JPH0829114B2 - ７−アミノセフアロスポラン酸およびその誘導体の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は７−アミノセファロスポラン酸（以下、７−
ACAと略す）およびその誘導体の酵素的手段による製造
方法に関するものである。

〔従来の技術〕 醗酵生産によって得られるセファロスポリンＣは７位
アミノ基に結合したアシル基を除去する反応（以下、脱
アシル化と略す）により７−ACAに誘導され、これを出
発原料として種々のセファロスポリン系抗生物質が合成
され、医薬品として実用に供されている。

セファロスポリンＣの脱アシル化方法としては化学的
方法および酵素的方法があるが、化学的脱アシル化法
（例えば特公昭41−13862号および特公昭45−40889号の
方法）は反応工程が多く、反応に用いる試薬のコストが
高いこと、反応の副産物として大量の化合物が排出され
ることなど工業的に欠点が多いことが知られている。

酵素的脱アシル化法としてはセファロスポリンＣの７
位側鎖７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタ
ンアミド）基のＤ−５−アミノ基にグリオキシル酸を作
用させた化学的に脱アミノ反応を行なう特公昭55−1291
0の方法、あるいは微生物酵素を作用させて脱アミノ反
応を行なう特公昭50−7158の方法などにより、セファロ
スポリンＣを７β−（５−カルボキシ−オキソペンタン
アミド）セファロスポラン酸に誘導し、ついで過酸化水
素を作用させることにより脱炭酸反応を行なわせて７β
−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラン酸
（通称グルタリルアミドセファロスポラン酸。以下、グ
ルタリル７−ACAと略す）に誘導しておき、更にシュー
ドモナス属（Pseudomonas）細菌の生産する酵素（文
献：シブヤ（Shibuya）ら（1981）アグリカチュラルバ
イオロジカルケミストリー（Agricultural Biological
Chemistry）45,1561−1567）を作用させることにより脱
アシル化反応を行なわせ、７−ACAへ誘導する方法があ
る。この方法は化学的脱アシル化法の問題点の多くを解
決できるが、３段の反応であるため、より勝れた酵素的
な一段反応による方法の開発が望まれていた。

セファロスポリンＣを直接脱アシル化して７−ACAを
得る方法としては、アクロモバクター属（Achromobacte
r）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）あるい
はフラボバクテリウム属（Flavobacterium）の細菌を用
いるアメリカ特許No.3239394（1966）の方法、アスペル
ギルス属（Aspergillus）あるいはアルタナリア属（Alt
ernaria）の真菌を用いる特開昭52−143289の方法、シ
ュードモナス属の細菌を用いる特開昭53−94093号の方
法、ペシロミセス属（Pecilomyces）の真菌を用いる特
開昭59−44392の方法およびシュードモナス属の新種に
属する細菌を用いる特開昭61−21097の方法がある。さ
らにはシュードモナス属の細菌からクローニングされた
セファロスポリンＣアシラーゼの遺伝子を含む大腸菌の
形質転換体を用いる特開昭61−152286の方法がある。

〔発明が解決しようとしている問題点〕

一般に微生物の培養物、その菌体処理物あるいは抽出
物による酵素反応を工業的に利用するためには、これら
の調製が容易であること、安価であること、あるいはこ
れの諸性質がすぐれていることなどの特長が必要とされ
ている。しかし上記の従来の方法で工業的にセファロス
ポリンＣを直接脱アシル化することに成功した例はいま
だに知られていない。

〔問題点を解決するための手段および作用〕

本発明者らは上記の問題点を解決するため、セファロ
スポリンＣから酵素的に１段の工程で７−ACAを生成さ
せる研究を行なってきた。この過程でコマモナス属（Co
mamonas）細菌よりグルタリル７−ACAを水解する能力を
有する７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロ
スポラン酸アシラーゼ（以下グルタリル７−ACAアシラ
ーゼと称す）の遺伝子を分離して大腸菌に導入し、この
酵素を著量生産させることに成功した（特開昭60−1102
92）。さらにトリゴノプシス属（Trigonopsis）酵母か
らセファロスポリンＣを酸化する能力を有するＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼ遺伝子を分離して大腸菌に導入し、こ
の酵素を著量生産させることに成功した〔特開昭61−21
5878（特開昭63−71180）〕。更に本発明者らが鋭意研
究を行なった結果、上記のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺
伝子とグルタリル７−ACAアシラーゼ遺伝子を含む単一
の大腸菌の培養物を同時にセファロスポリンＣに作用さ
せると意外にも一段の工程で７−ACAが生成することを
見出した。これらの知見にもとづき本発明を完成するに
到った。

すなわち本発明によれば、一般式（Ｉ） （式中Ｒは−OCOCH₃、−Ｈまたは−OHである）で表さ
れる化合物またはその塩を脱アシル化して一般式（II） （式中Ｒは前記と同じ意味を有する）で表わされる化
合物またはその塩を生成する７−ACAおよびその誘導体
を製造方法において、前記（Ｉ）で表される化合物に、
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及びグルタリル７−ACAアシ
ラーゼを発現する単一の大腸菌の培養物を含む酵素混合
物を過酸化水素の存在下または非存在下に水性媒体中で
作用させることを特徴とする７−ACAおよびその誘導体
の製造方法が提供される。

本発明の方法は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物ま
たはその塩と、組換えDNA技術により単一の大腸菌に産
生せしめたＤ−アミノ酸オキシダーゼ及びグルタリル７
−ACAアシラーゼを含む酵素混合物とを水性媒体中で混
合し、これらの酵素が作用により一般式（II）で表わさ
れる化合物またはその塩を製造するものである。

本発明の方法で出発物質として用いる一般式（Ｉ）で
表わされる化合物またはその塩及び本発明の方法で得ら
れる最終生成物である一般式（II）で表わされる化合物
またはその塩に関し、一般式（Ｉ）及び（II）中、Ｒが
−OCOCH₃の場合のものがそれぞれセファロスポリンＣ及
び７−ACAを示す。本発明において一般式（Ｉ）及び（I
I）で表わされる化合物の塩としては例えば、ナトリウ
ム塩やカリウム塩などが挙げられる。

本発明で用いられる酵素混合物としては、Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼ遺伝子とグルタリル７−ACAアシラーゼ
遺伝子を含む組換え体DNAで形質転換された単一の大腸
菌においてＤ−アミノ酸オキシダーゼおよびグルタリル
７−ACAアシラーゼを発現するものであって、この単一
の大腸菌の培養物またはその処理物との混合物を用いる
ことができる。例えば好適には、Ｄ−アミノ酸オキシダ
ーゼ遺伝子を含む組換え体DNAおよびグルタリル７−ACA
アシラーゼ遺伝子を含む組換え体DNAを共存させて保有
する単一の大腸菌の形質転換体を造成し、その培養物ま
たはその処理物を用いることもできるし、Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼ遺伝子およびグルタリル７−ACAアシラー
ゼ遺伝子を単一のベクター上に含む組換え体DNAを造成
し、これにより形質転換された単一の大腸菌の培養物ま
たはその処理物を用いることもできる。尚、Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換え体DNAおよびグルタ
リル７−ACAアシラーゼ遺伝子を含む組換え体DNAを共存
させて保有する単一の大腸菌の形質転換体を造成するに
は互いに不和合性の異なるグループに属する２種類のプ
ラスミドをベクターとして用い、各々に上記の２種の遺
伝子を別々に含む組換え体DNAを造成し、得られた２種
の組換え体DNA両者で同時に一種の大腸菌を形質転換す
ればよい。

