JPWO2002055715A1 - D−ミオ−イノシトール1−エピメラーゼをコードするdna - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットのタンパク質をコードする新規なDNAならびに該DNAでコードされるタンパク質に関し、また前記の新規DNAを内部DNA領域として含有する新規なDNA断片にも関する。さらに、本発明は、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットタンパク質をコードする新規なDNAとβユニットタンパク質をコードする新規なDNA、ならびにこれら新規なDNAによりコードされるタンパク質にも関する。
さらに、本発明は、上記の本発明DNAを外来遺伝子として導入された宿主微生物を利用して、その菌体をD−ミオ−イノシトールに作用することによってD−ミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールを製造する方法も包含する。さらにまた、本発明は、前記の本発明DNAとストリジェントな条件でハイブリダイズする改変DNAを包含する。また本発明は前記の新規なDNA、またはその一部からなるDNAをPCR法のためのプローブまたはプライマーとして用いる、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAのクローニング方法を包含する。
背景技術
D−キロ−イノシトールは、経口投与可能な化合物で、細胞内情報伝達を活性化するイノシトール脂質系に作用して、II型糖尿病の治療(特表平4−505218号)、および、多嚢胞性卵巣症候群の治療(USP5906979号;The New England Journal of Medicine、J.E.Nestler et al.、1999年、340巻、1314頁)に医療効果をもたらすことが提唱されている治療剤である。D−キロ−イノシトールは、機能的には広範な代謝系疾患に関与すると考えられ、今後その適応が拡大する可能性が期待される物質である。
D−キロ−イノシトールは、9種類あるイノシトール立体異性体の一つであり、その製造方法は、これまで、抗生物質であるカスガマイシンを加水分解し、製造する方法(USP5091596号、USP5463142号、USP5714643号)、またマメ科植物に含有されるD−ピニトールを加水分解し、製造する方法(USP5827896号)、さらに有機合成により製造する方法(USP5406005号、WO96/25381号)、その他が知られる。
しかしながら、カスガマイシンやD−ビニトールを出発原料とする場合、これらの物質が高価であり、また、有機合成により製造する場合も収率および光学純度が低く、最終産物であるD−キロ−イノシトールは高価なものになる。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・ラジオバクター、アグロバクテリウム・リゾゲネスまたはアグロバクテリウム・ルビの細菌をミオ−イノシトールに作用させて、これから、D−キロ−イノシトール、L−キロ−イノシトール、シロ−イノシトール、ネオ−イノシトールの混合物を製造する方法も知られる(特開平9−140388号)。この方法では、4種のイノシトール立体異性体の混合物が生成するため、そして特にD体とL体との分離が困難であるので精製操作が煩雑であり、単離されたD−キロ−イノシトールの最終的な収率は1%以下の低収率である。
ミオ−イノシトールは、次式
で示される化学構造を有する。なお、式(A)ではD−ミオ−イノシトールとして炭素番号を付けてある。D−キロ−イノシトールは次式(B)
で示される化学構造を有する。D−ミオ−イノシトールとD−キロ−イノシトールとは、エピマーの関係にある。
先に、ミオ−イノシトールにアグロバクテリウム・エスピーAB10121株(FERM BP−7679として寄託中)の菌体またはその菌体破砕物を作用させて、ミオ−イノシトールをD−キロ−イノシトールへ変換させることを特徴とする、D−キロ−イノシトールの製造方法が提案された(日本特願平11−179796号、1999年6月25日出願)。しかし、この方法では、ミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールへの変換率が良くなく、また所望のD−キロ−イノシトールの精製品の収率も満足できないという不都合がある。
発明の開示
本発明者らは、D−ミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールの製造に1−エピメラーゼ酵素を直接に用いる反応により、より効率的であり且つ副生物のないD−キロ−イノシトールの製造が可能であると考えた。そこで、1−エピメラーゼ酵素を用いてD−キロ−イノシトールを製造する方法を検討した。このような作用の1−エピメラーゼ酵素を有する微生物として、土壌より単離した前記のアグロバクテリウム・エスピーAB10121株が、D−ミオ−イノシトールを基質として利用してD−キロ−イノシトールを生成する酵素活性を有するD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼを産生することが見出された。また、本菌株からD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼを単離する研究を行った。
前記のアグロバクテリウム・エスピーAB10121株から新規酵素としてD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼを得ることに成功した(後記の実施例1参照)。この酵素は、D−ミオ−イノシトールを1−エピ化によりD−キロ−イノシトールに変換する酵素活性と、D−キロ−イノシトールを6−エピ化によりD−ミオ−イノシトールに変換する酵素活性を有することが見出された。しかも、本発明者らにより、この酵素、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼは、次の諸性質を有すると認められた。
(1)基質特異性:D−キロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールの異性化(エピ化)を触媒する酵素活性または作用を有する
(2)補酵素特異性:酵素活性の発現に補酵素としてNAD+またはNADP+を要求する
(3)Km値:D−キロ−イノシトールでは56mM、ミオ−イノシトールでは17mMである
(4)分子構造と分子量:本酵素は、補酵素を結合するβユニットと、補酵素を結合しないαユニットとが1:1に結合するサブユニット構造を持ち、前記の両ユニットの共存下に酵素活性を有する。補酵素を結合するβユニットの分子量はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定で35,000〜37,000ダルトンであり、補酵素を結合しないαユニットの分子量はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定で27,000〜29,000ダルトンである
(5)至適pH:25℃で、pH8.5から9.0の範囲にある
(6)温度安定性:pH7.0で10分間保持したとき、補酵素を結合するβユニットは約40℃までの温度で安定である。補酵素を結合しないαユニットは約30℃までの温度で安定である
(7)金属塩の影響:Mn2+およびMg2+の存在下に酵素活性は増強される。Cu2+またはNi2+の存在下では酵素活性は阻害される。
この新規酵素は、上記のようにD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼと命名されたが、D−ミオ−イノシトールを1−エピ化する酵素活性より強い、D−キロ−イノシトールを6−エピ化する活性を有することから、D−キロ−イノシトール 6−エピメラーゼと称することもできる。
本発明の第1の目的は、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株の菌体から前記のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼを酵素工学的手法により単離、精製し、精製されたD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの酵素学的性質を明らかにさせ、しかもまた前記のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼをコードする遺伝子を遺伝子工学的な手法で収得し、そしてこの遺伝子のDNA配列を解明することにある。
本発明の第2の目的は、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼをコードし得る新規なDNAまたはこれの改変DNAを提供し、またその新規なDNAを内部DNA領域として含有して、前記の1−エピメラーゼをコードすることのできる新規なDNA断片を提供することにある。本発明の別の目的は、本発明で得られた新規なDNAを利用して、D−ミオ−イノシトールをD−キロ−イノシトールに変換する方法を提供することにある。本発明のその他の目的は、次の記載から明らかとなるものである。
本発明者らは、上記の課題を解決するために一連の研究を行った。先ず、前記のAB10121株からD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼを酵素工学的方法により単離して精製する研究を行い、本酵素の単離、精製に成功した。さらに該AB10121株の菌体の染色体DNAから、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼをコードする遺伝子DNAを分離する研究を行った。その研究の一つの過程において、後記に詳しく説明される遺伝子工学的方法に従って、AB10121株の染色体DNAをテンプレートとして用い且つ適当に設計されたプライマーDNAとして後記のプライマーAepi−1FおよびAin−2Rを用いるPCR法を採用すると、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的DNA配列を含有する約700 bpのDNA断片−Aが得られることを見出し、またこのことに成功した。また、適当に設計されたプライマーDNAとして後記のプライマーBepi−1FおよびBin−2Rを用いるPCR法を採用すると、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニット遺伝子の部分的DNA配列を含有する822 bpのDNA断片−Bが得られることを見出し、またこのことに成功した。
前記のDNA断片−AとDNA断片−Bとの塩基配列を解析して決定することによって、前記のαユニット遺伝子の部分的DNA配列の塩基配列と、前記のβユニット遺伝子の部分的DNA配列の塩基配列とが解明された。
αユニット遺伝子の解明された部分的DNA配列の塩基配列を参考にして工夫、設計された後記の2種のプライマーAepi−4FおよびAepi−3Rを作製した。これら2種のプライマーを用いて且つ前記のAB10121株染色体DNAをテンプレートとして用いて、リバースPCR法(細胞工学、14巻、p591−593、1995年、参照)を行った。このことによって、約2.5 kbpのDNA断片−Cを得ることに成功した。このDNA断片−Cの塩基配列を解析し、DNA断片−CとDNA断片−Aの塩基配列のデータと組合せることにより、配列表の配列番号1に示された2581 bpの塩基配列には、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニット遺伝子とαユニット遺伝子が含まれていると判明した。
他方、前述したβユニット遺伝子の解明された部分的DNA配列の塩基配列を参考にして工夫、設計された後記の2種のプライマーBepi−4FおよびBepi−3Rを作製した。これら2種のプライマーを用いて且つ前記のAB10121株染色体DNAをテンプレートとして用いて、リバースPCR法を行った。このことによって、約2.5 kbpのDNA断片−Dを得ることに成功した。
このDNA断片−Dの塩基配列を解析し、DNA断片−Bの塩基配列を組合せることにより、前記のDNA断片−CとDNA断片−Aを組合せた場合と全く同じ塩基配列を有することが認めらた。
配列表の配列番号1のコード領域を、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの化学分析で解明された部分的なアミノ酸配列と比較して研究した。その結果、配列表の配列番号1の塩基配列の内部には、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットをコードする2つの遺伝子の全塩基配列が含有されると判明した。
更に、配列表の配列番号1の塩基配列中のコードDNA領域を参考にして後記の2種のプライマーBepi−8FおよびAepi−6Rを作製した。これら2種のプライマーを用いて且つ前記AB10121株の染色体DNAをテンプレートとして用いてPCR法を行った。これによって、1932 bpの塩基配列より成るDNA断片−Eを得ることに成功した。
