JP2876652B2 - Ｄ―アミノ酸オキシダーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（以下、DAOと
略称する）に関し、さらに詳しくは、セファロスポリン
Ｃの７−β−（５−カルボキシ−５−オキソぺンタンア
ミド）セファロスポラン酸（ケト−AD−7ACA）への変換
を触媒し得る微生物由来のDAO、該DAOをコードするDN
A、該DNAを担持する発現ベクター、および該発現ベクタ
ーで形質転換された形質転換体、並びに、該形質転換体
を培養してDAOを製造する方法およびそのようにして得
られたDAOの使用法に関するものである。

従来技術とその課題 DAOは、脊椎動物から微生物に至る広範な動物組織に
存在する、Ｄ−アミノ酸の酸化的脱アミノ酵素である。
しかるに、DAO産生性の微生物の内、フザリウム・ソラ
ニ（Fusarium solani）Ｍ−0718（通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所から微工研菌寄第2688号の下で
入手可能）の菌糸体またはその処理物は、上記の脱アミ
ノ作用以外に、抗生物質の一種であるセファロスポリン
Ｃ（CC）に作用して７−β−（５−カルボキシ−５−オ
キソペンタンアミド）セファロスポラン酸（ケト−AD−
7ACA）を生成させ、さらに、ケト−AD−7ACAの一部と副
生成物である過酸化水素との反応生成物として７−β−
（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラン酸
（GL−7ACA）を生成させる作用を有することが知られて
いる（特公昭第57−18879号公報参照）。なお、このフ
ザリウム属のDAO産生性微生物F.ソラニＭ−0718は、微
工研条寄第2619号の下でも、上記の公的機関から入手可
能である。

GL−7ACAはアシラーゼ（GL−7ACAアシラーゼ）の酵素
作用によって、種々のセフェム系抗生物質の化学合成に
おける重要な出発物質である７−アミノセファロスポラ
ン酸（7ACA）に変換される。CCからケト−AD−7ACA、GL
−7ACAを経て7ACAに至る一連の酵素反応は以下の反応式
で示される。

現在、多くの抗生物質が存在しているが、新たな耐性
菌の出現、多様化する治療状況等の理由で、より効果的
な抗生物質を、安価に供給することが望まれている。と
ころで、広い抗菌スペクトルを有し、極めて有用な抗生
物質であるセフェム系抗生物質の製造における最も重要
な出発物質は、上記のごとく、7ACAである。従って、多
量の7ACAを容易に得ることができれば、既存のセフェム
系抗生物質の増産、あるいは新規な抗生物質の開発がよ
り容易になり、促進されると考えられる。しかしなが
ら、従来の化学合成法では、CCから多段階工程を経て7A
CAを得ており、その工程は複雑であり、効率の良い方法
ではなかった。近年、このような場合に有用な方法とし
て、微生物等に由来する酵素を用いるバイオリアクター
法が注目されている。

バイオリアクター法で7ACAを製造するには、各工程に
関与する酵素を確保する必要がある。即ち、上記反応式
から明らかなように、DAOおよびGL−7ACAアシラーゼが
不可欠である。従って、DAOおよびGL−7ACAアシラーゼ
を大量に供給し得る手段が確立されれば、7ACAのバイオ
リアクターまたは直接発現法による製造が可能となり、
ひいては、セフェム系抗生物質の製造並びに開発が促進
されると考えられる。

既に、トリゴノプシス・バリアビリス（Trigonopsis
variabilis）が産生するDAOをコードする遺伝子はクロ
ーニングされている（特開昭62−262994）。しかしなが
ら、フザリウム属由来のDAOについては、十分に精製さ
れ、DNA配列が決定された例はなく、当然、遺伝子がク
ローニングされるまでに至っていない。従って、CCを基
質としてGL−7ACAを生成する酵素活性を有するフザリウ
ム属由来のDAOをコードする遺伝子のクローニングがな
されたならば、遺伝子組換え技術によりDAOを大量に製
造し、これを上記したバイオリアクター法、または他の
酵素的手段に適用することにより、７−ACAの大量生産
が可能になると考えられる。

課題を解決するための手段 本発明者らは、F.ソラニＭ−0718由来のDAOの有用性
に着目し、上記したCCのケト−AD−7ACAへの変換を触媒
する酵素活性を有するDAOを菌糸体から精製した。

次いで、DAOのmRNAを単離し、該mRNAを逆転写してcDN
Aを得、cDNAライブラリーを調製し、プローブしてDAOを
コードするDNAをクローニングすることに成功した。さ
らに、クローニングしたDNAを適当な発現ベクターに組
込んでDAO発現ベクターを構築し、該発現ベクターを大
腸菌宿主に導入して得られた形質転換体を培養し、該形
質転換体にDAOを発現させた。このようにして得られた
形質転換体の培養物、およびその処理物は、CCをケト−
AD−7ACAおよびGL−7ACAに変換するDAO酵素作用を有す
ることが示された。さらに精製した酵素標品を用いて測
定したDAOの分子量はSDS PAGEにより40,000±1000ダル
トンであった。

プローブは、菌糸体から精製したDAOの９個のペプチ
ド断片（AP−１〜AP−９）のアミノ酸配列を決定し、そ
れを基にして調製された。これらの各断片のアミノ酸配
列は、第７図に記載のDAOをコードするDNAの塩基配列か
ら推定されるアミノ酸配列の対応する部分と一致してい
た（第８図参照）。このことは、菌糸体からのDAOの精
製が成功したことを示すものである。決定された各ペプ
チド断片のアミノ酸配列は以下の通りである。

従って、本発明はまた、CCをケト−AD−7ACAに変換す
る酵素活性を有し、分子量がSDS−PAGE上、40,000±1,0
00ダルトンであって、上記のAP−１〜AP−９で示される
ペプチド断片を含有するペプチド配列を有するDAOを提
供するものである。

DAOをコードするDNAのクローニングは、添付の第１図
にその概要を記載した方法に従って行われた。

まず、F.ソラニＭ−0781の全RNAから得たmRNAを逆転
写してcDNAライブラリーを調製する一方、菌体からDAO
を精製し、精製DAOの部分アミノ酸配列（ペプチド断片A
P−１〜AP−９）を決定した。その部分アミノ酸配列に
基いて合成DNAプローブを作成し、このプローブと上記c
DNAライブラリーとのハイブリダイゼーションによって
所望のクローンを検索し、得られたDNAのクローニング
を行い、所望のcDNAを含有するプラスミドを選択し、pC
FS3と命名した。次いで、このDAOをコードするcDNA（DA
OcDNA）の塩基配列、並びに対応するアミノ酸配列を決
定した。DNAライブラリー作成の模式図を第２図に、DAO
cDNAの塩基配列および対応するアミノ酸配列を第７図に
示す。

