl-7-ACA-Desacetoxy 0,6 %
Glutaryl-7-ACA-Sulphoxid 1,4 %
Andere β-Lactame 2,8 %
Das Experiment wurde 60 Zyklen lang mit einer Gesamt-Glutaryl-7-ACA- Produktion von 280 g durchgeführt, die 40 g/g immobilisiertes Enzym entspricht.

BEISPIEL 9

PRODUKTION VON Gl-7-ACA-Acylase mit einer E. coli ATCC 9637 (pJc 200) Kultur

1) GEWINNUNG DES MIKROORGANISMUS E. COLI ATCC 9637 (pJc 200)

a) HERSTELLUNG DES PLASMID pACYC 184

Der E. coli- Stamm ATCC 37033, der den Plasmidvektor pACYC 184 (Tet , Cam ) enthält, wird bei 37ºC 16 Stunden in 0,5 l LB-Kulturmedium inkubiert, das 10 g/l Bacto Trypton Difco, 5 g/l Bacto-Hefenextrakt Difco und 10 g/l NaCl enthält.
Die erhaltenen Zellen werden sedimentiert, gewaschen, lysiert und das Plasmid nach dem alkalischen Verfahren (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) isoliert. Die erhaltene Plasmid-DNA wird dann durch Zentrifugieren in einem CsCl-Gradienten gereinigt.

b) HERSTELLUNG DES DNA-DONORS, DER DIE GENETISCHE INFORMATION BEZÜGLICH DER GLUTARYL-7-ACA-ACYLASEPRODUKTION ENTHÄLT

Der Stamm der Acinetobacter ATCC 53891-Spezies, der Gl-7-ACA-Acylase produziert, wird in einem Medium kultiviert, das 5 g/l saures Natriumglutamat, 1,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 5 g/l NaCl, 25 g/l Kollagenhydrolysat, 5g/l Maislauge (corn steep liquor) und 2g/l Glucose enthält. Man inkubiert das System 48 Stunden bei einer Temperatur von 25ºC.
Die erhaltenen Zellen werden dann sedimentiert, gewaschen und mit 1%igem SDS, 20 mM ETDA und 0,1 mg/ml Proteinase-K lysiert.
Man erhitzt die lysierte Mischung 3 Stunden auf 55ºC, und extrahiert dann mehrfach mit Phenol und Chloroform-Isoamylalkohol. Mittels Ethanol fällt man die DNA in der wäßrigen Phase.
Die gefällte DNA wird mit 100 % Ethanol und 70 % Ethanol gewaschen und in einem 10 mM (pH 7,5) Tris-HCl-Puffer, der 1 mM ETDA enthält, gelöst.

c) EINFÜGEN DER DNA-DONORFRAGMENTE IN DEN VEKTOR

Man schließt mehrere Proben, die 1 µg der aus dem Acinetobacter sp. ATCC 53891-Stamm enthaltenen DNA enthalten, mit BamHI-Restriktions-Endonuklease bei 37ºC auf und blockiert die Reaktion zu unterschiedlichen Zeiten durch 10-minütiges Erhitzen der Probe auf 65ºC. Auf diese Weise erhält man verschiedene partielle DNA-Aufschlüsse, wobei man diese durch Anfärben mit Ethidiumbromid nach Elektrophorese auf Agarosegel sichtbar macht.
Mehrere Proben, die 2 µg des Plasmids pACYC 184 DNA enthalten, werden mit BamHI-Restriktions-Endonuklease bei 37ºC 2 Stunde lang aufgeschlossen und dann 10 Minuten auf 65ºC erhitzt, um die Reaktion zu blockieren. Jede Probe der partiellen BamHI-Aufschlüsse der Acinetobacter-DNA wird mit T4- DNA-Ligase in Gegenwart von ATP, Mg²&spplus;-Ionen und 2-Mercaptoethanol 16 Stunden bei 14ºC mit einer Probe des BamHI-Aufschlusses des pACYC 184-Plasmids verbunden.
Durch dieses Verfahren kann man mehrere Sammlungen an rekombinaten Vektoren erhalten, die in das Plasmid pACYC 184 eingeschleuste DNA-Fragmente der Acinetobacter ATCC 53891-Spezies enthalten.

