KR0131063B1

KR0131063B1 - 디-아미노산 옥시다제 생산성 형질 전환체

Info

Publication number: KR0131063B1
Application number: KR1019930014228A
Authority: KR
Inventors: 가오루 후루야; 아끼오 마쓰다
Original assignee: 유미꾸라 레이이찌; 아사히가세이고오교가부시끼가이샤
Priority date: 1992-07-27
Filing date: 1993-07-26
Publication date: 1998-04-11
Also published as: CA2100987C; EP0583817A3; US5453374A; ATE226980T1; CN1064079C; ES2185620T3; CA2100987A1; KR940002352A; CN1087118A; DE69332447T2; EP0583817B1; EP0583817A2; DE69332447D1

Abstract

트리고노프시스 바리아빌리스 내에서 발현 가능한 D-아미노산 옥시다제 유전자를 함유하는 재조합 DNA로 형질전환된 트리고노프시스 바리아빌리스가 제공된다. 또한, 트리고노프시스 바리아빌리스의 형질 전환 방법 및 트리고노프시스 바리아빌리스의 형질 전환체를 이용한 7-β-(5-카르복시-5-옥소펜탄아미드) 세파로스포란산의 제조방법이 제공된다. 트리고노프시스 바리아빌리스의 형질 전환체는 DAO 활성이 높고, 세파로스포린 C의 생성을 방해하는 에스테라제의 활성은 낮다. 따라서, 본 발명의 트리고노프시스 바리아빌리스는 세파로스포린 C를 생산할 수 있다.

또한, 본 발명의 트리고노프시스 바리아빌리스는 단지 세포를 톨루엔으로 처리함에 의해 세파로스포린 C의 제조를 위해 사용될 수 있으므로, 대규모 이용이 실제로 가능하다.

Description

디(D)-아미노산 옥시다제 생산성 형질 전환체

제1도는 DAO에 대한 N-말단 아미노산 서열을 나타낸다.

제2도는 DAO 유전자클로닝을 위해 사용되는 DNA 프로브를 나타낸다.

제3도는 DAO에 대한 N-말단아미노산 서열과 함게 EcoRI 단편의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

제4도는 플라스미드 pDAOC 2-12의 제한효소 지도이다.

제5(a)도 및 5(b)도는 DAO 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며 비-코오딩 뉴클레오티드 404-439는 도면에서 삭제되었다.

제6도는 인트론에 BanI 부위를 가진 DAO 유전자를 포함하는 플라스미드 13ME1의 제조를 나타낸 개략도이다.

제7도는 인트론에 BonI 부위를 가진 DAO 유전자를 포함하는 플라스미드 pTDO1의 제조를 나타낸 개략도이다

제8도는 히그로마이신 B 저항 유전자를 포함하는 플라스미드 pTHY83의 제조를 나타낸 개략도이다.

제9도는 DAO 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있는 플라스미드 pADH의 제조를 나타낸 개략도이다.

도면에서, 부호는 DAO 유전자를 포함하는 트리고노프시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis)에서 유래된 DNA를 나타낸다.

본 발명은, D-아미노산 옥시다제를 생산할 수 있는 유전자(이하, DAO유전자라 한다)로 형질전환된 트리고노프시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis), 및 트리고노프시스 바리아빌리스의 형질 전환 방법에 관한 것이다. 트리고노프시스 바리아빌리스의 형질전환체는 세파로스포린 C의 유도체를 새성하기 위해 사용된다.

D-아미노산 옥시다제(이하, DAO라 한다)는 D-아미노산의 산화 탈아미노기 반응에 촉매 작용을 하는 효소이다. DAO는 또한 DL-아미노산의 라세미 혼합물로부터 L-아미노산을 분리하고, D-아미노산으로부터 케토산을 제조하고, D-아미노산을 분석하는데 유용하다. 효모 트리고노프시스 바리아빌리스(이하, 티. 바리아빌리스라고 한다)로부터 생산되는 특별한 종류의 DAO는 D-아미노산 뿐만 아니라 항생물질 세파로스포린 C의 산화를 촉진하여 7-β-(5-카르복시-5-옥소펜탄아미드) 세파로스포란산을 생성하고, 이는 H₂0₂와 반응하여 7-β-(4-카르복시부탄아미드) 세파로스포란산을 생성할 수 있다. 세파로스포란산은 중요한 의약품인 세파로스포린 항생물질의 합성을 위한 중간물질이다. 예를들면, 매우 유용한 중간 물질인 7-아미노세파로스포란산(7ACA)은 상기 화합물을 H₂O₂또는 세파로스포린 아실라제와 반응시킴으로써 제조된다.

상기 이외에도, 종래, 많은 양의 DAO를 수득하기 위한 노력으로 각종 배지 및 배양조건에 대해 검토를 수행하였다: 에프.엠.후버(F.M Huber). BIOTECHNOLOGY LETTERS, 14(3), 195-200(1992) 및 일본국 특허 공보 제 35118/1980호에는 pH 3-4에서 동결하고 해동하거나 유기 용매, 계면활성제 등으로 처리함으로써 활성화된 티. 바리아빌리스가 개시되어 있다. 다른 통상적인 유전자 조작 기술도 사용된다.

예를들면, 국제 출원 공개 제 WO 90/12110호에는, 랜덤 돌연변이에 의해 수득되고 다량의 DAO를 생산하는 티.바리아빌리스의 돌연변이주가 개시되어 있다. 유럽 특허 공개공보 제409521호에는 모든 선행기술 노력의 통상적인 문제점, 즉 티. 바리아빌리스가 세파로스포린 C-의 3-위치를 아세틸기 이탈반응시키는 에스테라제를 갖고 있으며, 이 에스테라제는 생성물인 7-β-(5-카르복시-5-옥소펜탄아미드) 세파로스포란산 및 7-β-(5-카르복시부탄아미드) 세파로스프란산을 아세틸기 이탈반응시킴으로써 생성물의 수율을 저하시킨다는 문제점을 가지고 있다.

