KR20040014498A - 세팔로스포린 유도체의 제조 방법 - Google Patents

세팔로스포린 유도체의 제조 방법 Download PDF

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KR20040014498A
KR20040014498A KR10-2003-7013615A KR20037013615A KR20040014498A KR 20040014498 A KR20040014498 A KR 20040014498A KR 20037013615 A KR20037013615 A KR 20037013615A KR 20040014498 A KR20040014498 A KR 20040014498A
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산체즈-페레르알바로
로페즈-마스호세아니세토
가르시아-카르모나프란시스코
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바이오퍼마 무르시아, 에스.에이.
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    • C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

3-티올화 7-아미노세팔로스포란산 유도체를 제조하기 위한 효소적 방법은 하기 화학식 (I)의 3-티올화 세팔로스포린 C를 효소적으로 전환시켜 하기 화학식 (II)의 3-티올화-글루타릴-7-ACA를 형성하는 단계; 및 화학식 (II)의 화합물을 효소적으로 전환시켜 하기 화학식 (III)의 3-티올화-7-ACA를 형성하는 단계를 포함한다:
(I)
(II)
(III)
상기 식에서, R은 하나 이상의 질소 원자를 포함하는 복소환기이고, R1및 R2는 모두 수소 원자이거나, 또는 이들 중 하나는 수소 원자이고 다른 하나는 아실공여기이다.

Description

세팔로스포린 유도체의 제조 방법 {PROCESS FOR PREPARING CEPHALOSPORIN DERIVATIVES}
치료 용도로 사용되는 모든 세팔로스포린은 반-합성적인 물질로서,아크레모니움 크리소게눔(Acremonium chrysogenum)의 발효 육즙(broth)으로부터, 또는 화학 전환 후 상이한 전구체를 사용하여페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum)의 발효 육즙으로부터 얻어지는 생성물로부터 얻어지는 물질에서 β-락탐의 기본 구조를 변형시킴으로써 제조된다.
전형적으로, 세팔로스포린 C[3-아세톡시메틸-7-(D-5-아미노-5-카르복시펜탄아미도)-세프-3-엠-4-카르복실산]는 β-락탐 고리의 아미노아디프산의 측쇄를 제거함으로써 통상 7-아미노 세팔로스포린산(7-ACA)으로 알려져 있는 3-아세톡시메틸-7-아미노-세프-3-엠-카르복실산으로 전환된다. 7-ACA는 정제 및 결정화된 다음, 7- 및 3-위치에서의 후속적인 변형을 위한 출발 물질로서 사용된다. 7-ACA는 현재 생물 약제학적 산업에서 다수의 중요한 반-합성 세팔로스포린 항생제를 합성하기위해 사용되는 기본 구조적 단위이다.
3-티오메틸 세팔로스포린 C 유도체는 미국 특허 제 3,278,531호; 미국 특허 제 3,516,997호; 미국 특허 제 3,647,788호; GB 제 1,400,804호; GB 제 1,565,053호 및 GB 제 1,566,515호에 기재되어 있다. 3'-티오메틸 글루타릴 7-ACA 유도체의 일부 예들이 WO-A-9535020호 및 유럽 특허 제 0846695호에 기재되어 있다.
7-ACA는 산업적 규모로 화학적 또는 효소적으로 얻어질 수 있기 때문에 복소환 티올과의 반응을 위해 가장 광범위하게 사용되는 중간체이다. 7-ACA는 미국 특허 제 3,502,665호; 미국 특허 제 3,954,745호; 미국 특허 제 3,516,997호; 미국 특허 제 3,979,383호; 미국 특허 제 4,115,645호; 미국 특허 제 4,317,907호; 미국 특허 제 5,387,679호; JP 제 55,139,327호; 유럽 특허 제 0167651호 및 WO-A-9302085호를 포함하는 몇몇 특허에 개시되어 있다.
미국 특허 제 5,387,679호는 pH 6-7의 아세톤 중 중탄산나트륨의 존재하에서 7-아미노 세팔로스포란산과 2-메르캅토-5-메틸-1,3,4-티아디아졸(MMTD)의 반응을 기재하고 있다. 그 수율은 약 60-65%이다.
미국 특허 제 4,317,907호에 따르면, 무수물 매질에서 일어나는 상기 반응의 수율은 삼불화붕소 또는 삼불화붕소 에테레이트의 존재하에서 용매로서 아세트산 또는 니트로메탄올을 사용했을 때 약 86%로 증가하였다. 그러나, 미반응의 7-ACA와 분해 산물을 함유하고 있기 때문에, 그 순도는 최대 80%까지 낮다. WO-A-9302085호는 디알킬 카르보네이트 트리플루오라이드 착물과 아디프산의 존재하에서 디알킬 카르보네이트를 사용하면 최대 89%까지 수율을 증가시킬 수 있다고 기재하고 있다. 그러나, WO-A-9302085호는 BF3와 같이 독성이 있으며 매우 고가인 가스를 사용한다는 점과 붕화물 및 불소 붕화물을 함유하는 폐수 유출물을 처리해야 한다는 점과 관련한 문제점이 있음을 나타내고 있다.
세팔로스포린 C의 탈아실화 반응, 즉 7'-측쇄의 제거 반응은 예를 들면 아세토니트릴의 존재하에서 포름산에서 니트로실 클로라이드를 화학적으로 사용하여 통상 수행된다(미국 특허 제 3,367,933호). 또 다른 탈아실화 방법은 아미노펜테아노익산 사슬의 카르복실기의 보호, -55℃에서 오염화인과의 반응 후 물과 메탄올의 혼합물과 저온에서의 가수분해를 수반한다(BE 제 718,824호).
이들 공지된 방법들은 일반적으로 저온에서 수행되어야 하며, 고가이면서 유독성인 용매 또는 시약의 사용을 필요로 하기 때문에, 심각한 환경 문제를 야기할 수 있다. 또한, β-락탐 핵의 화학적 불안정성 및 고리의 3과 7 위치에 존재하는 작용기의 반응성 때문에, 특별한 반응 조건이 적용되어야 하므로 산업적 규모로서의 공정이 복잡해진다.
7-ACA로의 화학적 경로의 문제점들을 극복하기 위해, 세팔로스포린 C의 도 다른 효소적 분해가 기재되어 있다.
7-ACA로의 화학적 경로의 단점을 극복하기 위해, 세팔로스포린 C의 또 다른 효소적 분해반응(cleavage)이 기재되어 있다. 세팔로스포린 C의 7'-아미노아디프산-측쇄에 대한 직접적인 1-단계 제거는 특이적 세팔로스포린 아실라아제(acylase)를 사용하면 가능하다(FR 제 2,241,557호; 미국 특허 제 4,774,179호; 유럽 특허제 283,248호; WO 제 9512680호; WO 제 9616174호). 그러나, 이들 방법은 미국 특허 제 5,296,358호에 기재되어 있는 바와 같이 종종 재현성이 없고 수율이 낮으며 반응 시간이 길다는 단점이 있다. 상기 기술(7-ACA로의 세팔로스포린 C의 단일 단계(single-step) 전환 반응)의 산업적 적용은 현재까지 보고된 바가 없다(Parmar et al, Crit. Rev. Biotechnol. 18, 1, 1998).
한편, 효소적 2-단계에 의해 세팔로스포린 C를 7-ACA로 변형시키는 공정은 산업적 관점에서 중요하다. 그 첫 단계는 상이한 공급원(트리고놉시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis), GB 제 1,272,769호;로도토룰라 그라실리스(Rhodotorula gracilis), 유럽 특허 제 0,517,200호; 또는푸사리움 솔라리(Fusarium solari) M-0718, 유럽 특허 제 0,364,275호)으로부터 분리한 D-아미노산 옥시다아제(E.C. 1.4.3.3, 이하, DAAO라 언급함)를 사용하는 것으로 구성된다. DAAO는 분자 산소의 존재하에서 세팔로스포린 C의 D-5-아미도-카르복시펜타노일 측쇄를 산화시켜 α-케토아디필-7-ACA를 7β-(4-카르복시 부탄아미도)-세프-3-엠-4-카르복시산(또는 글루타릴-7-아미노세팔로-스포란산, 이하 GL-7-ACA라 함)으로 화학적으로 탈카르복실화(decarboxylation)시키는 7β-(5-카르복시-5-옥소펜트-아미도)-세프-3-엠-카르복시산(또는 α-케토아디필-7-아미노세팔로-스포란산, 이하 α-케토아디필-7-ACA라 함)와 과산화수소를 제조한다.
두 번째 단계에서, GL-7-ACA에 대한 특이적 아실라아제, 즉 글루타릴-7-ACA 아실라아제(E.C. 3.5.1.3)가 예를 들면 대장균(E. coli)에서 과발현된슈도모나스(Pseudomonas)형 미생물(미국 특허 제 3,960,662호, 유럽 특허 제0496993호)의 아실라아제로서 사용되며, 이 아실라아제는 GL-7-ACA를 7-아미노-세프-3-엠-4-카르복시산(또는 7-아미노 세팔로스포란산, 이하 7-ACA라 함)을 탈아실화(deacylation)시킨다.
7-ACA를 얻기 위한 이러한 2-단계 효소적 공정은 산업적 규모로 사용되어 왔다(Conlon et al. Biotechnol. Bioeng. 46, 510,1995).