d) SELEKTION DES TRÄGERPLASMIDS NACH DEM FÜR DIE Gl-7-ACA-ACYLASE- ENZYMAKTIVITÄT KODIERENDEN GEN

E. coli HB101 wird durch die Genbank des Gl-7-ACA-Acylase-Produzentenstamms der Spezies Acinetobacter transformiert, die die transformierten Gl- 7-ACA-Acylase-Genträger ihrer Fähigkeit nach selektiert, bei 37ºC in einem basischen Medium M9, zu dem man 0,2 g/dl Glucose, 0,1 mg/dl Thiamin-HCl, 10 mg/dl Prolin, 5 mg/dl Glutaryl-Leucin und 5 mg/dl Chloramphenicol gegeben hat, zu wachsen (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Auf diese Weise erhält man den Stamm E. coli HB101 (pJC11).
Das Plasmid pJC11 ist dadurch gekennzeichnet, daß es das Chloramphenicol-Resistenzgen und das Gl-7-ACA-Acylasegen (lokalisiert in einem DNA- Fragment von ungefähr 8,5 kb, das mit BamHI teilweise aufgeschlossen wird) besitzt, und das unter Kontrolle des Genpromotor für die Tetracyclinresistenz [Bolivar et al., (1977) Gene 2:95) exprimiert wird.
Nach dem Aufschluß von 5 µg pJC11-DNA mit EcoRV und HpaI-Endonuklease und der Reinigung eines 3-kb-Gl-7-ACA-Acylase-Genträgerfragments wird dieses mit dem Plasmid pUC18, das zuvor mit HimcII und aufgeschlossen wurde, verbunden und dephosphoryliert. Das resultierende Plasmid wird pJC40 genannt (siehe Fig. 7).
5 µg des Plasmids pDR540 [de Boer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Soi. USA 80:21] werden mit BamHI-Endonuklease aufgeschlossen und dann unter den von T. Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschriebenen Bedingungen dephosphoryliert.
Ausgehend von pJC40 reinigt man ein partielles 3-kb-BamHI-Gl-7-ACA- Acylase-Genträgerfragment und verbindet es mit der BamHI-Stelle des Plasmids pDR540.
Der resultierende Vektor wird pJC54011 genannt (siehe Fig. 8).

e) KONSTRUKTION DES PLASMIDS pJC 200

5 µg des Plasimids pACYC-184 werden mit XbaI- und HindIII-Restriktions-Endonuklease unter den in Biochemicals Catalogue (Boehringer Mannheim GmbH (1987)) beschriebenen Bedingungen aufgeschlossen und dann mit einem Fragment des DNA-XbaI-HindIII-Gl-7-ACA-Acylase-Genträgers, abgeleitet von pJC54011, verbunden. Das resultierende Plasmid wird pJC 200 (siehe Fig. 8) bezeichnet. Alle bei der Handhabung der DNAs angewendeten Techniken sind bei T. Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben.
Das Plasmid pJC 200 ist dadurch gekennzeichnet, daß es das Chloramphenicol-Resistenzgen als Selektionsmarker in E. coli und das für die Gl-7- ACA-Acylaseaktivität der Spezies Acinetobacter ATCC 53891 kodierende Gen besitzt, das unter der Kontrolle des tac-Promoters exprimiert wird.