앞서, 본 발명자들은, 일본국 특허 출원 공개 제 71180/1988호에서, 티.바리아빌리스로부터 유래된 DAO 유전자를 세파로스포리나제 활성이 저하된 에스케리키아 콜리(Escherichia coli:이하, 이.콜리라한다)의 숙주 세포내로 도입시킴으로써 얻어지는 이.콜리의 형질전환체를 제공하였다. 그러나, 세포로부터 DAO를 회수하기 위하여 사용전에 형질전환된 이. 콜리를 파괴해야 하므로, 그 결과 공업적 규모의 사용은 실용될 수 없다. 또한, 형질전환된 이. 콜리내에 수율을 저하시키는 잔류 β-락타마제 활성이 남아 있다.

일본국 특허출원 공개 제 200181/1990호 및 티.이소가이 등의 Bio/Technology, 9.188(1991)에는, 각각, 후사리움솔라니(Fusarium solani)로부터. 유래된 DAO유전자를 도입시킴으로써 수득되는 이. 콜리 및 아크레모늄크리소제눔(이하, 에이. 크리소제늄이라 한다.)의 형질전환체가 개시되어 있다. 그러나, 이러한 형질전환체를 이용함에 있어서는, 최종 생성물의 손실을 피하기 위하여 내인성 β-락타마제의 활성을 저하시키는 추가의 공정을 수행하는 것이 필요하다.

따라서, 종래에는 티. 바리아빌리스를 숙주 세포로 이용하는 형질전환체 체계 뿐만 아니라 내인성 β-락타마제 또는 에스테라제 활성을 가지 않능 형질전환세포가 모두 개발되지 않았었다.

본 발명은, 재재합 DNA 기술에 의해 유전자의 다중 카피를 티.바리아빌리스 염색체 DNA내로 안정하게 삽입할 수도 있음을 알리고 있다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 DAO의 다중카피를 발현하는 티.바리아빌리스의 신규한 형질전환체를 제공한다. 본발명의 티. 바리아빌리스는 DAO활성이 높고 β-락타마제 및 에스테라제 활성은 낮다. 따라서, 본 발명은 세파로스포린 C를 뛰어난 수율로 제조하기 위해 사용될 수도 있다. 본 발명의 티.바리아빌리스의 다른 장점은, 미리 기계적으로 파괴시키지 않고도, 세파로스포린 C의 제조를 위해 사용될 수 있다는 것이다. 세포를 톨루엔으로 간단히 처리하는 것만으로도 충분하다. 따라서, 본 발명의 형질전환체를 공업적 규모로 사용할 수 있다. 또한 당기술분야의 숙련자라면 형질전환체의 바람직한 특성은 주기적 클로닝 및 재선택에 의해 보호될 수 있음을 이해하게 될 것이다.

본 발명은 또한 티.바리아빌리스를 안정하게 형질전환하고 원하는 유전자를 발현시키기 위한 신규의 방법을 제공한다. 본 방법에 따르면, 효소등을 코딩하는 유전자의 다중 카피를 티.바리아빌리스의 염색체 DNA 내에 삽입할 수 있고, 높은 수준으로 발현시킬 수 있으며, 연속 선택압을 사용하지 않고도 안정하게 유지할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 형질전환체를 값싸게 대규모로 배양할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 본 발명의 다른 장점은 선행 기술의 통상적인 유전자 기술에 비해 예측 가능성이 더욱 높다는 것이다.

본 발명은 또한 형질전환된 티.바리아빌리스로부터 수득된 DAO를 사용하는 7-β-(5-카르복시-5-옥소펜탄아미드) 세파로스포란산의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 한가지 측면은 DAO유전자를 코딩하는 재조합 DNA를 발현하는 티.바리아빌리스를 제공하는데 있다.

본 발명에서 사용되는 티.바리아빌리스에는 CBS 4095균주(Central Bureau voor Schimmelcultures 주). 그의 카탈라제-결핍 변이주 KC 103(통상산업성 공업기술원 생명 공학 공업 기술 연구소에 수탁번호 FERM BP - 4359로 기탁되었음), 카탈라제-음성 변이주 및 기타 각종 변이주가 포함된다. 이들중에서, 카탈라제-결핍 또는 -음성변이주는 H₂O₂가 세파로스포린 C의 제조에서 반응물로서 사용되기 때문에 바람직하다.

본 발명에서 유용한 DAO유전자의 예로는, 본 발명자들에 의해 티.바리아빌리스로부터 클로닝된 DAO유전자, 고-발현된 프로모터 및 터미네이터와 결합된 DAO 유전자, 및 티.바리아빌리스에서 형질발현될수 있도록 변이된 에프.솔라니(일본국 특허 출원 공개 제200181/1990호)와 같은 기타 종으로부터 클로닝된 DAO유전자를 들 수 있다. DAO를 코딩하는 cDNA를 또한 게놈 DAO로서 사용할 수도 있다. 이중에서, 티.바리아빌리스에서 유래된 DAO유전자가 그의 프로모터 및 코돈 처리의 효율성 때문에 바람직하다.