3'-복소환 티오메틸 세팔로스포란산 유도체를 제조하기 위한 또 다른 환경 친화적 방법이 유럽 특허 제 0846695호에 기재되어 있다. 수성 매질에서 글루타릴-7-ACA의 3-위치의 화학적 친핵성 치환 반응 후, 효소 글루타릴-7-ACA를 사용함으로써 3'-글루타릴-7-ACA-유도체의 효소적 변형이 일어난다. 상기 유도체의 양은 어떠한 환경적 충격이 없는 약 65%이다. 상기 과정은 가용되어 있는 세팔로스포린 C의 생물학적 전환반응(bioconversion)으로부터 GL-7-ACA가 분리된 다음, GL-7-ACA가 복소환 티올과 반응하여 최종적으로는 3-복소환 티올-유도체가 GL-7-ACA 아실라아제에 의해 효소화되기 때문에, 효소-화학-효소적(ECE) 공정으로서 정의될 수 있다. 이 방법의 문제점은 WO-A-9535020호에 기재되어 있는 바와 같이, GL-7-ACA의 수용성이 매우 크기 때문에 이를 분리하는 것이 기술적으로 어렵고 비용이 많이 든다는 것이다.
또 다른 문제점은 상기 효소가 단지 몇 사이클로만 사용가능하다는 것이다. 실제로, 결정화 이후 MMTD의 잔류량이 2.8mg/ml인 5-메르캅토트리아졸과 MMTD에서 3번 이하의 사이클이 가능하다는 것이 기재되어 있다. 실시예로서 사용된 나머지 2개의 티올은 용액 중 잔류하는 티올의 양이 많기 때문에 단 1 사이클로만 사용될뿐이다. 매우 수용성이고 pH를 감소시킴으로써 제거될 수 없는 5-메르캅토-1-메틸테트라졸(MMTZ) 또는 2,5-디히드로-3-메르캅토-2-메틸-5,6-디옥소-1,2,4-트리아진 (TTZ)의 경우가 있다. 이러한 티올의 독성화(poisoning) 효과가 세파졸린(cefazolin)의 효소적 합성 과정 중에E. coliCFC-04017로부터의 페니실린 G 아미다아제에 대한 MMTD에 대해서 기재되어 있다(Won et al, App. Biochem. Biotech. 69, 1, 1998). 이러한 억제효과를 극복하기 위해 MMTD/7-ACA의 몰비가 1.2: 1로 감소되어 효소의 수명을 연장시킨다. 이러한 낮은 몰비는 3-티오 유도체의 수율을 감소시키고, D-아미노산 옥시다아제-글루타릴-7-ACA 아실라아제 및 복소환 티올과의 화학적 반응을 사용함으로써, 3-변형된 세팔로스포린의 화학-효소적 합성에 대한 다른 공지된 방법, 예를 들면 효소-효소-화학적 방법(EEC)을 사용하지 않아도 된다(Jistiz et al., J. Org. Chem. 62, 9099, 1997).
따라서, 3-세팔로스포린 C 유도체를 제조하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 있다.
본 발명은 β-락탐 항생제를 제조하는데 사용되는 3-세팔로스포린 C를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 3-아세톡시-메틸-7-아미노-세프-3-엠-카르복실산의 3-티올화 유도체를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 하기 화학식 I의 3-티올화 세팔로스포린 C를 효소적으로 전환시켜 하기 화학식 II의 3-티올화-글루타릴-7-ACA를 형성하는 단계; 및
화학식 II의 화합물을 효소적으로 전환시켜 하기 화학식 III의 3-티올화-7-ACA를 형성하는 단계를 포함하는, 3-티올화 7-아미노세팔로스포란산 유도체를 제조하기 위한 효소적 방법이 제공된다:
상기 식에서, R은 하나 이상의 질소 원자를 포함하는 복소환기이고, R1및 R2는 모두 수소 원자이거나, 또는 이들 중 하나는 수소 원자이고 다른 하나는 아실 공여기이다.
바람직하게는, 화학식 I의 3-티올화 세팔로스포린 C는
화학식 I의 화합물을 분자 산소의 존재하에서 고정화 D-아미노산 옥시다아제와 반응시키고;
담지된 효소를 수성 반응 혼합물로부터 분리하고;
과산화수소를 첨가하여 3-티올화-α-케토아디필 세팔로스포란산을 화학식 II의 화합물로 전환시킴으로써 화학식 II의 3-티올화-글루타릴-7-ACA로 전환된다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 절대 압력 약 2 바아, pH 6.0 내지 8.0, 온도 20 내지 30℃에서 0.5시간 내지 3시간 동안 고정화 D-아미노산 옥시다아제와 반응된다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 상기 담지된 효소를 농축 염 용액으로 세척하는 단계 및 그 결과 형성되는 용액에 바람직하게는 30 내지 50ppm의 양의 과산화수소를 첨가하는 단계를 포함한다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 방법은 바람직하게는 상기 용액에 촉매를 첨가함으로써 과량의 과산화수소를 용액으로부터 제거하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 상기 과량의 과산화수소는 용액에 카탈라아제를 첨가함으로써 제거된다. 바람직하게는, 화학식 II의 화합물은 고정화 글루타릴-7-ACA 아실라아제와 화학식 II의 화합물을 접촉시킴으로써 화학식 III의 화합물로 전환된다. 가장 바람직하게는, 화학식 II의 화합물로부터 화학식 III의 화합물을 형성하기 위한 상기 반응은 상압, pH 6.0 내지 8.5, 20 내지 35℃의 온도, 불활성 분위기 하에서 0.5 내지 3시간 동안 수행된다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 화학식 III의 화합물은 반응 매질을 산성화시킴으로써 침전되고, 이렇게 형성된 침전물을 세척 및 건조시킨다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 효소들은 적절한 고체 담지체에서 적절한 가교제를 사용하여 고정시킨다. 바람직하게는, 상기 효소들은 생체 촉매로서 사용하기에 적합한 크기의 결정 형태이다. 가장 바람직하게는, 상기 효소적 방법은 상기 효소를 수성 기질 용액에서 분산된 형태로 유지하는 동안 수행된다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 각 효소적 방법은 칼럼에서 수행된다.
바람직하게는, 상기 방법은 재사용을 위해 효소를 회수하기 위한 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 화학식 III의 화합물의 결정화는 산성 pH에서 수행된다.
본 발명의 일요지에 따르면, 화학식 III의 3-티올화-7-ACA를 형성하기 위한 화학식 I의 3-티올화 세팔로스포린 C의 효소적 전환반응은 단일 포트에서 수행되는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 고체 형태이거나 또는 그의 비-독성 염 형태이다. 상기 비-독성 염으로는, 세팔로스포린 C의 결정화 과정에서 아연염과 같이 인체에 비독성인 양이온을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 III의 화합물을 형성한 다음 효소화하는 것을 포함하는 세팔로스포린 C 항생제 및 이들의 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 항생제는 세파졸린(cefazolin), 세파제돈(cefazedone), 세포페라존(cefoperazone), 세파만돌(cefamandol), 세파트리아진(cefatriazine), 세포티암(cefotiam) 및 세프트리악손(ceftriaxone) 중 하나 이상으로부터 선택된다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 3-티올화 7-아미노세팔로스포란산 유도체를 제조하는 효소적 방법은:
세팔로스포린 C를 하기 화학식 IV의 티올 화합물과 반응시켜 화학식 I의 화합물을 형성시키는 단계; 및
화학식 I의 화합물을 형성한 후 화학식 IV의 과량의 티올을 제거하는 단계를 포함한다:
R-SH (IV)
상기 식에서, R은 하나 이상의 질소원자를 포함하는 복소환기이다.
바람직하게는, 상기 과량의 티올은 음이온 교환 수지 상에서 흡착시킴으로써 제거된다. 가장 바람직하게는 상기 음이온 교환 수지는 가교된 아크릴 공중합체 구조를 갖는 미세 다공성 수지이다. 바람직하게는, 상기 음이온 교환 수지는 티알킬 벤질 암모늄 작용기를 함유하며 가교도 8%를 포함한다. 상기 수지는 클로라이드, 히드록시, 포스페이트 또는 아세테이트 고리 화합물일 수 있다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 상기 과량의 티올은 결정화( crystallization)에 의해 제거된다. 바람직하게는, 상기 결정화는 산성 pH에서 수행된다. 가장 바람직하게는, 상기 과량의 티올은 결정화한 다음 음이온 교환 수지 상에서 흡착함으로써 제거된다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 상기 세팔로스포린 C는 수성 매질 형태이다.
본 발명의 또 다른 일실시형태에 있어서, 상기 세팔로스포린 C는 고체 세팔로스포린 C 또는 직접 또는 정제된 세팔로스포린 C 육즙으로부터 얻어지는 진한 세팔로스포린 C 용액 형태이다. 상기 세팔로스포린 C는 진한 세팔로스포린 C 용액 형태이거나 진한 세팔로스포린 C 육즙일 수 있다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 상기 반응 과정은 pH 5.5 내지 8.0, 온도 60 내지 80℃에서 1 내지 12시간 동안 수행된다. 바람직하게는, 상기 반응은 pH 약 6.0, 온도 약 65℃에서 수행된다. 가장 바람직하게는, 상기 티올 화합물은 세팔로스포린 C의 1 내지 5몰/몰의 양으로 존재한다.
R은 하나 이상의 질소 원자와 경우에 따라 황 또는 산소 원자를 포함하는 복소환기일 수 있다. 바람직하게는, R은 티에닐, 디아졸릴, 테트라졸릴, 티아졸릴, 트리아지닐, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 벤조티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈옥사졸릴 또는 이들의 유도체를 포함하는 군의 하나 또는 그 이상으로부터 선택되는 복소환기이고, 바람직하게는 5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일, 1-메틸-테트라졸-5-일 또는 1,2,5,6-테트라히드로-2-메틸-5,6-디옥소-1,2,4-트리아진-3-일이다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물들은 고체 형태이거나, 그의 비독성 염 형태이다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 하기 화학식의 화합물을 제공한다:
상기 식에서, R은 하나 이상의 질소 원자를 포함하는 복소환기이다.