f) TRANSFORMATION VON E. COLI ATCC 9637 MIT DEM HOCHEXPRESSIONSVEKTOR pJC 200

Man erreicht das Einschleusen des Plasmids pJC 200 in nicht-β-Lactamase-produzierende E. coli ATCC 9637 nach dem von Hanahan (J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983)) beschriebenen Verfahren.
Man läßt die E. coli ATCC 9637-Zellen zuerst in einem SOB-Medium bei 37ºC und 250 Upm wachsen bis OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,45. Die Kultur wird dann bei 3000 g 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert und die Zellen in 1/3 des Anfangsvolumen des RF1 resuspendiert. Nach 15-minütigem Inkubieren in Eis und Zentrifugieren unter den gleichen Bedingungen resuspendiert man die Zellen in 1/12,5 des Anfangsvolumens an RF2. Die Mischung wird nochmals in Eis 15 Minuten lang inkubiert.
Die so erhaltenen Zellen, die man als "kompetent" bezeichnet, sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, exogene DNA mit großer Wirksamkeit aufzunehmen.
Man schleust die DNA ein, indem man 10 ng des Plasmids pJC 200 mit 100 µl der kompetenten Zellen mischt und die Mischung dann in Eis 30 Minuten lang inkubiert.
Nach einem 60-sekündigen Hitzeschock bei 42ºC gibt man 800 µl SOB-Medium zu und inkubiert das System bei 37ºC und 200 Upm 60 Minuten lang.
Die Selektion der Transformer wird im LB-Medium, zu dem man 30 µg/ml Chloramphenicol gibt, abgeschlossen.
Der erhaltene Mikroorganismus, der eine hohe Gl-7-ACA-Acylase-Produktionskapazität aufweist, wird als E. coli ATCC 9637 (pJC 200) bezeichnet.
Die LB-, SOB- RF1- und RF2-Zusammensetzungen werden von Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben.

2) FERMENTIERUNG

a) VEGETATIVE PHASE

Man läßt E. coli ATCC 9637 (pJC 200)-Zellen bei 28ºC 24 Stunden auf einer 180 x 10 mm Schräge mit festem Medium wachsen, das Trypton (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l), NaCl (5 g/l), Chloramphenicol (30 mg/l) und Agar (15 g/l) bei einem pH von 7,5 umfaßt und nimmt die Zellen in 5 ml steriler physiologischer Lösung auf.
0,5 ml dieser Zellsuspension werden in 500-ml-Kolben überführt, die 100 ml vegetatives Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten: Trypton (12 g/l), Hefeextrakt (24 g/l), Glucose (5 g/l), KH&sub2;PO&sub4; (1,1 g/l), K&sub2;HPO&sub4; (6,2 g/l) und Chloramphenicol (30 mg/l).
Man läßt die Kultur bei 28ºC und 250 Upm 24 Stunden lang wachsen bis OD&sub6;&sub0;&sub0; = 15 bis 18.

b) PRODUKTIVE PHASE

Man sterilisiert einen 100-l-Fermenter, der 58 l Kulturflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung enthält: saures Natriumglutamat (6 g/l), Hefeextrakt (3 g/l), Kollagenhydrolysat (20 g/l), Maislauge (corn steep liquor) (3 g/l), KH&sub2;PO&sub4; (1,1 g/l) und K&sub2;HPO&sub4; (6,2 g/l), bei 120ºC 20 Minuten lang und kühlt auf 23ºC ab, wonach man separat sterilisierte Glucose (6 g/l) und Chloramphenicol (30 mg/l) zugibt.
Man okuliert das Medium mit 2 % einer vegetativen Kultur, die man wie im vorangegangenen Punkt erhält. Die Fermentierung wird 72 Stunden bei 23ºC bei einer Luftzufuhr von 0,5 V/V/min durchgeführt, wobei man bei 200 Upm rührt und 3 g/l Glucose alle 12 Stunden zugibt.
Nach Beendigung der Fermentierung erhält man 63 l Kulturflüssigkeit mit einem pH von 8, einem OD&sub6;&sub0;&sub0; von 28 und einer Gl-7-ACA-Acylaseaktivität von 2790 U/l.
Beim Zentrifugieren bei 6000 g gewinnt man 1,8 kg Zellpaste (Feuchtigkeit 80 %), die insgesamt 166980 U Gl-7-ACA-Acylase entsprechen.