본 발명의 형질전환된 티.바리아빌리스의 게놈은 2이상의 DAO유전자 및 하나의 마커 유전자: 바람직하게는, 최대 발현에 대하여, 4내지 약 50-100카피의 DAO유전자를 함유한다. 본 발명의 티.바리아빌리스는 DAO유전자의 존재로 인하여 낮은 에스테라제 활성을 나타낸다. 따라서, DAO카피수가 증가할수록 , 본 발명의 이용성도 커진다.

마커 유전자의 대표예로는 내약품성 유전자, 영양 요구성 상보 유전자 및 갈락토시다제와 같은 효소를 코딩하는 유전자를 들 수 있고, 이들의 발현은 티.바리아빌리스내에서 쉽게 검정되며, 히그로마이신 B 내성유전자 및 티.바리아빌리스가 고감수성인 약품에 대한 G418내성 유전자가 포함된다.

본 발명의 티. 바리아빌리스는 DAO활성이 높고 에스테라제 활성이 낮은 것을 제외하고는, 원균주와 동일한 균학적 특징을 갖는다.

본 발명의 티.바리아빌리스는 하기 단계에 따라 제조된다 :

(1)DAO 유전자를 정제하여 그의 N-말단 아미노산 서열을 결정하고, DAO의 N-말단 아미노산 서열에 상응하는 DNA 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 DNA공여 균주의 DNA라이브러리로부터 DAO유전자를 단리해 내는 방법에 의하여, 티.바리아빌리스(일본국 특허 공개 공보 제71180/1998)호와 같은 DNA공여균주로부터 DAO유전자를 클로닝하고;

(2)(1)에서 수득된 DAO 유전자, 프로모터에 기능적으로 연결된 융합 선택성 마커 유전자 및 DAO 유전자와 같은 유전자의 3' 비번역 서열을 함유하는 벡터 플라스미드를 티. 바리아빌리스의 숙주 세포내에서 발현될 수 있도록 제조하고(여기에서, 상기 마커 유전자는 전형적으로 내약품성 유전자이다);

(3)프로토플라스트를 제조하고, 효모에 대한 프로토프라스트 융합법, 또는 일렉트로포레이션(electroporation) 및 입자 전달 체제(BIOLISTIC)와 같은 물리적 도입법 또는 금속 이온 및 DMSO와 같은 화학적 도입법과 같이 당업자에게 이미 공지되어 있는 방법중의 어느 한 방법에 따라 벡터를 숙주 세포내로 도입하는 것으로 구성된 방법에 의하여, (2)에서 수득된 벡터 플라스미드로 티.바리아빌리스의 숙주 세포를 형질전환시키고;

(4) DAO 유전자 및 마커 유전자를 가진 형질전환체를 함유하는 집단을 선택배지, 예를들어 히그로마이신 B를 함유하는 선택배지내에서 배양하고, 내성콜로니(마커 유전자를 발현하는 콜로니)를 클로닝하고, 비-선택 조건하에서 선택된 균주를 배양한 다음, DAO의 합성활성이 높고 에스테라제 합성 활성이 낮은 형질전환체 균주를 단리함으로써, 목적하는 형질전환체를 선택해낸다.

본 발명의 또다른 측면은 티.바리아빌리스의 형질전환방법을 제공하는데 있다.

본발명자들은, 형질전환된 티. 바리라빌리스가 목적 유전자의 다중 카피를 그의 염색제 DNA 내로 안정하게 전달시킬 수 있으며, 따라서 형질전환된 티.바리아빌리스의 바람직한 특성을 유지시킬 수 있음을 알아내었다.

본 발명에 있어서, 유용한 효소를 코딩하는 유전자는 이들의 높은 발현율에 기이하여 티.바리아빌리스로부터 바람직하게 수득된다. 이러한 유전자의 대표적인 예는 DAO 유전자 및 일본구 특허 출원 공개 제117396/1990호에 개시된 거울상 선택성 NAD(P)-의존성 산화 환원효소이다. 본 발명에 따르면, 기타 미생물, 식물 및 동물로부터 유래된 유전자도 발현될 수 있다.

본 발명은 형질전환의 통상적인 조건; 예를들어 온도, 배양배지, 목표세포의 농도를 사용하여 성공적으로 실행될 수도 있다.

본 발명은 하기 비-제한적 실시예를 참고로 하여 더욱 상세히 설명할 것이다.

실시예1

단계1 : DAO 유전자의 클로닝

(Ⅰ)티.바리아빌리스로부터 총 DNA 의 추출 크리어(Cryer)등의 방법 (Methods in Cell Biology,12, 39-44(1975), Academic Press)에 의해 티.바리아빌리스 CBS 4095균주의 총 DNA를 추출 및 정제한다. 40㎍의 DNA를 4유니트의 MobI과 37에서 15분 동안 반응시킨다. 소화된 DNA를 동일 부피의 페놀 및 클로로포름(1:1 부피)으로 추출하고, 에틸 알콜로 침전시키고, 0.1× TE 완충액(mM 트리스 -HCl 완충액(pH8.0), 1mM EDTA)에 용해시킨다. DNA를 0.7%아가로오스 겔 전기 영동시켜 6-9kb 분획을 회수한다. 30㎍의 벡터 플라스미드 pUC 18(다까라슈조 가부시기가 이샤 제)을 BamHI 으로 소화시키고 게놈 단편과 결찰시켜 티. 바리아빌리스 CBS 4095게놈 잰드 라이브러리를 수득한다.