上記のごとくクローニングしたDAOをコードするDNA
を、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入す
ることにより、微生物宿主内でDAOを発現するDAO発現ベ
クターを構築することができる。DAO遺伝子を挿入し得
る発現ベクターは当業者に既知であり、また、様々な種
類のプロモーターを利用し得る。本発明においては、ta
cプロモーターとSD配列、並びにカナマイシン耐性を付
与するDNA配列を含有し、大腸菌宿主内で複製可能なDAO
発現ベクター、pCFS 315を構築した。該ベクターで大腸
菌宿主［エシェリキア・コリ（Escherichia coli）JM10
9］を形質転換し、得られた形質転換体、エシェリキア
・コリ（E.coli）JM109（pCFS315）を培養してその培養
物からDAO活性を有する生成物を得た。プラスミドpCFS3
15の構築模式図を第５図に示す。

上記した発現ベクターおよび宿主細胞は本発明のDAO
をコードするDNAの発現に適した多くのベクターおよび
宿主細胞の１例にすぎず、当該技術分野で通常の方法に
より、任意の宿主細胞内で機能的なDAO発現ベクターを
構築することができる。そのようなベクターに用い得る
プロモーターは既知のものから適宜選択するか、あるい
は新たに調製したもののいずれでもよい。

本発明のDAOをコードするDNAを担持する発現ベクター
で形質転換するために用いられる宿主細胞は、大腸菌等
の原核性細胞、酵母等の真核性細胞のいずれでもよく、
さらには一般的に利用されている高等生物の細胞も適す
る。また、特定の宿主系に応じた発現ベクターの構築、
該発現ベクターによる宿主細胞の形質転換、形質転換体
の培養、ならびに培養物からの生成物の回収、は全て当
業者に既知の通常の技術を用いて行うことができる。

従って、本発明は、そのような発現ベクターの構築に
有用な、第７図記載のアミノ酸配列を有するDAOを提供
するものである。

また、本発明は、上記したDAOをコードするDNA、並び
に該DNAを担持するDAO発現ベクターを提供するものであ
る。

さらに、本発明は、該発現ベクターで形質転換された
形質転換体、並びに該形質転換体を培養し、その培養物
からDAO活性を有する生成物を回収することからなるDAO
の製造方法を提供するものである。

上記のごとく、本発明方法で得られる培養物はDAO活
性を示すが、このものを当業者既知の通常の方法でさら
に処理して酵素液を調製することができる。また、所望
により精製してもよい。例えば、培養物を遠心してDAO
産生−形質転換体を収穫し、りん酸緩衝液に懸濁し、音
波処理等によって細胞を破壊する。次いで、上清を遠心
分離することにより、酵素標品を得る。さらに、上清を
透析し、クロマトグラフィー等でさらに精製すれば精製
酵素が得られる。このようにして得られた精製酵素標品
は、CCのケトAD−7ACAおよびGL−7ACAへの変換を触媒す
る。

上記から明らかなように、本発明の形質転換体を培養
して得られる培養物およびその処理物はいずれも、DAO
の酵素活性を有する。

本明細書中、培養物の「処理物」とは培養物から得ら
れる物質であって、CCを上記式（Ｉ）で示される化合物
に変換し得る酵素活性を高めるために、当該技術分野で
通常の方法により処理された物質を指す。

大腸菌宿主の場合、DAO活性は形質転換体細胞内に止
まっているので、処理物の例として以下のものを挙げる
ことができる。

（１）生の細胞：培養ブロスからろ過または遠心等の通
常の方法で分離された細胞。

（２）乾燥細胞：（１）の生細胞を凍結乾燥または真空
乾燥したもの。

（３）細胞抽出物：（１）または（２）の細胞を通常の
方法（有機溶媒中での自己溶菌、アルミナや海砂と混合
しての摩砕、または超音波処理）して得られる。

（４）酵素溶液：細胞抽出物を常法通り精製するか部分
精製することにより得られる。

（５）固定化細胞または酵素：細胞または酵素を通常の
方法で固定化（アクリルアミド、ガラスビーズ、イオン
交換樹脂等に固定化）したもの。

従って、本発明は、セファロスポリンＣまたその塩と
DAOをコードするDNAで形質転換された微生物の培養物ま
たはその処理物とを接触させることからなる、式
（Ｉ）： （式中、Ｙは−COCOOHまたは−COOHを表す） で示される化合物またはその塩の製造方法を提供するも
のである。

CCと酵素との接触は水または緩衝液中で行うことがで
きる。例えばCCを含有する緩衝液に培養物またはその処
理物の水または緩衝液中懸濁液（溶液）を加える。反応
混合物中に含有させ得る基質CCの濃度は１〜100mg/mlの
範囲が好ましい。また、pH、温度および反応時間等の反
応条件は特に限定されるものではなく、同様の酵素反応
に通常用いられる条件から適宜選択するとよい。しかし
ながら、pH7〜８、温度５〜37℃で１〜50時間反応させ
ると、好適にCCがその対応する生成物に変換される。こ
のように、本発明方法によって得られる形質転換体の培
養物またはその処理物は前記のバイオリアクター法にお
ける酵素として有用である。

本発明の発現ベクターは既述のごとく、本明細書記載
の例示のプラスミドに限定されない。これらの通常の技
術を用いて修飾（例えば、プロモーターを変換する）す
ることによって、異なる種類の微生物、また他の細胞内
で機能的であり、および／またはDAOを高レベルに産生
させることができる発現ベクターを構築することができ
る。

即ち、本発明の１実施態様として、プラスミドpCSF 3
15のtacプロモーーターをtrpプロモーターで置換し、さ
らに、fdファージターミネーターを導入することによ
り、大腸菌内で機能し、しかもより高レベルにDAOを産
生させる発現ベクター、プラスミドpYS9120A（Am^R）、p
YS9122K（Km^RおよびpYS9122C（Cm^R）を構築した。これ
らのプラスミド類で形質転換された大腸菌は高レベルに
DAOを産生することが分かった。例えば、pYS9122Kで形
質転換された大腸菌形質転換体はpCSF315で形質転換さ
れた細胞の約2.5倍の組換えDAO（ｒ−DAO）を発現し
た。このｒ−DAOを硫安沈澱、疎水性カラムクロマトグ
ラフィー、DEAEカラムクロマトグラフィー等で精製する
と、その比活性（単位/mgタンパク質）は24.5にも達し
た。また、精製ｒ−DAOのＮ−末端アミノ酸配列をも決
定した。その配列は、第７図記載の推定のアミノ酸配列
のＮ−末端配列と一致しており、組換え法によるDAOの
生産が確認された。

このように、本発明はまた、本発明のDAO発現ベクタ
ーで形質転換された宿主によって産生される組換えDAO
をも提供するものである。

本明細書においてDAOをコードするDNAの塩基配列が開
示されたので、これの基づき、通常の遺伝子組換え技術
を用いて活性なDAO誘導体を得ることは当業者にとって
容易である。故に、そのような常套手段で得られるDAO
の活性な誘導体も本発明の範囲に包含されるものである
ことは、当業者ならば理解し得るであろう。