配列表の配列番号1の塩基配列を調べると、この塩基配列には、2つのコード領域が含まれていることが認められ、その5’側にある上流の第1のコード領域は、配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列をコードしていること、および第1のコード領域の3’側に続く数個の塩基(GGTCTTTC)よりなるDNA配列を介して、下流にある第2のコード領域は、配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列をコードしていることが判明した。
さらに、上記の第1のコード領域でコードされるアミノ酸配列(配列番号2)をもつポリペプチドは、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニットのタンパク質であること、また上記の第2のコード領域でコードされるアミノ酸配列(配列番号3)をもつポリペプチドは、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼαユニットのタンパク質であることが本発明者によって決定された。
さらに前記の1932 bpのサイズを有するDNA断片−Eは、これの塩基配列を解析すると、前記の2581 bpのサイズの配列番号1の塩基配列の464番目の塩基Aから2394番目の塩基Gに至る1931 bpのサイズのDNA配列と5’側末端の塩基1個とを含有することが認められ、従って、1932 bpのDNA断片−Eは、前記の2581 bpのサイズのDNA断片と共通して、配列表の配列番号2のアミノ酸配列をコードする第1のコードする領域と、それに続くDNA配列と、これに続く第2のコード領域、すなわち配列番号3のアミノ酸配列をコードする第2のコード領域とを含有することが解明された。
上記の1932 bpのサイズのDNA断片−Eをプラスミドベクターに連結し、この連結されたDNAとしてのプラスミドで大腸菌を形質転換し、得られた大腸菌形質転換株の菌体を外来遺伝子の発現の誘導のための処理にかけた。そのように処理された大腸菌形質転換株の菌体を培養すると、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼに相当するタンパク質を産生できることが確認できた。さらに、そのように処理された大腸菌形質転換株の菌体をD−ミオ−イノシトールに作用させると、D−キロ−イノシトールを生成できること、またD−キロ−イノシトールに作用させると、D−ミオ−イノシトールを生成できることが確認された。
こうして、本発明者らによって今回、得られた前記の2581 bpのサイズのDNA断片−CとDNA断片−Aを組合せた塩基配列および1932 bpのサイズのDNA断片−Eは、ともに、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼをコードする遺伝子に相当するDNA配列を内部に含有することが確認された。前記に示したように本発明者により見出された諸知見に基づいて、本発明は完成された。
従って、第1の本発明においては、D−ミオ−イノシトールを1−エピ化によりD−キロ−イノシトールに変換する酵素活性とD−キロ−イノシトールを6−エピ化によりD−ミオ−イノシトールに変換する酵素活性とを有するD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニットタンパク質を構成するところの配列表の配列番号2に示されたアミノ酸配列をコードするDNA領域(i)と、前記D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットタンパク質を構成するところの配列表の配列番号3に示されたアミノ酸配列をコードするDNA領域(ii)とから成るDNAが提供される。
第1の本発明によるDNAは、配列表の配列番号2のアミノ酸配列をコードするDNA領域(i)としての、配列表の配列番号1に示される2581 bpのサイズの塩基配列の587番目の塩基Aから1594番目の塩基Gに至る1008 bpのサイズのDNA配列と、配列表の配列番号3のアミノ酸配列をコードするDNA領域(ii)としての、配列表の配列番号1に示される2581 bpのサイズの塩基配列の1606番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る783 bpのサイズのDNA配列とを含有することを特徴とする、DNAであることができる。
第2の本発明においては、第1の本発明のDNAを内部DNA領域として含有するDNA断片であって、配列表の配列番号1に記載される2581 bpのサイズの塩基配列の464番目の塩基Aから2394番目の塩基Gに至る1932 bpのサイズの塩基配列を有することを特徴とする、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの各遺伝子を内部に含有するDNA断片が提供される。
第3の本発明においては配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列をコードするDNAであって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニットのタンパク質をコードするDNAが提供される。
第4の本発明においては、配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列をコードするDNAであって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼαユニットのタンパク質をコードするDNAが提供される。
第5の本発明においては、配列表の配列番号1に記載される2581 bpのサイズの塩基配列の587番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る1802bpのサイズの塩基配列をもつDNAによってコードされるタンパク質であって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの酵素活性を有するタンパク質が提供される。
第5の本発明のタンパク質は、配列表の配列番号2に示される336個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列と、配列番号3に示される261個のアミノ酸によりなるアミノ酸配列とを含有する、タンパク質であることができる。
第6の本発明においては、配列表の配列番号1に記載される2581 bpのサイズの塩基配列の587番目の塩基Aから1594番目の塩基Gに至る1008 bpのサイズのDNAによってコードされるタンパク質であって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニットの活性を有するタンパク質が提供される。
また、第7の本発明においては、配列表の配列番号1に記載される2581bpのサイズの塩基配列の1606番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る783bpのサイズのDNAによってコードされるタンパク質であって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼαユニットの活性を有するタンパク質が提供される。
さらに、第1の本発明のDNAを得るためにPCR法でテンプレートとして使用されるDNA染色体を有して、しかもD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ産生能を有する微生物の具体例は、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株(FERM BP−7679の受託番号で寄託中)である。本菌株の菌学的性質は次の通りである。
尚、本菌株の同定の当たっては、新細菌培地学講座(第2版、近代出版)、医学細菌同定の手引き(第2版、近代出版)、細菌学実習提要(丸善)に準じて実験を行い、実験結果をBergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1(1984)を参考にして同定した。
(AB10121株の菌学的性質)
(a)形態的特徴
(1)細胞形態:桿菌で大きさは0.5〜0.7×0.9〜2.8μm。多形性は無い。
(2)運動性:懸滴法及びSIM培地での観察の結果、運動性は認められなかった。
(3)普通寒天培地上での生育状態:生育は中程度。コロニー形態は円形、平滑で光沢を帯びる。
以上の通り、AB10121株の主性状は、グラム陰性の桿菌で、大きさは0.5〜0.7×0.9〜2.8μmである。グルコースを好気的に分解し、酸を生成する。カタラーゼ、オキシダーゼ、3−ケトラクトン酸テストに陽性であった。これらの菌学的性質を総合して検索した結果、本菌株はアグロバクテリウム属に属する菌株であると判断した。Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1(1984)244頁−254頁によると、アグロバクテリウム属細菌は4種に分類されているが、AB10121株はいずれの種とも、その菌学的性質において完全には合致しなかった。従って、本菌株を公知のものと区別するため、アグロバクテリウム・エスピー(Agrobacterium sp.)AB10121と命名し、1999年5月7日に工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−17383として寄託された。工業技術院生命工学工業技術研究所は2001年に独立行政法人産業技術総合研究所に編入されたので、該AB10121株は、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6に在る独立行政法人 産業技術総合研究所にブダペスト条約の規約下に2001年7月30日に移管寄託され、FERM BP−7679の受託番号で同研究所に寄託されている。
第1の本発明のDNAはD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼをコードする遺伝子であり、第1の本発明のDNAは、その遺伝子の由来に関わらずD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼをコードでき、好適には、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来の遺伝子であるDNAであることができる。第1の本発明のDNAの使用形態は、このDNAを組み込んだ微生物を構築し、そのDNAを発現させて、そのコードするD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼを生成、機能させることである。
第1の本発明のDNAは、該DNAを導入された宿主の菌のプラスミドおよび染色体上のいずれに存在していてもかまわない。第1の本発明のDNAでコードされるタンパク質を発現させるための宿主・ベクター系は、この遺伝子が安定に維持され発現される宿主・ベクター系であればいずれの宿主・ベクター系でもかまわないが、好適には宿主として大腸菌JM109株、またベクター系としてはpUC18を挙げることができる。
さらに第1の本発明のDNAには、前記DNAだけでなく、それらの改変DNA体であって、前記DNAに対して、一定のハイブリダイゼーション条件下、例えば、60℃で2×SSC(標準クエン酸食塩水)中、好ましくは60℃で0.5×SSC中、特に好ましくは60℃で0.2×SSC中のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする改変DNA体も包含される。このような改変DNA体のより具体的なものとして、以下のようなものが挙げられる。
前記のエピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの改変体は、配列表の配列番号1における587番目の塩基から2388番目の塩基にいたる塩基配列に対して少なくとも55%、好ましくは70%、さらに好ましくは95%の相同性を示すものである。このようなDNA改変体は、前記塩基配列の、それぞれ、5′末端もしくは3′末端においてまたはその途中において塩基が除去または付加されたもの、あるいは塩基の一部が他の塩基により置換されているものを含む。この塩基の一部が他の塩基により置換されているDNA改変体には、同一のタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重に伴い、前記DNAと異なる塩基配列を有するものも含まれる。
遺伝暗号の縮重に伴うもの以外の塩基の置換は、それぞれ、前記各DNAがコードする推定アミノ酸配列を参照し、各アミノ酸に由来する側鎖の類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、大きさなどを基準に、タンパク質全体として類似の形状を有するように行うのがよい。前記のDNA改変体は、第1の本発明の前記DNAと同等の機能をもつDNA、すなわちD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードしているものが、相当高い確率で得られると推定される。