결찰 혼합물을 사용하여 하기와 같이 수득된 이.콜리 MC 1061의 선택된 균주를 형질전환시킨다: 세파로스포리나제 활성이 저하된 이. 콜리의 변이주를 하기 절차에 의해 제조한다. 이 . 콜리 MC 1061(말콤 카사다반 박사(Dr, Malcom Casadaban)로부터 수득됨. University 앨 Chicago, U.S.A:casadaban, J. Mol. Biol, 138, 179-207(1980)참조)을 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 처리하고, 세파로스포린 C에 대해 높은 감수성을 나타내는 콜로니를 선택한다. 이중에서, 세파로스포리나제 활성이 저하된 균주를 더욱 선택하고 분리한다. pUC 18벤드 라이브러리를 발현하기 위해 사용되는 것인 MB65는 통상 산업성 공업 기술원 생명공학 공업 기술 연구소에 수탁번호 FERM BP-4360으로 기탁되었다.

(2) DAO의 N-말단 아미노산 서열의 결정

티.바리아빌리스 CBS 4095의 습윤 균체 60g을 60ml의 0.1M 인산염 완충액(pH 7.5)에 현탁시키고 5분동안 초음파 처리한다. 이어서, 현탁액을 원심분리하여 상충액을 수득한다. 상충액을 황산 암모늄으로 침전 처리하여, 20-60%의 상충액의 황산 암모늄 분획을 회수한다. 회수된 분획을 0.05M 인산염 완충액(pH 7.5)에 대해 투석한 다음 DEAE-세파로스 CL-6B 컬럼(Pharmacia LKB Biotechnology AB 제 : 컬럼 규모 200ml, NaCl 0 → 0.5M 구배)로 컬럼 크로마토그래피하여 활성 분획을 수득한다. 분획은 0.05M 인산염 완충액 (pH 7.5) 에 대해 투석한 다음, HPLC DEAE - 5 PW (도소오 가부시끼가이샤 제 ; 21.5mm×150mm, Nacl 0 → 0.5M 구배)로 칼럼 크로마토그래피하여 활성 분획을 수득한다. 얻어진 분획을 셋트리프레프(Centriprep:아미콘 인코포레이티드 제)를 사용하여 농축한 다음, 농축액을 프로테인 컬럼 300(PROTEIN COLUMN 300); 밀리포어 코오포레이션 제 7.8㎜×300㎜, 0.1M KPB 용액(pH 7.0) 및 0.2M NaCl을 함유한 수용액)으로 HPLC 하여 정제된 DAO를 수득하며 이는 SDS-PAGE에서 하나의 밴드로 주어진다.

정제된 DAO 의 N-말단 아미노산 서열을 헝카필러(Hunkapiller)등의 방법(Science, 219, 650-659(1983))에 의해 분석하여 N-말단으로부터 41번째 아미노산까지의 아미노산 서열을 결정한다. 얻어진 아미노산 서열을 제1도에 나타낸다.

(3) DNA 프로브의 제조

제1도에서 밑줄 그은 두 개의 아미노산 서열을 코딩하는 변성 올리고뉴 클레오티드 프로브를 DNA 합성기 모델 380-A(Applied Biosystems Inc. 제)를 사용하여 합성한다. 프로브 DAO-1, DAO-2, DAO-3 및 DAO-4의 올리고 뉴클레오티드 서열을 제2도에 나타낸다.

(4) DAO클론의 선별 및 동정

(3)에서 수득된 DNA 프로브를 잉글리아 (Inglia)등의 방법(Ingila et al., Nucleic Acids Res., 9, 1627-1642(1982))에 의해 T4 폴리튜클레오티드-카니아제 및 γ-32P-ATP로 표식한다. (1)에서 수득된 이.콜리를 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 L-브로쓰 한천 배지상에서 배양하여 콜로니를 형성시킨다. 얻어진 콜로니를 복제 방법을 사용하여 왓트만 541여과지로 옮기고, 복제된 콜로니를 라이소자임으로 용균시킨다. DNA를 알칼리로 변성시키고, HCl로 중화시키고, 표식된 프로브 DAO-1 및 DAO-2로 각각 하이브리드를 형성시킨다. 0.15M NaCl 및 0.015M 시트르산 나트륨(pH7.5)을 함유하는 6×SSC 용액, 0.5%NONIDET P-40(시그마 케밀칼 캄파니제) 및 프로브 DAO-1 또는 DAO-2(약 2×10⁵cpm/ml)을 사용하여 44℃에서 1.5시간동안 하이브리드 형성을 수행한다. 여과지를 6×SSC로 실온에서 2회, 44℃에서 1회 세척한다. 이어서, 여과지를 건조시키고 -80℃에서 3시간 동안 방사선 자동 사진 촬영한다.

40개의 양성 콜로니를 뽑아 취하여 액테 배양으로 확대시킨다. 번보임(Birnboim)등의 방법(Nucleic Acids Res., 7, 1513-11523(1979))에 의하여 플라스미드 DNA를 균주로부터 제조한다. 얻어진 DNA를 통상의 방법에의해 변성시키고, 니트로셀룰로오스 필터상에 점으로 찍은 다음 각각의 DNA프로브와 하이브리드를 형성시킨다. 6×ssc 용액, 0.02%의 피콜(Ficoll), 0.02%의 폴리비닐 피롤리돈 및 0.02%의 소혈청 아부민을 함유하는 10×덴하르트(Denhardt)용액, 및 각각의 표식화 DNA 프로브를 함유하는 용액을 사용하여, 프로브 DAO-1 및 DAO-2에 대해서는 44℃에서 1시간 동안그리고 프로브 DAO-3 및 DAO-4에 대해서는 40℃에서 1시간 동안 각각의 하이브리드 형성을 수행한다. 니트로셀롤로오스 필트를 실온에서 6×SSC로 세척하고, 프로브 DAO-1 및 DAO-2에 대해서는 44℃에서, 프로브 DAO-3 및 DAO-4에 대해서는 40℃에서 6×SSC로 더욱 세척한다. 이어서, 필터를 건조시키고 -80℃에서 3시간동안 방사선 자동 사진 촬영한다. 프로브 DAO-1 및 DAO-2에 대해서, 또는 프로브 DAO-3 및 DAO-4에 대해서 양성인 6개의 콜로니가 발견된다. 더욱 분석하면, DAO-2 및 DAO-3 또는 DAO-4에 대해 강한 양성인 0.6kb EcoRI 단편을 갖는 클론이 발견되며, 이를 플라스미드 pDAOC2-12라 명명한다.