本発明方法で得られたフザリウム属由来のDAOのアミ
ノ酸配列を、上記のトリゴノプシス属由来のDAOのそれ
と比較すると、360個のアミノ酸の内、41％に相当する1
46個が相同性を示し、59％に相当する残りの214個が非
相同性を示した（第９図）。このことから、これらの別
起源由来のDAOは明らかに別物質である。

従って、本発明は、フザリウム属由来のDAOのDNA組換
え技術による製造を初めて可能にしたものである。

本発明の実施に用いた幾つかのプラスミド類、様々な
制限酵素やT4DNAリガーゼ、その他の酵素類は、市販品
から入手し、供給者の指示に従って使用した。また、DN
Aのクローニング、各プラスミドの構築、宿主の形質転
換、形質転換体の培養および培養物からの酵素の回収
は、当業者既知の方法、あるいは文献記載の方法に準じ
て行なった。本明細書において引用した文献は、該当箇
所に括弧を設け数字で表示されており、その詳細は、明
細書末部に記載されている。

実施例１ DAO遺伝子のクローニング 1.F.ソラニＭ−0718からのmRNAの抽出および精製 DAO遺伝子のクローニングは、実質上、モレキュラー
・クローニング［実験の手引き（1982）¹⁾］（Molecula
r Cloning）の記載に従って行った。

１）全RNAの抽出 ２％グルコース、２％コーンスチープリカー（CS
L）、0.2％DL−アラニン（pH5.0）からなる培地100mlで
F.ソラニＭ−0718株を30℃で３日間振盪培養した。菌糸
体を低温下で破砕した後、40mlのグアニジンイソチオシ
アネート溶液（4Mグアニジンイソチオシアネート、50mM
Tris−HCl（pH7.5）、20mM EDTA、２％Ｎ−ラウロイル
サルコシンナトリウム、0.17M β−メルカプトエタノ
ール）に懸濁し、60℃で５分間加熱した。10,000×ｇで
10分遠心した後、グアニジン／塩化セシウム法（Molecu
lar Cloning¹⁾196頁）に従って、上澄液から全RNA13mg
を得た。

２）オリゴ（dT）−セルロースによるpoly（Ａ）RNAの
精製 全RNA3mgを200mgオリゴ（dT）−セルロース（ベセス
ダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research L
aboratories）BRL）；により、Molecular Cloning¹⁾197
頁記載の方法に従って精製し、poly（Ａ）RNA（ｍ−RN
A）140μｇを得た。

2.cDNAライブラリーの調製 cDNAライブラリーの作成に用いたプラスミドおよび酵
素類の供給源は以下の通りである。

オリゴ（dT）−Tailed（テール化）pcDVl−PLプライ
マー ファルマシア オリゴ（dG）−TailedHonjoリンカー ファルマシア 逆転写酵素 生化学工業 ターミナルトランスフェラーゼ 宝酒造 E.coli DNAリガーゼ ファルマシア DNAポリメラーゼＩ ファルマシア R NaseH 宝酒造 Hind III BRL 1.で得たｍ−RNA 11μｇとオリゴ（dT）−テール化pcDV
1−PLプライマー２μｇに逆転写酵素を作用させること
により、ss−ｃ−DNA（一本鎖cDNA）0.53μｇを合成し
た。これにターミナルトランスフェラーゼを作用させ
て、平均15のＣ−tailing（テーリング）をした。制限
酵素Hind IIIで切断した後、オリゴ（dG）−テール化Ho
njoリンカー0.5μｇとアニーリングし、E.coli DNAリガ
ーゼを作用させた。次いで、RNaseH、DNAポリメラーゼ
ＩおよびE.coli DNAリガーゼを作用させて、ds−ｃ−DN
A（二本鎖cDNA）を合成した。以上の操作は、オカヤマ
（Okayama）およびバーグ（Berg）の方法²⁾に従った。
次いで、このｃ−DNAを用い、ハナーン（D.Hanahan）³⁾
の方法に従って、E.coli DH1（ATCC33849）を形質転換
し、3.5×10⁵のアンピシリン耐性（Ap^R）クローンを得
た。

DNAライブラリーの作成模式図を第２図に示す。

3.DAOの精製と部分アミノ酸配列の決定 DAOの精製は、微生物からの酵素の精製における標準
的な手法に従って行われた。

１）F.ソラニＭ−0718株の培養 ２％グルコース、２％CSL、0.5％DL−アラニン（pH5.
0）からなる培地100mlを、容量500mlの三角フラスコに
入れ、F.ソラニＭ−0718株を30℃で３日間振盪培養し
た。培養液5mlを100mlの新しい培地に移し、同様に30℃
で30時間培養した。

この菌を第３図の精製フローに従い、以下のごとくに
処理した。

２）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの抽出・精製 １）で調製したF.ソラニＭ−0718培養液2lを遠心し、0.
1Mリン酸緩衝液（PB）で洗浄して約500mlの菌体スラリ
ーを得た。これに同量の海砂を加え、氷冷下乳鉢で充分
摩砕した。次いで、約同量の上記緩衝液を加えて希釈し
た後、吸引濾過してDAO粗抽出液を得た。

このDAO粗抽出液を0.3％ポリエチレンイミン処理に付
して除核酸した後、70％硫酸アンモニウムによる沈澱
（硫安沈澱）処理し、得られた沈澱を遠心分離（6,000r
pm×10min）し、0.1Mりん酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し、
0.1Mりん酸緩衝液（pH7.5）に対して一夜透析し、透析
物を35％硫安沈澱に付し、遠心分離（6,000rpm×10mi
n）して上澄液110mlを得た。これを疎水性クロマトグラ
フィー［担体:Toyopearl HW65F（商標、東洋曹達工業社
製）（200ml）、カラム内径:26mm、洗浄液:35％硫安を
含む0.1Mりん酸緩衝液（pH7.5）（500ml）、溶出:35％
硫安を含む0.1Mりん酸緩衝液（pH7.5）→0.1Mりん酸緩
衝液（pH7.5）リニアグラジエント］に付し、活性画分1
50mlを集め、20mM Tris−HCl（pH8.0）に対して一夜透
析した。透析物（160ml）をイオン交換クロマトグラフ
ィー［担体:Toyopearl DEAE 650M（商標、東洋曹達工業
社製）（120ml）、カラム内径:26mm、洗浄液:20mM Tris
−HCl（pH8.0）（250ml）、溶出:20mM Tris−HCl（pH8.
0）→0.3M NaClを含む20mM Tris−HCl（pH8.0）リニア
グラジエント（600ml）］に付し、活性画分（90ml）を
集め、10mMりん酸緩衝液（pH7.0）に対し一夜透析し
た。透析物の一部（22ml）をHPLCヒドロキシアパタイト
カラムクロマトグラフィー［担体：ヒドロキシアパタイ
トカラムHCA−A7610（三井東圧化学社製）、カラム・サ
イズ:7.6×100mm、移動相:10mMりん酸緩衝液（pH7.0）
→300mMりん酸緩衝液（pH7.0）リニアグラジエント、30
分、流速1ml/min、検出:UV280nm］に付し、活性画分（5
ml）を集めた。

