JPH02200181A - Ｄ―アミノ酸オキシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（以下、ＤＡＯと
略称する）に関し、さらに詳しくは、セファロスポリン
Ｃの７−β−（５−カルボキシ５−オキソペンタンアミ
ド）セファロスポラン酸（ケト−ＡＤ　　７ＡＣＡ）へ
の変換を触媒し得る微生物由来のＤＡＯ，該ＤＡＯをコ
ードするＤＮＡ。

該ＤＮＡを担持する発現ベクター、および該発現ベクタ
ーで形質転換された形質転換体、並びに、該形質転換体
を培養してＤＡＯを製造する方法およびそのようにして
得られたＤＡＯの使用法に関するものである。

従来技術とその課題 ＤＡＯは、を推動物から微生物に至る広範な動物組織に
存在する、Ｄ−アミノ酸の酸化的脱アミノ酵素である。

しかるに、ＤＡＯ産生性の微生物の内、フザリウム・ソ
ラニ（Ｆ　ｕｓａｒｉｕＩＩｌｓｏｌａｎｉ）Ｍ−０７
１８（通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所から
微工研菌寄第２６８８号の下で入手可能）の菌糸体また
はその処理物は、上記の脱アミン作用以外に、抗生物質
の一種であるセファロスポリンＣ（ＣＣ）に作用して７
−β−（５−カルボキシ−５−オキソペンタンアミド）
セファロスポラン酸（ケト−ＡＤ−７，Ａ、ＣＡ）を生
成させ、さらに、ケト−ＡＤ−７ＡＣＡの一部と副生成
物である過酸化水素との反応生成物として７−β−（４
−カルボキシブタンアミド）セファロスポラン酸（ＧＬ
−７ＡＣＡ）を生成させる作用を有することが知られて
いる（特公昭第５７−１８８７９号公報参照）。なお、
このフザリウム属のＤＡＯ産生性微生物Ｆ、ソラニＭ−
０７１８は、微工研条寄第２６１９号の下でも、上記の
公的機関から人手可能である。

ＧＬ−７ＡＣＡはアシラーゼ（ＧＬ−７ＡＣＡアシラー
ゼ）の酵素作用によって、種々のセフェム系抗生物質の
化学合成における重要な出発物質である７−アミノセフ
ァロスポラン酸（７，Ａ、ＣＡ）に変換される。ＣＣか
らケト−ＡＤ−７ＡＣＡ。

Ｇ　Ｌ　−７Ａ　ＣＡを経て７ＡＣＡに至る一連の酵素
反応は以下の反応式で示される。

（以下余白） 酵素法による７ＡＣＡの製造 ０ＯＩＩ ケト−＾Ｄ−７ＡＣ＾ ＯＯＨ ＧＬ−７ＡｅＡ ７ＡＣ＾ 現在、多（の抗生物質が存在しているが、新たな耐性菌
の出現、多様化する治療状況等の理由で、より効果的な
抗生物質を、安価に供給することが望まれている。とこ
ろで、広い抗菌スペクトルを有し、極めて有用な抗生物
質であるセフェム系抗生物質の製造における最も重要な
出発物質は、上記のごとく、７ＡＣＡである。従って、
多量の７ＡＣＡを容易に得ることができれば、既存のセ
フェム系抗生物質の増産、あるいは新規な抗生物質の開
発がより容易になり、促進されると考えられる。

しかしながら、従来の化学合成法では、ＣＣから多段階
工程を経て７ＡＣＡを得ており、その工程は複雑であり
、効率の良い方法ではなかった。近年、このような場合
に有用な方法として、微生物等に由来する酵素を用いる
バイオリアクター法が注目されている。

バイオリアクター法で７ＡＣＡを製造するには、各工程
に関与する酵素を確保する必要がある。即ち、上記反応
式から明らかなように、ＤＡＯおよびＧＬ−７ＡＣＡア
シラーゼが不可欠である。従って、ＤＡＯおよびＧＬ−
７ＡＣＡアシラーゼを大量に供給し得る手段が確立され
れば、７ＡＣＡのバイオリアクターまたは直接発現法に
よる製造が可能となり、ひいては、セフェム系抗生物質
の製造並びに開発が促進されると考えられる。

既に、トリゴノプシス・パリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏ
ｐｓｉｓ　ｖａｒｉａｂＨｆｓ）が産生ずるＤＡＯをコ
ードする遺伝子はクローニングされている（特開昭６２
−２６２９９４）。しかしながら、フザリウム属由来の
ＤＡＯについては、十分に精製され、ＤＮＡ配列が決定
された例はなく、当然、遺伝子がクローニングされるま
でに至っていない。従って、ＣＣを基質としてＧＬ−７
ＡＣＡを生成する酵素活性を有するフザリウム属由来の
ＤＡＯをコードする遺伝子のクローニングがなされたな
らば、遺伝子組換え技術によりＤＡＯを大量に製造し、
これを上記したバイオリアクター法、または他の酵素的
手段に適用することにより、７−ＡＣＡの大量生産が可
能になると考えられる。

課題を解決するための手段 本発明者らは、Ｆ、ソラニＭ−０７１８由来のＤＡＯの
有用性に着目し、上記したＣＣのケ）−ＡＤ−７ＡＣＡ
への変換を触媒する酵素活性を有するＤＡＯを菌糸体か
ら精製した。

次いで、ＤＡＯのｍＲＮＡを単離し、該ｍＲＮＡを逆転
写してｃＤＮＡを得、ｃＤＮＡライブラリーを調製し、
プローブしてＤＡＯをコードするＤＮＡをクローニング
することに成功した。さらに、クローニングしたＤＮＡ
を適当な発現ベクターに組込んでＤＡＯ発現ベクターを
構築し、該発現ベクターを大腸菌宿主に導入して得られ
た形質転換体を培養し、該形質転換体にＤＡＯを発現さ
せた。

このようにして得られた形質転換体の培養物、およびそ
の処理物は、ＣＣをケト−ＡＤ−７ＡＣＡおよびＧＬ−
７ＡＣＡに変換するＤＡＯの酵素作用を有することが示
された。さらに精製した酵素標品を用いて測定したＤＡ
Ｏの分子量は５ＤＳＰＡＧＥにより４０．０００±１０
００ダルトンであった。

プローブは、菌糸体から精製したＤＡＯの９個のペプチ
ド断片（ＡＰ−１〜ＡＰ−９）のアミノ酸配列を決定し
、それを基にして調製された。これらの各断片のアミノ
酸配列は、第７図に記載のＤＡＯをコードするＤＮＡの
塩基配列から推定されるアミノ酸配列の対応する部分と
一致していた（第８図参照）。このことは、菌糸体から
のＤＡＯの精製が成功したことを示すものである。決定
された各ペプチド断片のアミノ酸配列は以下の通りであ
る。

ＡＰ−１：＾ｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−＾５ｎ−
Ａｓｐ−Ｉｌｅ−６ｅｒ−Ｇｌｕ−ＡｌａＬｙｓ ＡＰ−２：Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＬｙｅＡ
Ｐ−３：＾ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−ＧｔｙＶａｌ−Ｈｉｓ
−Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−ＬｙｓＡＰ−４：Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ
−Ｓｅｒ−Ｖａ　１Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈ１ｓ−Ａ　Ｉａ
−Ｖａ　ｉＧ　ｌｙｅｔ ＡＰ−５：Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−＾５ｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−
’／ａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ＧｌｙＬｅｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＬｙｓＡＰ−６：Ｈｉｓ−Ｎｅ
ｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−＾５ｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
−Ｇｌｕ−ＴｙｒＡｌａ−８ｅｒ ＡＰ−７：ｔｌｉｓ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−＾５ｐ
−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−ＴｙｒＡｌａ−Ｓ
ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡｌａＡＰ−８：Ｔｈｒ−Ｍｅ
ｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ
−Ｉ　１ｅ−ＶａｌＶａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−
Ｇｌｕ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−ＭｅｔＬｅｕ−Ｌｅ
ｕ ＡＰ−９：Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−＾ｓｐ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ（注：ＡＰ−６はＡＰ
−７に包含される）従って、本発明はまた、ＣＣをケト
−ＡＤ−７ＡＣＡに変換する酵素活性を有し、分子量が
５ＤＳ−ＰＡＧＥ上、４０，０００±１，０００ダルト
ンであって、上記のＡＰ−１〜ＡＰ−９で示されるペプ
チド断片を含有するペプチド配列を有するＤＡＯを提供
するものである。

ＤＡＯをコードするＤＮＡのクローニングは、添付の第
１図にその概要を記載した方法に従って行われた。

まず、Ｆ、ソラニＭ−０７１８の全ＲＮＡから得たｍＲ
ＮＡを逆転写してＣＤＮＡライブラリーを調製する一方
、菌体からＩ）　Ａ　Ｏを精製し、精製ＤＡＯの部分ア
ミノ酸配列（ペプチド断片ＡＰ−１〜ＡＰ−９）を決定
した。その部分アミノ酸配列に基いて合成りＮＡプロー
ブを作成し、ごのプローブと上記ｃＤＮＡライブラリー
とのハイブリダイゼ−７ヨンによって所望のクローンを
検索し、得られたＤＮＡのクローニングを行い、所望の
ＣＤＮＡを含有するプラスミドを選択し、ｐｃ　Ｆ　Ｓ
３と命名した。次いで、このＤＡＯをコードするｃＤＮ
Ａ（ＤＡＯｃＤＮＡ）の塩基配列、並びに対応するアミ
ノ酸配列を決定した。ＤＮＡライブラリー作成の模式図
を第２図に、ＤＡＯｃＤＮＡの塩基配列および対応する
アミノ酸配列を第７図に示す。