(5) DAO클론의 동정 및 그의 DNA 서열 결정

0.6kb DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 상거 등의 방법[Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-5467(1997))에 의해 결정하고, 제3도에 나타낸 DAO 유전자의 N-말단 83개 잔기를 포함함을 발견하였다. 플라스미드 pDAOC 2-12의 제한 효소 지도를 제4도에 나타낸다. 서열분석을 더욱 수행한 결과, 플라스미드 pDAOC 2-12가 제5(a)도 및 5(b)도에 나타낸 355개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩함이 입증되었다. 1069위치에 TAG 정지 코오돈이 존재함은, pDAOC2-12삽입부가 DAO유전자의 완전한 길이 카피임을 나타내는 것이다.

(6) DAO 유전자의 변이

하기 방법에 따라서 BanI 부위를 인트론내에 삽입한다. 40㎍의 플라스미드 pDAOC2-12를 EcoRI 및 HindIII로 소화시켜 0.45kb 단편을 수득한다. 정제된 단편(0.8㎍)을, 각각 0.33mM의 최종 농도를 갖는 dATP, dGTP, dCTP 및 TTP 및 10mM 트리스-CHl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨 및 50mM NaCl을 함유하는 반응 용액 30μl중의 5유니트의 DNA폴리머라제 클레노우 단편과 30℃에서 20분동안 반응시켜, 블런트 말단을 수득한다. 약 0.2㎍의 정제 DNA단편을, BamHI 링커 (0.0175 O.D.). 및 50mM 트리스 - HCi(pH 7.5), 10mM MgCl2, 0.5Mm ATP 및 5mM 디티오트레이톨을 함유하는 20μl의 반응 용액 중의 1유니트의 T4 DNA 리가아제와 15℃에서 밤새 반응시킨다. 얻어진 DNA 단편을 회수하고, 정제한 다음, EcoRI 및 BamHI으로 소하시켜 EcoRI-BamHI 단편을 수득한다. M13mp18파아지의 이중 사슬 DNA(다까라슈조 가부시까가이샤제)를 EcoRI 및 BamHI으로 소화시킨 다음, 소화된 M13mp18 파아지와 상기 수득된 EcoRI 및 BamHI단편을 T4리가아제로 결찰시켜 DAO 유전자의 일부를 함유하는 M13M2-12-7파아지를 제조한다.

EcoRI 부위를 인트론내에 삽입하기 위하여, 제6도에 나타낸 바와같이, 인트론의 머리와 말단을 합한 뉴클레오티드 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드를 제조하고 DAOE1이라 명명한다. 25P몰의 DAOE1 및 10p 몰의 M13 프라이머 M1(다까라슈조 가부시끼가이샤 제)을 T4폴리뉴크레이티드 키나아제로 포스포릴화한 다음, 메싱(Messing)의 방법(Methods Enzymol., 101, 20-78(1983))에 의해 제조된 단일 사슬 M13M2-12-7팡지의 약 0.5p 몰을 첨가한다. 이어서, 생성물을 95에서 5붐동안 가열하고, 반응 혼합물이 실온으로 식을 때까지 방치한다. 이어서, 얻어진 혼합물을 0.4mM dATP, 0.4mM dGTP, 0.4mM dCTP, 0.4mM TTP, 0.4mM ATP, 5유니트의 DNA 폴리머라제 클레노우 단편 및 7mM 트리스 - HCL (pH 7.5), 7mM MgCl2, 7mM NaCl 및 14mM 디티오트레이톨을 함유하는 50μl의 반응용액중의 2유니트의 T4 DNA 리가아제와 37℃에서 30분동안 반응시킨다. 5μl의 0.5M EDTA를 첨가하고 반응을 정지시킨다. RDB 103균주로서 RIKEN(the Institute of physical and Chemical Research) DNA 뱅크에 있는 이. 콜리 JM 105를, 상기 언급된 메싱 방법에 따라 얻어진 파아지 현탁액으로 감염시켜 플라그를 형성시킨다. 플라그를 플라그 하이브리드 형성방법 (Science, 196 180∼182(1977)) 에 따라서³²p - 표식화 DAOE1과 하이브리드 형성시킨다. 양성플라그를 상술된 하이브리드 형성방법에 의해 반복하여 정제한다. 이어서, 정제된 플라그내의 파아지를 통상의 방법에 따라 액체 배양하여 단일 사슬 DNA를 수득하고 이를 분석한다. 기대한 바와 같이, 뉴클레오티드 서열은 BanI부위를 가진 티.바이아빌리스 CBS 4095로부터 유래된 DNA 단편을 포함하고 있으며, 인트론은 갖고 있지 않음을 알 수 있다. 파아지를 M13ME1 파아지라 명명한다.