上記透析物の他の一部（22ml）についても同様にHPLC
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーに付
し、活性画分（5ml）を得た。活性画分を合し、凍結乾
燥して、純度90％以上のDAO凍結乾燥品約10mgを得た。
この標品はSDS−PAGEに付すと分子量約45（40,000±100
0）の単一バンドとして観察された。

３）部分アミノ酸配列の決定 ２）で得たDAO凍結乾燥品850μｇを6Mグラニジン・HC
lおよび５％２−メルカプトエタノールからなる溶液に
溶解し、37℃において４時間、変性処理した。次に、逆
相HPLC（担体:Cosmosil 5C₄−300（ナカライテスク株式
会社）、移動相:0.05％TFA→0.05％TFA・60％CH₃CNグラ
ジエント、30分、流速1ml/min、検出UV220nm）によって
分取した。

上記の変性DAO 400μｇを2M尿素含有50mM Tris−HCl
バッファーに溶解（400μg/0.8ml）し、アクロモバクタ
ー・プロテアーゼ（Achromobacter Protease）Ｉ（AP−
Ｉ）（リシルエンドペプチダーゼ）を加え（S/E＝50
0）、37℃で２時間インキュベートした。不溶物を除去
し、上澄液に５％２−メルカプトエタノールを添加後、
逆相HPLC（担体:Cosmosil 5C₄−300、移動相:0.05％TFA
→0.05％TFA・60％CH₃CNグラジエント、60分、流速1ml/
min、検出UV220nm）にかけて各断片を分取した。結果を
第４図に示す。このようにしてAP1〜AP9の９種を得た。
次いで、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods
in Enzymology）91巻⁴⁾⁵⁾記載の方法に従い、アプライ
ド・バイオシステム（Applied Biosystems）社の気相プ
ロテインシーケンサー470Aを用いてこれら９種のペプチ
ド断片のアミノ酸配列分析を行なった。98アミノ酸配列
が決定された。結果を以下に示す。

上記の配列式中、“X"は不明のアミノ酸を示す。上記
の配列式は、DNA配列から推定されるアミノ酸配列とよ
く一致している（第８図）。

なお、上記と同様な方法で、DAOのＮ末端アミノ酸配
列の分析を試みたが、Ｎ末端アミノ酸が何らかの修飾
（Ｎ−アセチル化、ピログルタミル化など）を受けてい
るためにアミノ酸配列を決定することができなかった。

４）DNAプローブの合成 ３）で示した９種類のアミノ酸配列の内、AP−３、AP
−９、およびAP−６とAP−７の３ペプチド断片の配列に
ついて、これらのアミノ酸配列から推定される遺伝子上
の可能なDNA配列をなるべく多く含むオリゴヌクレオチ
ド混合物を合成し、DNAプローブAP−３、AP−９およびA
P−6,7と命名した。オリゴヌクレオチドの合成は、すべ
てアプライド・バイオシステム社のDNA合成機モデル381
−Ａを用いて行なった。また、アミノ酸配列からのDNA
配列の推定に際しては、ソリディーら⁶⁾による、フザリ
ウム・ソラニのキュティナーゼ（Cutinase）のコドンユ
ーゼージ（codon usage）をもとに、使用頻度の高いも
のを用いた。

このようにして得られたDNA合成プローブを以下に示
す。

5.c−DNAライブラリーからのＤ−アミノ酸オキシダーゼ
クローンの選択と分離 １）DNAプローブのラベリング 上記4.で調製したAP−３、AP−９、AP−6,7の各DNAプ
ローブを、イングリアら（Inglia）⁷⁾の方法に従い、T4
ポリヌクレオチドキナーゼとγ−³²P−ATPとを用いてラ
ベルした。

２）³²PラベルしたAP−３プローブによる選択と分離 上記2.2）で作成した1.5×10⁵のcDNAライブラリーを
含むE.coli DH1をアンピシリン50μg/mlを含んだＬ−ブ
ロス寒天培地上でコロニーとして生育させ（37℃、10時
間）、ニトロセルロースフイルターに移した後、さらに
クロラムフェニコール250μg/mlを含んだ上記の培地上
で、37℃において12時間保温した。次に、0.5N NaOH−
1.5N NaClで処理して溶菌およびDNA変性を行い、0.5M T
ris−HCl（pH7.0）−1.5N NaClにより中和した後、デー
ビスらの方法⁸⁾に従ってAP−３とハイブリダイゼーショ
ンさせた。即ち、50％（v/v）ホルムアミド、５×SSPE
（0.9M NaCl、50mM NaHPO₄、5mM EDTA、pH7.0）、１×B
FP［0.02％牛血清アルブミン、0.02％フィコール（m.w.
400,000）、0.02％ポリビニルピロリドン］、0.3％SDS
（ドデシル硫酸ナトリウム）、100μg/mlの変性音波処
理担体DNA（クシ胸腺）、およびAP−３約３×10⁶cpm/ml
を用いて、37℃で一夜保温した後、20mMリン酸緩衝液
（PB）、0.2％SDS、1mM EDTAを用い、37℃で３回フィル
ターを洗浄した。次いで、フィルターを乾燥させ、オー
トラジオグラフィー（感光条件：−80℃、３日間）にか
けたところ、ハイブリダイゼーション陽性のコロニーが
多数見出された。陽性コロニーから13株を取り上げ、液
体培養した後、デービスら⁹⁾の方法により、該コロニー
からプラスミドDNAを調製した。得られたプラスミドDNA
をアガロースゲル電気泳動にかけた後、サザーンら（So
uthern）の方法¹⁰⁾に従ってAP−３、AP−９またはAP−
6,7のDNAプローブとのサザーン・ハイブリダイゼーショ
ンに付した。ハイブリダイゼーションの条件は、AP−３
に関しては、上記と同様である。AP−９およびAP−6,7
に関しては、６×SSC（0.9M NaCl;0.09Mクエン酸ナトリ
ウムpH7.0）、５×BFP、0.5％SDS、100μg/ml担体DNAお
よびラベルしたDNAプローブを用いて、37℃（AP−９の
場合）または45℃（AP−6,7の場合）で一夜ハイブリザ
イゼーションさせた後、６倍×SSCを用いて、37℃（AP
−９の場合）または50℃（AP−6,7の場合）で１回、つ
いで37℃で２回洗浄した。それぞれのプローブのハイブ
リダイゼーションとフィルター洗浄の条件を表１に示
す。