上記のごとくクローニングしたＤＡＯをコードするＤＮ
Ａを、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入
することにより、微生物宿主内でＤＡＯを発現するＤＡ
Ｏ発現ベクターを構築することができる。ＤＡＯ遺伝子
を挿入し得る発現ベクターは当業者に既知であり、また
、様々な種類のプロモーターを利用し得る。本発明にお
いては、ｔａｃプロモーターとＳＤ配列、並びにカナマ
イシン耐性を付与するＤＮＡ配列を含有し、大腸菌宿主
内で複製可能なりＡＯ発現ベクター、ｐｃ　Ｆ　５３１
５を構築した。該ベクターで大腸菌宿主［エシェリキア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ）　Ｊ　
Ｍ　Ｉ　Ｑ　９　］を形質転換し、得られた形質転換体
、エシェリキア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐ
ＣＦＳ３１５）を培養してその培養物からＤＡＯ活性を
有する生成物を得た。プラスミドｐｃＦｓ３１５の構築
模式図を第５図に示す。

上記した発現ベクターおよび宿主細胞は本発明のＤＡＯ
をコードするＤＮＡの発現に適した多くのベクターおよ
び宿主細胞の１例にすぎず、当該技術分野で通常の方法
により、任意の宿主細胞内で機能的なりＡ○発現ベクタ
ーを構築することかできる。そのようなベクターに用い
得るプロモーターは既知のものから適宜選択するか、あ
るいは新たに調製したもののいずれでもよい。

本発明のＤＡＯをコードするＤＮＡを担持する発現ベク
ターで形質転換するために用いられる宿主細胞は、大腸
菌等の原核性細胞、酵母等Ω真核性細胞のいずれでもよ
く、さらには一般的に利用されている高等生物の細胞も
適する。また、特定の宿主系に応じた発現ベクターの構
築、該発現ベクターによる宿主細胞の形質転換、形質転
換体の培養、ならびに培養物からの生成物の回収、は全
で当業者に既知の通常の技術を用いて行うことができる
。

従って、本発明は、そのような発現ベクターの構築に有
用な、第７図記載のアミノ酸配列を有するＤＡＯを提供
するものである。

また、本発明は、上記したＤＡＯをコードするＤＮＡ、
並びに該ＤＮＡを担持するＤＡＯ発現ベクターを提供す
るものである。

さらに、本発明は、該発現ベクターで形質転換された形
質転換体、並びに該形質転換体を培養し、その培養物か
らＤＡＯ活性を有する生成物を回収することからなるＤ
ＡＯの製造方法を提供するものである。

上記のごとく、本発明方法で得られる培養物はＤＡＯ活
性を示すが、このものを当業者既知の通常の方法でさら
に処理して酵素液を調製することができる。また、所望
により精製してもよい。例えば、培養物を遠心してＤＡ
Ｏ産生−形質転換体を収穫し、りん酸緩衝液に懸濁し、
音波処理等によって細胞を破壊する。次いで、上清を遠
心分離することにより、酵素標品を得る。さらに、上清
を透析し、クロマトグラフィー等でさらに精製すれば精
製酵素が得られる。このようにして得られた精製酵素標
品は、ＣＣのケトＡＤ−７ＡＣＡおよびＧＬ−７ＡＣＡ
への変換を触媒する。

上記から明らかなように、本発明の形質転換体を培養し
て得られる培養物およびその処理物はいずれも、ＤＡＯ
の酵素活性を有する。

本明細書中、培養物の「処理物」とは培養物から得られ
る物質であって、ＣＣを上記式（１）で示される化合物
に変換し得る酵素活性を高めるために、当該技術分野で
通常の方法により処理された物質を指す。

大腸菌宿主の場合、ＤＡＯ活性は形質転換体細胞内に止
まっているので、処理物の例として以下のものを挙げる
ことができる。

（１）生の細胞；培養ブロスからろ過または遠心等の通
常の方法で分離された細胞。

（２）乾燥細胞：（１）の生細胞を凍結乾燥または真空
乾燥したもの。

（３）細胞抽出物：（１）または（２）の細胞を通常の
方法（有機溶媒中での自己溶菌、アルミナや海砂と混合
しての摩砕、または超音波処理）して得られる。

（４）酵素溶液：細胞抽出物を常法通り精製するか部分
精製することにより得られる。

（５）固定化細胞または酵素：細胞または酵素を通常の
方法で固定化（アクリルアミド、ガラスピーズ、イオン
交換樹脂等に固定化）したもの。

従って、本発明は、セファロスポリンＣまたその塩とＤ
ＡＯをコードするＤＮＡで形質転換された微生物の培養
物またはその処理物とを接触させることからなる、式（
り： （式中、Ｙｉｉ−ＣＯＣＯＯＨまたは−ＣＯＯＨを表す
） で示される化合物またはその塩の製造方法を提供するも
のである。

ＣＣと酵素との接触は水または緩衝液中で行うことがで
きる。例えばＣＣを含有する緩衝液に培養物またはその
処理物の水または緩衝液中懸濁液（溶液）を加える。反
応混合物中に含有させ得る基質ＣＣの濃度は１〜１００
ｘｖ／＊（ｌの範囲が好ましい。また、ｐＨ，温度およ
び反応時間等の反応条件は特に限定されるものでなく、
同様の酵素反応に通常用いられる条件から適宜選択する
とよい。

しかしながら、ｐＨ７〜８、黒度５〜３７℃で１〜５０
時間反応させると、好適にＣＣがその対応する生成物に
変換される。このように、本発明方法によって得られる
形質転換体の培養物またはその処理物は前記のバイオリ
アクター法における酵素として有用である。

本発明の発現ベクターは既述のごとく、本明細書記載の
例示のプラスミドに限定されない。これらを通常の技術
を用いて修飾（例えば、プロモーターを交換する）する
ことによって、異なる種類の微生物、また他の細胞内で
機能的であり、および／またはＤＡＯを高レベルに産生
させることができる発現ベクターを構築することができ
る。

即ち、本発明の１実施態様として、プラスミドｐｃｓＦ
３１５のｔａｃプロモーターをｔｒｐプロモーターで置
換し、さらに、ｆｄファージターミネータ−を導入する
ことにより、大腸菌内で機能し、しかもより高レベルに
ＤＡＯを産生させる発現ベクター、プラスミドｐＹ　Ｓ
　９１２　ＯＡ（ＡｍＩ′）、ｐｙｓ９１２２　Ｋ（Ｋ
ｍＩｌ）およびｐＹ３９１２２Ｃ（Ｃ＋＋＋Ｒ）を構築
した。これらのプラスミド類で形質転換された大腸菌は
高レベルにＤＡＯを産生ずることが分かった。例えば、
ｐＹ３９１２２にで形質転換された大腸菌形質転換体は
ｐｃｓＦ３１５で形質転換された細胞の約２．５倍の組
換えＤ　Ａ　Ｏ（ｒＤＡＯ）を発現した。このｒ−ＤＡ
Ｏを硫安沈澱、疎水性カラムクロマトグラフィー、ＤＥ
ＡＥカラムクロマトグラフィー等で精製すると、その比
活性（単位７１１ｇタンパク質）は２４．５にも達した
。

また、精製ｒ−ＤＡ○のＮ−末端アミノ酸配列をも決定
した。その配列は、第７図記載の推定のアミノ酸配列の
Ｎ−末端配列と一致しており、組換え法によるＤＡＯの
生産が確認された。

このように、本発明はまた、本発明のＤＡＯ発現ベクタ
ーで形質転換された宿主によって産生される組換えＤＡ
Ｏをも提供するものである。

本明細書においてＤＡＯをコードするＤＮＡの塩基配列
が開示されたので、これの基づき、通常の遺伝子組換え
技術を用いて活性なりＡＯ誘導体を得ることは当業者に
とって容易である。故に、そのような常套手段で得られ
るＤＡＯの活性な誘導体も本発明の範囲に包含されるも
のであることは、当業者ならば理解し得るであろう。

本発明方法で得られたフザリウム属由来のＤＡＯのアミ
ノ酸配列を、上記のトリボノブシス属由来のＤＡＯのそ
れと比較すると、３６０個のアミノ酸の内、４１％に相
当する１４６個か相同性を示し、５９％に相当する残り
の２１４個が非相同性を示した（第９図）。このことか
ら、これらの別起源由来のＤＡＯは明らかに別物質であ
る。

従って、本発明は、フザリウム属由来のＤＡＯのＤＮＡ
組換え技術による製造を初めて可能にしたものである。

本発明の実施に用いた幾つかのプラスミド類、様々な制
限酵素やＴ４ＤＮＡリガーゼ、その池の酵素類は、市販
品から入手し、供給者の指示に従って使用した。また、
ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主の形
質転換、形質転換体の培養および培養物からの酵素の回
収は、当業者既知の方法、あるいは文献記載の方法に準
じて行なった。本明細書において引用した文献は、該当
箇所に括弧を設は数字で表示されており、その詳細は、
明細書末部に記載されている。

（以下余白） 実施例］　　ＤＡＯｉ１伝子のクローニング１、　　Ｆ
、ソラニＭ−０７１８からのｌ１ｌＲＮＡの抽出および
精製 ＤＡＯ遺伝子のクローニングは、実質−１−、モレキュ
ラー・クローニング［実験の手引き（１９８２）”］（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｔｏｎｉｎｇ）の記載に従って
行った。

■）全ＲＮΔの抽出 ２％グルコース、２％コーンスチーブリ力−（Ｃ３Ｌ）
、０，２％ＤＬ−アラニン（ｐＨ５，０）からなる培地
１００酎でＦ、ソラニＭ−０７１８株を３０°Ｃで３日
間振盪培養した。菌糸体を低温下で破砕した後、４０１
σのグアニジンイソチオンアネート溶）夜（４Ｍグアニ
ジンインチオシアネート、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ＆
（ｐＨ７，５）、２０ｍＭＥＤＴＡ、２％Ｎ−ラウロイ
ルサルコ／ンナトリウム、０．１７Ｍβ−メルカプトエ
タノール）に懸濁し、６０°Ｃで５分間加熱した。１０
．　ＯＯＯＸ９で１０分遠心した後、グアニジン／塩化
セシウム法（Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ”　］　９６頁）に従
って、上澄液から全ＲＮＡ１３ｙ９を得た。