前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子としては例え
ば、酵母トリゴノプシス・バリアビリス（Torigonopsis
variabilis）CBS4095由来のものがあげられ、またグ
リタリル７−ACAアシラーゼ遺伝子としては例えば、コ
マモナス・エスピー（Comamonas sp.）SY−77−１（微
工研菌寄第2410号）由来のものがあげられる。トリゴノ
プシス・バリアビリス由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ
遺伝子及びその遺伝子を含む組換え体DNAは例えば特願
昭61−215878（特開昭63−71180）号に記載されている
方法により得ることができる。即ち、以下のようにして
取得することができる。

（１）トリゴノプシス・バリアビリスCBS 4095から全DN
Aを抽出し、制限酵素で切断した後、ベクターに組みこ
み、大腸菌に導入し、DNAライブラリーを作成する。ト
リゴノプシス・バリアブリスCBS 4095は寄託機関である
セントラール・ビユーロー・フォーア・シメルカルチュ
レス（Centraal Bureau voor Schimmel−cultures）、
オランダ国に寄託番号4095号の下に寄託されている酵母
である。

（２）トリゴノプシス・バリアブリスCBS 4095からセフ
ァロスポリンＣを酸化する能力をもつＤ−アミノ酸オキ
シダーゼを抽出・精製し、アミノ基末端アミノ酸配列を
決定する。

（３）得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末
端アミノ酸配列の一部分について、これにより推定され
る遺伝子のDNA塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの混
合物を合成し、これをDNAプローブとする。

（４）DNAプローブを³²Pでラベルし、前記（１）で得ら
れたDNAライブラリーとコロニー・ハイブリダイゼーシ
ョンを行なわせ、DNAプローブと相補性を示した大腸菌
のコロニーを選択・分離する。

（５）選択された大腸菌の菌株からプラスミドDNAをと
りだし、ベクターに組みこまれたトリゴノプシス・バリ
アビリスCBS 4095由来のDNAの塩基配列を決定する。

（６）決定されたDNA塩基配列中にＤ−アミノ酸オキシ
ダーゼのアミノ基末端アミノ酸配列を正しくふくむアミ
ノ酸配列の読取り枠を見出し、これをふくむDNA断片に
適当な修飾をほどこした上で、大腸菌の遺伝子発現のた
めのベクターに組みこみ、発現用の組換え体DNAを造成
する。

また、コマモナス・エスピー由来のグルタリル７−AC
Aアシラーゼ遺伝子及びその遺伝子を含む組換え体DNAは
例えば特開昭60−110292号に記載されている方法により
取得することができる。即ち、以下のようにして得るこ
とができる。

１）コマモナス属細菌SY−77−１（微工研菌寄第2410
号）の菌体より全DNAを抽出し、制限酵素で切断する。

２）ベクターDNAを制限酵素で切断・開裂させる。

３）ベクターDNAの開裂部位に１）で得たDNA断片を組込
ませ、閉環した組換え体DNAをつくる。

４）組換え体DNAを宿主たる大腸菌に導入する。

５）組換え体DNAを導入させた大腸菌の中から、グルタ
リル７−ACAアシラーゼ活性を有する菌株を選択分離す
る。

６）選択された大腸菌の菌株よりプラスミドDNAをとり
出し、制限酵素および再結合酵素あるいは他のベクター
を用いて改変し、グルタリル７−ACAアシラーゼ遺伝子
の発現が増大するようになった組換え体DNAをつくる。

７）改変された組換え体DNAを大腸菌に導入し、その後
導入された大腸菌の中からグルタリル７−ACAアシラー
ゼ産生能の増大した株を選択分離する。

尚、前記２種の遺伝子の調製、それらを含む組換え体
DNAならびにその組換え体DNAで形質転換転換された大腸
菌の調製は通常の公知の組換えDNA技術により行なうこ
とができる。

以上のようにして得られる大腸菌を通常の培養条件で
培養することによりＤ−アミノ酸オキシダーゼおよびグ
ルタリル７−ACAアシラーゼを、両者を同時に著量含む
培養物が得られる。得られた培養物はそのまま用いても
よいし、この培養物を例えば菌体を集めて破砕して酵素
を抽出したり、それを液体クロマトグラフィーや等電点
電気泳動等に供するなどの公知の常用手段を用いる精製
処理に付すことにより、部分精製もしくは実質的に完全
に精製したＤ−アミノ酸オキシダーゼおよびグルタリル
７−ACAアシラーゼを調製してこれを用いてもよい。

上記両酵素活性を有する培養物またはその部分的また
は実質的に完全に精製した両酵素を含む混合物を酵素混
合物として用いて化合物（Ｉ）またはその塩に作用させ
ることにより、化合物（II）またはその塩を効率よく生
成させることができる。この反応は水性媒体中で行なわ
れ、反応時のpHは7.0〜8.5を、温度は20〜40℃を維持す
ることが好ましい。本発明の方法で用いられる水性媒体
としては例えば水およびリン酸緩衝液などの緩衝液など
があげられる。

本発明の方法により、化合物（Ｉ）またはその塩から
化合物（II）またはその塩を製造するメカニズムを化合
物（Ｉ）においてＲが−OCOCH₃である場合、即ちセファ
ロスポリンＣである場合を例にとって説明すると以下の
ようになる。

まず、セファロスポリンＣが酵素混合物中のＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼの作用により酸化されて７β−（５−
カルボキシ−５−オキソペンタンアミド）セファロスポ
ラン酸が生成する。この時に過酸化水素が同時に生成す
る。この過酸水素の作用により、生成した７β−（５−
カルボキシ−５−オキソペンタンアミド）セファロスポ
ラン酸が脱炭酸されてグルタリル７−ACAに転化され
る。グルタリル７−ACAは酵素混合物中のグルタリル７
−ACAアシラーゼの作用を受けて脱アシル化され７−ACA
［一般式（II）で表わされる化合物においてＲが−OCOC
H₃のもの］が生成する。

上記反応系において用いる酵素混合物を調製する際に
使用する大腸菌として、通常の大腸菌を用いた場合、過
酸化水素を分解するカタラーゼ活性を有しているため、
該酵素混合物中にカタラーゼが混入し、そのためその酵
素混合物を用いると上記の反応過程で生成する過酸化水
素を分解し、反応の進行をさまたげる。これを解決する
ためには、過酸化水素の存在下に水性媒体中で該酵素混
合物を作用させればよい。過酸化水素を存在させる方法
としては、高濃度の過酸化水素はセファロスポリン化合
物を分解してしまうので必要量をできるだけ低濃度にな
るように加えるのが好ましく、適当な方法で過酸化水素
を補給することが望ましい。また、カタラーゼ活性を欠
損している大腸菌の変異株を誘導し、これを宿主とした
形質転換体を用いた場合には該酵素混合物を過酸化水素
の非存在下に作用させることができる。

尚、上記カタラーゼ欠損変異株の誘導は通常の公知の
方法、例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジンな
どの変異誘起剤を用いる方法などにより行なうことがで
きる。

以上のようにして生成した化合物（II）またはその塩
は公知の通常の方法、例えばカラムクロマトグラフ法、
等電点沈でん法などを使用して反応液から分離精製する
ことができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、
本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

なお実施例において化合物（II）またはその塩の定量
には高速液体カラムクロマトグラフを用いた。カラムは
ミクロボンダパンク（μ−Bondapak）C₁₈（ウォーター
ズ社製）を用い、移動相としては５％酢酸アンモニウム
98容とアセトニトリル２容の混合液を用いた。化合物
（II）またはその塩の検出は260mmで行なった。