본 발명은 화학식 I에서 R이 5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일인 하기 화학식의 화합물을 제공한다:
본 발명은 또한 화학식 I에서 R이 1,2,5,6-테트라히드로-2-메틸-5,6-디옥소-1,2,4-트리아진-3-일인 하기 화학식의 화합물을 제공한다:
본 발명은 또한 상술한 화학식 I의 화합물을 형성한 다음 효소화하는 것을 포함하는 세팔로스포린 C 항생제 및 이들의 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 항생제는 세파졸린, 세파제돈, 세포페라존, 세파만돌, 세파트리아진, 세포티암 및 세프트리악손 중 하나 이상으로부터 선택된다.
상세한 설명
본 발명자들은 용액 중의 세팔로스포린 C가 7-위치 측쇄를 효소적으로 제거하기 이전에 복소환 티올과 먼저 반응하는 화학적-효소적-효소적 방법(CEE)이 3-세팔로스포린 C 유도체를 제조하기 위한 개선된 방법을 제공함을 발견하였다.
본 발명에 따른 방법은 다음과 같이 나타낼 수 있다.
제1단계: O2존재하에서 고정화 D-아미노산 옥시다아제
(I)
3-티올화 세팔로스포린 C (T'X'C)
3-티올화-글루타릴-7-ACA (T'X'G)
제2단계: O2존재하에서 고정화 글루타릴-7-ACA-아실라아제
(II)
3-티올화-글루타릴-7-ACA (T'X'G)
(III)
3-티올화-7-ACA (T'X'A)
상기 식에서, R은 티에닐, 디아졸릴, 테트라졸릴, 티아졸릴, 트리아지닐, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 벤조티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈옥사졸릴 또는 상기 복소환 구조의 치환이 가능한 가능한 위치에서 치환된 유도체와 같이, 경우에 따라 황 또는 산소를 갖는 적어도 질소 원자를 포함하는 복소환기이다.
상기 화합물 I을 3-티올화 글루타릴-7-ACA (화합물 II)로 효소적으로 전환시키는 반응은 pH 약 6.5 내지 8.0, 바람직하게는 7.0의 수용액에서 수행된다. 이는 8 이상의 pH 수준에서의 세팔로스포란산 화합물의 불안정성 증가 문제를 방지할 수있다. 이때의 반응 온도는 15 내지 35℃일 수 있고, 통상적으로는 20℃로 고정된다.
분자 산소는 산화적 탈아민화 반응을 위한 공-기질(co-substrate)로서 작용한다. 이는 적절한 기계적 교반하에서 0.01 내지 1부피/부피의 용액/분, 바람직하게는 0.1vvm의 유속으로 바닥 분배기(bottom diffuser)를 통해 반응 용액으로 살포된다. 광범위한 설계 파라미터 및 반응 특성에 따라 교반 속도가 상이할 것이라는 것은 당업자에게 있어 명백하다. 일반적으로, 교반은 20-500rpm으로 수행된다. 이러한 생체 반응기의 구조는 산소를 충분히 이동시키기 어려워 3-티올화 글루타릴-7-ACA의 최종 수율을 감소시키는 고정화 효소를 함유하는 삼출(percolation) 칼럼에 비해 바람직하다.
완전한 변형을 위해 필요한 시간은 0.5 내지 3시간 정도이며, 이는 운전 조건에 따라 다르지만, 전형적으로 약 1시간이다.
화학식 I의 화합물의 화학식 II의 화합물로의 전환율은 높고, 통상적으로 생성 수율 95%와 함께 약 98%이다. 반응 종료시, 반응 용액은 화학식 IV의 일부 미분해 중간체 화합물을 여전히 함유하고 있으며, 이는 외부의 과산화수소를 사용하여 화학식 II의 화합물로 전환된다. 또한, 화학식 II의 일부 화합물은 효소가 고정되어 있는 수지에 결합된 채로 잔류할 수 있다.
이러한 잠재적 손실을 감소시키기 위해, 반응기 용액을 체류조(holding tank)에 압력을 과도하게 걸어 방출시키고, 효소는 pH 7.0의 100mM 인산염 완충액으로 세척한다. 유사한 특성을 가진 다른 완충액 용액이 또한 사용될 수 있다.이러한 완충액 세척액을 반응 용액과 조합한 다음, 그 혼합물을 과산화수소로 적정하면 약 25℃에서 30-50분 동안 용액 중 최종 농도가 30-50ppm, 바람직하게는 30분 동안 35ppm이 된다.
상기 과량의 H2O2는 카탈라아제와 같은 적절한 효소, 피루빈산(pyruvic acid)과 같은 적절한 환원제, 알칼리성 술파이트(sulphite) 또는 기타 임의의 적절한 촉매를 사용하여 가용성 또는 고정화 형태로 다음 단계로 진행하기 전에 제거된다. H2O2의 효소적 제거 과정은 본 발명에 있어 최종 생성물의 품질과 순도를 보존하기 위해 바람직한 과정이다.
상기와 같이 처리함으로써, 최종 화합물(II)의 수율은 97-98%로서, 이는 변형되지 않은 세팔로스포린 C를 글루타릴-7-ACA로 전환시키기 위한 유럽 특허 제 0496993호에 기재된 수율에 비해 3% 더 높았다.
H2O2로 적정한 후의 최종 용액은 적절한 습식 고정화 또는 결정상의 글루타릴-7-ACA 아실라아제 제제가 주입된 제2 생체 반응기로 이송하기 전에 암모니아와 같은 농축 유기 또는 무기 염기를 사용하여 pH를 약 7.5 내지 8.5, 바람직하게는 pH 8.0으로 조절한다. Roche Molecular Biochemicals에서 시판하고 있는 제제가 본 발명의 목적에 적합하다. 이때, pH는 약 pH 8.0으로 고정시키는 자동 적정기(autotitrator)를 사용하여 상술한 바와 같은 동일한 유기 또는 무기 염기를 반응물에 투여함으로써 유지된다. 수행 온도는 약 15 내지 25℃, 바람직하게는 20℃일 수 있다. 전환반응 시간은 수행 조건에 따라 0.5 내지 2시간으로 다양할 수있지만, 통상 약 1시간이다. 효소 제제에 의한 미생물 오염을 방지하기 위해, 질소 기류를 바닥 분배기를 통해 부드러운 교반하에서 0.01부피/부피/분의 속도로 흘려보낸다.
3-티올화 글루타릴-7-ACA 유도체의 97% 이상의 전환율 또는 최초 소비 속도의 2%까지 암모늄 소비 속도의 감소에 의해 확인가능한 반응을 종결한 후, 용액을 여과하고, 글루타릴-7-ACA 아실라아제가 고정되는 수지를 바람직하게는 pH 7.0의 100mM 인산염 완충액으로 세척한다.
2개의 효소적 단계 후 3-티올화-7-ACA(화합물 III)의 수율은 약 94%이다. 이후, 후자의 화합물은 염산, 황산 또는 인산과 같은 무기산으로 최종 생성물의 등전점(isoelectric point)에 따라 1.7 내지 약 5.5의 산성 pH에서 결정화시키거나, 또는 상이한 비율로 적절한 유기 용매와 이들 산을 조합함으로써 최종 용액으로부터 회수한다.
본 발명의 방법은 신규한 것이고, 전체 생성물 수율이 양호하며, 품질이 우수하고(색상 및 순도 측면에서), 분리가 용이하며, 연속 수행이 가능하며, 화학 반응 후, 잔류하는 복소환 티올에 의한 독성화를 피할 수 있으면서 효소의 재사용이 가능하다.
본 발명에 따른 방법은 용액 중의 세팔로스포린 C가 복소환 티올과 먼저 반응하기 때문에 3-복소환 티올화-7-아미노세팔로스포란산을 얻기 위한 공지된 3-단계 공정에 비해 놀랄만한 개선을 보여준다. 본 발명의 방법은 발효 육즙으로부터 직접 유도되는 세팔로스포린 C의 용액 상에서 편리하게 수행될 수 있다. 따라서,본 발명의 방법은 금속 염으로서 세팔로스포린 C를 결정화시킬 필요가 없으며, 동시에 유기 용매를 사용하거나 회수할 필요가 없다. 또한, 본 발명의 방법은 세팔로스포린 C에 대한 전체 회수 공정에 의한 수율 손실을 감소시킬 수 있다. 3-치환된 유도체는 모(母) 화합물인 세팔로스포린 C 보다 용액에서 보다 안정하기 때문에, 전체 발효 수율이 훨씬 효과적으로 증가된다.
과량의 티올기가 선택적으로 제거되어 화학식 I의 화합물이 매우 높은 순도로 제조되도록 하며 또한 복소환 티올이 매우 낮은 수준(<0.2mg/ml)으로 존재하게 한다. 이러한 방법은 다음과 같은 몇몇 이점이 있다. 이러한 방법을 통해 화학식 I의 화합물을 효소의 독성화 없이 효소적 공정을 위한 기질로서 사용할 수 있다. 그 결과, 효소를 반복적으로 사용할 수 있게 된다. 또한, 상기 방법은 어떠한 독성 시약을 사용하거나 또는 중간체를 분리할 필요가 없기 때문에 연속적인 공정이 가능해진다.
강한 음이온 이온 교환기 Amberlite IRA-400(Rohm and Haas사 제조)을 이용한 매우 선택적인 제거 과정이 사용되는 바, 이는 존재하는 복소환 티올의 매우 낮은 수준(<0.2mg/ml)를 가진 화학식 I의 화합물을 얻을 수 있다.
3' 위치에서의 친핵성 치환 반응은 알칼리 금속 수산화물, 수산화 암모늄 또는 바람직하게는 알칼리 금속 탄산화물 또는 중탄산화물과 같은 수용성 염을 형성하는 염기성 화합물을 첨가함으로써 물에 복소환 티올과 비-독성 세팔로스포린 C 염을 용해시킬 수 있는 수성 매질에서 수행된다. 일반적으로, 상술한 바와 같이 제조되는 염들 이외에, 세팔로스포린 C 및 복소환 티올 중 시판되고 있는 임의의염을 본 발명에 따른 방법의 요지를 변경하지 않는 한, 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.