次いで、各フィルターをオートラジオグラフィー（感
光条件：−80℃、一夜）に供したところ、すべてのプロ
ーブに対して陽性を示す以下の７種のクローンが見出さ
れた:pCFS3,pCFS17、pCFS19、pCFS22、pCFS25、pCFS2
6、pCFS27。これら７種のプラスミドDNAを制限酵素BamH
Iで切断し、同様にラベルしたAP−３、AP−９またはAP
−6,7のDNAプローブとのサザーン・ハイブリダイゼーシ
ョン¹⁰⁾に付した。その結果、約1.3Kbpまたは約1.1Kbp
のDNA断片と、すべてのプローブがハイブリダイゼーシ
ョン陽性を示した。約1.3KbpのDNA断片を持つプラスミ
ドの１つをpCFS3と命名し、そのDNA塩基配列を決定し
た。

6.DNA塩基配列の決定とＤ−アミノ酸オキシダーゼクロ
ーンの同定 5.で得たプラスミドpCFS3をBamH I切断して生成した
1.3KbpのDNA断片の塩基配列を、M13mp10およびM13mp11
ベクター¹¹⁾、α−³²P−dATPとセクエナーゼ（Sequenas
e）¹³⁾（ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル・コ
ーポレーション、東洋紡（株）輸入販売）を用い、サン
ガーら（Sanger）のジデオキシ配列決定法¹²⁾によって
決定した。このようにして決定されたpCFS3の制限酵素
地図を第５図に、また、pCFS3のBamHI 1.3Kbp断片のDNA
塩基配列を第６図に示す。第６図から明らかなように、
171〜196の位置にAP−6,7と、294〜329の位置にAP−３
と、420〜437の位置にAP−９のDNAプローブと夫々、一
致する部位が認められる。なお、第６図において、ヌク
レオチド番号約1280位のＸは、同定されていないことを
示す。

次に、このDNA配列に基いて推定のアミノ酸配列を決
定した。結果を第７図に示す。1086bpのオープン・リー
ディング・フレーム（ORF）が存在している。このORFの
アミノ酸配列とDAOタンパク質のAP−１〜AP−９各部分
アミノ酸配列（実施例１、2.3）で決定）とを比較する
と、第８図に示すようにこれらは完全に一致した。この
結果に基き、上記5.で得たクローン（プラスミドpCFS
3）は間違いなくDAOの遺伝子であり、かつ、完全なORF
を持つものであると同定された。

実施例２ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含有する
発現ベクターpCFS315の構築 １）DAOをコードするKm^RプラスミドpCFS105の構築 カナマイシン耐性pUCタイプベクターpHSG298（宝酒
造）0.5μｇとpCFS32μｇを夫々、BamH Iで切断した
後、各BamH I断片をT4DNAリガーゼ（2unit）で結合させ
た。そのライゲーション反応液を用い、ハナーンらの方
法³⁾に従ってE.coli JM109（宝酒造）を形質転換し、カ
ナマイシン20μg/ml、2mM IPTG（イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシッド）および0.5mg/ml X−Gal
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラ
クトシッド）を含んだＬ−ブロス寒天培地上で生育して
くる白いコロニーを選択した。これらのコロニーからプ
ラスミドDNAを抽出し、pHSG298のlacプロモーターとDAO
遺伝子とが同一方向であるプラスミド、pCFS105を選択
した。

２）tacプロモーターを含有するプラスミドpCFS202に構
築 tacプロモーターを有する発現ベクターpDR540（ファ
ルマシア）をEcoRIおよびBamH I切断に付し、tacプロモ
ーターをコードすると共に、翻訳に必要なSD配列をも含
有する約0.4KbpのDNA断片を分離した。このtacプロモー
ター部分の約0.4Kbp断片のDNA塩基配列は第５図に示さ
れている。

次に、１）で構築したpCFS105をBamH Iで部分切断し
た後、EcoR Iで切断し、3.9KbpのDNA断片を分離した。
これら3.9Kbpおよび約0.4KbpのEcoR I−BamH I断片を混
合し、T4DNAリガーゼの存在下、結合反応を行なった。
その反応液を用いてE.coli JM109を形質転換し³⁾、カナ
マイシン20μg/ml、2mM IPTGおよび0.5mg/ml X−Galを
含むＬ−ブロス寒天培地上で生育してくる青いコロニー
を選択した。DAOのｃ−DNAのpolyAから下流のpCDV1−PL
プライマー部分とpHSG298のβ−ガラクトシダーゼのＮ
末端側の翻訳のフレームがうまく合って、tacプロモー
ターのリードスルーによってβ−ガラクトシダーゼが生
成するために青いコロニーになるようである。これらの
青いコロニー中の１株からプラスミドDNAを抽出し、こ
れをpCFS202と命名し、制限酵素切断によりpCFS202の構
造を確認した。

３）合成DNAアダプター１の合成 pCFS202では、tacプロモーターのSD配列から翻訳開始
コドンATGまで62塩基あり、大腸菌でDAO遺伝子を発現さ
せるには離れすぎている。そこで、合成DNAアダプター
１を作成し、SD配列とATGの距離を７塩基短くした。

以下に、アダプター１のDNA塩基配列を示す。

上記の58merと50merのオリゴヌクレオチドの合成はア
プライド・バイオシステム社のDNA合成機モデル381−Ａ
を用いて行なった。２つのオリゴヌクレオチドを共に10
0μg/mlになるように混合した後、95℃で５分間加熱
し、充分な時間をかけて室温に戻すことにより、２本の
オリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。

４）DAO発現プラスミド、pCFS315の構築 pCFS202をBamH Iで部分切断した後、Aat IIで切断
し、4.3KbpのDNA断片を分離した。このDNA断片（0.5μ
ｇ）とアニーリングした合成DNAアダプター（２μｇ）
とを混合し、T4DNAリガーゼによる結合反応に付した。
その反応液を用いて、Ecoli JM109を形質転換し³⁾、カ
ナマイシン20μg/mlを含むＬ−ブロス寒天培地で生育し
てくるコロニーを選択した。これらのコロニーの中の１
株からプラスミドDNAを抽出し、これをpCFS315と命名
し、制限酵素切断によりpCFS315の構造を確認した。次
いで、合成DNAアダプター部分のDNA塩基配列をジデオキ
シ配列決定法¹³⁾により確認した。

プラスミドpCFS315の構築模式図を第５図に示す。該
図面には、中間体プラスミドであるpCFS105およびpCFS2
02の構築も示されている。

実施例３ 形質転換体、E.coli JM109（pCFS315）によ
るDAOの発現、および該DAOのCCへの作用 実施例２で構築したDAO発現プラスミドpCFS315を保持
する形質転換体E.coli JM109（pCFS315）をカナマイシ
ン20μg/mlと1mM IPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド）とを含んだＬ−ブロス200mlに植菌
し、37℃で24時間振盪培養した。培養液を遠心分離（60
00×ｇ、10分間、５℃）して集菌し、20mM PB（pH7.5）
10mlに懸濁し、超音波破砕機にかけて細胞を破砕した。
破砕された菌体混合物を遠心分離（6000×ｇ、10分間、
５℃）し、得られた上清を上記PB3lに対して透析して酵
素液とした。一方、実施例１、3.2）記載のごとくにし
てF.ソラニＭ−0718株の培養菌体から抽出精製した純度
90％以上のDAO凍結乾燥標品を1.0mg/ml（ウシ血清アル
ブミンを標準としてローリィー（Lowry）法で測定）と
なるように溶解したものを酵素標品として比較試料に用
いた。次いで、以下のごとくにしてCCを基質とする酵素
反応を行った。