また実施例において７−ACAまたはその誘導体の生成
率は、次式により求めた 更に、実施例において７−ACAまたはその誘導体の純
度は実施例で得られた７−ACAまたはその誘導体の粉末
を一定量とって水に溶解し、これを前記液体クロマトグ
ラフィーに供し、７−ACAまたはその誘導体を定量し、
該粉末中の７−ACAまたはその誘導体の含量（％）を計
算することにより求めた。

〔実施例〕

参考例１ 本参考例１はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む
形質転換体とグルタリル７−ACAアシラーゼ遺伝子を含
む形質転換体を別々に培養して得られる培養物を用いる
方法である。

〔１〕酵母トリゴノプシス・バリアビリス（Trigonopsi
s variavilis）からクローニングされたＤ−アミノ酸
オキシダーゼ遺伝子を含む組換え体pEDA01を保持し、Ｄ
−アミノ酸オキシダーゼを生産する大腸菌エシェリヒア
・コリ（Escherichia coli）MB65/pEDA01〔特願昭61−
215878（特開昭63−71180）〕は下記の方法によって調
製した。

1.トリゴノプシス・バリアビリスからの全DNAの抽出と
切断 クライヤー（Cryer）らの方法〔文献：メソッズイン
セルバイオロジー（Methods in Cell Biology）12巻、3
9−44,アカデミックプレス（Academic Press）社,197
5〕にしたがって、トリゴノプシス・バリアビリスCBS 4
095から全DNAを抽出精製した。このDNA40μｇをとり、
制限酵素MboI4単位と37℃、15分間反応させた。反応液
を等量のフェノール・クロロホルム（1:1）で抽出し、D
NAをエタノールで沈殿させた後、0.1倍濃度のTE緩衝液
〔10mMトリス−塩酸（pH8.0）,1mMEDTA〕にとかした。
得られたDNA溶液の全量を0.7％アガロースゲル電気泳動
に供し、６〜9kbの大きさに相当するゲルからDNAをふく
む部分を切出して、電気溶出法によりゲルからDNA断片
を溶出させた。ついで溶出液を等量のフェノールおよび
フェノール・クロロホルムで順次抽出し、得られる水層
にエタノールを添加してDNAを沈殿させた後、0.1倍濃度
のTE緩衝液20μｌにとかした。

2.ベクターDNAの開裂 ベクターpUC18 30μｇをBamHIで完全に開裂させ、得
られたDNA断片を0.1倍濃度のTE緩衝液20μｌにとかし
た。

3.ベクターへのDNA断片の挿入 上記工程１で得られた溶液と上記工程（２）で得られ
た溶液を3:1の割合に混合し、T4・DNAリガーゼを15℃で
６時間反応させ、ベクターとトリゴノプシス・バリアビ
リスCBS 4095のDNA断片を結合させた。

4.トリゴノプシス・バリアビリスのDNAライブラリーの
作成 まず大腸菌宿主としてセファロスポリナーゼ 欠損変
異菌株を造成した。すなわちエシェリヒア・コリ（Esch
erichia coli）MC 1061（米国シカゴ大学マルコム カ
サダバン（Malcom Casadaban）博士より入手。本菌の性
質はジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー
（J.Mol.Biol.），138,179−207,1980に記載されてい
る）をＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンで処理した後、セファロスポリンＣに対する感受性
が増大したコロニーを選択した。これらの中からセファ
ロスポリナーゼ活性をほとんど示さない株を選択分離
し、その一株をエシュリヒア・コリMB65と命名して宿主
として用いた。なお、本変異株エシュリヒア・コリMB65
は工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第89
00号として寄託されている。つぎに上記工程３で得られ
た組換え体DNAを形質転換によりエシェリヒア・コリMB6
5に導入し、アンピシリン50μg/mlをふくむＬ−ブロス
寒天培地〔バクトトリプトン（ディフコ（Difco）社
製）１％、酵母エキス0.5％、NaCl 0.5％、寒天1.5％〕
上で生育してきたコロニーを集めて、これをトリゴノプ
シス・バリアビリスCBS 4095のDNAライブラリーと称し
た。

5.D−アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末端アミノ酸配
列の決定 トリゴノプシス・バリアビリスCBS 4095から前述のス
ワジュセル（Szwajcer）らの方法にしたがってＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼを精製した。精製した酵素蛋白質のア
ミノ基末端のアミノ酸配列を前述の方法により解析し、
アミノ基末端から41番目までのアミノ酸配列を決定し
た。得られたＮ−末端アミノ酸配列を次式にて表わす。

Ala−Lys−Ile−Val−Val−Ile−Gly−Ala−Gly−Val
−Ala−Gly−Leu−Thr−Thr−Ala−Ler−Gln−Leu−Leu
−Arg-Lrs-Gly-His-Glu-Val−Thr−Ile−Val−Ser−Glu
−Phe−Thr−Pro−Gly−Asp−Leu−Ser−Ile−Gly−Tyr
− 注：下線部はプローブ合成に用いられた配列を示す。

6.DNAプローブの合成 上記工程５で得られたアミノ酸配列中から前記式中に
下線で示される２箇所の配列を選択し、これらのアミノ
酸配列から推定される遺伝子上の可能なDNA塩基配列す
べてをふくむオリゴヌクレオチド混合物を第１表に示す
ように合成した。すなわち各アミノ酸配列ごとに可能な
オリゴヌクレオチドを２群にわけて合成して混合物をつ
くり、これらをDNAプローブDAO−１とDAO−２、およびD
AO−３とDAO−４と称した。オリゴヌクレオチドの合成
はすべてアプライド バイオシステム（Applied Biosys
tem）社のDNAシンセサイザー（Synthesizer）モデル380
−Ａを用いて行なった。

7.DNAライブラリーからＤ−アミノ酸オキシ ターゼ・クローンの候補の選択・分離 上記工程６で得られたDNAプローブを各々イングリア
（Inglia）らの方法〔文献：ヌクレイック アシッド
リサーチ（Nucleic Acids Res.），9,1627−1642,198
2〕にしたがってT4ポリヌクレオチドキナーゼとγ−³²P
−ATPを用いてラベルした。つぎにDNAライブラリーであ
る前記工程４で得られた大腸菌をアンピシリン50μg/ml
をふくむＬ−ブロス寒天培地上でコロニーとして生育さ
せ、これをレプリカ法によってワットマン（Whatman）5
41紙でうつし、リゾチームで溶菌し、アルカリでDNA
変性させ、塩酸による中和処理を行なった後、DAO−１
およびDAO−２とハイブリダイゼーションさせた。ハイ
ブリダイゼーションは６倍濃度のSSC（0.15M NaCl,0.01
5Mクエン酸ナトリウム,pH7.0）,0.5％ノニデットＰ−40
（シグマ社、米国製）、DAO−１あるいはDAO−２約２×
10¹⁵cpm/mlを用いて、44℃で１時間半行ない、この後６
倍濃度のSSCを用いて室温で２回、つづいて６倍濃度のS
SCを用いて44℃で１回紙を洗浄した。この後紙を乾
燥させ、オートラジオグラフィ（感光条件：−80℃,3時
間）に供した。その結果、DAO−１またはDAO−２に対し
ハイブリダイゼーション陽性のコロニーが多数見出され
た。そこで陽性のコロニーから40株をとりあげ、液体培
養した後、バーンボイム（Birnboim）らの方法〔文献：
ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acids Re
s.），7,1513−1523,1979〕によりプラスミドDNAを調製
した。ついでこれらのDNAを常法により変性させた後、
ニトロセルロースフィルターにスポットして、DNAプロ
ーブとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼ
ーションは６倍濃度のSSC、10倍濃度のデンハルト（Den
hardt）液（0.02％フィコール、0.02％ポリビニルピロ
リドン、0.02％牛血清アルブミン）およびラベルしたDN
Aプローブを用いて、44℃（DAO−１およびDAO−２の場
合）または40℃（DAO−３およびDAO−４の場合）で１時
間行ない、この後６倍濃度のSSCを用いて室温で１回、
ついで44℃（DAO−１およびDAO−２の場合）または40℃
（DAO−３およびDAO−４の場合）で１回洗浄した。この
後フィルターをオートラジオグラフィー（感光条件：−
80℃,3時間）に供した結果、DAO−１あるいはDAO−２に
ハイブリダイゼーション陽性に示すものでかつDAO−３
あるいはDAO−４にも陽性を示すものが６株見出され
た。これら６株からのプラスミドDNAを種々の制限酵素
で切断し、アガロースゲル電気泳動を行なった後、ラベ
ルしたDNAプローブとサザン・ハイブリダイゼーション
〔方法については文献：サザン（Sout hern）（1975）
ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（J.Mol.Bio
l.），98,503−517）を行なった。その結果、EcoRI切断
で生成する約0.6kbのDNA断片にDAO−２とDAO−３または
DAO−４が強くハイブリダイゼーション陽性を示すプラ
スミドDNAが見出された。このプラスミドをPDAO2−12と
命名し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ・クローンの候補と
した。