BEISPIEL 10

EXTRAKTION UND REINIGUNG VON Gl-7-ACA-ACYLASE

1 kg der wie in Beispiel 9 erhaltenen Zellpaste (92766 U Gl-7-ACA-Acylase) werden in 2 l 25 mM (pH 8) Kaliumphosphatpuffer dispergiert. Man kühlt die Suspension auf 4ºC ab und führt sie zweimal durch ein Manton-Gaulin-Presse bei 550 bar. Das Lysat wird mit 25 mM (pH 8) Kaliumphosphatpuffer auf 6 l aufgefüllt und durch Zugabe von 6 ml Nymco 2045 C kationischen Polyelektrolyt ausgeflockt. Das Flockulat wird durch Zentrifugieren bei 6000 g geklärt.
Man erhält 5,5 l eines geklärten Produkts mit einer Gl-7-ACA-Acylaseaktivität von 13915 U/l, entsprechend einem Gesamtwert von 76532 U.
Man konzentriert das geklärte Produkt mittels Ultrafiltration durch eine Polysulfonmembran des MG 50000.
Man führt das Rohkonzentrat mit einem Volumen von 1580 ml (Gl-7-ACA- Acylase = 48 U/ml; Protein = 45 mg/ml) durch eine Säule, die 1 l Sepharose DEAE im Gleichgewicht mit 25 mM (pH 8) Kaliumphosphatpuffer enthält. Die Gl-7-ACA-Acylase wird in einem Volumen von 2170 ml mit dem gleichen Puffer, zu dem man 0,15 M NaCl gegeben hat eluiert.
Das gereinigte Enzym hat eine Aktivität von 20,3 U/ml und eine spezifische Aktivität von 2,6 U/mg Protein.

BEISPIEL 10b

HERSTELLUNG VON Gl-7-ACA-ACYLASE MIT ESCHERICHIA COLI p-3 (pJC200)- KULTUREN DER REGISTRATIONSNR. NCIMB 40433

E. coli P-3, mit der Registrationsnr. NCIMB 40432 (nicht-β-Lactamase- produzierender Mikroorganismus), ist mit dem Gen der Gl-7-ACA-Acylase geklont worden, das aus Acinetobacter-Spezies mit der Registrationsnr. ATCC 53891 isoliert wurde. Man fermentiert die so erhaltenen E. coli (pJC200), Registrationsnr. NCIMB 40433, im TB-Medium (siehe Maniatis et al., zitiert in Beispiel 9) 48 Stunden bei 21ºC. Nach der Sedimentierung der Zellen trennt man das Gl-7-ACA-Acylaseenzym von der Zellpaste durch Schalleinwirkung.
Die Aktivität der so erhaltenen Gl-7-ACA-Acylase beträgt im Ergebnis 2 U/mg Proteine.