（１）E.coli JM109（pCFS315）から得た酵素液によるC
Cの酸化 CC10.8mM、PB（pH7.5）100mM、酵素液50μｌからなる
全量1mlの反応液中、30℃において120分間反応させ、反
応混合物を高速液体カラムクロマトグラフィー［カラ
ム：イナートシル（Inertsil）ODS−２（ガスクロ工
業）、移動相:6.6mM PB（pH7.0）と３％メタノールから
なる溶液、検出:254nm］に供して生成物を定量した。

その結果、CCは検出されず、ケト−AD−7ACA4.75mM
と、GL−7ACA6.28mMとが生成していることが分かった。

（２）E.coli JM109（pCFS315）の酵素液とF.ソラニＭ
−0718のDAO酵素標品の単位タンパク質当りの活性の比
較 1.0mg/ml DAO酵素標品10μｌまたはE.coli JM109（pC
FS315）の酵素液12.5μｌのいずれかを、10.8mMCC、100
mMPB（pH7.5）からなる全量1mlの反応液中で30℃におい
て60分間、および120分間させた。次いで、各反応液を
高速液体カラムクロマトグラフィーに供して生成物を定
量した。

E.coli JM109（pCFS315）の酵素液のタンパク質濃度
は、1.0mg/mlのDAO酵素標品を標準として、プロテイン
アッセイキット（Protein Assay Kit）（バイオラッド
社）により測定した。CCの減少およびケト−AD−7ACAと
GL−7ACAの生成の合計に基いて、両酵素液のタンパク質
当りの活性を求め、比較検討した。その結果、F.ソラニ
Ｍ−0718のDAO酵素標品の単位タンパク質当りのＤ−ア
ミノ酸オキシダーゼ活性を100％とした時、E.coli JM10
9（pCFS315）の酵素液のそれは、CCの減少、またはケト
−AD−7ACAとGL−7ACAの生成量のいずれに基いても7.8
％であった。

上記の結果は、本発明のDAO発現ベクター、pCFS315に
より形質転換された形質転換体が、活性なDAOを有効に
発現したことを表している。この形質転換体、E.coli J
M109（pCFS315）は、通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所（つくば市東１丁目１−３）に、受託番号微
工研条寄第1916号（FERM BP−1916、寄託日:1988年６月
20日）として、寄託されている。

（３）F.ソラニＭ−0718由来の組換えDAOとトリゴノプ
シス・バリアビリス由来のDAOのアミノ酸配列の比較 本発明にかかるF.ソラニＭ−0718由来のDAOと従来の
トリゴノプシス・バリアビリス由来のDAOのアミノ酸配
列を第９図に示す。この配列式から、360アミノ酸中146
（41％）が相同であることが分かる。同様の性質を示す
酵素としては、この41％の相同性の存在は考え得ること
である。しかし、いずれも下等真核生物に由来する物質
であることから、この両者間の59％の相異はむしろ大き
く、実質上、別物質であることを示しており、従って、
これらは異なる酵素であるとみなされる。

実施例４ プラスミドp322A/Cの構築 pBR322（10μｇ）を100μｌの反応緩衝液（10mM Tris
−HCl（pH7.5）、7mM MgCl₂、60mM KCl、7mM β−メル
カプトエタノール（２−ME）、100μg/mlウシ血清アル
ブミン）にてAat II（1.0ユニット、東洋紡）及びClaI
（10ユニット、ベーリンガー・マンハイム（Boehringer
Manheim）で消化し、約4.3KのDNAを0.8％アガロースゲ
ル電気泳動にて単離した。

DNAオリゴマーDAO−１（56mer）及びDAO−２（50me
r）は各々DNA合成機（381ADNAシンセサイザー、アプラ
イド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）を用い
て合成した。DAO−１とDAO−２の重複アニーリングは両
端がClaIとAat IIで切断された形の粘着末端でtrpプロ
モーターＶのClaIサイト（部位）とDAO DNAのAat II間
を接合するアダプターである。

約4.3KのDNA（200ng）、DAO−１（9.7pmole）及びDAO
−２（38.5pmole）を20μｌの反応緩衝液（50mM Tris−
HCl（pH7.8）、10mM MgCl₂、20mMジチオスレイトール
（DTT）、1mM ATP、50μg/ml BSA）にてT4 DNAリガーゼ
（300ユニット、宝酒造）を用いて15℃にて60分インキ
ュベートした。ライゲーション混合物でE.coli JM109を
形質転換（シゲサダ、細胞工学（1983）、２、616−62
6、記載の方法に準じた）した。形質転換菌からプラス
ミドを抽出し、制限酵素マッピングにより目的とするp3
22A/Cであることを確認した。プラスミドp322A/Cの構築
模式図を第10図に示す。

実施例５ プラスミドpYS9120の構築 p322A/C（10μｇ）をAat II（10ユニット）とClaI（1
0ユニット）で消化し、約54bpのDNAを2.25％アガロース
ゲル電気泳動で単離した。次にpCFS315（10μｇ）とAat
II（10ユニット）とBamH I（10ユニット、東洋紡）で
消化し、約1.1K DNAを0.8％アガロースゲル電気泳動で
単離した。さらにpCLaHtrp3t（10μｇ）をClaI（10ユニ
ット）とBamH I（10ユニット）で消化し、約3.8KのDNA
を単離した。

得られたClaI−Aat II 54bp DNA（50ng）、Aat II−B
amH I 1.1K DNA（50ng）及びClaI−BamH I 3.8K DNA（2
00ng）をT4 DNAリガーゼ（300ユニット）を用いて実施
例１と同様にして結合させた。ライゲーション混合物で
E.coli JM109を形質転換した。形質転換菌からプラスミ
ドを抽出し、目的とするpYS9120Aを得た。プラスミドpY
S9120Aの構築模式図を第11図に示す。