단계 2 : 형질전환용 마커 유전자의 제조

(1) pHY 300 PLK 내의 BanI 부위의 결실

하기 방법에 따라서, pHY 300 PLK (다까라슈조 가부시끼가이샤 제) 내에 플라스미드의 구조를 파괴할 수도 있는 BanI 부위를 결실시킨다. 3㎍의 플라스미드 pHY 300 PLK를 BanI 으로 소화시킨 다음, DNA 블런팅 키트 (다까라슈조 가부시끼가이샤 제)를 사용함으로써 더욱 소화시켜 블런트 말단을 수득하고, 이를 자기 - 결찰시킨다. 얻어진 플라스마드를 이. 콜리 MB65(FERM BP - 4360) 내로 도입하고, 10㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 L-브로쓰 한천 배지 상에서 배양시켜 형질전환체를 선택한다. 이어서, 상기 언급된 번보임 등의 방법에 의하여 BanI부위를 갖지 않는 플라스미드를 제조하고 pHY 301 이라 명명한다.

(2) 플라스미드 pTDAO1의 제조

하기 방법에 따라서, pHY 301 상에 인트론을 갖지 않는 티. 바리아빌리스의 DAO 유전자를 포함한 플라스미드 pTDAO1을 제조한다. 플라스미드 pDAOC2-12를 HindIII로 소화시킴으로써 수득된 1700kb 단편을 아가로오소 겔 전기영동에 의해 정제하고 회수한다. 200ng의 회수된 단편을 1㎍의 플라스미드 pUC18과 혼합하고 이를 HindIII로 소화시키고, 알칼린포스파타제로 처리하고 T4 DNA 리가아제로 결찰시켜 플라스미드 pDAOC 2-12V4를 수득한다.

팔린드롬(palindrome)을 결실시키기 위하여, pDAOC 2-12 V4를 SalI으로 소화시키고 T4 DNA 리가아제로 자기-결찰시켜 플라스미드 pDAOC 2-12 V5를 수득한다. 플라스미드 pDAOC 2-12 V5를 BamHI 및 EcoRI으로 소화시켜 1200bp 단편을 수득한다. 1200bp단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 정제 한다. 이중 사슬 M13 ME1을 BamHI 및 EcoRI 으로 소화시켜 470bp 단편을 수득한다. 470bp 단편을 또한 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 정제한다. BalII로 소화시키고 알칼린포스파타제로 처리한 1㎍의 플라스미드 pHY 301 및 200ng 의 각각의 생성된 단편을 혼합하고 T4 DNA 리가아제로 결찰시켜 플라스미드 pTDA1을 수득한다.

(3) 플라스미드 pTDA02의 제조

하기 방법에 따라서, 티. 바리아빌리스 DAO 프로모터 및 3' 비번역 서열을 갖는 플라스미드 pTDAO1를 제조한다. 플라스미드 pTDAO1을 SacI 및 BanI으로 소화시켜 5.5kb 단편을 수득한다. 5.5kb 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 정제한다. 1㎍의 단편을 DNA 블런팅 키트 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제)로 소화시켜 블런트 말단을 수득하고 알칼린포스파타제로 처리한다. 이어서, 얻어진 단편 및 300ng 의 BgIII 링커 (86bp, 다까라 슈조 가부시끼가이샤 제)를 혼합하고, T4 DNA 리가아제로 결찰시키고, BalII로 소화시키고, 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 정제하여 5.5kb 단편을 회수한다. 단편을 T4 DNA 리가아제로 자기 - 결찰시켜 플라스미드 pTDAO2를 수득한다.

(4) 플라스미드 pTHY 83의 제조

pTDAO2 프로모터 및 3'비번역 서열의 제어하에서 히그로마이신 B 내성 유전자를 발현시키기 위해 플라스미드 pTHY 83을 제조한다. (3)에서 수득된 1㎍의 플라스미드 pTDAO2를 BgIII로 소화시키고, 이어서 알칼리포스파타제로 처리한다. 히드로마이신 B 내성 유전자를 갖는 플라스미드 pACTHY 83 (EP-A-450758의 명세서에 따라 구축됨)을 BamHI으로 소화시켜 1.5kb 단편을 수득한다. 200ng의 1.5kb의 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 정제한다. 얻어찰시켜 플라스미드 pTHY 83을 수득한다.

단계 3 : 티. 바리아빌리의 형질 전환체의 제조

(1) 프로토플라스트의 제조

10g/ℓ의 효모추출물, 20g/ℓ의 펩톤 및 20g/ℓ의 글루코오스를 함유하는 YEPD 배지상에 티. 바리아빌리스 CBS 4095 균주를 배양한다. 1.5ml의 하비스트 (harvest)를 1.5ml의 환원 완충액(0.05% 메르캅토에탄올, 10mM트리스-HC1, pH 7.5)에 현탁시키고, 30℃에서 15분 동안 보온하고, NOVOZYMTM(NOVO Biolabs. 제)을 함유하는 2ml의 A-완충액 (0.6M 슈크로오스, 2% MgSO4, 50mM 트리스 - HC1, pH 8.0)으로 옮기고, 30℃에서 3시간동안 보온한다. 이어서, 프로토플라스트를 수집하고 A-완충액으로 세척한다.

(2) 프로토플라스트 융합에 의한 플라스미드 pTHY 83의 도입

상기 수득된 프로토플라스트를 80μl의 B-완충액 (0.75M 슈크로오스, 50mM CaCl2, 10mM 트리스 - HC1, pH 8.2)에 현탁시킨다. 10㎍의 pTHY 83을 20μl에 가하고, 30℃에서 3분간 보온한다. 이어서, 900μl의 C-완충액(0.6M 슈크로오스, 50mM CaCl₂, 38% 폴리에틸렌 글리콜, 10mM 트리스 - HC1, pH 8.2)을 가하고, 혼합물을 30℃에서 추가 30분 동안 보온한다. 이어서, 프로토플라스트를 수집하고 A-완충액으로 세척하고 재수집한다.