このような本発明のDNA改変体は、前記各DNAの塩基配列またはそれらによりコードされる推定アミノ酸配列を参考に、核酸合成機を用いて合成するか、あるいは、自体既知の点突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発により作成することができる。
従って第8の本発明においては、配列表の配列番号1に記載される2581bpのサイズの塩基配列の587番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る1802bpのサイズの塩基配列をもつDNAにおける1個もしくは数個の塩基が欠失、置換および(または)付加されることで形成された改変DNAであって、前記の1802bpのサイズの塩基配列をもつDNAに対してストリジェントな条件でハイブリダイズすることができ且つD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの酵素活性をもつタンパク質をコードする改変DNAが提供される。
第8の本発明の改変DNAは、配列表の配列番号1に記載される2581 bpのサイズの塩基配列の587番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る1802bpのサイズの塩基配列をもつDNAにおける692番目の塩基Gが塩基Aにより置換されることにより形成された改変DNAである改変DNAであることができる。
また、第8の本発明の改変DNAは、配列表の配列番号1に記載される2581 bpのサイズの塩基配列の587番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る1802 bpのサイズの塩基配列をもつDNAによりコードされるところの、配列番号1に記載の合計597個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列における36番目のアミノ酸、バリンがイソロイシンにより置換されることにより形成された組換タンパク質であって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの酵素活性をもつ組換タンパク質をコードする改変DNAであることもできる。
さらに第9の本発明では、第1の本発明のDNA、あるいは該DNAの一部からなるDNAを、PCR法のためのプローブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAのクローニング方法が提供される。
さらに、第10の本発明によると、制限酵素EcoRIとBamHIで消化されたプラスミドベクターpUC18のDNAの切断断片に対して第2の本発明による1932 bpのサイズの塩基配列(すなわち配列番号1の塩基配列の464番目のAから2394番目のGに至るDNA領域)を有して且つD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのα、βユニットの遺伝子を内部に含有するDNA断片を連結してなるプラスミドを導入することにより形質転換された宿主微生物を作成し、この形質転換した宿主微生物を培養して宿主菌体内に導入した遺伝子を発現させ、このように遺伝子を発現させた形質転換宿主微生物の菌体を、緩衝液または培地中でD−ミオ−イノシトールに作用させてD−キロ−イノシトールを生成することから成る、D−キロ−イノシトールの製造法が提供される。ここで用いられる宿主微生物は、導入された外来遺伝子を発現できる能力を持つ微生物であり、例えば細菌、特に大腸菌であることができる。
第10の本発明方法において、配列表の配列番号1の塩基配列の464番目の塩基Aから2394番目の塩基Gに至る1931 bpのサイズの塩基配列を有する第2の本発明のDNA断片を、プラスミドベクターpUC18のEcoRI−BamHI消化断片に連結してなるプラスミドが使用される。このプラスミドの導入により形質転換される宿主微生物は大腸菌例えば大腸菌JM109株であるのが好ましい。
次に、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株(FERM BP−7679として前記の産業技術総合研究所に寄託中)の菌体からD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットタンパク質およびβユニットタンパク質をそれぞれ単離して精製する方法、ならびに前記のαユニットタンパク質およびβユニットタンパク質の部分アミノ酸配列を決定する方法、さらには該D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットタンパク質およびβユニットタンパク質を各々コードするαユニット遺伝子およびβユニット遺伝子を内部に含有する2581 bpのサイズのDNA断片を収得する方法の概要を説明する。これらの方法の各段階の詳細は後記の実施例1〜3に記載される。
(1)アグロバクテリウム・エスピーAB10121株からのD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの単離と精製
前記AB10121株からD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの単離と精製のためには、常法に従って、AB10121株の菌を適当な条件下で液体培養し、その培養液を遠心分離、またはろ過などの手段によって、固液分離し、上清濾液ならびに湿菌体を採取する。分離した菌体は、超音波破砕、フレンチプレス、ダイノミールなどの種々の破砕手段を用いて破砕するか、あるいは、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて細胞抽出液の形にして酵素液とする。このようにして採取される上清濾液あるいは酵素含有溶液は、次に、通常用いられている酵素の精製手段によって精製される。例えば、塩析、除核酸、イオン交換クロマトグラフィー、疎水結合クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティーカラムクロマトグラフィーなどにかけることによって、酵素の精製を行うことができる。これにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動でほぼ単一なバンドを示す精製D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼを得ることができる。
(2)酵素活性の測定方法
本酵素を単離して精製する方法において、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの酵素活性を測定するためには、1.0Mリン酸緩衝液(pH8.5)0.13ml、D−キロ−イノシトール 18mg、NAD+ 0.75mg、8mg/ml DCIP(2,4−ジクロロインドフェノール)0.3ml、250単位/mlジアホラーゼ(オリエンタル酵母社製、EC1.6.99.2)6μlにD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ酵素の溶液を加えて全容を1.0mlとする。得られた混合液を、25℃に保って、16時間反応させた後、反応液に強塩基性イオン交換樹脂と強酸性イオン交換樹脂を各200mg加え、30分間静置する。その後に、15,000×gで遠心し、上清をHPLCにより分析する。HPLCは、Wakosil 5NH2カラム(ID4.6mm、長さ250mm)を用いて、40℃で、移動相として80%アセトニトリルを流速2ml/minで流して行い、RI検出器で溶出液中のイノシトール含量を検出する。このHPLC条件において、16時間で70nモルのD−キロ−イノシトールを異性化して、D−ミオ−イノシトールを生成する酵素量を、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの1単位とした。
(3)D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの部分アミノ酸配列の決定
前記のとおり精製品として得られたD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼを用いると、エドマン分解法によりN末端アミノ酸配列を決定することができる。また、内部アミノ酸配列の決定は、本精製酵素をペプシンにより加水分解し、HPLCでペプチドフラグメントを単離し、このペプチドフラグメントを用いて、エドマン分解法による内部アミノ酸配列を決定することができる。この方法の各段階の詳細は後記の実施例1に記載される。
(4)アグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAの調製
培地でAB10121株を培養する。得られた培養液を遠心して菌体を集める。その菌体からBlood & Cell Culture kit(QIAGEN社)を用いて染色体DNAを調製する。
すなわち、AB10121株菌体をB1緩衝液に懸濁し、リゾチーム、RNaseA、プロテイナーゼKのそれぞれの酵素を添加し、保温して溶菌する。得られた反応混合物にB2緩衝液(3Mグアニジンチオシアン酸塩、20%Tween−20、pH5.5)を添加し保温しタンパク質を変性させる。得られた変性反応溶液をフェノール抽出し、このフェノール抽出を数回行う。クロロホルムで抽出後に、クロロホルム抽出液に、3M酢酸ナトリウムを加えてからエタノールを加えて染色体DNAを沈殿させる。沈澱させたDNAを乾燥後、TE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解して保存する。この染色体DNAは次のPCRでテンプレートとして用いる。
(5)D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的配列のクローニング
(i)アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来D−ミオ−イノシトール1−エピメラーゼαユニットタンパク質の遺伝子の一部をPCR法(Polymerase Chain Reaction法)にて部分的にクローニングするための操作を次のように行う。
前述のαユニットのタンパク質の化学分析で判明したN末端アミノ酸8残基の配列Met Arg Phe Ala Ile Asn His Ileと、ペプシン分解内部ペプチドのアミノ酸8残基の配列Ala Ala Gly Tyr Lys Gly Pro Tyrに対応する以下のようなプライマーを設計し作製する。
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために以下に示す混合塩基あるいはイノシンを使用する。
プライマーAepi−1Fの塩基配列は後記の配列表の配列番号4に下記のとおり示され、また、プライマーAepi−2Rの塩基配列は配列表の配列番号5に下記のとおり示される。
Aepi−1Fはαユニットタンパク質のN末端アミノ酸8残基を順方向にコドンに変換したものであり、Ain−2Rはペプシン分解物である内部ペプチドのN末端アミノ酸8残基のコドンの相補鎖を逆向きに並べたものである。この2種類のプライマーおよびテンプレートとしての染色体DNAを用いてPCRを行うと、両端にこれらの配列を持つDNA断片が特異的に増幅される。
上記のプライマー2種(Aepi−1FおよびAin−2R)と前項(4)で得たアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAをテンプレートとして用いてPCRを行なう。上記のPCR反応によって、約700 bpの大きさのDNA断片(以下、DNA断片−Aと称する)が増幅される。このDNA断片−Aはαユニット遺伝子の一部分である可能性が高い。PCR増幅した反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて分画する。この約700 bpの大きさのDNA断片(DNA断片−A)をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出によりDNAを精製し、エタノール沈澱して回収する。乾燥させたDNAをTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解させて保存する。
(ii)このPCR増幅させたDNA断片−AをPCR産物のクローニングベクターであるpT7Blue T vectorにクローニングする。プラスミドベクターpT7Blue T vector(Novagen社)にDNA Ligation kit ver.2(宝酒造)によりDNA断片−Aを連結し、得られた連結DNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換する。すなわち、精製したPCR増幅DNA断片−Aの溶液とpT7Blue Tベクター溶液を混合し、等量のDNA Ligation kit ver.2のSolution Iを加え、ベクターDNAとDNA断片−Aとの連結反応を行う。こうして得られた連結DNAの溶液と、大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合し、大腸菌にプラスミドを導入させる。