8.D−アミノ酸オキシダーゼ・クローンの同定とDNA塩基
配列の決定 プラスミドpDAOC2−12よりEcoRI切断により生成する
0.6kbのDNA断片について、前述のサンガー（Sanger）ら
の方法に従ってDNA塩基配列を決定した。その結果、第
２図で示されるように真核生物の遺伝中に存在するイン
トロン様の配列をはさんで、上記工程５で得られたＤ−
アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末端のアミノ酸配列に
完全に一致するアミノ酸配列をコードする塩基配列が見
出され、この断片がＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の
一部をふくむことが明らかになった。プラスミドpDAOC2
−12については、制限酵素切断の結果にもとづいて第３
図にあらわされる制限酵素開裂地図を作成した。上記の
結果にもとづいて、すでに決定された塩基配列から遺伝
子読取り方向の下流にあたる領域についてDNA塩基配列
を決定したところ、第１図に示される355個のアミノ酸
よりなる蛋白質をコードする塩基配列が存在することが
判明した（第１図では第２図で示されたイントロン様配
列を削除して表示してある）。かくしてプラスミドpDAO
C2−12中のトリゴノプシス・バリアプリスCBS 4095由来
のDNA断片中にはＤ−アミノ酸オキシダーゼの構造遺伝
子が完全にふくまれているものと推定された。

9.D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の修飾 クローニングされたＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子
が大腸菌で発現する上で障害となりうるDNA塩基配列部
分をプラスミドpDAOC2−12中のトリゴノプシス・バリア
ビリスCBS 4095由来のDNA断片から第４図に示される工
程にしたがって削除した。以下に各工程を詳述する。

（１）プラスミドpDAOC2−12 40μｇをEcooRIとHindIII
で切断し、得られる約0.45kbの断片を精製した後、その
0.8μｇにdATP,dGTP,dCTP,TTPを終濃度各0.33mM,DNAポ
リメラーゼクレノウ（Klenow）断片５単位を加え、10mM
トリス−塩酸（pH7.5）、10mM MgCl₂、1mMジチオレイト
ール、50mM NaClの反応液30μｌ中で30℃、20分間反応
させた。これより両端が平滑端にされたDNA断片を精製
し、その約0.2μｇにBamHIリンカー（0.0175 O.D.）とT
4 DNAリガーゼ１単位を加え、50mMトリス−塩酸（pH7.
5）、10mM MgCl₂、0.5mM ATP、5mMジチオスレイトール
の反応液20μｌで15℃、一夜反応させた。反応後DNA断
片を精製し、EcoRIとBamHIで両端を切断し、EcoRI−Bam
HI断片として回収した。一方ファージM13mp18の２本鎖D
NAをEcoRIとBamHIで切断した後、これに上記のEcoRI−B
amHI断片を加え、T4DNAリガーゼで結合させて、Ｄ−ア
ミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一部を組みこんだファージ
M13M2−12−７を造成した。

（２）イントロン様配列を削除するために、第４図に示
されるようにイントロン様配列の前後を直結した配列に
相補するオリゴヌクレオチドを合成し、DAOE1と命名し
た。DAOE1 25 pmoleとM13プライマーM1（宝酒造社製）1
0pmoleをT4ポリヌクレオチドキナーゼでりん酸化し、メ
ッシング（Messing）の方法〔文献：メソッズインエン
ザイモロジー（Methods Enzymol.），101,20−78,198
3〕にしたがって調整したファージM13M2−12−７の１本
鎖DNA約0.5pmoleを加え、95℃で５分間加熱後室温にな
るまで放置した。ついでこれにdATP,dGTP,dCTP,TTP（各
0.4mM）,ATP（0.4mM）,DNAポリメラーゼクレノウ（Klen
ow）断片（５単位）、T4DNAリガーゼ（２単位）を加
え、各7mMのトリスー塩酸（pH7.5）、MgCl₂、NaClおよ
び14mMのジチオスレイトールの反応液50μｌ中で37℃、
30分間反応させた。0.5MのEDTA5μｌを加えて反応停止
後、メッシング（Messing）の方法（文献前出）にした
がってエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）JM105
を反応液でトランスフェクション処理し、ファージ導入
菌をプラークとして検出した。出現したファージ・プラ
ークをプラーク・ハイブリダイゼーション法〔文献：ベ
ントン（Benton）ら（1977）サイエンス（Science），1
96,180−182〕によって³²PでラベルしたDAOE1とハイブ
リダイゼーションさせ、陽性を示したプラークを見出し
た。陽性プラーク中のファージを再度エシュリヒア・コ
リJM105に感染させて、上記と同様にしてDAOE1とハイブ
リダイゼーションを示すプラークを純化して分離した
後、プラーク中に存在するファージを常法によって液体
培養し、１本鎖DNAを分離した。得られた１本鎖DNAの塩
基配列を解析したところ、予定通りイントロン様配列を
欠失した塩基配列をもつトリゴノプシス・バリアビリス
CBS4095由来のDNA断片をもつことが判明したので、この
ファージをM13ME1と命名した。

（３）つぎにＤ−アミノ酸オキシダーゼ蛋白質合成開始
部位（ATG）よりも上流にあるトリゴノプシス・バリア
ビリスCBS4095由来のアミノ酸非コード領域を削除する
ために、第４図に示されるようにこの領域の前後を直結
した配列に相補するポリヌクレオチドを合成し、DAOE2
と命名した。ついでDAOE2とファージM13ME1の１本鎖DNA
とから、上記工程（２）でのべた方法と同一の工程にし
たがって、イントロン様配列の削除を加えてATGより上
流のアミノ酸非コード領域をも削除されたＤ−アミノ酸
オキシダーゼ遺伝子の一部を保有するファージを造成
し、これをM13ME12と命名した。