BEISPIEL 11

IMMOBILISIERUNG DER Gl-7-ACA-ACYLASE AUF DUOLITE A 568

40 g Duolite A 568 Harz mit einer Teilchengröße von 100 bis 300 µm werden mit 0,6 l 100 mM (pH 8) Kaliumphosphatpuffer behandelt. Nach 15-minütigem Rühren stellt man den pH durch die nachfolgenden Zugaben von 10%iger H&sub3;PO&sub4; (12 ml) ein. Wenn der pH einen konstanten Wert von 8 hat, entfernt man die überstehende Flüssigkeit durch Filtration. Man gibt 500 ml 2%igen Glutaraldehyd zu dem feuchten Harz. Man läßt das System 15 Minuten bei Umgebungstemperatur rühren, trennt dann die Flüssigkeit mittels Filtration ab und erhält eine feuchte feste Masse.
Man gibt 200 ml der Gl-7-ACA-Acylaselösung (10,8 U/ml; 2,4 U/mg Proteine), die wie in Beispiel 10 gereinigt wurde, zu der feuchten aktivierten Masse. Man läßt das System 12 Stunden bei 4ºC schwach rühren. 5 ml 25%iger Glutaraldehyd werden dann zugegeben und das Rühren für mehr als 6 Stunden bei 4ºC fortgesetzt.
Das Produkt wird dann abfiltriert und die feuchte Masse mit 500 ml 0,5 M NaCl in 25 mM (pH 8) Kaliumphosphatpuffer und dann mit dem gleichen Puffer, jedoch ohne das Natriumchlorid gewaschen.
Man erhält 108 g (Feuchtmasse) immobilisierte Gl-7-ACA-Acylase mit einer Aktivität von 19 U/g und einer Ausbeute beim Anbinden von 100 %.
Das immobilisierte Enzym wird in einer 25 mM (pH 8) Kaliumphosphatpufferlösung gelagert und ist bei 25ºC mindestens 1 Monat und bei 4ºC 6 Monate stabil.

BEISPIEL 12

IMMOBILISIERUNG DER Gl-7-ACA-ACYLASE AUF EUPERGIT C

10 g Eupergit C (150 µm) werden zu 250 ml 1 M (pH 8) Kaliumphosphatpuffer bei 20ºC gegeben, gefolgt von 120 ml Gl-7-ACA-Acylaselösung (10,8 U/ml; 2,4 U/mg Protein), die wie in Beispiel 10 erhalten wurde. Man läßt das System 6 Stunden bei 20ºC schwach rühren und gewinnt das Harz durch Filtration zurück. Die feuchte Masse wird mit 25 mM (pH 8) Kaliumphosphatpuffer gewaschen. Man erhält schließlich 34 g feuchte immobilisierte Gl-7-ACA-Acylase mit einer Aktivität von 31 U/g, was 81 % der enzymatischen Aktivität für die Immobilisierung entspricht.

BEISPIEL 13

IMMOBILISIERUNG DER Gl-7-ACA-ACYLASE AUF UOP IPS-200

25 ml der Gl-7-ACA-Acylaselösung (16,4 U/ml; 2,2 U/mg Protein), die wie in Beispiel 10 gereinigt wurde, wird mit 75 ml 1 M (pH 7,5) Kaliumphosphatpuffer verdünnt. Man führt die Enzymlösung bei 4ºC und 1 l/Stunde durch eine Säule (∅ 2 cm; Höhe 8 cm), die 20 g UOP IPS-200 enthält, im Kreis.
Nach 4 Stunden Kreislauf wäscht man die Säule mit 25 mM (pH 8) Kaliumphosphatpuffer.
Die feuchte immobilisierte Enzymmasse (22 g) hat eine Aktivität von 14 U/g, was 75 % des der Reaktion zugeführten ursprünglichen Enzyms entspricht.