その後、SOC培地を加えて、37℃で1時間大腸菌を振とう培養する。この培養液を、アンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml)、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)を含むLB寒天培地に塗布する。さらに37℃、16時間培養する。この培養により白色に発色したコロニーとして、前記のプラスミドの導入で形質転換された大腸菌が得られるため、これを選択する。こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml)を含むLB液体培地で培養する。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット(QIA filter Plasmid Midi Kit、QIAGEN社)によりプラスミドDNAの分離および精製を行う。こうして得られたプラスミドDNAに挿入されたDNA配列は、目的とするエピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的配列を有する約700bpのDNA断片−Aであることが後記の塩基配列解析から確認された。
(6)クローニングされたDNA断片−Aの塩基配列解析
前項(5)(ii)でクローニングされたプラスミド中のDNA挿入断片の全遺伝子配列を解析する。アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットタンパク質遺伝子の部分配列に該当すると判定されるDNA配列の塩基配列を決定した。
塩基配列解析の結果、PCR増幅されたDNA断片−Aは電気泳動で約700 bpと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には693 bpであることが明らかとなった。693 bpの塩基配列のコード領域をコドンとしてアミノ酸に置換したところ1種のオープンリーディングフレームに翻訳することができた。
DNA断片−Aとしてクローニングした693 bpのDNA配列をアミノ酸へ置換したところ、N末端アミノ酸配列の9番目から15番目の配列はThr Ala Pro Ala Leu Ser Leuであることが判った。これはアグロバクテリウム・エスピーAB10121株から分離および精製したD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ αユニットタンパク質のN末端アミノ酸配列解析から得られた結果と一致しており、従って、クローニングした693 bpのDNA配列はアグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ αユニット蛋白質をコードする遺伝子の一部分であることが明らかとなった。
(7)D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニット遺伝子の部分的配列のクローニング
(i)前項(5)(i)で示したαユニット遺伝子の一部分のクローニングと同じ手法を用いて、β遺伝子の部分的配列をクローニングするためにアグロバクテリウム・エスピーAB10121株から直接に分離および精製されているD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニットタンパク質のN末端アミノ酸8残基Thr Val Lys Ile Gly Val Ile Glyとペプシン分解内部ペプチドのアミノ酸7残基Thr Asp Trp Lys Asp Arg Pheから以下のようなプライマーBepi−1FおよびBin−2Rを設計し作製する。
コドンの揺らぎは混合塩基あるいはイノシンを使用した。
プライマーBepi−1Fの塩基配列は後記の配列表の配列番号6に下記のとおり示され、また、プライマーBepi−2Rの塩基配列は配列表の配番号7に下記のとおり示される。
Bepi−1Fはβユニットタンパク質のN末端アミノ酸8残基を順方向にコドンに変換したものであり、Bin−2Rはペプシン分解物である内部ペプチドのN末端アミノ酸8残基のコドンの相補鎖を逆向きに並べたものである。この2種類のプライマーでPCRを行うと、両端にこれらの配列を持つDNA断片が特異的に増幅してくる。
上記のプライマー2種(Bepi−1FおよびBin−2R)と前記の(4)項で得たアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAをテンプレートとして用いてPCRを行なう。
上記のPCR反応によって約800 bpの大きさのDNA断片(以下、DNA断片−Bと称す)が増幅するが、このDNA断片−Bはβユニット遺伝子の一部分である可能性が高い。このPCR増幅反応液をアガロースゲル電気泳動法により分画する。その後、上記の約800 bpの大きさのDNA断片(DNA断片−B)をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出によりDNAを精製し、エタノール沈澱させる。精製したDNA断片−BをTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解して保存する。
(ii)このPCR増幅されたDNA断片−BをPCR産物クローニング用のプラスミドベクターpT7BlueT vectorにクローニングする。すなわちプラスミドベクターpT7Blue T vectorにDNA断片−BをDNA Ligation kit ver.2(宝酒造)を用いて連結し、大腸菌JM109株を形質転換した。すなわち、精製したPCR増幅DNA(DNA断片−B)溶液とpT7Blue Tベクター溶液を混合し、等量のDNA Ligation kit ver.2のSolution Iを加え、一晩保温して、ベクターDNAとDNA断片−Bとの連結反応を行う。こうして得られた連結DNAの溶液と大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合してプラスミドを大腸菌に導入させる。
その後、SOC培地を加えて、大腸菌を振とう培養する。この培養液をアンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml)、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)を含むLB寒天培地に塗布し、培養する。この培養により、白色に発色したコロニーとして前記の組換えプラスミドの導入で形質転換した大腸菌が得られるから、これを選択して分離する。
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml)を含むLB液体培地で培養する。増殖した形質転換大腸菌菌体からプラスミド精製キット(QIA filter Plasmid Midi Kit,QIAGEN社)によりプラスミドDNAを分離および精製する。こうして得られたプラスミドに挿入されたDNA配列は、目的とするエピメラーゼβユニット遺伝子の部分的配列を含有するDNA断片−Bであり、PCR反応で増幅された約800 bpのDNA断片と考えられた。
(8)クローニングされたDNA断片−Bの塩基配列解析
前項(7)(ii)でクローニングされたプラスミドDNAの中の挿入DNA断片の全塩基配列を解析した。これにより、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニットタンパク質遺伝子の部分配列に該当すると判定できるDNA配列の塩基配列を決定した。
この塩基配列解析の結果、クローニングされた822 bpのDNA断片−Bの塩基配列が明らかとなった。この822 bpのDNA配列のコード領域をアミノ酸に置換したところ1種のオープンリーディングフレームに翻訳することができた。クローニングされた前記の822 bpのDNA配列の両端には前記のPCRの時に使用した2種類のプライマーの配列が見い出されたので、前記のPCR反応ではDNA断片−Bがこの2種類のプライマー特異的に増幅したことが明らかとなった。
クローニングした822 bpのDNA配列をアミノ酸へ置換したところ、N末端アミノ酸配列の9番目から15番目の配列はThr Gly Ala Ile Gly Arg Aspであり、これはアグロバクテリウム・エスピーAB10121株から分離、精製したD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニットタンパク質のN末端アミノ酸解析から得られた結果と一致しており、DNA断片−BとしてクローニングしたDNA配列はアグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ βユニットタンパク質をコードする遺伝子の一部分であることが明らかとなった。
(9)アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの両方をコードする遺伝子を内部に含有するDNA断片のクローニングと、それの全DNAの塩基配列解析
前記のようにして、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的配列およびβユニット遺伝子の部分的配列が決定されたので、インバースPCR法(細胞工学14巻、P.591−593、1995年)によって、クローニング断片の上流、下流域に広がるαユニットあるいはβユニットの全DNA塩基配列を増幅、クローニング、配列解析する。すなわち、すでに前述のクローニングしたDNA断片−Aまたは−Bを切断しないような制限酵素を選択して用いて染色体DNAを切断し、その切断断片の両端を連結して環状化する。次に、クローニングしたDNA断片の両端方向(外側)に向かってプライマーをそれぞれ設計してPCR反応にかけると、クローニングされていない上流、下流に連続して存在する未知領域が、テンプレートが環状化しているために増幅される。すなわち、たとえばアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAのαユニットタンパク質の部分的DNA配列をもとにして、その上流、下流領域の配列を決定することができる。
(i)具体的には、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNA(前記の(4)参照)をH緩衝液(50mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、100mM NaCl)中で制限酵素EcoRIで完全に消化する。得られたEcoRI切断DNA断片をフェノール抽出、クロロホルム抽出を行いDNAを精製し、エタノール沈澱後、TE緩衝液にDNAを溶解する。このDNA溶液をDNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)のSolution Iと等量ずつ混合し、保温してDNA断片を自己環状化させる。フェノール抽出、クロロホルム抽出を行い精製する。エタノール沈澱で再びDNAを回収後、TE緩衝液に溶解し、これをテンプレートとして次のPCR反応に用いる。
(ii)他方、αユニット遺伝子の部分配列から、以下のようなプライマーAepi−4FおよびAepi−3Rを設計し作製する。
プライマーAepi−4Fの塩基配列は後記の配列表の配列番号8に示され、また、プライマーAepi−3Rの塩基配列は配列表の配列番号9に示される。
(iii)次に、上記のプライマー2種すなわちAepi−4FおよびAepi−3Rを用いて、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAを制限酵素EcoRIで消化した後に自己環状化したDNA自己環状化物をテンプレートとして用いてPCR反応を行なう。
この結果、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株の染色体DNAのEcoRI消化、自己環状化物をテンプレートとしてで約2.5 kbpのDNA増幅断片(以下、DNA断片−Cと称す)が得られる。
上記のPCR反応によって約2.5 kbpの大きさのDNA断片(DNA断片−C)が増幅したが、これは、αユニット遺伝子のDNA配列およびその上流と下流領域を含むDNA配列を有するDNAである可能性が高い。
このPCR増幅反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて分画する。約2.5kbpの大きさのDNA断片をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノール沈澱する。得られた精製品のDNA断片−CをTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解して保存する。
(iv)このPCR増幅したDNA断片−CをPCR産物用のクローニングベクターであるpT7BlueT vectorにクローニングする。プラスミドベクターpT7Blue T(Novagen社)にDNA断片−CをDNA Ligation kit ver.2(宝酒造)を用いて連結する。すなわち、精製したPCR増幅DNA断片−Cの溶液とpT7Blue Tベクター溶液を混合し、等量のDNA Ligation kit ver.2のSolution Iを加え、ベクターDNAとDNA断片−Cとの連結反応を行う。こうして得られた連結DNA溶液と大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合し、氷中で30分間、42℃で40秒間、さらに氷中で2分間静置する。その後、SOC培地を加えて、大腸菌を振とう培養する。