복소환 티올 및 세팔로스포린 C를 별도의 반응 용기에서 또는 함께 용해시킨 후, 상기 2개의 반응물을 pH 약 5.5 내지 7.0에서 약 65 내지 80℃의 온도로 가열하기 전후에 동일 반응기에서 혼합한다.
일단 반응이 개시되면, 반응 온도와 pH는 바람직하게는 각각 약 1 내지 4시간 동안 약 65 와 80℃에서 유지된다.
복소환 티올/세팔로스포린 C의 몰비는 반응 수율에 있어 중요한 변수로서, 사용되는 각 복소환 티올에 대해 최적화되어야 한다. 몰비는 1.0 내지 4.0, 바람직하게는 약 4이다.
80℃에서 40분 내에 완전하게 분해되는 티올이 없는 세팔로스포린 C 용액과 비교하면, 상기 몰비 범위에서 세팔로스포린 C는 β-락탐 고리 분해가 낮고 매우 안정하게 존재한다는 것이 밝혀졌다.
세팔로스포린 C 수준이 초기량의 2% 이하가 되면, 반응 혼합물을 경우에 따라 할로겐산 또는 옥시산(oxy acid)과 같은 강한 무기산으로 pH를 3.0 내지 5.5, 바람직하게는 약 5.2로 산성화시키면서 약 2 내지 약 10℃로 그 온도를 냉각시킨다.
이러한 산성화 단계는 일부의 경우 새로운 반응에 대한 재사용이 가능하고, 복소환 티올이 결정화되도록 한다.
경우에 따라 산성화 단계를 포함하는 상기 반응 후 얻어진 용액은 크로마토그래피 분리에 의해 정제 처리된다. 상이한 크로마토그래피 수지 및 유형들이 산업적 규모로 사용될 수 있다.
몇몇 수지는 흡착, 친수성-소수성 상호작용, 양이온 교환 및 음이온 교환을 기초로 하여 4개 유형의 수지로 시험 분류된다. 흡착을 기초로 하여 시험된 모든 수지(Amberlite XAD-761, Amberlite 7HP, Amberlite 16 HP 및 Amberlite XAD-4)는 유사한 결과, 즉 복소환 티올의 22 내지 38%를 함유하는 용출액을 얻게 된다. 친수성-소수성 상호작용 수지 Sephadex LH-20는 어떠한 티올을 많이 함유하지 않았다(<5%). 이와 유사한 결과가 양이온 교환 수지 AmberliteRIRC-50, IR-120 및 IR-200에서도 나타났다. 그러나, 음이온 교환 수지가 약한 음이온 교환 수지(Amberlite IRA-93) 인 경우 57 내지 60%에 이르는 복소환 티올에 가장 좋은 결합능을 갖는 것으로 밝혀졌다.
작용기로서 트리알킬 벤질 암모늄기를 함유하는 8%의 가교도를 갖는 강한 미세 다공성(gel-type I) 음이온(염기) 교환 수지 Amberlite IRA-400은 복소환 티올에 대한 가장 높은 결합능(92-98%) 및 3'-위치 복소환 티오메틸 세팔로스포린 C 유도체에 대한 가장 낮은 수준의 결합능을 제공한다(2-15%, 첫 번째 사이클(cycle)에서는 15% 미만이고, 후속 사이클에서는 5% 미만이다).
이러한 미세 다공성 수지는 몇몇 이점을 제공한다. 이러한 이점으로서, 이들 음이온 교환수지들은 덜 연성(fragile)이고, 취급에 있어 주의가 덜 필요하게 되며, 보다 높은 로딩(loading) 용량을 갖는다. 이들은 불연속적(discrete)인 기공을 갖지 않기 때문에, 용질 이온들은 입자를 통해 확산되어 교환 부위와 상호작용하게 된다. 상술한 수지의 총 이온 교환용량은 1.4meq/mL 정도이다.
놀랍게도, Amberlite IRA-400이 글루타릴-7-ACA와 7-ACA의 동일 유도체에 비해 세팔로스포린 C의 3'-복소환 티오메틸 유도체에 대한 결합 용량이 더 작다는 것이 밝혀졌다. 실제로, MMTD와 함께 제조되는 글루타릴-7-ACA의 3'-복소환 티오메틸 유도체는 칼럼에 대해 76.3% 수준으로 결합하게 된다. 이와 동일한 결과가 MMTD와 함께 칼럼에 대해 92.7%의 수준으로 결합하는 7-ACA의 3'-복소환 티오메틸 유도체에서 밝혀졌다. 이들 3개의 관련 β-락탐 화합물에 대한 Amberlite IRA-400의 예상치 못했던 거동은 글루타릴-7-ACA와 7-ACA에 비해 세팔로스포린 C의 측쇄 5번 위치에 있는 이온화성 아미노기의 존재에 기인하는 것으로 추측된다.
칼럼의 용출액이 변형된 세팔로스포린 C의 분리 없이 효소화반응을 위해 사용될 수 있고, 불순물들은 칼럼에 흡착되고 β-락탐 유도체는 단순히 물에 의해 용출된다는 세팔로스포란산 중간체 분야에서 새로운 개념을 나타내기 때문에, 본 발명에 방법에 의한 복소환 티올의 제거는 산업적 규모에 있어 매우 유용하다.
β-락탐 유도체가 용출되면(5% 미만이 결합된 상태로 잔류한다), 칼럼은 바람직하게는 10-20% 아세토니트릴과 같은 유기 용매의 가변량을 함유하는 할로겐산과 같은 강한 무기산의 1.5N 용액으로 통상 재생된다. 상기 용출액 중 티올의 농도가 0.2mg/ml를 넘으면, 3N HCl과 40% 아세토니트릴을 사용하는 강력한 재생 과정이 수행될 수 있다. 이와 달리, HCl과 NaOH에 의한 재생 과정이 또한 가능하다.
복소환 티올의 용출 후, 티올이 농축되어 재사용된다. 칼럼은 탈염수로 세척하여 다음 사이클 전에 과량의 재생액(regenerant)을 제거한다. 세척액의 최초 충전 부피(bed volume)는 재생시 사용된 유속으로 수행되어야 한다. 잔류물은 흡착 유속으로 용출된다.
놀랍게도, 3-티올화 유도체(TXC)가 변형되지 않은 세팔로스포린 C와 비교하면 보다 양호한 기질임이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 방법은 세팔로스포린 C 유도체의 제조를 위한 보다 개선되고 경제적인 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법의 두 번째 중요한 요지는 고체 담지체 상에 고정되거나 또는 매우 안정한 결정 형태로 재사용이 가능한 형태를 갖는 효소의 용도이다. 최종 요건은 본 발명의 방법을 산업적 규모로 실시하기 위해 중요한 요건이다.
본 발명의 또 다른 중요한 이점은 과량의 티올을 제거 및 재생한 후 화학적 용액을 제1 효소 반응기로 또한 제1 효소 반응기에서 제2 효소 반응기로 이송시키기 쉽다는 것이다. 이러한 이점은 세팔로스포린 C 농축액으로부터 단일의 액체 흐름으로 연속적으로 본 발명의 방법이 실시되도록 하거나 또는 변형시키지 않은 7-ACA에 비해 결정화가 용이한 3-티올화-7-ACA 유도체로 배치(batch) 용액으로 제조되게 할 수 있다.
후술하는 실시예들은 일반적으로 본 발명을 한정하는 것 없이 예시하고자 하는 것이다.
실시예 1 내지 5는 세팔로스포린 C로부터 화학식 I의 3-티올화-7-ACA 유도체의 제조를 예시하고 있다.
실시예 6 내지 10은 화학식 I의 3-티올화-글루타릴-7-ACA의 형성을 통한 화학식 III의 3-티올화-7-ACA 유도체의 제조를 예시하고 있다.
실시예 1: 7-β-(5-아미노-5-카르복시펜탄아미도)-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일 티오메틸)-3-세펨-4-카르복시산(TDC)의 제조
600mL의 탈염수를 함유하는 유리를 입힌(glass-lined) 반응기에 31.73g(0.24몰)의 2-메르캅토-5-메틸-1,3,4-티아디아졸(MMTD)을 첨가하고, 반응기를 교반하면서 약 65℃까지 가열하였다. 상기 혼합물의 pH를 약 10g의 탄산나트륨을 첨가하여 약 6.0으로 조정하였다.
별도의 유리를 입힌 플라스크에서, 200ml의 물 중 33.23g의 소듐 세팔로스포린 C(75% 자유 산(free acid), 0.06몰)를 용해시켜 진한 소듐 세팔로스포린 C 용액(HPLC 순도 98%)을 제조하였다. MMTD가 용해되었을 때, 진한 세팔로스포린 C 용액을 첨가하고, 세팔로스포린 C의 수준이 2% 이하로 될 때까지 반응 속도(kinetic)를 조절하면서 그 혼합물을 약 65℃에서 240분 동안 교반하였다. 다음과 같은 반응 속도가 밝혀졌다:
시간(분) 세팔로스포린 C (몰) TDC(몰) MMTD(몰)
0 0.06 0.00 0.24
120 0.01 0.039 0.20
240 0.0012 0.042 0.195
이후, 상기 반응 혼합물을 과량의 MMTD의 결정화가 개시되는 약 4℃로 냉각하였다. 교반하면서(150rpm) 37% 염산을 사용하여 pH를 5.2로 산성화하고, 결정화를 완료시키기 위해 60분 동안안 서서히 교반(50rpm)하에 방치하였다.
침전된 MMTD를 여과하고, 진공하 35℃에서 건조하였다. 23g의 재생된MMTD(HPLC 순도 99%)를 약 95%의 재생 수율로 얻었다.