実施例６ プラスミドp153trpの構築 両端にEcoR I及びClaIサイトを持つ新しいtrpプロモ
ーター（trpV）を以下の手順で調製した。

合成オリゴマーをグループＩ（Ａ′）、II（Ｂ′,C,
D,E,F）、III（G,H,I,J）、IV（K,L,M′）及びＶ
（Ｎ′）に分けた。グループIIのオリゴマー（各0.2nmo
le）を100μｌの混合バッファー（実施例１に記載）に
てT4 ポリヌクレオチドキナーゼ（2.5ユニット、宝酒
造）とともに37℃で60分インキュベートした。65℃にて
20分加熱して酵素を失活させ、反応混合液にT4 DNAリガ
ーゼ（600ユニット）及び20mM ATP（５μｌ）を添加し
て15℃で30分インキュベートした。グループIII及びIV
も同様にしてリン酸化ライゲーション反応を行った。得
られたグループII、III及びIVを合し、T4 DNAリガーゼ
（600ユニット）及び20mM ATP（５μｌ）を加えて15℃
で30分インキュベートした。得られた反応混合液にオリ
ゴマーＡ′及びＮ′（各0.4nmole）、T4 DNAリガーゼ
（600ユニット）及び20mM ATP（５μｌ）を添加し、15
℃で30分インキュベートした。反応混合物を2.25％アガ
ロースゲル電気泳動に付し、目的とする約104bpのDNAを
単離した。

pAT153（10μｇ、ファルマシア（Pharmacia））をEco
R I（10ユニット、東洋紡）とClaI（10ユニット）で消
化し、約3.6K DNAを0.8％アガロースゲル電気泳動で単
離した。

EcoR I−ClaI 104bp DNA（20ng）とEcoR I−ClaI 3.6
K DNA（200ng）をT4 DNAリガーゼ（300ユニット）を用
いて実施例１と同様にしてライゲーションし、ライゲー
ション混合物でE.coli JM109を形質転換した。形質転換
菌よりプラスミドを抽出し、目的のp153trpを得た。プ
ラスミドp153trpの構築模式図を第12図に示す。

実施例７ プラスミドpYS9121の構築 pl53trp（10μｇ）をSalI（10ユニット）とClaI（10
ユニット）で消化し、約2.9KのDNAをアガロースゲル電
気泳動で単離した。

pYS9120をClaI（10ユニット）とSalI（10ユニット）
で消化し、ca.1.3KのDNAを単離した。

ClaI−SalI 2.9K DNA（200ng）とClaI−SalI 1.3K DN
A（20ng）をT4 DNAリガーゼ（300ユニット）を用いて結
合させ、ライゲーション混合液でE.coli JM109を形質転
換した。形質転換菌からプラスミドを抽出し、目的とす
るpYS9121を得た。プラスミドpYS9121の構築模式図を第
13図に示す。

実施例８ プラスミドpYS9122Kの構築 pYS9121（10μｇ）をEcoR I（10ユニット）及びSalI
（10ユニット）で消化し、約1.4KのDNAを単離した。

pHSG298（10μｇ、宝酒造）EcoR I（10ユニット）及
びSalI（10ユニット）で消化し、約2.6K DNAを単離し
た。

1.4K DNA（50ng）と2.6K DNA（200ng）をT4 DNAリガ
ーゼ（300ユニット）で結合させて目的とするプラスミ
ドpYS9122Kを得た。プラスミドpYS9122Kの構築模式図を
第14図に示す。

実施例９ プラスミドpYS9122Cの構築 pYS9121及びpHSG396（宝酒造）を用いて実施例８と同
様にしてプラスミドpYS9122Cを得た。プラスミドpYS912
2Cの構築模式図を第15図に示す。

実施例10 形質転換体の培養 E.coli JM109（pYS9122K）ブロス（100ml）に移し、3
7℃で16時間培養した。培養液（0.8ml）と80％グリセロ
ール（0.2ml）を混和し、−80℃で保存した（グリセロ
ールストック菌）。

グリセロールストック菌を100mlのMSブロス（0.2％
グリセロール、1.2％バクトトリプトン、2.4％ 抽出酵
母、0.11％ Leu＋Pro＋Ile、1.25％ K₂HPO₄、0.38％
KH₂PO₄、0.005％ チアミン−HCl、0.0493％MgSO₄・7
H₂O、0.003％CaCl₂・2H₂O、0.0014％ FeSO₄・7H₂O）に
移し、Km（50μg/ml）を添加して30℃で16時間培養し
た。培養液（20ml）を変型M9培地［350ml、１％カザミ
ノ酸（Ｎ源）、１％グリセロール（Ｃ源）、他はM9培地
［マニアティスら（Maniatis,T.）、「モレキュラー・
クローニング（“Molecular Cloning"）］、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Ha
rbor Laboratory）、（1982）、p.440）］と同一組成］
に移し28℃にて振盪培養した。10時間後に50％ グリセ
ロール（3.5ml）とβ−インドールアクリリック酸（終
濃度50μg/ml）を添加し、さらに22時間培養を続けた。
４℃、5000rpm、10分の遠心で集菌して、菌体を−20℃
で保存した。

他の形質転換体、E.coli JM109（pYS9122C）およびE.
coli JM109（pYS9120A）をも同様に培養し、菌体を得
た。ただし、グリセロールストック菌の調製およびグリ
セロールストック菌の培養に際してカナマイシン（Km）
の代わりにクロラムフェニコール（Cm）を濃度30mg/ml
［E.coli JM109（pYS9122C）］、またはアンピシリン
（Am）を濃度50μg/ml［E.coli JM109（pYS9122A）］を
用いた。

実施例11 分析および検定 凍結菌体（20ml ブロス相当分）をTE（20ml、10mM T
ris−HCl（pH8.0）−1mM EDTA）に懸濁し、４℃にて超
音波処理（US−600、日本精機）してのち遠心（４℃、1
5,000rpm、30分）して上清をサンプルとした。

ｉ）SDS−PAGEおよびウエスタン・ブロット分析 15％SDS−PAGEは文献［レムリ（Laemmli,U.K.）、ネ
イチャー（Nature）、227、80−685］に記載されている
方法に準じた。

ウエスタン・ブロットは電気泳動後のポリアクリルア
ミドゲル上のタンパク質を電気的にニトロセルロースフ
ィルターに移し、抗DAO抗血清（家兎に天然DAOで免疫）
−ペルオキシダーゼ標識抗家兎IgGで反応し、４−クロ
ロ−１−ナフトール−H₂O₂で発色させた。

ii）検定（アッセイ） 20mg/ml CCNa（セファロスポリンＣナトリウム塩）
（pH7.5、1N NaOHで調製、0.5ml）、0.3M KH₂PO₄（pH8.
0、10N NaOHで調製;0.5ml）にDAOサンプル（0.1ml）を
添加し、30℃で20分振盪した。20分後に１％H₂O₂（0.1m
l）を加えて、更に10分間振盪した。反応混合物に４％A
cOH（0.1ml）を加えて振盪し、遠心して上清を氷中に静
置した。得られた上清をHPLCで分析して酵素量（ユニッ
ト:1ユニットはCCNaを基質とし１分間に1.0μmoleのGL
−7ACAを生成する酵素量）を定量した。

HPLC条件：カラム;I nertsil ODS−２（4.6mmφ×15c
m、ガスクロ工業）、pump;LC−6A（Shimadzu）、検出
器;SPD−6A（Shimadzu）、レコーダー;CR−6A（Shimadz
u）、溶出;5％ NH₄OAc中、３％ CH₃CN ｉ）、ii）の結果を表２に示す。