この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml)、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)を含むLB寒天培地に塗布し、培養する。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択して分離する。
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml)を含むLB液体培地で培養して増殖した大腸菌菌体からプラスミド精製キット(QIA filter Plasmid Midi Kit,QIAGEN社)によりプラスミドDNAを精製する。
(v)DNA断片−C(約2.5 kbのサイズ)の塩基配列の解析
前項(iv)でクローニングにより得られたプラスミドの中の挿入DNAの塩基配列をDNA塩基配列解析装置により解析した。これによって、前述のプラスミドDNAの全塩基配列を決定することができた。前記の約2.5 kbpのDNA断片−CとDNA断片−Aの塩基配列を組合せることにより、後記の配列表の配列番号1に示された2581 bpの塩基配列には、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニット遺伝子とαユニット遺伝子が含まれていることが判明した。
(vi)前項(i)に示したと同様にしてアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAを制限酵素EcoRIで完全に消化する。得られたEcoRI切断断片をDNAリガーゼによって自己環状化させ、これをテンプレートとして用いる。別途、βユニット遺伝子の部分配列を参考として、以下のような2方向に外向きのプライマーBepi−4FおよびBepi−3Rを設計、作製する。
プライマーBepi−4Fの塩基配列は後記の配列表の配列番号10に示され、また、プライマーBepi−3Rの塩基配列は配列表の配列番号11に示される。
(vii)これらプライマー2種と前記で得られたアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAを制限酵素EcoRIで消化した後に自己環状化したDNAをテンプレートとして用いてPCRを行なう。
この結果、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAのEcoRI消化、自己環状化物をテンプレートとしたPCR法により、約2.5 kbpのDNA増幅断片(DNA断片−Dと称す)が得られる。
上記のPCR反応によって約2.5 kbpの大きさのDNA断片(DNA断片−D)が増幅するが、これは、βユニット遺伝子のDNA塩基配列の未決定のDNA領域およびその周辺領域を含むDNAである可能性が高い。
このPCR増幅反応液をアガロースゲル電気泳動法により分画する。約2.5kbpの大きさのDNA断片(DNA断片−D)をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノール沈澱する。得られた精製品のDNA断片−DをTE緩衝液に溶解して保存する。
(viii)このPCR増幅されたDNA断片−Dの塩基配列を解析するために、まずDNA断片−Dのクローニングを行う。すなわち、プラスミドベクターpT7Blue T(Novagen社)にDNA Ligation kit ver.2(宝酒造)によりDNA断片−Dを連結する。すなわち、PCR増幅したDNA断片−Dの精製品の溶液とpT7Blue Tベクター溶液を混合し、等量のDNA Ligation kit ver.2のSolution Iを加え、保温して、ベクターDNAとDNA断片−Dとの連結反応を行う。
こうして得られた連結DNA溶液と大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合し、氷中で30分間、42℃で40秒間、さらに氷中で2分間静置する。その後、SOC培地を加えて、大腸菌を振とう培養する。
前記のプラスミドの導入により形質転換された大腸菌を含む培養液をアンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml)、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)を含むLB寒天培地に塗布し、培養する。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択して分離する。
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml)を含むLB液体培地で培養して増殖した大腸菌菌体からプラスミド精製キット(QIA filter Plasmid Midi Kit,QIAGEN社)によりプラスミドのDNAを分離および精製する。
(ix)DNA断片−D(約2.5 kbpサイズ)の塩基配列の解析
前項(viii)でクローニングにより得られたところの、上記のインバースPCRで増幅したDNA断片−Dの塩基配列を含有するプラスミドDNAの全塩基配列を解析する。
これによって、前述のプラスミドDNA中の挿入DNA配列の全塩基配列を決定することができる。前記の約2.5 kbpのDNA断片−DとDNA断片−Bの塩基配列を組合せると、後記の配列表の配列番号1に示された2581 bpの塩基配列と一致した。
(10)D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαおよびβユニットタンパク質をコードする遺伝子の判定
配列表の配列番号1に示された2581 bpの塩基配列から、それのコード領域によってコードされるアミノ酸配列を判定すると、配列番号1のDNA配列の587番目の塩基Aから1594番目の塩基Gまでの1008 bpのDNA配列によってコードされる336個のアミノ酸の配列−βと、配列番号1のDNA配列の1606番目の塩基Aから2388番目の塩基Aまでの783bpのDNA配列によってコードされる261個のアミノ酸の配列−αとがあることが判明した。
アグロバクテリウム・エスピーAB10121株から直接に分離されたD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットタンパク質およびβユニットタンパク質のN末端アミノ酸配列の化学分析の結果を参照すると、上記の336個のアミノ酸の配列−βは、βユニットタンパク質のアミノ酸配列に相当するものであり、かつ、上記の261個のアミノ酸の配列−αはαユニットタンパク質のアミノ酸配列に相当するものであると判断できた。
以上のようにして、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットをコードする遺伝子のDNA配列およびβユニットをコードする遺伝子のDNA配列は、それぞれに、配列表の配列番号1に示される2581 bpのDNA配列の内部に含有されており、そしてそれぞれが、配列番号1のDNA配列の1606番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る783 bpのサイズのDNA配列と、587番目の塩基Aから1594番目の塩基Gに至る1008 bpのサイズのDNA配列であると決定された。
その結果、αユニット遺伝子およびβユニット遺伝子のDNAの全塩基配列が決定された。αユニット遺伝子は、ATGを開始コドンとして有する783 bpの塩基からなり、261個のアミノ酸残基(分子量27700)からなるタンパク質をコードしている。このタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号3に示す。
βユニット遺伝子は、ATGを開始コドンとして有する1008 bpの塩基からなり、336個のアミノ酸残基(分子量36150)からなるタンパク質をコードしている。このタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号2に示す。
さらに、αユニット遺伝子とβユニット遺伝子は相互に近接してアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体上に存在する。βユニット遺伝子がαユニット遺伝子の上流に正方向に位置し、その下流にαユニット遺伝子が同じ方向にあり、両遺伝子間のDNA配列はGGTCTTTCの8塩基だけから成るものであることが判明した。
配列番号1および3に示されたαユニット遺伝子のアミノ酸配列について、相同性のあるタンパク質を検索したところ、相同性のあるタンパク質は見い出されなかった。
また、配列番号1および2に示されたβユニット遺伝子のアミノ酸配列について、相同性のあるタンパク質を検索したところ、バチラス サチラス由来のD−ミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼと54%の高い相同性が認められた。
次に、本発明により得られたところの、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニット遺伝子とβユニットの両方を含有する1932 bpのサイズのDNA断片−Eの作製と、このDNA断片を導入されて有するプラスミドpBA19を構築する方法を説明する。この方法の詳細は後記の実施例4に記載される。
(1)前記に記したアグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ αユニット遺伝子およびβユニット遺伝子の両方を内部に含有する塩基配列(配列番号1の2581 bpのDNA配列)を参考として用いて、βユニット遺伝子とαユニット遺伝子との両方を含有するDNA断片をサブクローニングする操作を次に行う。このために、以下のような5’末端にEcoRI siteあるいはBamHI siteを付加したプライマー(Bepi−8F/Aepi−6R)を作製する。
プライマーBepi−8Fの塩基配列は後記の配列表の配列番号12に示され、また、プライマーAepi−6Rの塩基配列は配列表の配列番号13に示される。
このプライマー2種すなわちBepi−8FおよびAepi−6Rを用いてかつアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNA(前記の(1)参照)をテンプレートとして用いてPCRを行なう。
上記のPCR反応によって約2.0 kbpの大きさのDNA断片が増幅する。このPCR増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてDNA増幅生成物を分画する。
上記の約2.0 kbpの大きさのDNA断片をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈澱する。得られたDNA断片の精製品をTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解して保存する。
さらに、このPCR増幅DNAをK緩衝液(20mM Tris−HCl、pH8.5、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトール、100mM KCl)中で制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、5’側にEcoRI部位、3’側にBamHI部位を持つDNA断片(DNA断片−Eと称する)を得る。このDNA断片−Eは、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニットの遺伝子(すなわちβユニット遺伝子)とαユニットの遺伝子(すなわちαユニット遺伝子)との両方を内部に含有するDNAである。それの塩基配列を解析すると、DNA断片−Eは1932 bpの塩基配列から成り、後記の配列表の配列番号1の464番目の塩基Aから2394番目の塩基Gまでの塩基配列を内部に含むものであると判明した。
(2)βおよびα遺伝子を大腸菌で発現させるためのプラスミドを次のように作製する。すなわち、プラスミドベクターpUC18に前記のDNA断片−Eを連結させる。このために、先ずベクターpUC18をK緩衝液(20mM Tris−HCl、pH8.5、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトール、100mM KCl)中で制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、ベクター消化物を得る。
前記のDNA断片−EとEcoRIとBamHIで消化されたプラスミドベクターpUC18のベクター消化物とを、DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)により連結する。これによって、βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の両方を内部に含有するDNA断片−Eと、ベクターpUC18との連結体である4597 bpのサイズのプラスミド(プラスミドpBA19と称する)が構築される。