２）オリゴ（ｄＴ）−セルロースによるｐｏｌｙ（Ａ）
ＲＮＡの精製 全ＲＮＡ３１９を２００買９オリゴ（ｄＴ）−セルロー
ス（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅ
ａｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）　；　Ｂ　ＲＬ　）により、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｔｏｎｉｎｇ”　ｌ　９７頁記載の方法に従って精製
し、ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮ　Ａ（ｌ＋ｌ−ＲＮ　Ａ）　１
４０Ｍｇを得た。

２、ｃＤＮＡライブラリーの調製 ｃＤＮＡライブラリーの作成に用いたプラスミドおよび
酵素類の供給源は以下の通りである。

オリゴ（ｄＴ　）　−Ｔ　ａｉｌｅｄ（テール化）ｐｃ
ＤＶｌ−ｐｔ、ブライマー　　　ファルマシアオリゴ（
ｄＧ　）　−Ｔ　ａｉ　１ｅｄＨｏｎｊｏリンカ−ファ
ルマシア 逆転写酵素　　　　　　　　　　生化学工業ターミナル
トランスフェラーゼ　宝酒ｍＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガ
ーゼ　　　　７７　ル？　’／　７ＤＮＡポリメラーゼ
ｌ　　　　　ファルマシアＲＮａｓｅＨ宝酒造 ＨｉｎｄｌＩ［ＢＲＬ ｌ、で得た畠−ＲＮＡ１１８ｇとオリゴ（ｄＴ）−テー
ル化ｐｃＤＶｌ−ＰＬプライマー２μｇに逆転写酵素を
作用させることにより、５ｓ−ｃ−ＤＮＡ（−本鎖ｃＤ
ＮＡ）０．５３μｇを合成した。これにターミナルトラ
ンスフェラーゼを作用させて、平均１５のＣ−Ｌａｉｌ
ｉｎｇ（テーリング）をした。制限酵素Ｈｉｎｄｎ［で
切断した後、オリゴ（ｄＧ）−テール化Ｈｏｎｊｏリン
カ−０１５Ｍｇとアニーリングし、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　　リガーゼを作用させた。次いで、
ＲＮａｓｅＨ，ＤＮＡポリメラーゼ■およびＥ、ｃｏｌ
ｉＤＮＡリガーゼを作用させて、ｄｓ−ｃ−ＤＮＡ（二
本鎖ｃＤＮＡ）を合成した。以上の操作は、オカヤマ（
Ｏｋａｙａｍａ）およびバーブ（Ｂ　ｅｒｇ）の方法３
）に従った。次いで、このｃ−ＤＮＡを用い、ハナーン
（Ｄ。

Ｈａｎａｈａｎ）”の方法に従って、Ｅ、　ｃｏｌｉ　
ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）を形質転換し、３．５Ｘ
ｌＯ’のアンピシリン耐性（Ａｐ”）クローンを得た。

ＤＮＡライブラリーの作成模式図を第２図に示す。

３、ＤＡＯの精製と部分アミノ酸配列の決定ＤＡＯの精
製は、微生物からの酵素の精製における標準的な手法に
従って行われた。

１）Ｆ、ンラニＭ−０７１８株の培養 ２％グルコース、２％Ｃ８Ｌ、０．５％ＤＬアラニン（
ｐＨ５，０）からなる培地１００村を、容１５００３１
１２の三角フラスコに入れ、Ｆ、ソラニ開−０フ１８株
を３０°Ｃで３日間振盪培養した。培養液５村をｉｏｏ
、ｔｃの新しい培地に移し、同様に３０℃で３０時間培
養した。

この菌を第３図の精製フローに従い、以下のごとくに処
理した。

２）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの抽出・精製ｌ）で調製
したＦ、ソラニＭ−０７１８培養液２ｅを遠心し、０．
１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ）で洗浄して約５００ｉ＋
２の菌体スラリーを得た。これに同量の海砂を加え、水
冷上乳鉢で充分摩砕した。次いで、約同量の上記緩衝液
を加えて希釈した後、吸引濾過してＤＡＯ粗抽出液を得
た。

このＤＡＯ粗抽出液を０．３％ポリエチレンイミン処理
に付して除核酸した後、７０％硫酸アンモニウムによる
沈殿（硫安沈澱）処理し、得られた沈殿を遠心分離（６
，０００ｒｐｍ８１０ｍ１ｎ）Ｌ、０゜ＩＭ　りん酸緩
衝液（ｐＨ７，５）に懸濁し、０．１Ｍりん酸緩衝液（
ｐＨ７，５）に対して一夜透析し、透析物を３５％硫安
沈澱に付し、遠心分離（６，０００ｒｐｍＸ　ｌ　Ｏ５
ｉｎ）　して上澄液１１０ｆｆ１２を得た。

これを疎水性クロマトグラフィー［担体：　Ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌＨＷ６５Ｆ（商標、東洋曹達工業社製）（２０
０ｚＩ２）、カラム内径：２６ｔｕｒ、洗浄液：３５％
硫安を含むＯ，ＩＭ　りん酸緩衝液（ｐＨ７，５）（５
００酎）、溶出：３５％硫安を含むＯ，ＩＭ　りん酸緩
衝１ｆＬ（ｐＨ７，５）→０．ＩＭりん酸緩衝液（ｐＨ
７゜５）リニアグラジェント］に付し、活性画分１５０
Ｊｌｌ１２を集め、２０ｏ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ２（
ｐＨ８，０）に対して一夜透析した。透析物（１６０３
１１２）をイオン交換クロマトグラフィー［担体：　Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌ　Ｄ　Ｅ　ＡＢ　６５０Ｍ（商標、東
洋曹達工業社製）（１２０ｍ１２）、カラム内径：２６
ｚｘ、洗浄液：　２ＱａＭ　Ｔｒｉａ−ＨＣＱ（ｐＨ８
，０）（２５０ｘＱ）、溶出：２０ｓＭＴｒｉｓ−Ｈ（
Ｊ！（ｐＨ８，０）−＋０．３Ｍ　Ｎａ（Ｊ！を含む２
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ８，０）リニアグラジ
ェント（６００ｘρ）コに付し、活性画分（９０７＋１
２）を集め、１０ｎ＋Ｍ　りん酸緩衝液（ｐＨ７，０）
に対し一夜透析した。透析物の一部（２２Ｒ１２）をＨ
ＰＬＣヒドロキ／アパタイトカラムクロマトグラフィー
［担体：ヒドロキシアパタイトカラムＨ’ＣＡ−Ａ７６
１０（三井東圧化学社製）、カラム・サイズ：７６ｘｌ
ｏｏｆｆｆｆ、移動相：１０ｍＭ　りん酸緩衝液（ｐＨ
７，０）→３００１ＩＩＭ　りん酸緩衝液（ｐＨ７，０
）リニアグラジェント、３０分、流速Ｉ　ＭＱ／　ｍｉ
ｎ、検出：ＵＶ２８Ｏｒ＋ｎ＋］に付し、活性画分（５
ｉのを集めた。

上記透析物の他の一部（２２ＪＩＱ）についても同様に
ＨＰＬＣヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
ーに付し、活性画分（５籾）を得た。活性画分を合し、
凍結乾燥して、純度９０％以上のＤＡＯａＩ結乾燥品約
Ｉｏｊ＋９を得た。この標品は５ＤＳ−ＰＡＧＥに付す
と分子量約４５（４０，０００±１．０００）の単一バ
ンドとして観察された。

３）部分アミノ酸配列の決定 ２）で得たＤＡＯ凍結乾燥品８５０μ２を６Ｍグアニジ
ン・ＨＣｌ２および５％２−メルカプトエタ／−ルから
なる溶液に溶解し、３７℃において４時間、変性処理し
た。次に、逆相ＨＰＬＣ（担体：　Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　
５　Ｃ４−３００（ナカライテスク株式％式％ ＦＡ・６０％ＣＨ，ＣＮグラジェント、３０分、流速１
　ｒｉＱ／　ｍｉｎ、検出Ｕ　Ｖ　２２　Ｏｒ＋ｎ＋）
によって分取した。

上記の変性ＤＡＯ４ＱＱμ９を２Ｍ尿素含有５ＱｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ２バッファーに溶解（４００μ９１０
．８ｘ□Ｌ、アクロモバクタ−・プロテアーゼ（Ａｃｈ
ｒｏｉｏｂａｃｔｅｒ　　Ｐ　ｒｏｔｅａｓｅ）　Ｉ　
（Ａ　Ｐ　−１）（リシルエンドペプチダーゼ）を加え
（Ｓ／Ｅ＝５００）、３７℃で２時間インキュベートし
た。不溶物を除去し、上澄液に５％２−メルカプトエタ
ノールを添加後、逆相ＨＰＬＣ（担体：　Ｃｏｓｍｏｓ
ｉｌ　５　Ｃ４３００、移動相：０．０５％ＴＦＡ→０
．０５％ＴＦＡ・６０％ＣＨ，ＣＮグラジェント、６０
分、流速１ｘＩ２／ｗｉｎ、検出Ｕ　Ｖ　２２０　ｎｍ
）にかけて各断片を分取した。結果を第４図に示す。こ
のようにしてＡＰＩ−ＡＰ９の９種を得た。次いで、メ
ソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｔ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　９１巻４１ｆｉ＋記載の
方法に従い、アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社の気相プロティンシー
ケンサ−４７０Ａを用いてこれら９種のペプチド断片の
アミノ酸配列分析を行なった。９８アミノ酸配列が決定
された。結果を以下に示す。