10.発現ベクターの造成 本実施例に用いられる発現用ベクター造成の出発プラ
スミドであるpAKKM1は公知の文献マツダ（Matsuda）ら
（1985）ジャーナルオブバクテリオロジー（J.Bacterio
l.），163,1222−1228にその造成方法が示されており、
β−ラクタマーゼ遺伝子が不活化された特徴をもつ。第
５図に示すように、まずpAKKM1をEcoRIとBamHIで切断
し、これより約5kbのDNA断片を分離・精製した。一方la
cUV5プロモーターをふくむプラスミドpRZ4022〔米国ウ
ィスコンシン大学ダブリュー・レズニコフ（W.Reznikof
f）博士より入手〕をEcoRIとBamHIで切断することによ
りlacUV5プロモーターを含む95bpの断片を調製した。つ
いで上記２断片をT4DNAリガーゼを用いて結合させ、発
現用ベクターpEX002を得た。なお上記で用いたプラスミ
ドpRZ4022はギルバート（Gilbert）らの方法〔文献：プ
ロシーディングスオブナショナルアカデミーサイエンス
ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），70,3581−3
584,1973〕にしたがってlacUV5プモーターをふくむ95bp
のALuI断片を調整し、pBR322のEcoRI−BamHI部位に置換
挿入することによって造成される。

11.D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の発現 第６図にＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換
え体の造成工程を示す。まずファージM13ME12の２本鎖D
NAよりEcoRIおよびBamHI切断により約0.3kbのＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼのアミノ基末端部分をコードするDNA
断片を分離した。ついでpDAOC2−12よりEcoRIおよびSal
I切断によりM13ME12にふくまれている部分をのぞく約1.
2kbのＤ−アミノ酸オキシダーゼの構造遺伝子部分をコ
ードするDNA切断を分離した。さらに発現用ベクターpEX
002をBamHIおよびXhoIで切断した後、上記の２つの断片
と混合し、T4DNAリガーゼで結合反応を行なわせた。そ
の反応液を用いてエシェリヒア・コリMB65を形質転換
し、カナマイシン40μg/mlをふくむＬ−ブロス寒天培地
上で生育してくるコロニーを選択した。得られたコロニ
ーについて、Ｄ−メチオニンを基質とし、Ｏ−ジアニシ
ジンを用いるＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の検出をヘ
ドリック（Hedrick）ら（1968）アーカイブスオブバイ
オケミストリーアンドバイオフィジックス（Arch.Bioch
em.Biophys.），126,155−164の方法に従って行なった
結果、多数の陽性コロニーを得た。この中の１株からプ
ラスミドDNAを抽出し、これをpEDAO1と命名し、制限酵
素切断により第６図に示される構造を確認した。またこ
の組換え体を保有する大腸菌をエシェリヒア・コリMB65
/pEDAO1と命名した。

この菌をカナマイシン40μg/mlをふくむＬ−ブロス
（Ｌ−ブロス寒天培地より寒天を除いたもの）100mlに
植菌し、32℃で24時間振とう培養した。培養液を遠心分
離して集菌し、これを10mlの0.1Mプロリン酸緩衝液（pH
8.0）に懸濁した。これを超音波処理して細胞を破砕
し、遠心分離した後の上清をＤ−アミノ酸オキシダーゼ
酵素液とした。

〔２〕コマモナス・エスピー（Comamonas sp.）SY−77
−１（微工研菌寄第2410号）からクローニングされたグ
ルタリル７−ACAアシラーゼ遺伝子を含む組換え体pAKKB
1001（特開昭60−110292）を下記の方法によって調製し
た。

１）コマモナス属細菌SY−77−１（微工研菌寄第2410
号）から全DNAの調製とその切断 ニュートリエント・ブロス（牛肉エキス0.3％，ペプ
トン0.5％）100mlにコマモナス属細菌SY−77−１（微工
研菌寄第2410号）を接種し、30℃にて一夜培養後集菌
し、8mlのTE緩衝液に懸濁する。これにリゾチームを終
濃度1mg/mlになるように加え、37℃にて１時間反応させ
る。次にこれにプロナーゼＥを終濃度200μg/mlになる
ように加え、つづいてドデシル硫酸ナトリウムを終濃度
１％となるように加えて37℃にて１時間反応させる。反
応終了後反応液に等容量のTNE緩衝液（50mMTris−HCl,5
mM EDTA,100mM NaCl;pH8.0）で飽和したフェノールを加
え、混合した後10,000rpmで10分間遠心し、水層を採取
する。この水層に等容量のフェノール・クロロホルム混
液（1:1,V/V）を加え、同様にして遠心後水層を採取し
て、さらに等容量のクロロホルムを加えて同様にして遠
心後水層を採取する。採取した水溶液にリボヌクレアー
ゼＡを終濃度40μg/mlになるように加え、37℃にて１時
間反応させる。反応終了後NaClとポリエチレングリコー
ル6000を各々終濃度1Mおよび10％になるように加え、４
℃にて４時間保持してから5000rpmで５分間遠心し、生
成した沈殿を0.1倍濃度TE緩衝液に溶かす。こうして得
られた溶液を酢酸ナトリウムを終濃度300mMになるよう
に加え、２倍容量のエタノールを加えて、−20℃にて４
時間保持した後、10,000rpmで20分間遠心してDNAの沈殿
を集める。この沈殿を0.1倍濃度TE緩衝液に溶かし、以
後の切断反応に供する。DNAの切断のためには１μｇのD
NAに対し0.3単位のPstIを加え、10mM Tris−HCl（pH7.
4）,10mM MgSO₄,50mM NaCl,1mMジチオスレイトールの緩
衝液30μｌ中で37℃にて1.5時間反応を行なわせ、つづ
いて70℃にて10分間加熱して反応を停止させる。

２）ベクターpBR322の開裂 １μｇのpBR322に対し１単位のPstIを加え、１）と同
一の緩衝液30μｌ中で37℃にて２時間反応させ、１）と
同様にして反応を停止させる。

３）再結合反応 0.8μｇの切断されたコマモナス属細菌SY−77−1DNA,
0.4μｇの開裂されたpBR322,30mM Tris−HCl（pH7.5）,
10mM MgCl₂,10mM 2−メルカプトエタノール,10mM ATP,1
単位T₄リガーゼをふくむ100μｌの反応液中で22℃にて
２時間反応させる。その後70℃にて10分間加熱すること
により、反応を停止させる。

４）組換え体プラスミドの大腸菌への導入 ３）で再結合反応させることにより得られたDNA溶液
でエシェリヒア・コリK12C600r−ｍ−（ATCC33525）を
形質転換し、テトラサイクリン10μg/mlを含むＬ−ブロ
ス寒天培地に生育してくるコロニーを分離した。これら
のコロニーをアンピシリン50μg/mlをふくむＬ−ブロス
寒天培地上に移植して生育の有無を試験し、アンピシリ
ン感受性を示すコロニーを組換え体DNAを保持した大腸
菌として分離した。

５）グルタリル７−ACAアシラーゼ産生能を有する大腸
菌の選択分離 上記のようにして得られたアンピシリン感受性株をテ
トラサイクリンをふくむＬ−ブロス寒天培地上で32℃に
て一夜培養し、生育した菌の一部をかきとって100μｌ
のグルタリル７−ACA（1mg/ml）をふくむ0.1M燐酸緩衝
液（pH7.0）に懸濁した後、37℃にて５時間反応させ
る。その後120μｌの反応停止液（100％酢酸２容と0.25
M NaOH1容の混合液）を加え、さらに40μｌの発色液
（ｐ−ジメチルアミノベンズアンデヒドを0.5％になる
ようにメタノールに加えた液）を加える。この反応でグ
ルタリル７−ACAアシラーゼ産生能を有する大腸菌は反
応液を黄色に変色させる。こうして得られた新規な大腸
菌をエシェリヒア・コリK12C600（pAKK1001）と命名し
た。