(3)このプラスミドpBA19を、前記に記載したと同じ要領で大腸菌JM109株の菌体に導入する。プラスミドpBA19の導入により形質転換された大腸菌を、大腸菌JM109−pBA19株と称する。この大腸菌JM109−pBA19株をLB液体培地中で培養する。培養した大腸菌菌体からプラスミドpBA19を抽出する。こうしてβユニット遺伝子とαユニット遺伝子との両方の遺伝子を含有するDNA断片−Eを内部に有するプラスミドpBA19がサブクローニングできる。
したがって、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの上記のβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子が大腸菌内でクローニングする事が可能になる。
次に、前記で得られたところの、βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を内部に含有するDNA配列(前記のDNA断片−Eに相当する)を含有するプラスミドDNApBA19の導入により形質転換された大腸菌JM109−pBA19株が、上記の両遺伝子の発現によって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニットタンパク質およびαユニットタンパク質を産生できるかを下記のとおり試験する。
そのためには、下記のとおり、形質転換大腸菌JM109−pBA19株を、培地中で遺伝子産物の誘導物質としてのIPTG(すなわちイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)の存在下または非存在下で培養し、αおよびβ遺伝子を発現できるかをみる。その産物であるタンパク質の発現はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(以下、SDS−PAGE)で確認する。これらの方法の概要を以下に説明するが、その詳細は実施例5に記載される。
(1)βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を内部に含有するプラスミドDNA pBA19の導入により得られた前記の形質転換大腸菌JM109−pBA19株をLB培地(アンピシリン50μg/ml含有)で前培養する。新しいLB培地(アンピシリン50μg/ml)に、その前培養した菌体を含む培養液を添加して培養する。次いで、IPTG(最終濃度1mM)を培地に添加後、さらに24時間培養して遺伝子発現を誘導する。得られた培養液を遠心分離にて菌体を集め、BugBuster Protein Extraction Reagent(Novagen社)に菌体を懸濁して、菌懸濁液を振とうさせ溶菌させる。得られた溶菌液をを遠心すると上清である菌体の可溶性画分を得る。得られた可溶性画分(上清)を10〜20%のグラジエントゲル(マルチゲル、第一化学薬品(株))を用いるSDS−PAGEにかける。
(2)βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を導入された形質転換大腸菌JM109−pBA19株の培養をIPTGの添加、存在下で行った場合には、その得られた培養菌体の可溶性画分のSDS−PAGEにおいて分子量約4万と3万の位置にタンパク質の顕著なバンドが検出される。
従って、形質転換大腸菌JM109−pBA19株の菌体のIPTGの存在下における培養により産生された分子量4万のタンパク質と分子量3万のタンパク質は、大腸菌JM109−pBA19株のβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の発現によって特異的に誘導されたタンパク質であることが判った。アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニットタンパク質およびαユニットタンパク質は、配列表の配列番号1のDNA配列中にあるその遺伝子の大きさから、それぞれ36100、27700と推定される。前記のSDS−PAGEによって検出された大きい方(4万)の蛋白質はD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニット、小さい方(3万)はαユニットに相当すると思われた。このことから、形質転換大腸菌JM109−pBA19株の菌体中に本発明により導入されたところのアグロバクテリウム・エスピーAB1021株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ αおよびβユニットの各遺伝子は大腸菌内でそのコードするタンパク質を発現することが認められる。
さらに、前記で得られた形質転換大腸菌JM109−pBA19株の菌体に本発明により導入されているD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ遺伝子が大腸菌内で実際にD−キロ−イノシトールを異性化するエピメラーゼ活性を発現することを確認する実験を行う。これらの実験は、大腸菌JM109−pBA19株の菌体を、基質としてD−キロ−イノシトールを含んだ緩衝液中で反応させる緩衝液中の変換反応法(イ)と、基質を含む培地中でJM109−pBA19株を培養しながら菌体を基質に反応させる培地中の変換反応法(ロ)の2通りを行う。これらの実験の詳細は後記の実施例6が参照される。
次に、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株からクローニングしたD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの遺伝子にError prone法を用いてランダムに変異を導入して遺伝子改変を行う方法の概要を説明する。その方法の各段階の詳細は後記の実施例7に記載される。
(1)Error prone法によるD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ遺伝子の改変
(i)エピメラーゼβユニット遺伝子及びαユニット遺伝子をコードするプラスミドDNA pBA19をテンプレートとして、βユニット遺伝子とαユニット遣伝子をPCRで増幅する。この際、鋳型となるDNAに対して間違った塩基がDNA1分子当たり1−数カ所ランダムに入るような条件でPCRを行なう。このために、以下のような5’末端にEcoRI siteあるいはBamHI siteを付加したプライマー(Bepi−8F/Aepi−9R)を設計し作製する。
次に、このプライマー2種すなわちBepi−8FおよびAepi−9Rを用いてかつエピメラーゼβユニット遺伝子及びα遺伝子を保有するプラスミドDNA:pBA19をテンプレートとして用いてPCRを行なう。
この時、通常の反応液組成の中にMnCl2を添加し、さらに4種のdNTPの割合を変えたものを用いることにより鋳型となるDNAに対して間違った塩基が取り込まれるようにする。
上記のPCR反応によって約2kbpの大きさのDNA断片が増幅される。このPCR増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてDNA増幅生成物を分画する。上記の約2kbpの大きさのDNA断片をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈澱した。得られたDNA断片の精製品をTE緩衝液(10mM Tris−HCl,1mM EDTA,pH8.0)に溶解させる。
さらに、このPCR増幅DNAを制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、5’側にEcoRI部位、3’側にBamHI部位を持つDNA断片を得られる。
このDNA断片は、D−ミオ−イノシトール1−エピメラーゼβユニットの遺伝子(すなわちβユニット遺伝子)とαユニットの遺伝子(すなわちαユニット遺伝子)との両方を内部に含有するDNAであり、その分子中にはランダムに1−数カ所の塩基置換が生じた集合体である。
(ii)このPCR増幅させたDNA断片を大腸菌のクローニングベクターpUC18にクローニングする。すなわち、プラスミドベクターpUC18に前記のDNA断片を連結させる。このために、先ずベクターpUC18をK緩衝液(20mM Tris−HCl,pH8.5,10mM MgCl2,1mMジチオスレイトール,100mM KCl)中で制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、ベクター消化物を得る。
前記のDNA断片とEcoRIとBamHIで消化されたプラスミドベクターpUC18のベクター消化物とを、DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)により連結する。こうして得られた連結DNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換する。すなわち、PCR増幅断片の溶液とpUC18ベクター溶液を混合し、等量のDNA ligation kit ver.2のSolution Iを加え、連結反応を行う。こうして得られた連結DNAの溶液と、大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合し、大腸菌にプラスミドを導入させる。
その後、SOC培地を加えて、37℃で1時間大腸菌を振とう培養する。この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml),IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)含むLB寒天培地に塗布し、37℃、16時間培養する。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択する。得られた形質転換体は、βユニット遺伝子及びαユニット遺伝子のいろいろな箇所の塩基が置換されたプラスミドを有しているライブラリーである。
(iii)上記で得られた、βユニット遺伝子あるいはαユニット遺伝子内にランダムに塩基置換が生じた形質転換大腸菌ライブラリーを基質ミオ−イノシトール(8mg/ml)、アンピシリン50μg/ml及びIPTG 1mMを添加されたLB液体培地で培養する。37℃、3日間培養した後に培養液をシリカゲルTLC(Merck社、Art5715)にかけ、展開溶媒クロロホルム−メタノール−水(5:5:1)で展開する。シリカゲル薄層に過マンガン酸カリウム溶液を噴霧させてスポットを発色させる。コントロールとして変異の入っていないエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を含有するプラスミドpBA19の形質転換大腸菌JM109−pBA19の培養液を用いる。
TLC上でコントロールより生成物であるD−キロ−イノシトールの発色スポットが大きくなったものを選別し、さらにHPLCで分析する。統計的に有為に変換率が高まったものをさらに選別し、これらのクローンについてはエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の塩基配列を解析して、変異箇所を同定する。
上記のようにD−ミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールへの変換が増大したクローンのスクリーニングによって、変換率がコントロールと比較して1.3−1.5倍程度統計的に有為に増大しているものとして、Y57−11E株が選別された。Y57−11E株の保有するプラスミドDNAを抽出してそのエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の塩基配列を解析したところ、βユニット遺伝子の106番目の塩基がGからAに置換し、アミノ酸としては36番目のアミノ酸がバリンからイソロイシンに変わっていた。Error prone法によるランダムな変異の導入によってエピメラーゼ遺伝子を改変し、活性の増大した株を作製する事が出来た。
次に、このβユニット遺伝子の36番目のアミノ酸をバリンやイソロイシン以外の18種類のアミノ酸に置換させて変換活性がどのように変化するか検討する。その方法の各段階の詳細は後記の実施例8に記載される。
(2)部位特異的総変異によるD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニット遺伝子36番目アミノ酸の置換
(i)でランダムに変異を導入することにより変換活性の増大したクローンが得られた。そのうちβユニット遺伝子の36番目アミノ酸が置換することによって変換活性が増大したことに着目して、36番目のアミノ酸を他のすべてのアミノ酸に置き換えて活性との相関を検討する。
エピメラーゼβユニット遺伝子36番目のアミノ酸だけを特異的に変えるために以下のような操作を実施する。エピメラーゼβユニット遺伝子の上流から36番目アミノ酸のコドンを混合塩基のNNNとして39番目アミノ酸までの上流領域断片を以下に示したBepi−16F/Bepi−14Rプライマーで増幅し、36番目アミノ酸のコドンを混合塩基のNNNとして33番目アミノ酸からαユニット遺伝子の最後までの下流領域断片をBepi−17F/Aepi−10Rプライマーで増幅する。