ＡＰ−１：＾ｒ８−Ａｌａ−！　１ｅ−Ｌｅｕ−＾５ｎ
−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａｙｓ ＡＰ−２：Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｐｈｅ−ＬｙｓＡＰ−
３：　Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｉＧ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−
Ｖａ　Ｉ　−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　１ｙ−
Ｖａ　ｌ−旧５−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ＾Ｐ−４：Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌｌ　Ｉｅ−＾ｒｇ−Ｘ−
Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ Ａ　Ｐ−５：Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓ　ｎ−Ｉｌｅ−Ｉ　
１ｅ−Ｖａ　ｌ　−Ａｓ　ｎ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｔｈｒ−Ｇ
　１ｙＬｅｕ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−ＬｙｓＡＰ−
６：旧ｓ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−
Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＴｙｒＡｌａ−８ｅｔ ＡＰ−７：Ｈｉｓ−Ｎｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｔｙｒ−＾５ｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＴｙｒＡｌａ−Ｓｅ
ｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ａｌａ ＡＰ−８：Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｉｌｅ−ＶａｌＶａｌ−Ｖａ
ｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ
−ＭｅｔＬｅｕ−Ｌｅｕ ＡＰ−９：＾ｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−
Ｐｈｅ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ上記の配列式中、“Ｘ”は
不明のアミノ酸を示す。

上記の配列式は、ＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配
列とよく一致している（第８図）。

なお、上記と同様な方法で、ＤＡＯのＮ末端アミノ酸配
列の分析を試みたが、Ｎ末端アミノ酸が何らかの修飾（
Ｎ−アセチル化、ピログルタミル化など）を受けている
ためにアミノ酸配列を決定することができなかった。

４）ＤＮＡプローブの合成 ３）で示した９種類のアミノ酸配列の内、ＡＰ＝３、Ａ
Ｐ−９、およびＡＰ−１３とＡＰ−７の３ペプチド断片
の配列について、これらのアミノ酸配列から推定される
遺伝子上の可能なりＮＡ配列をなるべ（多く含むオリゴ
ヌクレオチド混合物を合成し、ＤＮＡプローブＡＰ−３
、ＡＰ−９およびＡＰ−６，７と命名した。オリゴヌク
レオチドの合成は、すべてアプライド・バイオシステム
社のＤＮＡ合成合成デモデル３８１を用いて行なった。

また、アミノ酸配列からのＤＮＡ配列の推定に際しては
、ソリデイ−ら８′による、フザリウム・ソラニのキュ
ティナーゼ（Ｃｕｔ　１ｎａｓｅ）のコドンニーセージ
（ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ）をもとに、使用頻度の高い
ものを用いた。

このようにして得られたＤＮＡ合成プローブを以下に示
す。

ＤＮＡプローブＡＰ−３（下記１６種の３６マーの混合
物）Ｔ　　　　　　ＴＴＴ ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＴ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＧＣｃＧＧｃ
ＧＴｃＣＡＣＴＴＣＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　
Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｍａｌ　Ｈｉｓ　ＰｈｅＣＡ
Ｇ　ＡＡＧ Ｇｌｎ　Ｌｙｓ ＤＮＡプローブＡＰ−９（下記４種の１８７−の混合物
）＾Ａ″ｃＡＴＧ　ＴＴＣＧＡＧ　ＧＡｏＴＴＣ＾ｓｎ
　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ＰｈｅＤＮＡプロ
ーブＡＰ−６およびＡＰ−７（ＡＰ−６，７）ＴＴ　　
　　　　　ＴＴ ＾ＴＧＣＣＴＧＧｃＧＡｃＴＡＣＧＡｃＧＴｃＧＡＧＴ
＾Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　
Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ５、ｃ−ＤＮＡライブラリーか
らのＤ−アミノ酸オキシダーゼクローンの選択と分離 １）ＤＮＡプローブのラベリング 上記４．で調製したＡＰ−３、ＡＰ−９、ＡＰ６．７の
各ＤＮＡプローブを、イングリアら（Ｉｎｇｌｉａ）”
の方法に従い、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとγ−”
Ｐ−ＡＴＰとを用いてラベルした。

２）”ＰラベルしたＡＰ−３プローブによる選択と分離 上記２．２）で作成した１、５Ｘｌｏ’のｃＤＮＡライ
ブラリーを含むＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨｌをアンピシリン５
０μ９／ｘ（ｌを含んだし一グロス寒天培地上でコロニ
ーとして生育させ（３７°Ｃ，１０時間）、ニトロセル
ロースフィルターに移した後、さらにクロラムフェニコ
ール２５０μ９／ｙｔ（ｌヲ含んり上記の培地上で、３
７℃において１２時間保温した。

次に、０．５Ｎ　ＮａＯＨ−１，５Ｎ　ＮａＣＱで処理
して溶菌およびＤＮＡ変性を行い、０，５Ｍ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，０）　　１．５Ｎ　　ＮａＣｆ
ｆにより中和した後、デービスらの方法８）に従ってＡ
Ｐ−３とハイブリダイゼーションさせた。即ち、５０％
（ｖ／ｖ）ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ（０，９Ｍ　Ｎ
ａＣＱ、５．Ｏｏ＋Ｍ　ＮａＨＰＯ，，５＋＋＋Ｍ　Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ７，０）　、１ｘＢＦＰ［０，０２％牛血
清アルブミン、０．０２％フィコール（＊、ｗ、　４０
０．０００）、０．０２％ポリビニルピロリドン］、０
．３％５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ｌＯＯμ９
／ｌｘＱの変性音波処理担体ＤＮＡ（ウシ胸ＩＩＪ９）
、およびＡＰ３約３　Ｘ　ｌ　Ｏ’ｃｐｍ／　ｘＱを用
いて、３７℃で一夜保温した後、２０ｍＭリン酸緩衝液
（ＰＢ）、０゜２％ＳＤＳ、ｌｓＭ　ＥＤＴＡを用い、
３７℃で３回フィルターを洗浄した。次いで、フィルタ
ーを乾燥させ、オートラジオグラフィー（感光条件ニー
８０℃、３日間）にかけたところ、ハイブリダイゼーシ
ョン陽性のコロニーが多数見出された。陽性コロニーか
ら１３株を取り上げ、液体培養した後、デービスら６）
の方法により、該コロニーからプラスミドＤＮＡを調製
した。得られたプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気
泳動にかけた後、サザーンら（Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ）の
方法＋０１に従ってＡＰ−３、ＡＰ−９またはＡＰ−６
，７のＤＮＡプローブとのサザーン・ハイブリダイゼー
ションに付した。ハイブリダイゼーションの条件は、Ａ
Ｐ−３に関しては、上記と同様である。ＡＰ−９および
ＡＰ−６，７に関しては、５ＸＳＳＣ（０，９Ｍ　Ｎａ
ｃｔ；　０．０９Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７，０）、
５ＸＢＦＰ、０．５％ＳＤＳ、１００μ９／ｘ（ｌ担体
ＤＮＡおよびラベルしたＤＮＡプローブを用いて、３７
℃（ＡＰ−９の場合）または４５６Ｃ（ＡＰ−６゜７の
場合）で−夜ハイブリザイゼーションさせた後、６倍ｘ
ｓｓｃを用いて、３７℃（ＡＰ−９の場合）または５０
°Ｃ（ＡＰ−６，７の場合）で１回、ついで３７℃で２
回洗浄した。それぞれのプローブのハイブリダイゼーシ
ョンとフィルター洗浄の条件を表１に示す。

表１　合成りＮＡプローブのハイブリダイゼーション条
件 次いで、各フィルターをオートラジオグラフィー（感光
条件ニー８０℃、−夜）に供したところ、すべＣのプロ
ーブに対して陽性を示す以下の７種のクローンが見出さ
れた：ｐＣＦＳ３．ｐｃＦｓＬ７、ｐｃＦｓ１９、ｐＣ
Ｆ　Ｓ　２２、ｐｃ　Ｆ　Ｓ　２５、ｐＣＦＳ２６、ｐ
ｃ　Ｆ　Ｓ　２７゜これら７種のプラスミドＤＮＡを制
限酵素ＢａｍＨＩで切断し、同様にラベルしたＡＰ−３
、ＡＰ−９またはＡＰ−６゜７のＤＮＡプローブとのサ
ザーン・ハイブリダイゼーション１０′に付した。その
結果、約１．３Ｋｂｐまたは約１．ＩＫｂｐのＤＮＡ断
片と、すべてのプローブがハイブリダイゼーション陽性
を示した。

約１．３ＫｂｐのＤＮＡ断片を持つプラスミドの１つを
ｐｃ　Ｆ　Ｓ　３と命名し、そのＤＮＡ塩基配列を決定
した。

６、ＤＮＡ塩基配列の決定とＤ−アミノ酸オキシダーゼ
クローンの同定 ５、で得たプラスミドｐｃ　Ｆ　Ｓ　３をＢａｍＨＩ切
断して生成した１、３ＫｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を
、Ｍ１３＋＋ｐｌＯおよびＭ１３ｍｐＨベクター１目ａ
−３”Ｐ−ｄＡＴＰとセクエナーゼ（Ｓ　ｅｑｕｅｎａ
、ｓｅ）　’　”　’（ユナイテッド・ステーブ・バイ
オケミカル・コーポレーション、東洋紡（株）輸入販売
）を用い、サンガーら（Ｓ　ａｎｇｅｒ）のジデオキシ
配列決定法１１によって決定した。このようにして決定
されたｐＣＦＳ３の制限酵素地図を第５図に、また、ｐ
ＣＦＳ３のＢａｌｌ１ｌ（Ｉ　１．３　Ｋｂｐ断片のＤ
ＮＡ塩基配列を第６図に示す。第６図から明らかなよう
に、１７１〜１９６の位置にＡＰ−６，７と、２９４〜
３２９の位置にＡＰ−３と、４２０〜４３７の位置にＡ
　Ｐ−９のＤＮＡプローブと夫々、一致する部位が認め
られる。なお、第６図において、ヌクレオチド番号約１
２８０位のＸは、同定されていないことを示す。

次に、このＤＮＡ配列に基いて推定のアミノ酸配列を決
定した。結果を第７図に示す。１０８６ｂｐのオーブン
・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が存在している。