６）大腸菌プラスミドDNAの分離と解析 上記の大腸菌を100mlのテトラサイクリンをふくむＬ
−ブロスに接種し37℃にて一夜培養後、遠心集菌し、15
％蔗糖、50mM Tris−HCl（pH8.5）,50mM EDTAおよび1mg
/mlのリゾチームよりなる溶液2mlに懸濁した後、室温に
て１時間保持する。

次にトリトン（Triton）溶液（0.1％ TritonX−100,5
0mM Tris−HCl,50mM EDTA;pH8.5）2mlを加え、37℃にて
30分間保持する。その後この溶液を５℃にて30,000rpm
で30分間遠心し、上清を採取する。これをエチジウムブ
ロマイドー塩化セシウム平衡密度勾配遠心（15℃にて4
0,000rpm,48時間）にかけ、プラスミドDNAを分離精製す
る。これを２）と同様の方法でPstIで切断し、断片の長
さを１％アガロースを用いたアガロース電気泳動法で測
定したところ、ベクターDNAに相当する4.3Kbの断片の他
に3.6Kb,2,6Kb,0.9Kbの断片が見出された。このことか
ら新規な大腸菌から分離された組換え体DNAは第７図に
おいて制限酵素地図で示される構造を有し、組換え体DN
AではpBR322に7.1KbのDNA断片が組み込まれていること
が判明した。

７）反応生成物の確認 上記の新規な大腸菌をテトラサイクリンをふくむＬ−
ブロス5mlに接種し、32℃にて一夜培養後遠心集菌し、1
mlのグルタリル７−ACA（25mg/ml）をふくむ0.1M燐酸緩
衝液に懸濁する。これを37℃にて６時間反応させ、遠心
して上清を採取し、高速液体クロマトグラフィーに供す
る。高速液体クロマトグラフィーにはLinchrosorb S110
0を充てんしたカラム（150×4mm）を用い、溶媒として
は0.1M燐酸緩衝液（pH7.5）を用いて溶出し、溶出液中
の紫外部吸光物質を260nmの吸光度を測定して検出す
る。上記反応液からは７−ACAに完全に一致する紫外線
吸光物質が検出され、７−ACAが生成していることが確
認された。

８）組換え体DNAの改変によるグルタリル７−ACAアシラ
ーゼ産生能の増大した大腸菌の分離 組換え体DNA中に存在するグルタリル７−ACAアシラー
ゼ産生遺伝子の発現を増大することによりグルタリル７
−ACAアシラーゼの産生を増大させるため、以下にのべ
る工程にしたがって組換え体DNAの改変が行なわれた。

ａ）エシェリヒア・コリK12C600（pAKK1001）から６）
のようにして分離したプラスミドDNAを以下のようにし
てBamHIで部分的に切断する。プラスミドDNA1μｇに対
し0.5単位のBamHIを加え、１）でのべたDNA切断用の緩
衝液30μｌ中で37℃にて１時間反応させた後、等容量の
TNE緩衝液で飽和したフェノールを加え、反応を停止さ
せる。次に遠心によりフェノールを除去した後、等容量
のエチルエーテルを加えて混合し、エチルエーテルを除
去する。この溶液中のDNAエタノールで沈殿させ、沈殿
を0.1倍濃度TE緩衝液に溶かす。

ｂ）ベクターpBR325を２）でのべた方法によってPstIで
開裂し３）でのべた方法で再び閉環させた後、エシェリ
ヒア・コリK12C600r−ｍ−（ATCC33525）に導入し、テ
トラサイクリンをふくむＬ−ブロス寒天培地上に生育し
てくるコロニーからアンビシリンに感受性になった株を
選択分離する。こうして得られたアンピシリン感受性株
よりプラスミドDNAを取得することにより、アンピシリ
ン耐性遺伝子（β−ラクタマーゼ産生遺伝子）が不活性
された新規なベクターが得られる。

ｃ）上記の新規なベクタープラスミドをBamHIで開裂さ
せる。

ｄ）ａ）で得られたDNAと開裂された新規なベクタープ
ラスミドを３）でのべた方法より再結合し、エシェリヒ
ア・コリK12C600r−ｍ−（ATCC33525）に導入した後、
クロラムフェニコール20μg/mlをふくむＬ−ブロス寒天
培地に生育するコロニーを選択分離する。

ｅ）選択された株の中から５）にのべる方法によりグル
タリル７−ACAアシラーゼ産生能を有する株を選択分離
する。次にグルタリル７−ACAアシラーゼ産生能を有す
る株のグルタリル７−ACAアシラーゼ活性を測定し最も
活性の高い株を選択分離する。グルタリル７−ACAアシ
ラーゼ活性の測定にはクロラムフェニコールをふくむＬ
−ブロス5mlで一夜培養した菌体をグルタリル７−ACA
（25mg/ml）をふくむ0.1M燐酸緩衝液（pH7.0）2mlに懸
濁し、37℃にて15分間反応させ、反応後直ちに遠心して
菌体を除去した後、反応液の一定量を高速液体クロマト
グラフィーに供し、生成している７−ACAを定量する。

このようにして得られた高いグルタリル７−ACAアシ
ラーゼ産生能を有する新規な大腸菌の一株をエシェリヒ
ア・コリK12C600（pAKKB1001）と命名した。新規な大腸
菌のグルタリル７−ACAアシラーゼ産生能を比活性で比
較したところ、コマモナス属細菌SY−77−１（微工研菌
寄第2410号）の活性を１とするとき、エシェリヒア・コ
リK12C600（pAKK1001）は３、これに対してエシェリヒ
ア・コリK12C600（pAKKB1001）では15であった。

９）グルタリル７−ACAアシラーゼ産生能の増大した大
腸菌よりプラスミドDNAの分離と解析 ８）で得られた新規な大腸菌より６）でのべた方法に
よってプラスミドDNAを分離し、BamHIで切断してアガロ
ースゲル電気泳動法でDNA断片の長さを測定したとこ
ろ、８）のｂ）で得られた新規なベクターに相当する5.
9Kbの断片の他に4.8Kb,0.7Kbの断片が見出された。さら
にプラスミドDNAをPstIで切断し、アガロースゲル電気
泳動法で解析した結果にもとづいて、第８図に示される
組換え体DNAの制限酵素地図が作成された。

このことからエシェリヒア・コリK12C600（pAKKB100
1）より分離された組換え体DNAでは、pBR325を改変した
新規なベクターDNAにエシェリヒア・コリK12C600（pAKK
1001）から分離された組換え体DNAの一部分である5.5Kb
のDNA断片が組み込まれていることが判明した。

得られたプラスミドpAKB1001を第９図に示す工程によ
り改変してから、形質転換体を得て、酵素生産に用い
た。以下にこの工程を詳しく説明する。

プラスミドpAKKB1001を制限酵素Hpalで開裂し、つづ
いて制限酵素PvuIIで部分的に切断した後、T4DNAリガー
ゼで再結合させた。これでエシェリヒア・コリMM294
［アメリカンタイプカルチャーコレクション（American
Type Culture Collection）よりATCCNo.33678として入
手できる］を形質転換し、クロラムフェニコール25μg/
mlを含むＬ−ブロス寒天平板上で生育するがテトラサイ
クリン10μg/mlを含む培地上では生育できない（これを
テトラサイクリン感受性と称する）コロニーを選択し
た。このコロニーを培養してプラスミドDNAを分離し、p
AKKB1003と命名した。改変された組換え体はグルタリル
７−ACAアシラーゼ遺伝子を保持し、かつ小型化された
特徴をもつ。