BEISPIEL 14

UMWANDLUNG VON GLUTARYL-7-ACA MIT AUF DUOLITE A 568 IMMOBILISIERTER Gl- 7-ACA-ACYLASE

Man belädt 5 Säulen (∅ 22 mm) mit 500 g auf Duolite A 568 immobilisierter Gl-7-ACA-Acylase (Beispiel 11). Die Enzymladung wird gemäß der folgenden Anteile verteilt: erste Säule 50 g; zweite Säule 75 g; dritte Säule 100 g; vierte Säule 125 g; fünfte Säule 150 g. Man pumpt eine Glutaryl-7- ACA-Lösung (22,8 g/l; pH 8; 25ºC), die man durch enzymatische Umwandlung von Cephalosporin C mit immobilisierter D-Aminosäuroxidase erhält, durch die erste Säule der Serie mit einer Geschwindigkeit von 2 l/Stunde. Das Eluat der ersten Säule wird auf den pH 8 gebracht und durch die zweite gepumpt.
Der Arbeitsvorgang wird für alle Säulen der Serie wiederholt, um eine Umsetzung bei kontinuierlichem Fluß zu erzielen.
Am Ausgang der fünften Säule hat die Lösung die folgende Zusammensetzung:
7-ACA 85,80 %
Glutaryl-7-ACA 9,04 %
7-ACA-Desacetyl 1,70 %
7-ACA-Desacetoxy 0,80 %
7-ACA-Sulfoxid 1,70 %
Cephalosporin C 0,12 %
Ketoadipyl-7-ACA 0,14 %
Nach 200 Stunden beträgt die 7-ACA-Produktion 5480 g. Die Gesamtausbeute der Umsetzung ist 83,5 %.
7-ACA-Kristalle gewinnt man wie folgt: 10 l der von der fünften Säule eluierten Lösung werden mit 2 M HCl auf den pH 6 gebracht und durch Osmose bei 4ºC auf ein Volumen von 4,5 l konzentriert. Der pH des Konzentrats wird auf 3,5 eingestellt und die Kristalle durch Filtration gewonnen.
Kristallisationsausbeute: 94,5 %. Reinheit der 7-ACA-Kristalle: 97 %.

BEISPIEL 15

UMWANDLUNG VON GLUTARYL-7-ACA ZU 7-ACA MIT AUF EUPERGIT C IMMOBILISIERTER Gl-7-ACA-ACYLASE

12 g der Gl-7-ACA-Acylase, die gemäß Beispiel 12 auf Eupergit immobilisiert wurde, werden zu 150 ml Glutaryl-7-ACA-Lösung (20,3 g/l) gegeben, die man durch enzymatische Umwandlung von Cephalosporin C mit immobilisierter D-Aminosäureoxidase erhält.
Man inkubiert das System unter Rühren bei 25ºC, wobei man den pH durch automatische Zugabe von 5%igem Ammoniak bei 8 hält.
Maximale Umwandlung erhält man nach 50 Minuten bei einer Ausbeute umgesetzten 7-ACAs von 86 %.

BEISPIEL 16

UMWANDLUNG VON GLUTARYL-7-ACA ZU 7-ACA MIT AUF UOP 200 IPS-200 IMMOBILISIERTER Gl-7-ACA-ACYLASE

Man lädt 50 g (Feuchtgewicht) der wie in Beispiel 13 auf UOP IPS-200 immobilisierten Acylase in eine Säule (∅ 4 cm; Höhe 5 cm).
Durch die Säule werden 500 ml einer 1%igen Glutaryl-7-ACA-Lösung bei einer Geschwindigkeit von 50 ml/min im Kreis geführt.
Durch automatische von 5%igem Ammoniak hält man den pH konstant bei 7,8. Nach 60 Minuten sind 93 % des Glutaryl-7-ACAs zu 7-ACA umgewandelt worden.
Die von der Enzymmasse abgetrennte Lösung wird durch Zugabe von 2 N HCl auf den pH 3,5 gebracht und über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Man gewinnt 3,7 g 7-ACA. Reinheit 98 %. TABELLE 1 IMMOBILISIERUNG DER VON RHODOTORULA GRACILES PRODUZIERTEN DAO Träger (Handelsname) Fläche m²/g Poren ∅ nm Aktive Funktion (a) U/g immobisliert (b) % immobilisiertes Enzym (c) U/g feuchter Träger (d) Funktionalität % Duolite Amberlite Eupergit Primäres Amin Sekundäres Amin Tertiäres Amin Quaternäres Amin Epoxid Polyaminglutaraldehyd (a) Einheiten des freien Enzyms, das mit 1 g feuchtem Träger umgesetzt wird (b) Menge des immobilisierten Enzyms, ausgedrückt als Prozentsatz des umgesetzten freien Enzyms (c) Aktivität des immobilisierten Enzyms in U/g feuchtem Träger (d) Aktivität des immobilisierten Enzyms, ausgedrückt als Prozentsatz der entsprechenden Aktivität des umgesetzten freien Enzyms. TABELLE 2 IMMOBILISIERUNG DER VON E. COLI ATCC 9637 (pJC200) PRODUZIERTEN Gl-7-ACA-ACYLASE Träger (Handelsname) Fläche m²/g Poren ∅ nm Aktive Funktion (a) U/g immobisliert (b) % immobilisiertes Enzym (c) U/g feuchter Träger (d) Funktionalität % Duolite Amberlite Eupergit Primäres Amin Sekundäres Amin Tertiäres Amin Quaternäres Amin Epoxid Polyaminglutaraldehyd (a) Einheiten des freien Enzyms, das mit 1 g feuchtem Träger umgesetzt wird (b) Menge des immobilisierten Enzyms, ausgedrückt als Prozentsatz des umgesetzten freien Enzyms (c) Aktivität des immobilisierten Enzyms in U/g feuchtem Träger (d) Aktivität des immobilisierten Enzyms, ausgedrückt als Prozentsatz der entsprechenden Aktivität des umgesetzten freien Enzyms.