このＯＲＦのアミノ酸配列とＤＡＯタンパク質のＡＰ−
１〜ＡＰ−９各部分アミノ酸配列（実施例１．２．３）
で決定）とを比較すると、第８図に示すようにこれらは
完全に一致した。この結果に基き、上記５．で得たクロ
ーン（プラスミドｐＣＦＳ３）は間違いなく　ＤＡＯの
遺伝子であり、かつ、完全なＯＲＦを持つものであると
同定された。

実施例２　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含有する
発現ベクターｐｃＦｓ３１５の構築１）ＤＡＯをコード
するＫＩＩＩＲプラスミドｐＣＦＳ１０５の構築 カナマイシン耐性ｐＵＣタイプベクターｐｉ−ｔ　Ｓ　
Ｇ２９８（宝酒造）０．５μ９とｐＣＦ３３２μ９を夫
々、Ｂａ１ｔ−ＩＩで切断した後、各ＢａｍＨＩ断片を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２ｕｎｉｔ）で結合させた。その
ライゲーション反応液を用い、ハナーンらの方法３１に
従ってＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭＩ　０９（宝酒造）を形質
転換し、カナマイシン２０ｕｇ／ｘＱ、２ｍＭ［ＰＴＧ
（インプロピル−β−Ｄ−チオガラクトビラ／ジッド）
およびＱ、　５ｘｇ／ｙｔＱ　　Ｘ−Ｇａ１（５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトジッド
）を含んだし一ブロス寒天培地上で生育してくる白いコ
ロニーを選択した。これらのコロニーからプラスミドＤ
ＮＡを抽出し、ｐＨ５Ｇ２９８の（ａｃプロモーターと
ＤＡＯ遺伝子とが同一方向であるプラスミド、ｐｃＦｓ
１０５を選択した。

２）ｔａｃプロモーターを含有するプラスミドｐＣＦＳ
２０２の構築 ｔａｃプロモーターを有する発現ベクターｐＤＲ５４０
（ファルマシア）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ切断に
付し、ｔａｃプロモーターをコードすると共に、翻訳に
必要なＳＤ配列をも含有する約０．４ＫｂｐのＤＮＡ断
片を分離した。このｔａｃプロモーター部分の約０．４
Ｋｂｐ断片のＤＮＡ塩基配列は第５図に示されている。

次に、■）で構築したｐｃＦｓ１０５をＢａｍＨＩで部
分切断した後、ＥｃｏＲＩで切断し、３．９ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片を分離した。これら３．９Ｋｂｐおよび約０．
４ＫｂｐのＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ断片を混合し、Ｔ
４ＤＮＡＩＪガーゼの存在下、結合反応を行なった。そ
の反応液を用いてＥ、ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　１０９を形質
転換し３′、カナマイシン２０μｇ／ｘ（１，２ｍＶＩ
ＰＴＧおよび０．５ｘ９／ｚｃ　Ｘ−Ｇａ１を含むＬ−
ブロス寒天培地上で生育してくる青いコロニーを選択し
た。ＤＡＯのｃ　−Ｄ　Ｎ　ＡのｐｏｌｙＡから下流の
ｐｃＤＶｌ−ＰＬプライマ一部分とｐＨＳ　Ｇ２９８の
β−ガラクトシダーゼのＮ末端側の翻訳のフレームがう
まく合って、ｔａｃプロモーターのリードスルーによっ
てβ−ガラクトシダーゼが生成するために青いコロニー
になるようである。これらの青いコロニー中の１株から
プラスミドＤＮＡを抽出し、これをｐｃ　Ｆ　Ｓ　２０
２と命名し、制限酵素切断によりｐｃ　Ｆ　Ｓ　２０２
の構造を確認した。

３）合成りＮＡアダプター１の合成 ｐｃ　Ｆ　Ｓ　２０２では、ｔａｃプロモーターのＳＤ
配列から翻訳開始コドンＡＴＧまで６２塩基あり、大腸
菌でＤＡＯ遺伝子を発現させるには離れすぎている。そ
こで、合成りＮＡアダプター１を作成し、ＳＤ配列とＡ
ＴＧの距離を７塩基短（した。

以下に、アダプター１のＤＮＡ塩基配列を示す。

５８ｓｅｒ　５’　−ＧＡＴＣＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＣ
ＡＡＣＡＣＡＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＧ５０ｍｅｒ　
　　　３’　−ＧＴＴＡＧＴＡＣＡＧ　ＧＴＴＧＴＧＴ
ＴＡＧ　ＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＣＣＧＧＴＧＴ　
ＣＡＴＴＧＧＣＴＴＧ　ＡＣＧＴ−３゜ＣＡＣＧＧＣＣ
ＡＣＡ　ＧＴＡＡＣＣＧＡＡＣ−５′上記の５８１１＋
ｅｒと５０ｓｅｒのオリゴヌクレオチドの合成はアプラ
イド・バイオシステム社のＤＮＡ合成合成デモデル３８
１を用いて行なった。２つのオリゴヌクレオチドを共に
１００μｙ／　ｒｘ（ｌになるように混合した後、９５
℃で５分間加熱し、充分な時間をかけて室温に戻すこと
により、２本のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ
た。

４）ＤＡＯ発現プラスミド、ｐｃＦｓ３１５の構築 ｐｃ　Ｆ　Ｓ　２０２をＢａＩＩＨＩで部分切断した後
、ＡａｔＩ！で切断し、４．３ＫｂｐのＤＮＡ断片を分
離した。このＤＮＡ断片（０，５μｇ）とアニーリング
した合成りＮＡアダプター（２μｇ）とを混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼによる結合反応に付した。その反応液を
用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　］　０９を形質転換し
３）、カナマイシン２０μｙ／ｚＱを含むし一グロス寒
天培地で生育してくるコロニーを選択した。

これらのコロニーの中の１株からプラスミドＤＮＡを抽
出し、これをｐｃＦｓ３１５と命名し、制限酵素切断に
よりｐｃＦｓ３１５の構造を確認した。次いで、合成り
ＮＡアダプタ一部分のＤＮＡ塩基配列をジデオキシ配列
決定法１３１により確認した。

プラスミドｐｃＦｓ３１５の構築模式図を第５図に示す
。該図面には、中間体プラスミドであるｐＣＦＳ１０５
およびｐｃ　Ｆ　Ｓ　２０２の構築も示されている。

実施例３　形質転換体、旦、四環、ＪＭ１０９（ｐＣＦ
Ｓ３１５）によるＤＡＯの発現、および該ＤＡＯのＣＣ
への作用 実施例２で構築したＤＡＯ発現プラスミドｐＣＦＳ３１
５を保持する形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭＩ０９（ｐ
ｃＦｓ３１５）をカナマイシン２０μ９／肩Ｑと１ｓＭ
ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド）とを含んだし一グロス２００ｘ（ｌに植菌し、３
７℃で２４時間振盪培養した。

培養液を遠心分離（６０００ｘ９．１０分間、５℃）し
て集菌し、２０ｍＭ　　ＰＢ（ｐＨ７，５）ｌ　ＯａＱ
に懸濁し、超音波破砕機にかけて細胞を破砕した。破砕
された菌体混合物を遠心分離（６０００Ｘ９．１０分間
、５℃）し、得られた上清を上記ＰＢ３Ｑに対して透析
して酵素液とした。一方、実施例１．３．２）記載のご
とくにしてＦ６ソラニＭ−０７１８株の培養菌体から抽
出精製した純度９０％以上のＤＡＯ凍結乾燥標品をｌ　
、　Ｏｊ１９／１１２（ウシ血清アルブミンを標準とし
てローリイー（Ｌ　ｏｗｒｙ）法で測定）となるように
溶解したものを酵素標品として比較試料に用いた。次い
で、以下のごとくにしてＣＣを基質とする酵素反応を行
った。

（１）Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９（ｐＣＦＳ３１５）
から得た酵素液によるＣＣの酸化 ＣＣ１，０，８ｍＭ５ＰＢ（ｐＨ７，５）１００＋Ｍ、
酵素液５０μＱからなる全ｍＩｘＱの反応液中、３０°
Ｃにおいて１２０分間反応させ、反応混合物を高速液体
カラムクロマトグラフィー［カラム：イナートシル（Ｉ
　ｎｅｒｔｓｉｌ）　ＯＤ　Ｓ　−２（ガスクロ工業）
、移動相：　６．６ｎ＋Ｍ　ＰＢ（ｐＨ７，０）と３％
メタノールからなる溶液、検出：２５４ｎｍ］に供して
生成物を定量した。

その結果、ＣＣは検出されず、ケト−ＡＤ−７ＡＣＡ４
．７５ｍＭと、ＧＬ−７ＡＣＡ６．２８ｏ＋Ｍとが生成
していることが分かった。

（２）Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９（ｐｃＦｓ３１５）
の酵素液とＦ、ソラニＩＶＩ−０７１８のＤＡ○酵素標
品の単位タンパク質当りの活性の比較 １．０ｐ９／ｘＱ　ＤＡＯ酵素標品１０μｇまたはＥ。

ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐｃＦｓ３１５）の酵素液１２
゜５μＱのいずれかを、！　０．８ｍＭＣＣ，ｌ　ＯＯ
＋ａＭＰＢ（ｐＨ７，５）からなる全量１峠の反応液中
で３０′Ｃにおいて６０分間、および１２０分間させた
。

次いで、各反応液を高速液体カラムクロマトグラフィー
に供して生成物を定量した。

旦、唾ＪＭ１０９（ｐＣＦＳ３１５）の酵素液のタンパ
ク質濃度は、ｌ　、　ＯＲ９７１（ｌのＤＡＯ酵素標品
を標準として、プロティンアッセイキット（Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｋｉｔ）（バイオラッド社）により
測定した。ＣＣの減少およびケト−ＡＤ−７ＡＣＡとＧ
Ｌ−７ＡＣＡの生成の合計に基いて、両酵素液のタンパ
ク質当りの活性を求め、比較検討した。