0.042몰의 TDC 및 0.016몰의 MMID를 함유하는 여액(825ml)을 3M 암모니아를 이용하여 pH 7.25로 조정하고, 탈염수와 함께 클로라이드 사이클(충전 부피 180ml) 중의 Amberlite IRA-400 칼럼상에 유속 20ml/분으로 로딩하였다. 로딩한 후, 칼럼을 HPLC 순도 94%의 로딩된 TDC의 재생율 97%까지 탈염수(약 100ml)로 세척하였다. 유출액의 pH는 약 5.4이었고, 3M 암모니아를 이용하여 pH 7.0으로 중성화하였다. 잔류 MMTD는 0.0009몰(<0.2mg/ml)이었고, 이는 pH를 감소시킴으로써 결정화 이후 잔류하는 MMTD의 6% 미만이다. 이와 같은 MMTD의 낮은 수준(화학반응 후 최초 MMTD의 1% 미만)에 의한 TDC의 효소화가 가능하다.
전형적으로, 칼럼은 10% 아세토니트릴을 함유하는 1L의 1.5M HCl로 재생하며, 2리터의 탈염수로 세척함으로써 과다한 재생없이 세척한다. 필요한 경우(MMTD > 0.2mg/ml), 수지를 40% 아세토니트릴을 함유하는 1리터의 3M HCl을 사용하여 강하게 재생 처리할 수 있다.
pH 5.0에서 TDC 용액을 더욱 특성화하기 위해, TDC 용액을 Amberlite XAD-2 흡착 칼럼에 로딩하고, 칼럼을 물로 세척하였다. 세척 후, 수지를 물로 용출시키고, 25ml 분획을 모았다. HPLC 순도 98.5%의 TDC를 함유하는 분획을 동결건조시켜 분석 처리하였다:
생성물의 원소분석 C17H20N5O6S3·2H2O(TDC), 계산치 C 37.42; H 4.43; N 12.84; S 17.63; 실측치 C 37.27; H 4.3; N 13.11; S 17.51.
1H-NMR(DMSO/DCl)(δppm): 1.57(m, 2H, -CH2-); 1.63(m, 2H, -CH2-); 2.18(m, 2H, -CH2-); 2.64(s, 3H, CH3); 3.55, 373(J=18 Hz, 2H, -CH2-); 3.83(t, 1H, -CH-); 4.18-4.46(d, J=13 Hz, 2H, -CH2-); 5.02(d, J=3 Hz, 1H, C-6); 5.6(d, J=3 Hz, 1H, C-7).
실시예 2: 비교예: 상이한 칼럼 상에서 7-β-(5-아미노-5-카르복시펜탄아미도)-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일티오메틸)-3-세펨-4-카르복시산의 제조
TDC 유도체를 실시예에 기재된 바와 같이 제조하고, 이를 함유하는 여액을 상이한 유형의 수지 상에 로딩하였다.
칼럼 사용 제1 사이클에서 100ml의 물로 세척한 후 다음과 같은 데이터가 얻어졌다:
수지 형태 TDC 용출율 (%) MMTD 용출율(%)
Amberlite IRA-400Diaion SA10AAmberlite IRA93 강한 음이온 교환기강한 음이온 교환기약한 음이온 교환기 866787 21545
Amberlite IRC-50Amberlite IRC-200 약한 음이온 교환기강한 음이온 교환기 9373 9298
Amberlite XAD-761Amberlite XAD-7HPAmberlite XAD-16HPAmberlite XAD-4Amberlite XAD-1180 흡착흡착흡착흡착흡착 8677756878 2223352538
Sephadex LH-20 소수성친수성 98.5 95
Amberlite IRA-400에서 가장 좋은 결과가 나타났다. TDC의 높은 용출율이 MMTD의 낮은 용출율과 함께 관찰되었다. 다른 음이온 교환 칼럼들을 사용하였더니, 다량의 MMTD가 용출되었다. 다른 음이온 교환 칼럼들은 티올과 TDC에 대한 높은 2중 결합(dual binding)을 나타내었다.
실시예 3: Amberlite IRA-400에 대한 TDC의 특이성
출발물질로서 글루타릴-7-ACA와 7-ACA를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 글루타릴-7-ACA 유도체(TDG)와 7-ACA 유도체(7-TDA)를 제조하였다. 다음과 같은 데이터가 Amberlite IRA-400의 여액으로부터 얻어졌다.
수지 용출액 중 화합물 TDG 또는 TDA 용출율(%) MMTD 용출율(%)
Amberlite IRA-400 TDG 23.7 3.0
TDA* 7.3 1.4
* pH 7.8에서, TDA가 칼럼으로 침전되는 것이 방지된다.
TDC와 대조적으로, MMTD 뿐 아니라 TDC와 TDA는 Amberlite IRA400에 결합된 채 잔류하는 것으로 보인다.
실시예 4: 7-β-(5-아미노-5-카르복시펜탄아미도)-3-[(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-티오메틸]-세팔로스포란산(TZC)의 제조
유리를 입힌 반응기에 28.16g(0.24몰)의 5-메르캅토-1-메틸테트라졸(MMTZ)을 첨가하고, 반응기를 교반하면서 약 70℃의 온도로 가열하였다. 혼합물의 pH를 12g의 탄산나트륨을 첨가함으로써 약 5.7 내지 5.8로 조정하였다.
별도의 유리를 입힌 플라스크에서, 200ml의 물 중 33.23g의 소듐 세팔로스포린 C(75% 자유 산(free acid), 0.06몰, HPLC 순도 98%)를 용해시켜 진한 소듐 세팔로스포린 C 용액(HPLC 순도 98%)을 제조하였다. MMTZ가 용해되었을 때, 진한 세팔로스포린 C 용액을 첨가하고, 세팔로스포린 C의 수준이 3% 이하로 될 때까지 반응 속도를 조절하면서 그 혼합물을 약 70℃에서 120분 동안 교반하였다.
시간(분) 세팔로스포린 C (몰) TZC(몰) MMTZ(몰)
0 0.06 0 0.24
120 0.0017 0.040 0.19
상기 반응 혼합물을 약 4℃까지 냉각시키고, pH를 감소시켰지만, 과량의 MMTZ의 결정화가 개시되지 않았다. MMTZ 및 0.19몰의 MMTZ로부터 0.04몰의 TZC 유도체를 함유하는 용액을 3M 암모니아를 이용하여 pH 7.25로 조정하고, 탈염수와 함께 클로라이드 사이클(충전 부피 150ml) 중의 Amberlite IRA-400 칼럼상에 유속 20ml/분으로 로딩하였다. 칼럼을 최초로 통과시킨 후, 잔류 MMTZ는 초기의 13%보다 높았다(0.032몰).
이러한 이유로, 용출액을 또 다른 Amberlite IRA-400(충전 부피는 60ml임) 칼럼에 상술한 바와 동일한 조건하에서 로딩하여 MMTZ의 수준을 감소시켰다.
로딩한 후, 칼럼을 HPLC 순도 87%의 로딩된 TZC의 재생율 97%까지 탈염수(약 90ml)로 세척하였다. 유출액의 pH는 약 5.4이었고, 3M 암모니아를 이용하여 pH 7.0으로 중성화하였다. 잔류 MMTZ는 0.0013몰이었고, 이는 화학 반응 후 최초 MMTZ의 1% 미만이다. 이와 같은 MMTZ의 낮은 수준에 의해 효소의 독성화없이 상기 유도체의 효소화가 가능하다.
칼럼은 10% 아세토니트릴을 함유하는 1L의 1.5M HCl로 재생하였으며, 2리터의 탈염수로 세척함으로써 과다한 재생없이 세척하였다.
실시예 5:
7-β-(5-아미노-5-카르복시펜탄아미도)-3-[(1,2,5,6-테트라히드로-2-메틸-5,6-디옥소-1,2,4-트리아진-3-일)-티오메틸]-세팔로스포란산 (TTC)의 제조
600ml의 탈염수를 함유하는 유리를 입힌 반응기에 37.96g(0.24몰)의 2,5-디히드로-3-메르캅토-2-메틸-5,6-디옥소-1,2,4-트리아진(이하, TTZ라 함)을 첨가하고, 반응기를 약 75℃의 온도까지 교반하면서 가열하였다. 상기 혼합물의 pH를 약 12g의 탄산나트륨을 첨가하여 6.7로 조절하였다.
별도의 유리를 입힌 플라스크에서, 200ml의 물 중 33.23g의 소듐 세팔로스포린 C(75% 자유 산(free acid), 0.06몰, HPLC 순도 98%)를 용해시켜 진한 소듐 세팔로스포린 C 용액을 제조하였다. TTZ가 용해되었을 때, 진한 세팔로스포린 C 용액을 첨가하고, 세팔로스포린 C의 수준이 2% 이하로 될 때까지 반응 속도를 조절하면서 그 혼합물을 약 75℃에서 75분 동안 교반하였다.
시간(분) 세팔로스포린 C (몰) TTC(몰) TTZ(몰)
0 0.06 0 0.24
75 0.0011 0.036 0.19
상기 반응 혼합물을 약 4℃까지 냉각시키고, pH를 감소시켰지만, 과량의 TTZ의 결정화가 개시되지 않았다. 0.036몰의 TTC 및 0.19몰의 TTZ를 함유하는 용액을 3M 암모니아를 이용하여 pH 7.25로 조정하고, 탈염수와 함께 클로라이드 사이클(충전 부피 209ml) 중의 Amberlite IRA-400 칼럼상에 유속 20ml/분으로 로딩하였다. 칼럼을 최초로 통과시킨 후, 잔류 TTZ는 0.015몰이었다.
이러한 이유로, 용출액을 또 다른 Amberlite IRA-400 칼럼(동일한 충전 부피)에 상술한 바와 동일한 조건하에서 로딩하여 TTZ의 수준을 감소시켰다.