増幅したDNA断片は、そのβユニット遺伝子の36番目アミノ酸に相当する配列がいろいろなアミノ酸をコードする配列を有する集合体である。得られた上流領域断片と下流領域断片はβユニット遺伝子内の33番目アミノ酸から39番目アミノ酸までが重複しているのでこれらの断片をアニールさせたものをテンプレートとして、βユニット遺伝子の上流配列のプライマーBepi−16Fとαユニット遺伝子の下流配列のプライマーAepi−10RでPCRを行い、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の全長を得ることができる。
上記のPCR反応によって約2 kbpの大きさのDNA断片が増幅される。このPCR増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてDNA増幅生成物を分画する。上記の約2 kbpの大きさのDNA断片をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈澱した。得られたDNA断片の精製品をTE緩衝液(10mM Tris−HCl,1mM EDTA,pH8.0)に溶解させる。
さらに、このPCR増幅DNAを制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、5’側にEcoRI部位、3’側にBamHI部位を持つDNA断片を得られる。
このDNA断片は、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニットの遺伝子(すなわちβユニット遺伝子)とαユニットの遺伝子(すなわちαユニット遺伝子)との両方を内部に含有するDNAであり、そのβユニット遺伝子の36番目アミノ酸が種々のアミノ酸に置き換わったものである。
(ii)このPCR増幅させたDNA断片を大腸菌のクローニングベクターpUC18にサブクローニングする。すなわち、プラスミドベクターpUC18に前記のDNA断片を連結させる。このために、先ずベクターpUC18をK緩衝液(20mM Tris−HCl,pH8.5,10mM MgCl2,1mMジチオスレイトール,100mM KCl)中で制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、ベクター消化物を得る。
前記のDNA断片とEcoRIとBamHIで消化されたプラスミドベクターpUC18のベクター消化物とを、DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)により連結する。こうして得られた連結DNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換する。すなわち、PCR増幅断片の溶液とpUC18ベクター溶液を混合し、等量のDNA ligation kit ver.2のSolution Iを加え、連結反応を行う。こうして得られた連結DNAの溶液と、大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合し、大腸菌にプラスミドを導入させる。
その後、SOC培地を加えて、37℃で1時間大腸菌を振とう培養する。この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml),IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)含むLB寒天培地に塗布し、37℃、16時間培養する。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択する。
得られた形質転換体は、βユニット遺伝子の36番目アミノ酸が20種類のアミノ酸に置換されたプラスミドを有しているライブラリーである。
ライブラリーから白色コロニーを選別してβユニット遺伝子の塩基配列を解析して、βユニット遺伝子の36番目アミノ酸がどのようなアミノ酸に置換されたか確認する。この結果、βユニット遺伝子の36番目アミノ酸をコードする3塩基の並びが34種類の変異体が得られ、その結果、グルタミン、メチオニンを除く18種類のアミノ酸に置き換えることができた。
それぞれの変異株を基質D−ミオ−イノシトール(8mg/ml)、アンピシリン50μg/ml及びIPTG 1mMを添加したLB液体培地で37℃、4日間培養し、その培養上清を遠心回収して培養液中の基質D−ミオ−イノシトールの変換物をHPLCにて分析する。
コントロールとしてpBA19プラスミドを保持する大腸菌株pBA19−JM109を同時に培養して変換率の相対値をもとめたところ、βユニット遺伝子の36番目アミノ酸がイソロイシンに置換した時に最も変換活性が増大していることが判明した。
次に、自然界の土壌に生息する菌からD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ遺伝子に相同性のある遺伝子を得る方法を検討する。以下にその方法の概要を説明する。その方法の各段階の詳細は後記の実施例9に記載される。
(1)集積培養菌からの1−エピメラーゼ相同遺伝子の単離
(i)アグロバクテリウム・エスピーAB10121株からクローニングしたD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ βユニット遺伝子あるいはαユニット遺伝子の配列を指標にして自然界の土壌に生息する菌からエピメラーゼ遺伝子に相同性のある遺伝子が得られるか検討する。
土壌サンプルは、各地から採取して、約300mgを1mlの滅菌水に懸濁する。ボルテックスミキサーでよく混合して、室温で1時間静置してその上清10μlを、D−ミオ−イノシトールあるいはD−キロ−イノシトールを唯一の炭素源とする集積培地に添加する。
これを28℃で4−7日間振とう培養し、新しい集積培地に培養液を植え継ぐ操作を繰り返し、炭素源としてミオ−イノシトールを含む培地の方がD−キロ−イノシトールを含む培地よりよく増殖しているもの、あるいはD−ミオ−イノシトールを含む培地にのみ菌が増殖しているものを選別する。
上で選別した菌の培養液を遠心して培養菌体を回収し、菌体から染色体DNAを宝酒造(株)製の’Genとるくん’を使用して抽出、精製する。フェノール抽出を2回行い、クロロホルムで抽出後に、クロロホルム抽出液に、1/10容の3M酢酸ナトリウムを加えてから約2.5倍容のエタノールを加えてDNAを沈殿させる。、沈澱させたDNAを乾燥後、TE緩衝液(10mM Tris−HCl,1mM EDTA,pH8.0)に溶解し保存する。
この染色体DNAをテンプレートとして、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株からクローニングしたD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニットあるいはαユニット遺伝子に相同な配列が得られるかどうか以下に示すような操作を行うことにより検討する。
アグロバクテリウム・エスピーAB10121株ではエピメラーゼβユニット遺伝子とαユニット遺伝子がタンデムに近接して存在しているので、βユニット遺伝子とαユニット遺伝子を連結した状態で増幅できるか検討する。このために、以下に示すようなβユニット遺伝子の開始コドンから21塩基の配列にクローニング部位としてEcoRI siteをつなげたプライマーBepi−10F,およびαユニット遺伝子のC末端配列18塩基と終止コドンにクローニング部位としてBamHI siteをつなげたプライマーAepi−9Rを設計し作製する。
上記のプライマー2種(Bepi−10FおよびAepi−9R)と前項で得た集積培養菌からの染色体DNAをテンプレートとして用いてPCRを行う。
独立して採取した土壌由来の菌すべてにβおよびαユニット遺伝子の大きさの約2kbに相当するDNAが増幅された。このPCR増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてDNA増幅生成物を分画する。上記の約2.0kbpの大きさのDNA断片をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出によりDNAを精製し、エタノール沈澱して回収する。得られたDNA乾燥させたDNAをTE緩衝液(10mM Tris−HCl,1mM EDTA,pH8.0)に溶解する。
さらに、このPCR増幅DNAを制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、5’側にEcoRI部位、3’側にBamHI部位を持つDNA断片を得る。
(ii)このPCR増幅させたDNA断片を大腸菌のクローニングベクターpUC18にサブクローニングする。すなわち、プラスミドベクターpUC18に前記のDNA断片を連結させる。このために、先ずベクターpUC18をK緩衝液(20mM Tris−HCl,pH8.5,10mM MgCl2,1mMジチオスレイトール,100mM KCl)中で制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、ベクター消化物を得る。
前記のDNA断片とEcoRIとBamHIで消化されたプラスミドベクターpUC18のベクター消化物とを、DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)により連結する。こうして得られた連結DNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換する。すなわち、PCR増幅断片の溶液とpUC18ベクター溶液を混合し、等量のDNA ligation kit ver.2のSolution Iを加え、連結反応を行う。こうして得られた連結DNAの溶液と、大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合し、大腸菌にプラスミドを導入させる。
その後、SOC培地を加えて、37℃で1時間大腸菌を振とう培養する。この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml),IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)含むLB寒天培地に塗布し、37℃、16時間培養する。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択する。
得られた形質転換体を基質ミオ−イノシトール(8mg/ml)、アンピシリン50μg/ml及びIPTG 1mMを添加したLB液体培地で37℃、4日間培養する。その培養上清を遠心回収して培養液中の基質ミオ−イノシトールの変換物をHPLCにて分析する。コントロールとしてアグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ遺伝子を保持する大腸菌株pBA19−JM109を同時に培養する。
土壌菌から得たエピメラーゼに相同な配列を有する大腸菌株においても、基質D−ミオ−イノシトールをD−キロ−イノシトールへ変換する活性を有することが判明した。その変換活性は、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株からクローニングしたエピメラーゼ活性とほぼ同等であった。土壌菌由来のエピメラーゼ活性を発現しうるDNAの塩基配列を解析し、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のエピメラーゼ遺伝子の塩基配列と比較したところ、βユニット遺伝子99番目の塩基GがTに置換しているだけで(アミノ酸としては、ロイシンのまま)他の領域の塩基配列は一致していた。
以上のように、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株よりクローニングしたD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子に相同なDNA配列は、自然界に広く存在し、エピメラーゼ活性を発現させることが可能である。
さらに、基質としてD−ミオ−イノシトールを含む培地中で、前記の形質転換大腸菌JM109−pBA19株をイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドの存在下あるいは非存在下で、培養しながら菌体をD−ミオ−イノシトールに作用させ、D−キロ−イノシトールを生成させ、次いでこれを含む反応溶液からD−キロ−イノシトールを単離することができ、このための実験を行った。この実験の詳細は後記の実施例10、11が参照される。
発明を実施するための最良の形態
次に、本発明を実施例について具体的に説明する。
実施例1
(1)ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットとβユニットの採取と精製