その結果、Ｆ、ソラニＭ−０７１８のＤＡＯ酵素標品の
単位タンパク質当りのＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を
１００％とした時、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＣＦ
Ｓ３ｉ５）の酵素液のそれは、ＣＣの減少、またはケト
−ＡＤ−７ＡＣＡとＧＬ−７ＡＣＡの生成量のいずれに
基いても７．８％であった。

上記の結果は、本発明のＤＡＯ発現ベクターｐｃＦｓ３
１５により形質転換された形質転換体が、活性なりＡＯ
を有効に発現したことを表している。この形質転換体、
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　ｌ　０９　（ｐＣＦＳ３Ｊ５）
は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（つく
ば小束１丁目１−３）に、受託番号微工研条寄第１９１
６号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９１６、寄託臼：　１９８８
年６月２０日）として、寄託されている。

（３）Ｆ、ソラニＭ−０７１８由来の組換えＤＡＯとト
リボノブシス・パリアビリス由来のＤＡＯのアミノ酸配
列の比較 本発明にがかるＦ、ソラニＭ−０７１８由来のＤＡＯと
従来のトリボノブシス・パリアビリス由来のＤＡＯのア
ミノ酸配列を第９図に示す。この配列式から、３６０ア
ミノ酸中１４６（４１％）が相同であることが分かる。

同様の性質を示す酵素としては、この４１％の相同性の
存在は考え得ることである。しかし、いずれも下等真核
生物に由来する物質であることから、この両者間の５９
％の相異はむしろ大きく、実質上、別物質であることを
示しており、従って、これらは異なる酵素であるとみな
される。

実施例４　プラスミドｐ３２２　Ａ／Ｃの構築ｐＢＲ３
２２（１０８ｇ）を１００μｕ）反応緩衝液（１０ｖＡ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣρ（ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣ（
１１，６０ＩＩＭ　ＫＣ（ｌ、７ｍＭ　β−メルカプト
エタノール（２−ＭＥ）、１００μ９／ｚ（ｌウシ血清
アルブミン）にて八ａｔＵ（１，０ユニツト、東洋紡）
及びＣ１ａＩ（１０ユニツト、ヘーリンガー・マンハイ
ム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ））で消化
し、約４．３にのＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気
泳動にて単離した。

ＤＮＡオリゴｖ−ＤＡＯ−１（５６＋１ｌｅｒ）及びＤ
ＡＯ−２（５０ｉｅｒ）は各々ＤＮＡ合成機（３８１Ａ
ＤＮＡシンセサイザー、アプライド・バイオシステムズ
（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ　１ｏｓｙｓｔｅｎ＋ｓ）を用い
て合成した。

ＤＡＯ−１とＤＡＯ−２の重複アニーリングは両端がＣ
ＩａＩとＡａｔｌｌで切断された形の粘着末端でｔｒｐ
プロモーターＶのＣ１ａｌサイト（部位）とＤＡＯＤＮ
ＡのΔａｔ［間を接合するアダプターであ約４．３にの
ＤＮＡ（２００ｎｇ）、ＤＡＯ−１（９゜７　ｐｍｏｌ
ｅ）及びＤＡＯ−２（３８，５ｐｍｏｌｅ）を２０μＱ
の反応緩衝液（５０ＩＩＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ２（ｐ
Ｈ７，８）、１０　ｉ＋Ｍ　ＭｇＣＱｔ、２０ｍＭ　ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ　ＡＴＰ、５０μ
９／酎ＢＳＡ）にてＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（３００ユ
ニ・ット、宝酒造）を用いて１５℃にて６０分インキュ
ベートした。

ライゲーション混合物でＥ、ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　ｌ　０
９　ヲ形質転換（シゲサダ、細胞工学（１９８３）、２
，６１６−６２６、記載の方法に準じた）した。形質転
換菌からプラスミドを抽出し、制限酵素マ、ツピングに
より目的とするｐ３２２　Ａ／Ｃであることを確認した
。プラスミドｐ３２２Ａ／Ｃの構築模式図を第１０図に
示す。

実施例５　プラスミドｐＹｓ９１２０の構築ｐ３２２Ａ
／Ｃ（１０μ９）をＡａｔ［Ｉ（１０ユニ・ｙト）とＣ
１ａｌ（１０ユニツト）で消化し、約５４　ｂｐのＤＮ
Ａを２．２５％アガロースゲル電気泳動で単離した。次
にｐｃＦｓ３１５（１０μ９）とＡａｔＩ［（１０ユニ
ツト）とＢａｍＨＩ　（ｌ　Ｏ：”二ｙト、東洋紡）で
消化し、約１．１ＫＤＮＡを０．８％アガロースゲル電
気泳動で単離した。さらにｐＣＬａＨｔｒｐ３　ｔ（１
０８ｇ）をＣ１ａｌ（１０ユニツト）とＢａｍＨｌ（，
１０ユニツト）で消化し、約３．８にのＤＮＡを単離し
た。

得られたＣ１ａｌ　−ＡａｔＩ［５４ｂｐ　ＤＮＡ（５
０ｎｇ）、ＡａｔＩＩ−ＢａｍＨＩ　　１．　ＩＫ　　
ＤＮＡ（５０ｎｇ）及びＣ１ａｌ　−ＢａｍＨＩ　　３
．８Ｋ　ＤＮＡ（２００ｎｇ）をＴ４　　ＤＮＡリガー
ゼ（３００ユニツト）を用いて実施例１と同様にして結
合させた。ライゲーション混合物でＥ、ｃｏｌｉ　Ｊ　
Ｍ　１０９を形質転換した。

形質転換菌からプラスミドを抽出し、目的とするｐＹｓ
９１２０Ａを得た。プラスミドｐＹｓ９１２ＯＡの構築
模式図を第１１図に示す。

’１ｌｕ１６　　プラスミドｐ１５３ｔｒｐの構築両端
にＥｃｏＲＩ及びＣ１ａｌサイトを持つ新しいｔｒｐプ
ロモーター（ｔｒｐＶ）を以下の手順で調製した。

合成オリゴマーをグループＩ（Ａ’）、ＩＩ（Ｂ’、Ｃ
。

Ｄ、Ｅ、Ｆ）、ＩＩＩ（Ｇ、Ｈ，Ｉ、　Ｊ）、■（Ｋ、
　Ｌ、Ｍ’）及びＶ（Ｎ’）に分けた。グループ■のオ
リゴマー（各０　、２　ｎｍｏｌｅ）をｌｏｏμ＆の混
合バッファー（実施例１に記載）にてＴ４　ポリヌクレ
オチドキナーゼ（２，５ユニツト、宝酒造）とともに３
７°Ｃで６０分インキュベートした。６５℃にて２０分
加熱して酵素を失活させ、反応混合液にＴ４　　ＤＮＡ
　　リガーゼ（６００ユニツト）及び２０ｍＭＡＴＰ（
５μのを添加して１５℃で３０分インキュベートした。

グループ■及び■も同様にしてリン酸化とライゲーショ
ン反応を行った。得られたグループ■、■及び■を合し
、Ｔ４　　ＤＮＡ　　リガーゼ（６００ユニツト）及び
２０＋ａＭ　ＡＴＰ（５μのを加えて１５℃で８０分イ
ンキュベートした。得られた反応混合液にオリゴマーＡ
°及びＮ’（各０　、４　ｎ５ｏｌｅ）、Ｔ４　　ＤＮ
Ａ　　リガーゼ（６００ユニツト）及び２０ｓＭＡＴＰ
（５μｇ）を添加し、１５℃で３０分インキュベートし
た。反応混合物を２．２５％アガロースゲル電気泳動に
付し、目的とする約１０４ｂｐのＤＮＡを単離した。

ｐＡＴ　ｌ　５３（ＩＯＪＩ、ファルマシア（Ｐ　ｈａ
ｒｍａｃｉａ））をＥｃｏＲＩ　（Ｉ　Ｏユニット、東
洋紡）とＣ１ａｌ（１０ユニツト）で消化し、約３．５
Ｋ　ＤＮＡを０゜８％アガロースゲル電気泳動で単離し
た。

ＥｃｏＲＴ　−ＣＩａｌ　　ｌ　０４ｂｐ　ＤＮＡ（２
０ｎｇ）とＥｃｏＲＩ　−Ｃ１ａｌ　　３．６Ｋ　ＤＮ
Ａ（２００ｎｇ）をＴ４　　ＤＮＡ　　リガーゼ（３０
０ユニツト）を用いて実施例１と同様にしてライゲーシ
ョンし、ライゲーション混合物でＥ、ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ
　Ｉ　Ｏ９を形質転換した。形質転換菌よりプラスミド
を抽出し、目的のＰ１５３ｔｒｐを得た。プラスミドｐ
１５３ｔｒｐの構築模式図を第１２図に示す。

実施例７　プラスミドｐＹｓ９１２１の構築ｐ１５３ｔ
ｒｐ（１０μｇ）を５ａｌｌ（１０ユニツト）とＣ１ａ
ｌ（１０ユニツト）で消化し、約２．９にのＤＮＡをア
ガロースゲル電気泳動で単離した。

ｐＹｓ９１２０をＣ１ａｌ（１０−ニット）と５ａｌｌ
（１０ユニツト）で消化し、ｃａ、　　１　、３　Ｋの
ＤＮＡを単離した。

Ｃ１ａｌ−８ａｌＩ　　２．９Ｋ　　ＤＮＡ（２００ｎ
ｇ）とＣ１ａｌ−３ａｌＩ　　１．’３Ｋ　　ＤＮＡ（
２０ｎｇ）をＴ４ＤＮＡ’Ｊガーゼ（３００ユニツト）
を用いて結合させ、ライゲー／ヨン混合液でＥ、ｃｏＩ
ｉ　Ｊ　Ｍ　Ｉ　Ｃ９を形質転換した。形質転換菌から
プラスミドを抽出し、目的とするｐｙｓ９１２１を得た
。プラスミドｐＹｓ９１２１の構築模式図を第１３図に
示す。