プラスミドpUC9（アメンカンタイプカルチャーコレク
ションよりATCCNo.37252として入手できる）を制限酵素
HaeIIIで切断し、生成したDNA断片から約0.2Kbの大きさ
の断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、精製し
た。一方プラスミドpAKKB1003を制限酵素HindIIIで開裂
し、つづいてHaeIIIで部分的に切断した後、DNAポリメ
ラーゼ・クレノウ（Klenow）断片とdATP,dGTP,dCTPおよ
びTTPを作用させて、切断端を平滑末端にした。このも
のと上記のpUC9から分離した断片を混合し、T4DNAリガ
ーゼで結合反応を行なった。これをエシェリヒア・コリ
MM294を形質転換し、クロラムフェニコール25μg/mlと
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド20μg/mlを含むＬ−ブロス寒天平板上で生育
し、かつ青色を呈するコロニーを選択した。これらのコ
ロニーにグルタリル７−ACAを作用させ、前記５）に記
載のｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドで７−ACAを
発色させる方法を用いてグルタリル７−ACAアシラーゼ
活性を検出した。酵素活性を有するコロニーを選択し、
これによりプラスミドDNAを分離して、pAKKlac1001と命
名した。この組換え体をさらに簡便なものにするため、
pAKKlac1001を制限酵素HindIIIとSmalで切断し、DNAポ
リメラーゼ・クレノウ断片を前記と同様に作用させて平
滑末端をもつ断片とした後、T4DNAリガーゼで再結合さ
せた。これにエシェリヒア・コリMB65（微工研菌寄第89
00号）を形質転換し、クロラムフェニコールに耐性でか
つグルタリル７−ACAアシラーゼ活性を有するコロニー
を選択した。このコロニーよりプラスミドDNAを分離
し、pAKKΔSH1と命名し、またこれによる形質転換体を
エシェリヒア・コリMB65/pAKKΔSH1と命名した。組換え
体pAKKΔSH1は、エシェリヒア・コリのβ−ガラクトシ
ターゼ遺伝子のプロモーターを含む部分と融合し、発現
の調節が可能になったグルタリル７−ACAアシラーゼ遺
伝子を含むようになった特徴をもつ。

こうして得られたエシェリヒア・コリMB65/pAKKΔSH1
をクロラムフェニコール25μg/mlを含むＬ−ブロスで培
養し、上記（１）と同様に処理して、グルタリル７−AC
Aアシラーゼ酵素液を調製した。

〔３〕Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ酵素液10ml、グルタリ
ル７−ACAアシラーゼ酵素液10mlおよび0.1Mリン酸緩衝
液（pH8.0）30mlを混合し、セファロスポリンＣ（純度7
0％）714mgを添加して、37℃で振とうしながら反応を行
なった。30％過酸化水素水を反応開始後15分,30分,45分
後に各々0.5ml、70分、85分、100分後に各々0.01ml加え
て120分間反応を行なった。反応終了後中の７−ACAの生
成率は55.7％であった。

反応液で水で３倍に希釈し、100mlのDEAEセファデッ
クスＡ−25（Cl^-型．ファルマシア社製）のカラムに通
した。120mlの水で洗い、ついで0.05Mの食塩水を通すと
７−ACAが溶出された。７−ACA画分を集め、pH7.0に調
節して減圧濃縮後、予め0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で
洗ったダイヤイオンHP−20（三菱化成製）100mlのカラ
ムを通過させ、次に脱イオン水で充分カラムを水洗した
後、50％メタノール水で溶出した。７−ACA溶出画分を
集め、減圧濃縮後、pH3.0に調節し、冷所に放置したと
ころ、７−ACAが析出した。沈殿物を集め、真空乾燥し
て、160mgの７−ACAを得た。この純度は80％であった。

参考例２ 参考例１と同様の反応系にデアセチルセファロスポリ
ンＣ（純度65％）500mgを添加し、37℃で120分反応を行
なった。反応終了液中の７−アミノデアセチルセファロ
スポラン酸の生成率は52％であった。

実施例１ 本実施例はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組
換え体とグルタリル７−ACAアシラーゼ遺伝子を含む組
換え体が共存する形質転換体を用いる方法に関する。

（１）pEDAO1およびpAKKΔSH1はもとにpBR322に起源を
もつベクターを用いて造成された組換え体である。そこ
でpBR322とは不和合性の異なることが知られているプラ
スミドpACYC184（アメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョンよりATCCNo.37033として入手できる）に、第10図に
示される工程で、pAKKΔSH1中のグルタリル７−ACAアシ
ラーゼ遺伝子を含むDNA断片を組み込んだ。すなわち、
まずpACYC184をHindIIIで開裂した。一方pAKKΔSH1を制
限酵素PVuIIとNdeIで切断し、生成した約3KbのDNA断片
をアガロースゲル電気泳動で分離し、精製した後、DNA
ポリメラーゼ・クレノウ断片を前記と同様に作用させ
て、平滑末端をもつ断片とした。これにTDNAリガーゼの
作用でHindIIIリンカーを付加し、HindIIIで処理した
後、上記のpACYC184と混合し、T4DNAリガーゼで両者を
結合させた。これでエシェリヒア・コリMB65を形質転換
し、クロラムフェニコールに耐性でかつテトラサイクリ
ンに感受性であり、しかもグルタリル７−ACAアシラー
ゼ活性を有するコロニーを選択した。このコロニーを培
養してプラスミドDNAを分離し、これをpACYCaclと命名
した。pACYCaclでエシェリヒア・コリMB65/pEDA01を形
質転換し、カナマイシン40μg/mlとクロラムフェニコー
ル25μg/mlを含むＬ−ブロス寒天平板上で生育してくる
コロニーを選択して、これをエシェリヒア・コリMB65/p
EDA01/pACYCaclと命名した。

（２）エシェリヒア・コリMB65/pEDA01/pACYCaclをカナ
マイシン40μg/mlとクロラムフェニコール25μg/mlを含
むＬ−ブロスで培養して、実施例１と同様にして酸素液
を調製した。酵素液1ml、0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）4m
lにセファロスポリンＣ（純度70％）を70mg添加し、実
施例１と同様にして120分間反応を行なった。反応終了
液中の７−ACA生成率は40.6％であった。

実施例２ 本実施例はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子とグルタ
リル７−ACAアシラーゼ遺伝子が共存する組換え体を保
有する形質転換体の培養物を用いる方法である。

（１）上記両遺伝子が共存する組換え体の造成工程を第
11図に示す。すなわちpAKKΔSH1をPvuIIおよびNdeIで切
断し、生成したDNA断片の両端をDNAポリメラーゼ・クレ
ノウ断片を前記と同様に作用させて平滑末端とした。こ
れよりアガロースゲル電気泳動により約3Kbの大きさの
断片を分離し、精製した。一方pEDA01をSmaIで開裂し、
これと上記の断片を混合した後、両者をT4DNAリガーゼ
の作用で結合させた。これを用いてエシェリヒア・コリ
MB65を形質転換し、カナマイシン40μg/mlを含むとＬ−
ブロス寒天平板上に生育しかつグルタリル７−ACAアシ
ラーゼ活性を示すコロニーを選択した。このコロニーよ
りプラスミドDNAを分離し、これをpDOaclと命名し、こ
れを保持する形質転換体をエシェリヒア・コリMB65/pDO
aclと命名した。

（２）エシェリヒア・コリMB65/pDOaclをカナマイシン4
0μg/μｇを含むＬ−ブロスで培養し、参考例１と同様
にして酸素液を調製した。これを実施例１と同様にして
セファロスポリンＣに作用させたところ、反応終了液中
の７−ACA生成率は16％であった。