実施例12 組換えDAOの精製 実施例７で培養したE.coli JM109（pYS9122K）（350m
lブロス相当菌体）を1mM Tris・HCl（pH8.0）−0.1mM E
DTA（100ml）に懸濁し、４℃にて超音波処理してのち遠
心（４℃、15,000rpm、20min）して上清を集めた。残渣
を前述のTrisバッファー（100ml）に再懸濁して超音波
処理−遠心の操作を２回繰り返した。集めた上清を合し
（計310ml）、1N NaOHでpH9.0に調製してのち、ポリエ
チレンイミンを終濃度0.01％になるように添加し、４℃
で15分撹拌後遠心（４℃、7000rpm、40min）した。上清
（300ml）に(NH₄)₂SO₄（61.8g）を添加し、４℃で16時
間静置後、遠心（４℃、7000rpm、20min）した。

上清（340ml）を疎水クロマトグラフィー［樹脂、東
洋パールHW−65F（東ソー）、容量;100ml、カラム；フ
ァルマシア（Pharmacia）K26/40、溶出液;35％飽和→０
％、1mM Tris・HCl（pH9.0）中、(NH₄)₂SO₄;0.1mM EDTA
（線状勾配（linear gradient））、流速;2.5ml/min］
に付した。各フラクションを逆相HPLC［カラム;TSKゲル
・オクタデシルNPR（4.6mm×3.5cm）、溶出;0.05％TFA
（線状勾配10min）中、０→60％CH₃CN］で分析した。目
的物は吸廃画分とフラクション２に見い出された。

フラクション２（90ml）を5lの20mM NH4OAc（pH9.0）
に対して透析してのち陰イオン交換クロマトグラフィー
［樹脂;DEAE 東洋パール650M、容量;120ml、カラム；
ファルマシアK26−40、溶出;10mM Tris−HCl（pH8.0）
線状勾配中、０→0.5M NaCl、流速;2.5ml/min］に付し
た（Fig8b）。目的物を含むフラクション５及び６（計6
9ml）を10mMリン酸バッファー（pH9.0）に対して透析し
て精製組換えDAO 3.58mgを得た。このサンプルの活性を
測定し、比活性を24.5ユニット/mgプロテインと算出し
た。

精製組換えDAOを逆相HPLC［カラム;Cosmosil 5C₄−30
0（4.6mm×7.5cm）、溶出;0.05％TFA（線状勾配30min）
中、12→60％CH₃CN］で分取し、470Aペプチド配列（ア
プライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））
でＮ末端アミノ酸配列を決定した。以下に示すように、
Ｎ末端アミノ酸配列はcDNA配列から予想されるものと一
致していた。

また、この精製ｒ−DAOをSDS−PAGEに付したところ、
分子量40,000±1000の位置にシングルバンドが観察され
た。

以下に明細書中で引用した文献を列挙する。

引用文献 １）マニアティスら（T.Maniatis et al.），モレキュ
ラー・クローニング（Molacular Cloning）実験の手引
き（1982） コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory） ２）オカヤマ（H.Okayama）およびバーグ（P.Berg）,Mo
l.Cell.Biol.,2 161（1982） ３）ハナーン（D.Hanahan）、J.Mol.Biol.,166 557（1
983） ４）ハンカピラーら（M.W.Hunkapiller et al.），メソ
ッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），91 399（1983） ５）ハンカピラー（M.W.Hunkapiller）およびフッド
（L.E.Hood）,Methods in Enzymology,91 486（1983） ６）ソリディーら（C.L.Soliday et al.）,Proc.Nat.Ac
ad.Sci.USA 81 3939 （1984） ７）イングリアら（Inglia et al.）,Nucleic Aci ds R
es.,9 1627（1982） ８）デービスら（R.W.Davis et al.），アドバンスト・
バクテリアル・ジュネテックス（Advanced Bacterial G
enetics）（1980）p.174 Cold Spring Harbor Laborato
ry ９）サザーン（E.M.Southern）,J.Mol.Biol.,98 116
（1975） 10）サザーン（E.M.Southern）,J.Mol.Biol.,98 503
（1975） 11）メッシング（J.Messing）,Methods in Enzymology
101 20（1983） 12）サンガーら（F.Sanger et al.）,Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA 74 5463（1977） 13）テーボー（S.Tabor）およびリチャードソン（C.C.R
ichardson）,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 84 4767（1987）

【図面の簡単な説明】

第１図はDAOをコードするDNAの塩基配列決定の工程図、
第２図はDNAライブラリー作成模式図、第３図はDAO精製
および部分アミノ酸配列決定の工程図、第４図は逆相HP
LCによる９断片の分離パターンを示すグラフ、第５図は
プラスミドpCFS315の構築模式図、第６図はプラスミドp
CFS3のBamH I 1.3Kbp断片のDNA配列の模式図、第７図は
DAOのDNA塩基配列および推定のアミノ酸配列の模式図、
第８図は逆相HPLCで分取した９断片のアミノ酸配列と、
DAOをコードするDNAの塩基配列から推定されるアミノ酸
配列とを比較した模式図、第９図はF.ソラニＭ−0718由
来のDAOのアミノ酸配列とトリゴノプシス・バリアビリ
ス由来のDAOのアミノ酸配列とを比較した模式図、第10
図はプラスミドp322A/Cの構築模式図、第11図はプラス
ミドpYS9120Aの構築模式図、第12図はプラスミドp153tr
pの構築模式図、第13図はプラスミドpYS9121の構築模式
図、第14図はプラスミドpYS9122Kの構築模式図、第15図
はプラスミドpYS9122Cの構築模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/53 C12N 9/06 C12N 1/21 ＣＡ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】第７図記載のアミノ酸配列からなる組換え
   Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよび該アミノ酸配列におい
   て１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
   されたアミノ酸配列からなり、かつセファロスポリンＣ
   の７−β−（５−カルボキシ−５−オキソペンタンアミ
   ド）セファロスポラン酸への変換を触媒する酵素活性を
   有するその誘導体。
2. 【請求項２】請求項１記載の組換えＤ−アミノ酸オキシ
   ダーゼをコードするDNA。
3. 【請求項３】第７図記載のヌクレオチド配列を有する請
   求項２記載のDNA。
4. 【請求項４】請求項２または３記載のDNAを含有する発
   現ベクター。
5. 【請求項５】請求項４記載の発現ベクターで形質転換さ
   れた微生物。
6. 【請求項６】エシェリキア・コリである請求項５記載の
   形質転換された微生物。
7. 【請求項７】請求項５または６記載の形質転換された微
   生物を培養し、その培養物からＤ−アミノ酸オキシダー
   ゼを単離することからなる組換えＤ−アミノ酸オキシダ
   ーゼの製造方法。
8. 【請求項８】セファロスポリンＣまたはその塩と、請求
   項５また６記載の形質転換された微生物の培養物または
   その処理物とを接触させることからなる式（Ｉ）： （式中、Ｙは−COCOOHまたは−COOHを表す） で示される化合物またはその塩の製造法。