哀願り促　プラスミドｐＹ３９１２２にの構築ｐＹｓ９
ｉ２１（１０μｇ）をＥｃｏＲＩ（１０ユニツト）及び
５ａｌｌ（１０ユニツト）で消化し、約１゜４にのＤＮ
Ａを単離した。

ｐｉ−ｆｓＧ２９８（１０μｙ、宝酒造）ＥｃｏＲＩ（
１０ユニツト）及び５ａｉｌ（１０ユニツト）で消化し
、約２．ｆ３ＫＤＮＡを単離した。

１．４Ｋ　　ＤＮＡ（５０ｎｇ）と２．６Ｋ　　ＤＮＡ
（２００ｎｇ）をＴ４　　ＤＮＡ　　リガーゼ（３００
ユニツト）で結合させて目的とするプラスミドｐＹ３９
１２２Ｋを得た。プラスミドｐＹ３９１２２にの構築模
式図を第１４図に示す。

実施例９　プラスミドｐＹ３９１２２Ｇの構築ｐＹｓ９
１２１及びＰＨ３Ｇ３９６（宝酒造）を用いて実施例８
と同様にしてプラスミドｐＹｓ９１２２Ｃを得た。プラ
スミドｐＹ３９１２２Ｇの構築模式図を第１５図に示す
。

実施例１０　形質転換体の培養 旦、四旦ＪＭ１０９（ｐＹＳ９１２２Ｋ）ブロス（１０
０ｚ（１）に移し、３７℃で１６時間培養した。培養液
Ｃ０，８ｘのと８０％グＩ）　’ｒｒｏ−ル（０，２１
１＞を混和し、−８０°Ｃで保存した（グリセロールス
トック閑）。

グリセロールストック菌を１００ｘＲのＭＳ　　ブロス
（０，２％グリセロール、１．２％バクトドリブトン、
２．４％抽出酵母、０．１１％Ｌｅａ＋Ｐｒｏ＋　Ｉ　
ｌｅ、　　１．２５％に、ＨＰＯ，，０，３８％ＫＨ，
ＰＯ，，０，００５％ｆアミ７−ＨＣ（２，０゜０４９
３％ＭｇＳＯ４・７ＨｔＯＳ０．００３　％ＣａｃＱｔ
　・２ＨｔＯ−０−００１４％Ｆｅ５ｏ４・７Ｈ，０）
に移し、Ｋｔｓ（５０ｔｔｙ／ｘのを添加して３０℃で
１６時間培養した。培養液（２０ａ＋Ｑ）を変型Ｍ９培
地［３５０ｉ１２．１％カザミノ酸（Ｎ源）、１％グリ
セロール（Ｃ源）、他はＭ９培地［マニアティスら（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ、　’ｒ、）、［モレキｘラー・り０−
−１−ング（’Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ’
）］、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−
（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）、　（１９８２）、　ｐ、４４０ン］と
同一組成］に移し２８°Ｃにて振盪培養した。１０時間
後に５０％グリセロール（３，５１）とβ−インドール
アクリリック酸（終濃度５０μｇ／ｚのを添加し、さら
に２２時間培養を続けた。４°Ｃ１５０００ｒｐｍ、　
　Ｉ　０分の遠心で集菌して、菌体を一２０°Ｃで保存
した。

他の形質転換体、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　ｌ　０９　（
ｐＹ　Ｓ　９１２２ｃ）およびＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０
９（ＰＹＳ９１２０Ａ）をも同様に培養し、菌体を得た
。ただし、グリセロールストック菌の調製およびグリセ
ロールストック閑の培養に際してカナマイシン（Ｋ＋＋
＋）の代わりにクロラムフェニコール（Ｃｍ）を濃度３
Ｃ）＋９／ｘ（２［Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＹＳ
９１２２Ｃ）］、またはアンピシリン（Ａｍ）を濃度５
０μｇ／ｘ（［Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９（ｐＹＳ　
９１２２Ａ）Ｊを用いた。

実施例１１　分析および検定 凍結菌体（２０村ブロス相当分）をＴＥ（２０１（２，
１０ｍＭ　Ｔｒｔｓ−ＨＣＣ（ｐＨ８，０）−１ｘＭ　
ＥＤＴＡ）に＠濁し、４℃にて超音波処理（ＵＳ−６０
０゜日本精機）してのち遠心（４℃、１５．００Ｏｒｐ
ｍ、３０分）して上清をサンプルとした。

１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・プロット分析 １５％５ＤＳ−ＰＡＧＥは文献［レムリ（Ｌ　ａｅｒａ
ｍＬｉ、　Ｕ、　Ｋ、）、ネイチ＋　−（Ｎ　ａｔｕｒ
ｅ）、２２７．８０−６８５］に記載されている方法に
準じた。

ウェスタン・プロットは電気泳動後のポリアクリルアミ
ドゲル上のタンパク質を電気的にニトロセルロースフィ
ルターに移し、抗ＤＡ○抗血清（家兎に天然ＤＡＯで免
疫）−ペルオキシダーゼ標識抗家兎ＩｇＧで反応し、４
−クロロ−１−ナフトール−Ｈ２Ｏ，で発色させた。

）検定（アッセイ） ２０ｘ９／ｘ（ｌ　ＣＣＮａ（セファｒｆｆスポリンＣ
ナトリウム塩ＸｐＨ７，５、ｌＮＮａＯＨで調製、０゜
５　ｘＱ）、０．３Ｍ　　ＫＨｔＰＯ４（ｐＨ８，０、
ｌ０ＮＮａＯＨで調製；０．５ｊｌのにＤＡＯサンプル
（０゜１　ｘＱ）を添加し、３０℃で２０分振盪した。

２０分後に１％ＨｔＯｚ（０、Ｉ　Ｊ！１２）を加えて
、更ニｌ　０分間振盪した。反応混合物に４％Ａｃ０Ｈ
（０，ｌｚのを加えて振盪し、遠心して上清を水中に静
置した。得られた上清をＨＰＬＣで分析して酵素量（ユ
ニット：１ユニツトはＣＣＮａを基質とし１分間に１．
０μ５ｏｌｅのＧＬ−７ＡＣＡを生成する酵素量）を定
量した。

ＨＰＬＣ条件；カラム；　Ｉｎｅｒｔａｉｌ　０ＤＳ−
２（４，６ｓｕｓφＸ１５ｃｍ、ガスクロ工業）、ｐｕ
ｍｐ；ＬＣ６Ａ　（Ｓ　ｈｆｍａｄｚｕ）、検出器、Ｓ
ＰＤ−６Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）、レコーダー；　ＣＲ
−５Ａ　（Ｓ　ｈｉｍａｄｚｕ）、溶出：５％ＮＨ４０
Ａｃ中、３％ＣＨ，ＣＮ１）、ｉｉ）の結果を表２に示
す。

人ｌ　組換えＤＡＯの発現 ＊培養終了時の培養液の濁度 実施例１２　組換えＤＡＯの精製 実施例７で培養したＥ、ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　１０９　（
ｐＹ　Ｓ９１２２ＫＸ３５Ｍブロス相当菌体）をｂｎＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｇ（ｐＨ８，０）　　ｏ、１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ（１００ｊ１１２）に懸濁し、４°Ｃにて超音波処
理してのち遠心（４°Ｃ，１５，ＯＯＯｒｐｍ、２０ａ
＋ｉｎ）して上清を集めた。残渣を前述のＴｒｉｓバッ
ファー（１００１１ｉ２）に再懸濁して超音波処理−遠
心の操作を２回繰り返した。集めた上清を合しく計３１
０ｉの、ｌＮＮａＯＨでｐＨ９，０に調製してのち、ポ
リエチレンイミンを終濃度０．０１％になるように添加
し、４℃で１５分撹拌後遠心（４°Ｃ１７０００ｒｐｍ
、４０ｍ１ｎ）した。上清（３００ｆｆρ）に（ＮＨ４
）、Ｓ　Ｏ，（６１，８９）を添加し、４℃で１６時間
静置後、遠心（４℃、７０００ｒｐｍ、　　２０＋ｎ１
ｎ）した。

上清（３４０＊（２）を疎水クロマトグラフィー［樹脂
、東洋バールＨＷ−６５Ｆ（東ソー）、容量；１００ｆ
ｆｆｆ１、カラム；ファルマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃ　
１ａ）Ｋ　２６．／４０、溶出液；３５％飽和→Ｏ％、
ｌａ＋Ｍ　　Ｔｒｆｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ９，０）中、（
ＮＨ，）、ＳＯ。

；　０．１ｎＭ　ＥＤＴＡ　（線状勾配（ｌｉｎｅａｒ
　ｇｒａｄｉｅｎｌ））、流速；　２．５ｘ１２／ｓｉ
ｎ］に付した。各フラクションを逆相ＨＰＬＣ［カラム
；ＴＳＫゲル・オクタデシルＮＰＲ（４，６ｍｍＸ３．
５ｃｍ）、溶出；０．０５％ＴＦＡ（線状勾配置０ｍ１
ｎ）中、０→６０％ＣＨ，ＣＮ］で分析した。目的物は
吸廃画分とフラクション２に見い出された。

フラクション２（９０ｍｆｆ）を５１２の２０ｍＭ　　
ＮＨ４０Ａｃ（ｐＨ９，０）に対して透析してのち陰イ
オン交換クロマトグラフィー［樹脂；　ＤＥＡＥ東洋パ
ール６５０Ｍ、容量；１２０屑ｇ、カラム；ファルマシ
アに２６−４０、溶出；　ｌ　ＱｍＭ　ＴｒｉｓＨＣ（
１＜ｐＨ８，０）線状勾配中、０→０．５Ｍ　ＮａＣｅ
、流速；　２．５ｚＮ／ｍｉｎ］に付した（Ｆｉｇ８ｂ
）。目的物を含むフラクション５及び６（計６９ｍ（１
）をｌ０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ９，０）に対して
透析して精製組換えＤＡＯ３，５８ｍ５を得た。このサ
ンプルの活性を測定し、比活性を２４，５ユニッ１−／
ｍｇプロティンと算出した。