로딩한 후, 칼럼을 HPLC 순도 90%의 로딩된 TTC의 재생율 60%까지 탈염수(약 120ml)로 세척하였다. 유출액의 pH는 약 5.4이었고, 3M 암모니아를 이용하여 pH 7.0으로 중성화하였다. 잔류 TTZ는 0.00096몰이었고, 이는 화학 반응 후 최초 TTZ의 1% 미만이다. 이와 같은 TTZ의 낮은 수준에 의해 효소의 독성화없이 상기 유도체의 효소화가 가능하다.
칼럼은 10% 아세토니트릴을 함유하는 1L의 1.5M HCl로 재생하였으며, 2리터의 탈염수로 세척함으로써 과다한 재생없이 세척하였다.
실시예 6: 7-아미노-3-[(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)-티오메틸]-세팔로스포란산(TDA)의 합성
순도 94.4%(HPLC)를 갖는 0.041몰의 7β-(5-아미노-5-카르복시펜트아미도)-3-[(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)-티오메틸]세팔로스포란산(이하, TDC라 함)과 0.2mg/mL 미만의 2-메르캅토-5-메틸-1,3,4-티아디아졸(MMTD)을 함유하는 강한 음이온 교환기 AmberliteRIRA400로부터 실시예 1의 여액(925ml)의 pH를 3M 암모니아를 사용하여 pH 6.75로 조절하였다.
TDC 용액을 Roche Molecular Biochemicals가 시판하고 있으며 WO-A-9516773호에 기재되어 있는 습식 고정화 D-아미노산 옥시다아제 82.5g(30.3 Roche'sUnits/g)과 함께 1.5리터의 교반 반응기에 주입하였다.
전환반응은 20℃, 400rpm에서 바닥 분배기를 통해 2바아의 절대 압력에서 0.1vol/vol/분의 산소 유속으로 수행되었다. pH를 자동 적정기에 의해 3M 암모니아를 이용하여 pH 7.0으로 적정하였다.
전환율은 역상 칼럼 Nucleosil 120 3-C18 125×8×4mm에서 HPLC에 의해 제어하였다. 이동상은 260nm 검출기와 함께 1ml/분의 속도의 4% 아세토니트릴을 함유하는 pH 5.5의 20mM 아세테이트 암모늄이었다. TDC는 7.0분에서 나타났고, α-케토아디필-중간체는 8.5분에서 나타났으며, TDG(3-티올화 글루타릴-7-ACA)는 11.5분에서 나타났다.
상기 효소를 제외한 반응 혼합물의 대표적인 샘플들을 취하여 얻어진 결과를 하기 표에 나타낸다.
TDC TDK TDG TDA 부산물
시간(분) 전환율 (%) 생성율(%) 생성율(%) 생성율(%) 생성율(%)
0 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
10 30.20 2.04 25.49 0.00 0.30
100 98.49 2.94 94.69 0.00 0.86
H2O2적정 98.60 0.00 97.71 0.00 0.89
TDC의 전환율이 98%보다 높았을 때, 반응을 멈추고, 반응 용액을 여과하였다. 잔류 생물 촉매를 100ml의 100mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다. 후자의 부피를 첫 번째 여액에 첨가하였다.
잔류 α-케토아디필-티올화 유도체(TDK)를 TDG로 변형시키기 위해, 얻어진 용액을 1M 과산화수소를 이용하여 35ppm까지 30분 동안 25℃에서 적정하였다. 이때의 전환율을 TDG의 최대 수율까지(상기 표 참조) HPLC로 제어하였다. 처리후 순도는 TDG가 92.65%이고, 기타 β-락탐은 7.34%이었다.
잔류 과산화수소는 가용성코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 카탈라아제(650 kU, Roche Molecular Biochemicals로부터 구입) 10㎕를 5분 동안 첨가함으로써 제거하였다.
그 결과 얻어진 TDG 용액을 3M 암모니아를 이용하여 pH 8.0으로 조절하고, 습식 고정화 글루타릴-7-ACA 아실라아제(Roche Molecular Biochemicals으로부터 구입)의 57.08g(87.6 Roche's Units/g)을 함유하는 1.5L 교반 반응기로 이송하였다. 전환반응은 20℃, 250rpm, 상압에서 0.01부피/부피/분의 바닥 분배기를 통한 질소 기류로 수행하였다. pH를 자동 적정기에 의해 3M 암모니아를 이용하여 pH 8.0으로 적정하였다. 전환율은 D-AAO 반응과 동일한 조건을 갖는 HPLC에 의해 제어하였다. 생성물인 7-아미노-3-[(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)-티오메틸]-세팔로스포란산(이하, TDA라 함)에 대한 체류 시간은 7.2분이었다.
반응 혼합물의 대표적인 샘플들을 취하여 얻어진 결과를 하기 표에 나타낸다.
TDG TDA 부산물
시간(분) 전환율(%) 생성율(%) 생성물(%)
0 0.00 0.00 0.89
10 68.92 65.12 2.52
50 97.40 93.61 2.52
TDC의 전환율이 97% 보다 높았을 때, 반응을 중단하고, 반응 용액을 여과하였다. 잔류 효소를 100ml의 100mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 세척하고, 잔류 촉매는 재사용할 준비를 하였다. 후자의 부피를 TDA를 함유하는 여액에 첨가하고, 10℃로 냉각하였다. pH를 진한 황산으로 5.2까지 조정하고, 서서히 교반하면서 60분 동안 결정화시켰다.
침전물을 여과하고, 250ml의 50% 아세톤/물과 100ml의 아세톤으로 연속하여 세척하고, 재차 여과한 다음 35℃에서 진공 건조하여 13.91g(K.F. 1.81%)의 실질적으로 순수한 HPLC 순도 98.2% 및 420nm에서 투과도 87(2% NaHCO3에서 1% 용액으로서 확인; 1cm 세포)을 갖는 7-아미노-3-[(메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)-티오메틸]-세팔로스포란산을 얻었다.
이러한 CEE 방법으로 출발물질인 세팔로스포린 C 용액(자유산의 24.92 활성 그램)으로부터 TDA의 총 수율은 64.6%이었다.
TDA
1H-NMR (DMSO/HCl)(δppm): 2.59(s, 3H, -CH3); 3.68(broad s, 2H, -CH2-); 4.2-4.48(J=13.2 Hz, 2H, -CH2-); 5.03(d, J =4.8 Hz, 1H, C-6); 5.11(d, J =4.8 Hz, 1H, C-7).
원소분석
C11H12N4S3O3에 대한 계산치: C: 38.36%; H: 3.51%; S: 27.93%; N: 16.27%
실측치: C: 38.35%; H: 3.4%; S: 28.00%; N: 16.04%.
실시예 7: 효소의 재사용시 TDC 용액 내 존재하는 복소환 티올의 효과
TDC의 2-단계 효소화 반응시 잔류 복소환 티올의 독성 효과를 알아보기 위해, TDC를 강한 음이온 교환기 AmberliteRIRA400에서 경우에 따라 크로마토그래피에 의해 복소환 티올을 제거하여 사용하였다. 결정화 단계 후 MMTD의 수준은 2.56mg/ml이었다. AmberliteRIRA400 강한 음이온 교환기 상에서의 크로마토그래피 분리 단계 후, MMTD의 양은 0.2mg/mL 미만이었으며, 이 수치는 최초 사용 MMTD의 1% 미만이다.
하기 표는 크로마토그래피 분리 단계가 없는 경우 4 사이클 후 D-아미노산 옥시타아제 시간이 2배가 되는 반면에, 미량의 MMTD를 갖는 TDC의 경우 12 사이클 이후 동일한 양(약 100분)으로 잔류한다.
크로마토그래피 분리 단계가 없는 경우
사이클 D-아미노산 옥시다아제 글루타릴-7-ACA 아실라아제
시간(분) 시간(분)
1 100 70
2 150 50
3 150 60
4 230 60
크로마토그래피 분리 단계가 있는 경우
사이클 D-아미노산 옥시다아제 글루타릴-7-ACA 아실라아제
시간(분) 시간(분)
1 90 60
2 90 60
3 100 50
4 90 50
5 100 50
6 90 50
7 100 50
8 100 50
9 100 50
10 100 50
11 100 50
12 100 50
제2효소 글루타릴-7-ACA-아실라아제의 경우, 제1반응 이후 제조 및 첨가되는 과산화수소가 약 50분의 반응시간과 함께 촉매 활성을 유지하면서 미량의 MMTD를 파괴하는 것으로 보인다.
실시예 8: 7-아미노-3-[(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-티오메틸]-세팔로스포란산(TZA)의 합성
91.3% 순도(HPLC)를 갖는 0.039몰의 7-(5'-아미도아디프아미도)-3-[(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-티오메틸]-세팔로스포란산(TZC)과 0.2mg/ml의 5-메르캅토-1-메틸테트라졸(MMTZ)을 함유하는 강한 음이온 교환기 AmberliteR로부터 실시예 4의 여액(1000ml)의 pH를 3M 암모니아를 사용하여 7.25로 조정하였다.
TZC 용액을 Roche Molecular Biochemicals가 시판하고 있으며 WO-A-9516773호에 기재되어 있는 습식 고정화 D-아미노산 옥시다아제 82.5g(30.3 Roche's Units/g)과 함께 1.5리터의 교반 반응기에 주입하였다.
전환반응은 20℃, 400rpm에서 바닥 분배기를 통해 2바아의 절대 압력에서 0.1부피/부피/분으로 산소 기류로 수행되었다. pH를 자동 적정기에 의해 3M 암모니아를 이용하여 pH 7.25로 적정하였다.
전환율은 역상 칼럼 Nucleosil 120 3-C18 125×8××4mm에서 HPLC에 의해 제어하였고, 이동상은 260nm 검출기와 함께 1ml/분의 속도의 4% 아세토니트릴을 함유하는 pH 5.5의 20mM 암모늄 아세테이트이었다. TZC는 3.0분에서 나타났고, α-케토아디필-중간체는 3.6분에서 나타났으며, TZG(3-티올화 글루타릴-7-ACA)는 4.6분에서 나타났다.