단계 4 : 형질전환체의 선별

융합된 프로토플라스트를 1.5ml의 A-완충액에 현탁시키고, 10g/ℓ의 효모 추출물, 20g/ℓ의 펩톤 20g/l의 글루코오스, 0.6M 슈크로오스, 3g/ℓ의 DL-메티오닌 및 25g/l의 한천을 포함한 프로토플라스트 재생 배지 12.5ml를 함유하는 각각의 5개 플레이트상에 300μl씩 분배한 다음, 30℃에서 12시간동안 보온한다. 이어서, 4mg의 히그로마이신 B를 함유하는 7.5ml의 재생배지를 플레이트상에 얇게 깔고 30℃에서 1내지 2주일 동안 더욱 보온한다. 그 결과, 13개의 히그로마이신 B내성 콜로니 (이하, HYB 형질 전환체라 한다)가 수득된다. 대조 플라스미드로서 플라스미드 pHY 300 PLK를 사용하여 상술된 것과 동일한 형질전환을 수행하더라도 HYB 형질전환체를 수득할 수 없다.

실시예 2

숙주 세포로서 티. 바리아빌리스 KC 103 균주 (FERM BP-4359)의 카탈라제 - 결핍 변이주를 사용하고, 동일한 형질 전환 프로토콜을 사용하여 10개 HYB 형질전환체를 수득한다. pHY 300 PLK를 사용하여 HYB 형질 전환체를 수득하는 것은 불가능하다.

실시예 3

DAO 유전자로 형질전환된 티. 바리아빌리스의 제조

단계 1 : 플라스미드 pADH 1 의 제조

하기 방법에 따라서, DAO 유전자 및 마커 유전자로서 히그로마이신 B내성 유전자를 갖는 플라스미드 pADH 1을 제조한다. 플라스미드 pDAOC 2-12 V5 및 pDAOC 2-12를 BamHI 및 SacI으로 소화시켜 각각 400bp 및 2.4kb의 단편을 수득한다. 1㎍의 플라스미드 pTHY 83을 BamHI으로 소화시키고, 알칼린포스파타제로 처리하고, 100ng의 400bp 단편 및 200ng의 2.4kb 단편과 혼합하고, T4 DNA 리가아제로 결찰시켜 플라스미드 pADH 1을 수득한다.

단계 2 : 플라스미드 pADH 1을 사용한 티. 바리아빌리스의 형질 전환

숙주 세포로서 티. 바리아빌리스 CBS 4095 균주 및 플라스미드 pADH 1을 사용하여, 실시예 1에서와 동일한 형질 전환을 수행하여, 8개 HYB 형질 전환체를 수득한다.

단계 3 : DAO 활성의 측정

50㎍/ml의 히그로마이신 B를 함유하는 3ml의 YEPD 액체 배지에 1 접종 백금이의 HYB 형질전환체를 접종하고, 28℃에서 38시간 동안 보온한다. 6ml의 30% 글리세롤을 배양 배지에 첨가하고, -70℃에서 방치한다. 1ml의 보존액을 사용하여 50ml의 발효배지 (글루코오스 2.5%, DL-메티오닌 0.3%, MgSO₄0.1%, KH₂PO₄0.4%, C.S.L 6%, 신에쓰 실리콘 KM-72(신에쓰가가꾸 가부시끼가이샤 제) 0.5%, pH 6.5)를 함유하는 500ml 플라스크를 접종하고, 28℃에서 40시간동안 보온한다. 이어서, 2ml의 50% 글루코오스를 배양배지에 첨가하고 20시간동안 보온한다. 500㎕의 배양액을 2ml의 튜브(에펜도르프 인코포레이티드 제)에 옮긴다. 이어서 15㎕의 톨루엔을 배양액에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 마이크로 튜브 믹서 (TOMY - SEIKO Co. Ltd. 제, 속도 10)로 교반하여 세포를 수집한다. 수집된 세포를 1ml의 물로 세척하고, 500㎕의 물에 현탁시켜 톨루엔으로 처리된 침투 세포 현탁액을 수득한다. 10㎕의 이 현탁액을 시험관내에서 11mg/ml의 세파로스포린 C 및 100mM의 트리스-HCL (pH 7.5)를 함유하는 90㎕의 반응 완충액과 혼합한다. 이어서, 반응 혼합물을 25℃에서 10분동안 진탕기 (240 r.p.m)로 교반하고, 얻어진 혼합물과 동일한 부피의 스타퍼 (stopper ; 17mM NaCl, 13.3% 아세트산) 혼합물과 혼합하여 반응을 정지시킨다. 얻어진 용액을 HPLC(GL Science Inc. 제의 inertsil-ODS-2 칼럼, 5% 아세토미트릴-3% 아세트산 나트륨 용액, 유량 : 1ml/분, 검출 파장 : λ 254nm) 처리하여, 생성된 7-β-(5-카르복시-5-옥소펜탄아미드) 세파로스포란산 및 7-β-(4-카르복시부탄아미드) 세파로스포란산의 양을 결정한다. 1분당 1μ물의 각각의 화합물을 제조하기 위해 필요한 양을 1유니트의 DAO 활성으로 정의하고, 배양 배지 1ml당의 활성을 표1에 나타낸다. 얻어진 균주의 일부는 CBS 4095 균주보다 훨씬 증가된 DAO활성을 갖고 있다.