精製組換えＤＡＯを逆相ＨＰＬＣ［カラム；Ｃｏｓｍｏ
ｓｉｌ　５　Ｃ４−３００（４，６ｍｍＸ　７．５ｃ＋
ｎ）、溶出；０．０５％ＴＦＡ（線状勾配３０ｍ１ｎ）
中、１２→６０％ＣＨ，ＣＮ］で分取し、４７０Ａペプ
チド配列（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｊ
ｅｄＢ　１ｏｓｙｓｔｅ＊ｓ））でＮ末端アミノ酸配列
を決定した。

以下に示すように、Ｎ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡ配列
から予想されるものと一致していた。

ｃＤＮＡ　　’ＭＳ’　ＮＴ　Ｉ　Ｖ５ＶＶＧＡＧ”　
Ｖ　Ｉ　ＧＬ　　Ｔ”ｒＤＡｏ　　　Ｓ’ＮＴＩＶ　　
ＶＶＧＡＧ　　ＶＩＧＬ（Ｘ）また、この精製ｒ−ＤＡ
Ｏを５ＤＳ−ＰＡＧＥに付したところ、分子量４０，０
００±１０００の位置にシングルバンドが観察された。

以下に明細書中で引用した文献を列挙する。

引用文献 ｌ）マニアナイスら（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ
ｌ、）、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌａｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）実験の手引き（１９８２） コールド・スプリング・ノ＼−バー・ラボラトリ−（Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ！ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）２）オカヤ７　（Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ）およ
びノく−グ（Ｐ、　Ｂｅｒｇ）。

Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　２１６１　（１９８
２）３）ハナーン（Ｄ、　ｌ１ａｎａｈａｎ）、Ｊ、Ｍ
ｏ１．Ｂｉｃｌ、、　１６６４）バンカピラーら（Ｍ、
　Ｗ、　Ｈｕｎｋａｐｉ　１ｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）
＋メソッズ・イン・エンザイモロジー（ＭｅＬｈＯｄＳ
ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、　　９１　３９９（
１９８３）５）バンカピラー（Ｍ、　Ｌ　Ｈｕｎｋａｐ
ｉｌ　１ｅｒ）およびフッド（Ｌ、　Ｅ、　ｆｌｏｏｄ
）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
　９１６）ソリデイ−ら（Ｃ，Ｌ、５ｏｌｉｄａｙ　ｅ
ｔ　ａｌ、）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ
、ＵｓＡ　８１３９３９（＋９８４）７）イングリアら
（Ｉｎｇｌｉａ　ａｔ　ａｌ、）、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　　９１６２７（１９ｇ２）
８）デービスら（Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）
、　アドバンスト・バクチリアル・ジェネテックス（Ａ
ｄｙａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ）（１９８０）　ｐ、　１７４　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ９）サザーン
（Ｅ、Ｍ、５ｏｕｔｈｅｒｎ）、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉ
ｏｌ、＋　９８ｉｏ）サザーン（Ｅ、Ｍ、５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ）、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９８１１）メ
ッシング（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１２０（１９８３）１
２）サンガーら（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、
　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　７
４５４６３（１９７７）１３）チーボー（Ｓ、　Ｔａｂ
ｏｒ）およびリチャードソン（Ｃ，Ｃ，Ｒｉｃｈａｒｄ
ｓｏｎ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ

【図面の簡単な説明】

第１図はＤＡＯをコードするＤＮＡの塩基配列決定の工
程図、第２図はＤＮＡライブラリー作成模式図、第３図
はＤＡＯ精製および部分アミノ酸配列決定の工程図、第
４図は逆相ＨＰＬＣによる９断片の分離パターンを示す
グラフ、第５図はプラスミドｐｃＦｓ３１５の構築模式
図、第６図はプラスミドｐＣＦＳ３のＢａａＨＩ　１　
、３　Ｋｂｐ断片のＤＮＡ配列の模式図、第７図はＤＡ
ＯのＤＮＡ塩基配列および推定のアミノ酸配列の模式図
、第８図は逆相ＨＰＬＣで分取した９断片のアミノ酸配
列と、ＤＡＯをコードするＤＮＡの塩基配列から推定さ
れるアミノ酸配列とを比較した模式図、第９図はＦ、ソ
ラニＭ−０７１８由来のＤＡＯのアミノ酸配列とトリボ
ノブシス・パリアビリス由来のＤＡＯのアミノ酸配列と
を比較した模式図、第１０図はプラスミドｐ３２２Ａ／
Ｃの構築模式図、第１１図はプラスミドｐＹｓ９１２０
Ａの構築模式図、第１２図はプラスミドｐ１５３ｔｒｐ
の構築模式図、第１３図はプラスミドｐＹｓ９１２１の
構築模式図、第１４図はプラスミドｐＹｓ９１２２にの
構築模式図、第１５図はプラスミドｐＹ３９１２２Ｃの
構築模式図である。 １３図 ｐｐｔ ｆｔ股 アミノ融！ＥＰｌのダ９セ 第６図（２） ＡＧＡＡＣ（：ＡＧＣＣＧＧＡＴＣＡＸＴＴＣＧＡＧＣ
ＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣ第７図（２） １、ｅｕ！＊を 第７図（１） Ｌｅ［ｌ５ＯｒｌｌｉＳ＾ｌａＧ　１ｙＬｙｓＴｈｒＰ
ｒｏＡｓｎ　Ｉ　Ｉｅ　Ｉ　１ｅＶａ　１ＡｓｎＡ　Ｉ
　ａＴｈｒＧ　Ｉ　ｙＬｅｕＧ　ｌ　ｙＳｅｒＴｙｒ第
８図（１） ＳｅｒＡ５ｎＴｈｒｌｌｅＶａｌＶａｌＶａｌＧＩｙＡ
ＩａＧＩｙＶａＩｅＧＩｙＬｅｕ）ｈｒｓｅｒＡｌａＬ
ｅｕＬｅｕＡｓｐＶａ　ＩＧ　ＩｕＴｙｒＡ　ＩａＳｅ
ｒＰｒｏＰｈｅＡ　ＩａＧ　ｌ　ｙＡ　！ａＡｓｎｔｌ
　ｉｓＳｅｒＰｒｏＭｅｔＡ　ＩａＴｈｒＧ　ｌｕＧ　
ＩｕＧ０ ＧｌｕＡＩａＧｌｙＶａｌｌｌｉｓＰｈｅＧＩｎＬｙｓ
Ｓｅｒ＾ｒｇｌｌｅＧｌｎ＾ｒｇＡｒｇＡｓｎＶａｌ＾
５ｐＴｈｒＧＩｕｌ、ｙｓ目０ １２Ｇ＋３０ ＰｈａＧ　ｌ　ｕＡｓｐＰｈｅＡｒｇＧ　ＩｕＧ　１ｎ
ｌｌ　１ｓＰｒｏＳｅｒＧ　ＩｕＶａ　ｌ　Ｉ　ＩｅＰ
ｒｏＧ　ＩｙＴｙｒＡｓｐＳｅｒＧ　ＩｙＣｙｓ＋４０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０Ｇ　Ｉ
　ｕＰｈｅＴｈ　ｒｓｅｒＶａ　ｌ　Ｃｙｓ　Ｉ　１ｅ
Ａｓ　ｎＴｈ　ｒＡ　Ｉ　ａ　ｌ　１ｅＴｙ　ｒＬｅｕ
ＰｒｏＴｒｐｌ、ｅｕＬｅｕＧ　Ｉ　ｙＧ　Ｉ　ｎＣｙ
ｓ＾ｒｇＡｓｎＧ　ｌ　ｕｓｅｒｓｅｒＰｒｏＭｅＬＬ
ｅｕＬｅｕＴｈｒｓｅｒＧ　ｌ　ｙＶａ　ＩＧ　Ｉ　ｕ
ＡｑｐＧ　Ｉ　ｙＧ　）ｙ＾ｉａＡｓｐＶａｌ第８図（
２）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、セファロスポリンＣの７−β−（５−カルボキシ−
   ５−オキソペンタンアミド）セファロスポラン酸への変
   換を触媒する酵素活性を有し、分子量が４０，０００±
   １０００ダルトンであって、下記の配列式で示されるペ
   プチド断片ＡＰ−１〜ＡＰ−９を含有するペプチド配列
   を有することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼ。 ＡＰ−１：Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−
   Ａｓｐ−ｌｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ ＡＰ−２：Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＬｙｇＡ
   Ｐ−３：Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖ
   ａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｈｉ
   ｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−ＬｙｓＡＰ−４：Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
   −Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
   Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ ＡＰ−５：Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−
   Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇ
   ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＬｙｓＡＰ−７：Ｈｉｓ−Ｍｅ
   ｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
   −Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
   ＡｌａＡＰ−８：Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａ
   ｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａ
   ｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ
   −Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ ＡＰ−９：Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
   Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ２、第７図記載のアミ
   ノ酸配列を有する請求項１記載のＤ−アミノ酸オキシダ
   ーゼ。 ３、請求項１または２に記載のＤ−アミノ酸オキシダー
   ゼをコードするＤＮＡ。 ４、第７図記載のヌクレオチド配列を有する請求項３記
   載のＤＮＡ。 ５、請求項３または４記載のＤＮＡを含有する発現ベク
   ター。 ６、請求項５記載の発現ベクターで形質転換された微生
   物。 ７、エシェリキア・コリである請求項４記載の形質転換
   体。 ８、請求項６または７記載の形質転換体を培養し、その
   培養物からＤ−アミノ酸オキシダーゼを単離することか
   らなるＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造方法。 ９、セファロスポリンＣまたはその塩と、請求項６また
   ７記載の形質転換体の培養物またはその処理物とを接触
   させることからなる式（ I ）：▲数式、化学式、表等
   があります▼（ I ） （式中、Ｙは−ＣＯＣＯＯＨまたは−ＣＯＯＨを表す） で示される化合物またはその塩の製造法。