상기 효소를 제외한 반응 혼합물의 대표적인 샘플들을 취하여 얻어진 결과를하기 표에 나타낸다.
TZC TZK TZG TZA 부산물
시간(분) 전환율(%) 생성율(%) 생성율(%) 생성율(%) 생성(%)
0 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
10 73.98 6.49 66.02 0.00 0.30
35 100.00 4.26 91.28 0.00 2.12
H2O2적정 100.00 0.00 98.17 0.00 1.83
TZC의 전환율이 99%보다 높았을 때, 반응을 멈추고, 반응 용액을 여과하였다. 잔류 생물 촉매를 100ml의 100mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다. 후자의 부피를 첫 번째 여액에 첨가하였다.
잔류 α-케토아디필-티올화 유도체(TZK)를 TZG로 변형시키기 위해, 얻어진 용액을 1M 과산화수소를 이용하여 35ppm까지 30분 동안 25℃에서 적정하였다. 이때의 전환율을 HPLC로 제어하였다(상기 표 참조). 처리후 순도는 TZG가 89.45%이었고, 기타 β-락탐은 10.55%이었다.
잔류 과산화수소는 가용성코리네박테리움 글루타미쿰카탈라아제(650 kU, Roche Molecular Biochemicals로부터 구입) 10㎕를 5분 동안 첨가함으로써 제거하였다.
그 결과 얻어진 TZG 용액을 3M 암모니아를 이용하여 pH 8.0으로 조절하고, 습식 고정화 글루타릴-7-ACA 아실라아제(Roche Molecular Biochemicals으로부터 구입)의 57.08g(87.6 Roche's Units/g)을 함유하는 1.5L 교반 반응기로 이송하였다. 전환반응은 20℃, 250rpm에서 상압에서 0.01부피/부피/분의 바닥 분배기를 통한 질소 기류로 수행하였다. pH를 자동 적정기에 의해 3M 암모니아를 이용하여 pH 8.0으로 적정하였다. 전환율은 D-AAO 반응과 동일한 조건을 갖는 HPLC에 의해 제어하였다. 생성물인 7-아미노-3-[(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)-티오메틸]-세팔로스포란산(이하, TZA라 함)에 대한 체류 시간은 3.2분이었다.
반응 혼합물의 대표적인 샘플들을 취하여 얻어진 결과를 하기 표에 나타낸다.
TZK TZG TZA 부산물
시간(분) 전환율(%) 전환율(%) 생성율(%) 생성율(%)
0 0.00 0.00 0.00 1.83
10 0.00 73.08 69.72 3.36
45 0.00 100.00 95.12 4.88
TZG의 전환율이 99% 보다 높았을 때, 반응을 중단하고, 반응 용액을 여과하였다. 잔류 효소를 100ml의 100mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 세척하고, 잔류 촉매는 재사용할 준비를 하였다. 후자의 부피를 TZA를 함유하는 여액에 첨가하고, 10℃로 냉각시켰다. pH를 진한 황산으로 5.2까지 조정하고, 서서히 교반하면서 60분 동안 결정화시켰다.
침전물을 여과하고, 250ml의 50% 아세톤/물과 100ml의 아세톤으로 연속하여 세척하고, 재차 여과한 다음 35℃에서 진공 건조하여 9.94g(K.F. 1.4%)의 실질적으로 순수한 HPLC 순도 96.60%를 갖는 7-아미노-3-[(메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)-티오메틸]-세팔로스포란산을 얻었다.
이러한 ECC 방법으로 출발물질인 세팔로스포린 C 용액(자유산의 24.92 활성 그램)으로부터 TZA로의 총 수율은 48.05%이었다.
TZA
1H-NMR(D2O/Na2CO3)(δppm): 3.45-3.78 (J=17.7 Hz, 2H, -CH2-); 4.01-4.3 (J=13.2Hz, 2H, -CH2-); 4.03 (s, 3H, -CH3); 4.72 (d, J=4.8 Hz, 1H, C-6); 5.00( d, J=4.8 Hz, 1H, C-7).
실시예 9: 효소의 재사용시 TZC 용액 내 존재하는 복소환 티올의 효과
TZC의 2-단계 효소화 반응시 잔류 복소환 티올의 독성 효과를 알아보기 위해, TZC를 강한 음이온 교환기 AmberliteRIRA400에서 경우에 따라 크로마토그래피 분리에 의해 복소환 티올을 제거하여 사용하였다. 화학 반응 단계 후 MMTZ의 수준은 27.6mg/ml이었다. AmberliteRIRA400 강한 음이온 교환기 상에서의 크로마토그래피 분리 단계 후, MMTZ의 양은 0.2mg/mL 미만이었으며, 이 수치는 사용된 MMTZ의 1% 미만이다.
하기 표는 크로마토그래피 분리 단계가 없는 경우 2 사이클 내에 D-아미노산 옥시타아제 반응 시간이 얼마나 증가하였는지 나타내고 있지만, 글루타릴-7-ACA 아실라아제에 크게 영향을 미쳐 제2 사이클에서 제2반응을 종결할 수 없었다.
크로마토그래피 분리 단계가 없는 경우
사이클 D-아미노산 옥시다아제 글루타릴-7-ACA 아실라아제
시간(분) 시간(분)
1 100 >110
2 120 >>110
크로마토그래피 분리 단계가 있는 경우
D-아미노산 옥시다아제 글루타릴-7-ACA 아실라아제
사이클 시간(분) 시간(분)
1 45 45
2 35 45
3 35 40
4 40 48
5 45 48
그러나, 상기 2개의 효소에 대해 크로마토그래피 분리 단계를 갖는 사이클의 시간은 상기 표에 나타낸 5개의 사이클에서 거의 동일한 것으로 나타났다. 이는 효소의 안정성을 위해 티올의 제거가 필요함을 시사하고 있다.
실시예 10: 7-아미노-3-[(1,2,5,6-테트라히드로-2-메틸-5,6-디옥소-1,2,4-트리아진-3-일)-티오메틸]-세팔로스포란산(TTA)의 제조
88% 순도(HPLC)를 갖는 0.032몰의 7β-(5-아미노-5-카르복시펜트아미도)-3-[(1,2,5,6-테트라히드로-2-메틸-5,6-디옥소-1,2,4-트리아진-3-일)-티오메틸]-세팔로스포란산(이하, TTC라 함)과 0.2mg/ml의 2,5-디히드로-3-메르캅토-2-메틸-5,6-디옥소-1,2,4-트리아진(TTZ)을 함유하는 강한 음이온 교환기 AmberliteRIRA400으로부터 실시예 5의 여액(1000ml)의 pH를 3M 암모니아를 사용하여 7.25로 조정하였다.
TTC 용액을 Roche Molecular Biochemicals가 시판하고 있으며 WO-A-9516773호에 기재되어 있는 습식 고정화 D-아미노산 옥시다아제 82.5g(30.3 Roche's Units/g)과 함께 1.5리터의 교반 반응기에 주입하였다.
전환반응은 20℃, 400rpm에서 바닥 분배기를 통해 2바아의 절대 압력에서 0.1부피/부피/분의 산소 기류로 수행되었다. pH를 자동 적정기에 의해 3M 암모니아를 이용하여 pH 7.25로 적정하였다.
전환율은 역상 칼럼 Nucleosil 100 3-C18 125×8×4.6mm에서 HPLC에 의해 제어하였고, 이동상은 260nm 검출기와 함께 1ml/분의 속도의 10mM 테트라부틸암모늄 하이드로겐 술페이트 및 15mM 포타슘 디하이드로겐 포스페이트 중의 25% 메탄올이었다. TTC는 4.3분에서 나타났고, α-케토아디필-중간체는 6.8분에서 나타났으며, 3-티올화 글루타릴-7-ACA(TTG)는 8.2분에서 나타났다.
상기 효소를 제외한 반응 혼합물의 대표적인 샘플들을 취하여 얻어진 결과를 하기 표에 나타낸다.
TTC TTK TTG TTA 부산물
시간(분) 전환율(%) 생성율(%) 생성율(%) 생성율(%) 생성율(%)
0 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
40 75.43 1.80 66.67 0.00 5.21
90 97.60 2.67 88.54 0.00 6.39
H2O2적정 97.60 0 90.96 0.00 6.5
TTC의 전환율이 97%보다 높았을 때, 반응을 멈추고, 반응 용액을 여과하였다. 잔류 생물 촉매를 100ml의 100mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다. 후자의 부피를 첫 번째 여액에 첨가하였다.
잔류 α-케토아디필-티올화 유도체(TTK)를 TTG로 변형시키기 위해, 얻어진 용액을 1M 과산화수소를 이용하여 35ppm까지 30분 동안 25℃에서 적정하였다. 이때의 전환율을 HPLC로 제어하였다(상기 표 참조). 처리후 순도는 TTG가 80.77%이었고, 기타 β-락탐은 19.23%이었다.
잔류 과산화수소는 가용성코리네박테리움 글루타미쿰카탈라아제(650 kU, Roche Molecular Biochemicals로부터 구입) 10㎕를 5분 동안 첨가함으로써 제거하였다.
그 결과 얻어진 TTG 용액을 3M 암모니아를 이용하여 pH 8.0으로 조절하고, 습식 고정화 글루타릴-7-ACA 아실라아제(Roche Molecular Biochemicals으로부터 구입)의 57.08g(87.6 Roche's Units/g)을 함유하는 1.5L 교반 반응기로 이송하였다. 전환반응은 20℃, 250rpm에서 상압에서 0.01부피/부피/분의 바닥 분배기를 통한 질소 기류로 수행하였다. pH를 자동 적정기에 의해 3M 암모니아를 이용하여 pH 8.0으로 적정하였다.