단계 4 : 에스테라제 활성의 측정

하기 방법에 따라서, 기질이 7-β-(4-카르복시부탄아미드) 세파로스포란산인 에스테라제의 활성을 측정한다. 상기 단계 3에서 수득된 톨루엔으로 처리된 침투 세포의 현탁액 100㎕를 400㎕의 에스테라제 반응 완충액 (2.5mg/ml 7-β-(4-카르복시부탄아미드) 세파로스포란산, 250mM 트리스-HCL, pH 7.5)과 혼합하고, 25℃에서 30분동안 보온하고, 500㎕의 메틸 알콜과 혼합하여 반응을 정지시킨다. 반응 용액을 HPLC (zorbax BP-NH2 칼럼 ; Sumika Chemical Analysis Service Ltd. 제, 12% 아세토니트릴 - 8% 아세트산-4% 메틸알콜, 유량 : 1.8ml/분, 검출파장 : λ254nm)로 처리하여, 생성된 데아세틸-7-β-(4-카르복시-부탄아미드) 세파로스포란산의 양을 결정한다. 1분당 1μ몰의 화합물을 제조하기 위해 필요한 양을 1유니트의 에스테라제 활성으로 정의하고, 1ml의 배양 배지 당 활성을 표2에 나타낸다. 일부균주의 에스테라제 활성은 CBS 4095균주에 의해 상당히 저하되었다.

실시예 1 및 2에서 DAO 유전자의 일부를 가진 플라스미드를 도입함에 의해 수득되는 형질전환체의 에스테라제 활성을 상술된 것과 동일한 방법으로 측정하고, 결과를 표2에 나타낸다. 이들의 활성은 CBS 4095 균주 및 KC 103 균주에 비해 저하되었다. 즉, 에스테라제 활성의 저하는 DAO 활성의 증가와는 무관하게 일어난다.

실시예 4

숙주 세포로서 티. 바리아빌리스 KC 103 균주 (FERM BP-4359) 및 플라스미드 pADH1을 사용하여, 실시예 1에 기술된 것과 동일한 형질 전환을 수행하여 9개 HYB 형질전환체를 수득한다.

형질전환체의 DAO 활성을 실시예 3의 단계 3에 기술된 것과 동일한 방법으로 측정하고, 결과를 표1에 나타낸다. 일부 형질전환체는 KC 103 균주에 비해 향상된 DAO 활성을 갖고 있다.

형질전환체의 에스테라제 활성을 실시예 3의 단계 4에서와 동일한 방법으로 측정하고, 결과를 표2에 나타낸다. 이중 일부는 KC 103 균주에 비해 상당히 저하된 에스테라제 활성을 갖고 있다.

형질전환체를 선택압을 가하지 않고 브로쓰 내에서 60시간 동안 배양한다. 크리어(Cryer) 등의 방법 [Supra.]에 따라 DNA를 추출하고, 5㎍의 총 DNA를 HindIII로 소화시킨다. 소화물을 크기에 따라 분류하고, 블롯트하고, pDAOC 2-12 V4의 800bp EcoRI - Sacl 단편으로 탐색(probe) 한다. 블롯트는 형질전환체가 세로로 나란히 통합된 플라스미드 pADH1으로부터 유래된 4.0kb HindIII, 랜덤통합을 나타내는 약한 밴드, 뿐만아니라 KC 103 균주의 비형질전환된 DNA에서 발견되는 배경 3.2kb밴드를 함유하고 있음을 나타낸다. 4.0kb띠의 방사능 강도 대 3.2kb띠의 방사능 강도의 비율을 바이오이미지 분석기(Bioimage-analyzer) BSA 2000 (Fuji Photo Film Co., Ltd 제)에 의해 측정하고, 결과를 표3에 나타낸다. DAO유전자의 다중 카피가 염색체 DNA에 존재함이 확인되었다.

Claims

트리코노프시스 바리아빌리스 내에서 발현가능한 D-아미노산 옥시다제 유전자를 함유하는 재조합 DNA로 형질전환된 카탈라제-결핍성 또는-음성 변이주 트리코노프시스 바리아빌리스.
제 1 항에 있어서, 형질전환 재조합 유전자가 2이상의 D-아미노산 옥시다제 유전자 및 하나의 마커 유전자를 포함함을 특징으로 하는 트리코노프시스 바리아빌리스.
제 1 항에 있어서, D-아미노산 옥시다제 유전자가 트리코노프시스 바리아빌리스의 염색체 DNA 내로 삽입됨을 특징으로 하는 트리코노프시스 바리아빌리스.
제 1 항에 있어서, 숙주 세포로서의 트리코노프시스 바리아빌리스가 CBS4095 균주 및 KC103 균주로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 트리코노프시스 바리아빌리스.
제 1 항에 있어서, DAO 유전자가 트리코노프시스 바리아빌리스에서 유래됨을 특징으로 하는 트리코노프시스 바리아빌리스.
에스테라제 활성이 낮은 트리코노프시스 바리아빌리스에서 클론된 DAO 유전자, 고(高)발현 프로모터 및 터미네이터와 결합된 DAO 유전자, 및 트리코노프시스 바리아빌리스에서 발현가능하게 부분변화시킨 기타종들에서 클론된 DAO 유전자들로 구성된 군에서 선택된 DAO 유전자를 암호화하는 재조합 DNA를 도입함을 특징으로 하는 트리코노프시스 바리아빌리스의 형질전환 방법.
제 1 항의 형질전환체를 배양함을 특징으로 하는 7-β-(5-카르복시-5-옥소펜탄아미드) 세파로스포란산의 제조 방법.
제 7 항에 있어서, 트리코노프시스 바리아빌리스의 형질전환체를 톨루엔으로 더욱 처리함을 특징으로 하는 방법.