参考例３ エシェリヒア・コリMB65を変異誘起剤Ｎ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで処理した後、
ルーエン（loewen）の方法（文献：ジャーナルオブバク
テリオロジー（J.Bacteriol.）152,622−626,1984）に
したがって、カタラーゼ活性の欠損した変異株を分離
し、これをエシェリヒア・コリMBC1013と命名した。な
お本変異株は工業技術院微生物工業技術研究所に、微工
研菌寄第8901号として寄託されている。

pEDA01およびpAKKΔSH1で独立にエシェリヒア・コリM
BC1013を形質転換し、得られた各々の形質転換体を培養
して、参考例１と同様にして酸素液を調製した。各々の
形質転換体からの酵素液各1ml、0.1Mリン酸緩衝液（pH
8.0）3mlにセファロスポリンＣ（純度70％）70mgを添加
し、37℃で振とうさせながら、過酸化水素水を添加せず
に120分反応を行なった。反応終了後中の７−ACA生成率
は59％であった。

実施例３ エシェリヒア・コリMBC1013をpEDA01およびpACYCacl
で同時に形質転換し、カナマイシン40μg/mlとクロラム
フェニコール25μg/mlを含むＬ−ブロス寒天平板上で生
育してくるコロニーを形質転換体として分離した。この
形質転換体をカナマイシン40μg/mlとクロラムフェニコ
ール25μg/mlを含むＬ−ブロスで培養して、参考例１と
同様にして酵素液を調製した。酵素液1ml、0.1Mリン酸
緩衝液（pH8.0）にセファロスポリンＣ（純度70％）70m
gを添加し、37℃で振とうさせながら、過酸化水素水を
添加せずに120分反応を行なった。反応終了液中の７−A
CA生成率は42.6％であった。

〔発明の効果〕

本発明者らは大腸菌のクローニングされたＤ−アミノ
酸オキシダーゼ遺伝子とグルタリル７−ACAアシラーゼ
遺伝子を用いれば、 （１）両遺伝子を箇別に含む組換え体の共存する単一の
形質転換体の培養物または処理物あるいは、 （２）両遺伝子が共存する単一の組換え体による単一の
形質転換体の培養物または処理物 のいずれを用いても、１段の工程できわめて効率よくセ
ファロスポリンＣおよびその誘導体から７−ACAおよび
その誘導体を生成せしめることができる。また上記反応
の進行のためには通常の大腸菌を宿主として用いた場合
過酸化水素の補給を必要とするが、実施例から明らかな
ようにカタラーゼ生産能を欠損した大腸菌の変異株を宿
主として用いれば、過酸化水素を補給する必要もなく、
さらに容易な反応工程にすることができる。このように
セファロスポリンＣから７−ACAを製造する上で、従来
の方法と比較して画期的にすぐれた方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図はトリゴノプシス・バリアビリス由来のＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列およびそれをコードす
るＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
図中、上段は塩基配列を、下段はアミノ酸配列をそれぞ
れ示す。 第２図はプラスミドpDAOC2−12よりEcoRI切断により生
成する約0.6Kbの断片の塩基配列の一部を示す。図中で
上段は塩基配列を、下段はこれに対応するアミノ酸配列
を、点線を引いた部分はイントロン様配列を示す。 第３図はプラスミドpDAOC2−12の制限酵素開裂地図を示
す。 第４図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ・クローンよりアミ
ノ酸非コード領域削除の概要を示す。 第５図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ発現用ベクター造成
工程の概要を示す。図中で記号Cm^r，Km^r，Ap^rは各々ク
ロラムフェニコール、カナマイシン、アンピシリンに対
する耐性遺伝子を、PlacUV5はlacUV5プロモーターを示
す。 第６図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え
体造成工程の概要を示す。図中で の部分はＤ−アミノ酸オキシダーゼ（DAOの略号で表
示）のアミノ酸配列コード領域を示す。 第７図はエシェリヒア・コリK12C600（pAKK1001）より
分離された組換え体プラスミドの制限酵素地図である。 第８図はエシェリヒア・コリK12C600（pAKKB1001）より
分離された組換え体プラスミドの制限酵素地図である。 第９図は組換え体pAKKB1001の改変の工程を示す。図中
には工程に関与しているかあるいはマーカーとなる制限
酵素切断部位のみが以下の略号で示されている。E,EcoR
I。Pv,PvuII。H,HindIII。B,BamHI。He,HaeIII。Hp,Hpa
I。N,NdeI。Sm,SmaI。また図中Cm^r，Tc^r，Ap^rは各々ク
ロラムフェニコール、テトラサイクリン、およびアンピ
シリンへの耐性遺伝子を、acy1はグルタリル７−ACAア
シラーゼ遺伝子を表示する。 第10図はプラスミドpACYC184にグルタリル７−ACAアシ
ラーゼ遺伝子を組込んだ組換え体pACYCaclの造成工程を
示す。 第11図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子（図中DAOの
略号で表示）を含む組換え体pEDA01にグルタリル７−AC
Aアシラーゼ遺伝子を組込んだ組換え体pDOaclの造成工
程を示す。図中Km^rはカナマイシンの耐性遺伝子を表示
する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 501/22 １０１ 7602−4Ｃ 501/28 7602−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 35/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭52−38092（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−110292（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−152286（ＪＰ，Ａ)

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式（Ｉ） （式中Ｒは−OCOH₃、−Ｈ、またはOHである）で表され
   る化合物またはその塩を脱アシル化して一般式（II） （式中Ｒは前記と同じ意味を有する）で表される化合物
   またはその塩を生成させる７−アミノセファロスポラン
   酸及びその誘導体の製造方法において、前記（Ｉ）で表
   される化合物に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及び７β−
   （４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラン酸ア
   シラーゼを発現する単一の大腸菌の培養物を含む酵素混
   合物を過酸化水素の存在下または非存在下に水性媒体中
   で作用させることを特徴とする７−アミノセファロスポ
   ラン酸およびその誘導体の製造法。
2. 【請求項２】該酵素混合物が、Ｄ−アミノ酸オキシダー
   ゼ遺伝子を含む組換え体DNAおよび７β−（４−カルボ
   キシブタンアミド）セファロスポラン酸アシラーゼ遺伝
   子を含む組換え体DNAで形質転換された単一の大腸菌の
   培養物またはその処理物であることを特徴とする特許請
   求の範囲第（１）記載の製造法。
3. 【請求項３】該酵素混合物が、Ｄ−アミノ酸オキシダー
   ゼ遺伝子および７β−（４−カルボキシブタンアミド）
   セファロスポラン酸アシラーゼ遺伝子を共に含む単一の
   組換え体DNAで形質転換された単一の大腸菌の培養物ま
   たはその処理物であることを特徴とする特許請求の範囲
   第（１）項に記載の製造法。
4. 【請求項４】該酵素混合物が、カタラーゼ産生能を欠損
   していない大腸菌が産生するＤ−アミノ酸オキシダーゼ
   と７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポ
   ラン酸アシラーゼを含む酵素混合物であり、該酵素混合
   物を一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩に過酸
   化水素の存在下に作用させることを特徴とする特許請求
   の範囲第（１）乃至（３）項のいずれかに記載の製造
   法。
5. 【請求項５】該酵素混合物が、カタラーゼ産生能を欠損
   している大腸菌が産生するＤ−アミノ酸オキシダーゼと
   ７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラ
   ン酸アシラーゼを含む酵素混合物であり、該酵素混合物
   を一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩に過酸化
   水素の非存在下に作用させることを特徴とする特許請求
   の範囲第（１）乃至（３）項のいずれかに記載の製造
   法。