전환율은 D-AAO 반응과 동일한 조건을 갖는 HPLC에 의해 제어하였다. 생성물인 7-(5'-아미노아디프아미도)-3-[(1,2,5,6-테트라히드로-2-메틸-5,6-디옥소-1,2,4-트리아진-3-일)-티오메틸]-세팔로스포란산(TTA)에 대한 체류 시간은 5.2분이었다.
반응 혼합물의 대표적인 샘플들을 취하여 얻어진 결과를 하기 표에 나타낸다.
TTK TTG TTA 부산물
시간(분) 전환율(%) 전환율(%) 생성율(%) 생성율(%)
0 0 0.00 0.00 6.39
10 0 94.33 84.49 7.13
50 0 100.00 89.09 7.64
TTG의 전환율이 99% 보다 높았을 때, 반응을 중단하고, 반응 용액을 여과하였다. 잔류 효소를 100ml의 100mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 세척하고, 잔류 촉매는 재사용할 준비를 하였다. 후자의 부피를 TZA를 함유하는 여액에 첨가하고,10℃로 냉각시켰다. pH를 진한 염산으로 4.2까지 조정하고, 서서히 교반하면서 60분 동안 결정화시켰다.
침전물을 여과하고, 250ml의 50% 아세톤/물과 100ml의 아세톤으로 연속하여 세척하고, 재차 여과한 다음 40 에서 진공 건조하여 8.53g(K.F. 5.95%)의 실질적으로 순수한 HPLC 순도 98.28%를 갖는 7-(5'-아미도아디프아미도)-3-[(1,2,5,6-테트라히드로-2-메틸-5,6-디옥소-1,2,4-트리아진-3-일)-티오메틸]-세팔로스포란산을 얻었다.
이러한 ECC 방법으로 출발물질인 세팔로스포린 C 용액(자유산의 24.92 활성 그램)으로부터 TTA로의 총 수율은 40.01%이었다.
TTA
1H-NMR(D2O/Na2CO3)(δppm): 3.43-3.7 (J=17.7 Hz, 2H, -CH2-); 3.63 (s, 3H, -CH3); 4.02-4.33 (J=13.8 Hz, 2H, -CH2-); 4.73 (d, J=4.5 Hz, 1H, C-6); 5.02 (d, J=4.5 Hz, 1H, C-7).
본 발명은 구체적으로 변경될 수 있는 상술한 실시형태로 한정되지 않는다.

Claims (43)

  1. 하기 화학식 I의 3-티올화 세팔로스포린 C를 효소적으로 전환시켜 하기 화학식 II의 3-티올화-글루타릴-7-ACA를 형성하는 단계; 및
    화학식 II의 화합물을 효소적으로 전환시켜 하기 화학식 III의 3-티올화-7-ACA를 형성하는 단계를 포함하는, 3-티올화 7-아미노세팔로스포란산 유도체를 제조하기 위한 효소적 방법:
    (I)
    (II)
    (III)
    상기 식에서, R은 하나 이상의 질소 원자를 포함하는 복소환기이고, R1및 R2는 모두 수소 원자이거나, 또는 이들 중 하나는 수소 원자이고 다른 하나는 아실공여기이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 I의 3-티올화 세팔로스포린 C가
    화학식 I의 화합물을 분자 산소의 존재하에서 고정화 D-아미노산 옥시다아제와 반응시키고;
    담지된 효소를 수성 반응 혼합물로부터 분리하고;
    과산화수소를 첨가하여 3-티올화-α-케토아디필 세팔로스포란산을 화학식 II의 화합물로 전환시킴으로써 화학식 II의 3-티올화-글루타릴-7-ACA로 전환되는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물이 절대 압력 약 2 바아, pH 6.0 내지 8.0, 온도 20 내지 30℃에서 0.5시간 내지 3시간 동안 고정화 D-아미노산 옥시다아제와 반응되는 방법.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 담지된 효소를 농축 염 용액으로 세척하는 단계 및 그 결과 형성되는 용액에 바람직하게는 30 내지 50ppm의 양의 과산화수소를 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 상기 용액에 촉매를 첨가함으로써 과량의 과산화수소를 용액으로부터 제거하는 단계를 포함하는방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 과량의 과산화수소가 용액에 카탈라아제를 첨가함으로써 제거되는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 II의 화합물이 고정화 글루타릴-7-ACA 아실라아제와 화학식 II의 화합물을 접촉시킴으로써 화학식 III의 화합물로 전환되는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 화학식 II의 화합물로부터 화학식 III의 화합물을 형성하기 위한 상기 반응이 상압, pH 6.0 내지 8.5, 20 내지 35℃의 온도, 불활성 분위기 하에서 0.5 내지 3시간 동안 수행되는 방법.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 화학식 III의 화합물이 반응 매질을 산성화시킴으로써 침전되고, 이렇게 형성된 침전물이 세척 및 건조되는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소들이 적절한 고체 담지체에서 적절한 가교제를 사용하여 고정되는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 효소들이 생체 촉매로서 사용하기에 적합한 크기의결정 형태인 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소적 방법이 상기 효소를 수성 기질 용액에서 분산된 형태로 유지하는 동안 수행되는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소적 방법이 칼럼에서 수행되는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 재사용을 위해 효소를 회수하기 위한 단계를 포함하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 III의 화합물의 결정화가 산성 pH에서 수행되는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 III의 3-티올화-7-ACA를 형성하기 위한 화학식 I의 3-티올화 세팔로스포린 C의 효소적 전환반응이 단일 포트에서 수행되는 방법.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, R이 하나 이상의 질소 원자와 경우에 따라 황 또는 산소 원자를 포함하는 복소환기인 방법.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, R이 티에닐, 디아졸릴, 테트라졸릴, 티아졸릴, 트리아지닐, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 벤조티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈옥사졸릴 또는 이들의 유도체를 포함하는 군의 하나 또는 그 이상으로부터 선택되는 복소환기이고, 바람직하게는 5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일, 1-메틸-테트라졸-5-일 또는 1,2,5,6-테트라히드로-2-메틸-5,6-디옥소-1,2,4-트리아진-3-일인 방법.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물이 고체 형태이거나 또는 그의 비-독성 염 형태인 방법.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 화학식 III의 3-티올화-7-ACA.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 화학식 III의 화합물을 형성한 다음 효소화하는 것을 포함하는 세팔로스포린 C 항생제 및 이들의 유도체를 제조하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 항생제가 세파졸린, 세파제돈, 세포페라존, 세파만돌, 세파트리아진, 세포티암 또는 세프트리악손인 방법.
  23. 세팔로스포린 C를 하기 화학식 IV의 티올 화합물과 반응시켜 화학식 I의 화합물을 형성시키는 단계; 및
    화학식 I의 화합물을 형성한 후 화학식 IV의 과량의 티올을 제거하는 단계를 포함하는, 3-티올화 7-아미노세팔로스포란산 유도체를 제조하는 효소적 방법:
    R-SH (IV)
    상기 식에서, R은 하나 이상의 질소원자를 포함하는 복소환기이다.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 과량의 티올이 음이온 교환 수지 상에서 흡착시킴으로써 제거되는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지가 가교된 아크릴 공중합체 구조를 갖는 미세 다공성 수지인 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지가 티알킬 벤질 암모늄 작용기를 함유하며 가교도 8%를 포함하는 방법.
  27. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 상기 수지가 클로라이드, 히드록시, 포스페이트 또는 아세테이트 고리 화합물인 방법.
  28. 제 23항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 과량의 티올은 결정화에 의해 제거되는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 결정화가 산성 pH에서 수행되는 방법.
  30. 제 23항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 과량의 티올이 결정화된 다음 음이온 교환 수지 상에서 흡착됨으로써 제거되는 방법.
  31. 제 23항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세팔로스포린 C가 수성 매질 형태인 방법.
  32. 제 23항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세팔로스포린 C가 진한 세팔로스포린 C 용액 형태인 방법.
  33. 제 23항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응이 pH 5.5 내지 8.0, 온도 60 내지 80℃에서 1 내지 12시간 동안 수행되는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 반응이 pH 약 6.0, 온도 약 65℃에서 수행되는 방법.
  35. 제 23항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티올 화합물이 세팔로스포린 C의 1 내지 5몰/몰의 양으로 존재하는 방법.
  36. 제 23항에 있어서, R이 하나 이상의 질소 원자와 경우에 따라 황 또는 산소 원자를 포함하는 복소환기인 방법.
  37. 제 23항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, R이 티에닐, 디아졸릴, 테트라졸릴, 티아졸릴, 트리아지닐, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 벤조티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈옥사졸릴 또는 이들의 유도체를 포함하는 군의 하나 또는 그 이상으로부터 선택되는 복소환기이고, 바람직하게는 5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일, 1-메틸-테트라졸-5-일 또는 1,2,5,6-테트라히드로-2-메틸-5,6-디옥소-1,2,4-트리아진-3-일인 방법.
  38. 제 23항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물이 고체 형태이거나, 또는 그의 비독성 염 형태인 방법.
  39. 제 1항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어지는 하기 화학식의 화합물:
    상기 식에서, R은 하나 이상의 질소 원자를 포함하는 복소환기이다.
  40. 화학식 I에서 R이 5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일인 하기 화학식의 화합물:
  41. 화학식 I에서 R이 1,2,5,6-테트라히드로-2-메틸-5,6-디옥소-1,2,4-트리아진-3-일인 하기 화학식의 화합물:
  42. 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 화합물을 형성한 다음 효소화하는 것을 포함하는 세팔로스포린 C 항생제 및 이들의 유도체를 제조하는 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 상기 항생제가 세파졸린, 세파제돈, 세포페라존, 세파만돌, 세파트리아진, 세포티암 또는 세프트리악손인 방법.
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