Claims

1. Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure oder ihren Derivaten aus Cephalosporin C oder seinen Derivaten gemäß dem folgenden Reaktionsschema: immobilisierte DAO Sauerstoff Gl-7-ACA-Acylase

worin R -OCOCH&sub3;, -H, -OH, -OCONH&sub2; ist, mittels des Enzyms D-Aminosäureoxidase (DAO), das aus einer Rhodotorula gracialis ATCC 26217-Kultur in einer gegenüber Cephalosporanverbindungen (I) aktiven Form und praktisch frei von störenden Enzymen erhalten wird, und die nachfolgende Umwandlung der Glutarylderivate (II) zu 7-Aminocephaosporansäuren (III) mittels des Enzyms Glutaryl-7-ACA-Acylase, das von gentechnischen nicht-β-Lactamase-produzierenden Mikroorganismen hergestellt wird; wobei dieses Verfahren aus den folgenden Schritten besteht:

1a) die Herstellung des Enzyms D-Aminosäureoxidase (DAO) von einer Rhodotorula gracilis ATCC 26217-Kultur bei 26 + 30ºC und einem pH von 4,8 bis 5,5, die Zellpaste einer Lysis zu unterziehen, das Enzym von der wäßrigen Dispersion abzutrennen, chromatographisch zu reinigen und das gereinigte Enzym auf einem inerten, festen Träger zu immobilisieren, der in einem wäßrigen Medium unlöslich ist und funktionelle Gruppen enthält, die sich zur Ausbildung von Cross-Links, möglicherweise mittels geeigneter bifunktioneller Agenzien, mit dem enzymatischen Protein eignen;

1b) die oxidative Deaminierung von Cephalosporin C oder seinen Derivaten (I), in dem das in 1a) erhaltene immobilisierte Enzym in Kontakt gebracht wird mit einer wäßrigen Lösung besagter Verbindungen in einer Konzentration von 20 bis 60 g/l bei einem pH von 7 bis 8 und einer Temperatur von 20 bis 30ºC in der Gegenwart von Sauerstoff oder Luft;

1c) das Abtrennen des gestützten Enzyms von der wäßrigen Reaktionsmischung und die Zugabe von Wasserstoffperoxid zu letzterer in gleicher Menge oder im Überschuß zur stöchiometrischen Menge, die erforderlich ist, die Ketoadipylcephalosporansäure zu Glutaryl-7-aminocephalosporansäure umzuwandeln;

1d) das Eliminieren des Überschusses an Wasserstoffperoxid durch die Zugabe geeigneter Reduktionsmittel wie Brenztraubensäure oder ihren Salzen oder alkalischen Sulfiten zu der Lösung;

1e) die Herstellung des Enzyms Gl-7-ACA-Acylase von Kulturen gentechnischer Mikroorganismen, die man aus nicht-β-Lactamase-produzierenden Escherichia coli-Kollektionsstämmen erhält, in die die aus irgendeinem Mikroorganismus der Acinetobacter-Spezies, dem Produzenten dieses Enzyms, isolierten Gl-7-ACA-Ayclase-Gene geklont wurden, wobei die Herstellung besteht aus: dem Fermentieren unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 21 bis 28ºC, die Zellmasse einer Lysis zu unterziehen, die chromatographische Reinigung über DEAE-Harz und das Immobilisieren des gereinigten Enzyms auf einem inerten festen Träger, der in einem wäßrigen Medium unlöslich ist und funktionelle Gruppen enthält, die sich zur Ausbildung von Cross-Links, möglicherweise mittels geeigneter bifunktioneller Agenzien, mit dem enzymatischen Protein, eignen;

1f) die Deacylierung der Glutaryl-7-aminocephalosporansäure oder ihren Derivaten (II), in dem das in 1e) erhaltene immobilisierte Enzym in Kontakt mit einer wäßrigen Lösung dieser Verbindung in einer Konzentration von 10 bis 30 g/l bei einer Temperatur von 20 bis 30ºC und einem pH von 7 bis 9 gebracht wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Herstellung des Enzyms Gl-7- ACA-Acylase (Schritt 1e) unter Verwendung des Mikroorganismus Escherichia coli P-3 (pJC200) mit der Registrationsnr. NCIMB 40433 ausgeführt wird, der von Stämmen nicht-β-Lactamase-produzierender Escherichia coli P-3 mit der Registrationsnr. NCIMB 40432 kommt, in die das aus irgendeinem Mikroorganismus der Acinetobacter-Spezies, dem Produzenten dieses Enzyms, isolierte Gl-7-ACA-Acylasegen geklont worden ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das in Schritt 1e) verwendete Gl-7-ACA-Acylasegen aus einem Mikroorganismus der Acinetobacter-Spezies mit der Registrationsnr. ATCC 53891 isoliert wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin Schritt 1e) gekennzeichnet ist durch die Verwendung von E. coli ATCC 9637 (pJC 200), einem Abkömmling der nicht-β-Lactamase-produzierenden E. coli ATCC 9637, in die das Gen der Gl-7-ACA-Acylase aus irgendeinem Mikroorganismus der Acinetobacter-Spezies, dem Produzenten dieses Enzyms, geklont worden ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin der Mikroorganismus der Acinetobacter-Spezies ATCC 53891 ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Schritte 1a) und 1e) dadurch gekennzeichnet sind, daß die Enzyme DAO und Gl-7-ACA-Acylase chromatographisch über DEAE-Harz gereinigt werden.

7. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Schritte 1a) und 1e), die die Immobilisierung der Enzyme DAO und Gl-7-ACA- Acylase umfassen, auf den folgenden Trägerarten ausgeführt werden:

a) makroretikulares Ionenaustauscherharz des Amintyps;

b) Polyacrylharz mit Epoxid-Bindefunktionen;

c) Harz mit anorganischer Matrix, imprägniert mit Polyaminglutaraldehyd.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Schritte 1a) und 1e) durch die Verwendung von Glutaraldehyd als vernetzendem Agens zur Immobilisierung der Enzyme gekennzeichnet sind.

9. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Schritt 1b) ausgeführt wird, in dem man das immobilisierte Enzym in der wäßrigen Substratlösung in Dispersion hält.

10. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Schritt 1b) ausgeführt wird, in dem man die wäßrige Substratlösung über das in einer Säule angeordnete immobilisierte Enzym führt.

11. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Schritt 1f) ausgeführt wird, in dem man das immobilisierte Enzym in der wäßrigen Substratlösung in Dispersion hält.

12. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Schritt 1f) ausgeführt wird, in dem man die wäßrige Substratlösung über das in einer Säule angeordnete immobilisierte Enzym führt.