ミオ−イノシトール40g/L、酵母抽出物(ディフコ社製)1g/L、塩化アンモニウム4g/L、リン酸水素2カリウム7g/L、5リン酸2水素カリウム2g/L、硫酸マグネシウム7水塩0.1g/L、硫酸亜鉛7水塩0.02g/L、塩化カルシウム2水塩0.005g/L、塩化ニッケル0.0025g/Lおよび水からなる液体培地(pH6.8)を500ml容バッフル付き三角フラスコに100ml入れ、滅菌(120℃、20分間)した後冷却し、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株(FERM BP−7679)を接種し、27℃で240時間培養した。培養後、50本5リットル分の培養液を遠心分離して菌体を集めた。100mMリン酸緩衝液(pH7.0)の100mlを菌体に加えて、懸濁させ、ロッドタイプの超音波破砕装置で菌体を破砕した後、遠心分離によって、上清の粗酵素液100mlを得た。この粗酵素液の全D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ活性は78,847単位であった。
この粗酵素液に、終末濃度45%になるように硫安を加え、沈殿物を遠心して集め、硫安分画を行った。沈殿画分を透析し、あらかじめ20mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したDEAE−トヨパール650M(ベッドボリューム200ml:東ソー社製)に吸着させ、吸着物を0M〜0.5MのNaClの濃度勾配でクロマトグラフィー法によって、荷電の違いにより、精製を行った。活性画分を再度透析し、再度20mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したDEAE−トヨパール650Mに吸着させ、吸着物を0M〜0.5MのNaClの濃度勾配でクロマトグラフィーによって、酵素の精製を行った。
次に不要なNAD+依存酸化酵素を除く目的で、溶出された活性画分を20mMリン酸緩衝液(pH7.0)に透析し、あらかじめ20mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したブルートヨパール(ベッドボリューム20ml:東ソー社製)を通過させた。次に、その通過した活性画分に3mMになるようにMgSO4を加えて、あらかじめ20mMリン酸緩衝液(pH7.0)1mM MnSO4、3mM MgSO4を含む溶液で平衡化したブルートヨパール(ベッドボリューム20ml:東ソー社製)に吸着させ、吸着物を0M〜1.0MのKClの濃度勾配でクロマトグラフィー法によって、親和力の違いにより、酵素の精製を行った。通過画分には、補酵素を結合しないαユニットが含まれた。また、カラムからKCl濃度勾配によって脱着した画分には、補酵素を結合するβユニットが含まれた。
それぞれの酵素ユニットを含有する溶液を回収し、限外ろ過(分子量3,000カットオフ)により濃縮し、あらかじめ20mMリン酸緩衝液(pH7.0)0.3M NaClで平衡化したTSKgel G2000SWXL(ID7.8mm、長さ300mm:東ソー社製)によって、分子量の違いにより分取精製し、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットのそれぞれの精製酵素標品を得た。
(2)D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの部分アミノ酸配列の決定
上記(1)で精製されたαユニットとβユニットの各々のタンパク質のN末端アミノ酸配列は、それぞれ、エドマン分解法による気相アミノ酸シーケンサー(東ソー社製のPI−2020気相プロテインシーケンサー)により決定した。決定されたN末端アミノ酸配列15残基は、以下の通りであった。
また、内部アミノ酸配列は、精製されたαユニットとβユニットの各タンパク質を、それぞれ、タンパク濃度換算で1/50量のペプシンと共に、pH2.0塩酸溶液中にて、36℃、10時間処理を行い、限定加水分解を行った。その後、得られたペプチドをあらかじめ0.1%のトリフルオロ酢酸含む10%アセトニトリル水溶液で平衡化したODSカラム(直径4.6mm、長さ25cm:資生堂社)に吸着させ、吸着物を10%〜50%のアセトニトリルの濃度勾配でクロマトグラフィーによって、疎水親和力の違いにより、ペプチドの分離を行った。
このようにして、αユニットとβユニットのペプチドフラグメントは、それぞれ、調製され、HPLCによって分取され精製されたペプチドフラグメントの1つをエドマン分解法による前記の気相アミノ酸シーケンサーにより決定した。決定されたN末端アミノ酸配列は、以下の通りであった。
以上のように分析されたαユニットとβユニットの各タンパク質の部分アミノ酸配列の情報を基にして、後記の実施例2においてプライマーを設計し作製した。
実施例2
(1)アグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体のDNAの調製
LBフラスコ培地(1%バクト−トリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.0)にスラント培地(2%ミオ−イノシトール、0.2%酵母エキス、0.1%(NH4)2SO4、0.7%K2HPO4、0.2%KH2PO4、0.01%MgSO4・7H2O)で培養したAB10121株(FERM BP−7679)を一白金耳接種し、28℃、16時間培養した。得られた培養液を6000rpm、15分間遠心して菌体を集めた。その菌体から以下のようにしてBlood & Cell Culture kit(QIAGEN社)を用いて染色体DNAを調製した。
すなわち、AB10121株菌体をB1緩衝液(50mM EDTA、50mM Tris−HCl、0.5%Tween 20、0.5%Triton X−100、pH8)に懸濁し、2mg/mlリゾチーム、87.55μg/ml RnaseA、450μg/mlプロテイナーゼKとなるようにそれぞれの酵素を添加し、37℃、1時間保温した。得られた反応混合物にB2緩衝液(3Mグアニジンチオシアン酸塩、20%Tween−20、pH5.5)を添加し50℃、30分保温しタンパク質を変性させた。得られた変性反応溶液をフェノール抽出し、このフェノール抽出を5回行った。クロロホルムで抽出後に、クロロホルム抽出液に、1/10容の3M酢酸ナトリウムを加えてから約2.5倍容のエタノールを加えてDNAを沈殿させた。沈澱させたDNAを乾燥後、TE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解した。この染色体DNAは次のPCRでテンプレートとして用いる。
(2)D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的配列のクローニング
(i)アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットタンパク質の遺伝子の一部をPCR法(Polymerase Chain Reaction法)にて部分的にクローニングするための操作を次のように行った。
前述のαユニットのタンパク質のN末端アミノ酸8残基の配列Met Arg Phe Ala Ile Asn His Ileと、ペプシン分解で得た内部ペプチドのアミノ酸8残基の配列Ala Ala Gly Tyr Lys Gly Pro Tyrに対応する以下のようなプライマー(Aepi−1FおよびAin−2R)を設計し作製した(配列表の配列番号4および5参照)。
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、以下に示した混合塩基あるいはイノシンを使用した。
次に、このプライマー2種(Aepi−1FおよびAin−2R)と前項(1)で得たアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAをテンプレートとして用いてPCRを行なった。PCR用の反応液組成は、LA Taq polymerase反応用緩衝液(宝酒造)、2.5mM MgCl2、dNTP混合液(各0.4mM)、LA Taq polymerase2.5ユニットからなるものとした。
PCR反応は、PCR増幅装置(Biometra社 T Gradient)を用い、初めに変性を95℃、3分、さらに変性を94℃、30秒間、アニーリングを50℃、2分間、伸長を68℃、1分間行う3段階の反応を35回繰り返し、最後に72℃で伸長反応を1分間行うことにより実施した。上記のPCR反応によって、約700 bpの大きさのDNA断片が(以下、DNA断片−Aと称する)増幅した。このDNA断片−Aはαユニット遺伝子の一部分である可能性が高い。
PCR増幅した反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて分画した。この約700 bpの大きさのDNA断片(DNA断片−A)をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出によりDNAを精製し、エタノール沈澱して回収した。乾燥させたDNAをTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解させた。
(ii)このPCR増幅させたDNA断片−AをPCR産物のクローニングベクターであるpT7BlueT vectorにクローニングした。すなわち、プラスミドベクターpT7Blue T vector(Novagen社)にDNA断片−Aを、DNA Ligation kit ver.2(宝酒造)を用いて連結し、得られた連結DNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換した。すなわち、精製したPCR増幅DNA断片−Aの溶液とpT7Blue Tベクター溶液を混合し、等量のDNA Ligation kit ver.2のSolution Iを加え、16℃、一晩保温して、ベクターDNAとDNA断片−Aとの連結反応を行った。こうして得られた連結DNA溶液と、大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合し、氷中で30分間、42℃で40秒間、さらに氷中で2分間静置した。
その後、SOC培地(2%バクト−トリプトン、0.5%酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース、10mM MgSO4、10mM MgCl2)を加えて、37℃で1時間大腸菌を振とう培養した。この培養液を、アンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml)、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)を含むLB寒天培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.0、1.5%寒天)に塗布した。さらに37℃、16時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドの導入で形質転換された大腸菌が得られるため、これを選択した。こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml)を含むLB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット(QIA filter Plasmid Midi Kit,QIAGEN社)によりプラスミドDNAの分離および精製を行った。こうして得られたプラスミドDNAは、目的とするエピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的配列を有する約700 bpのDNA断片−Aであることが確認された。
(3)クローニングされたDNA断片−Aの塩基配列解析
前項(2)(ii)でクローニングされたプラスミド中のDNA挿入断片の全遺伝子配列を解析した。アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットタンパク質遺伝子の部分配列に該当すると判定されるDNA配列の塩基配列を決定した。この塩基配列解析は、DNA塩基配列解析装置(PE Biosystems 377XL)を用い、ダイターミネーター サイクル シークエンス法で行った。
塩基配列解析の結果、PCR増幅されたDNA断片−Aは電気泳動で約700 bpと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には693 bpであることが明らかとなった。693 bpの塩基配列をコドンとしてアミノ酸に置換したところ1種のオープンリーディングフレームに翻訳することができた。クローニングされた前記の693 bpのDNA配列の両端には前期のPCR反応の時に使用した2種類のプライマーのDNA配列が見い出されたので、前記のPCR反応ではDNA断片−Aがこの2種類のプライマー特異的に増幅したことが明らかとなった。
DNA断片−Aとしてクローニングした693 bpのDNA配列をアミノ酸へ置換したところ、N末端アミノ酸配列の9番目から15番目の配列はThr Ala Pro Ala Leu Ser Leuであることが判った。これはアグロバクテリウム・エスピーAB10121株から分離および精製したD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ αユニットタンパク質のN末端アミノ酸配列解析から得られた結果と一致しており、従って、クローニングした693 bpのDNA配列はアグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ αユニットタンパク質をコードする遺伝子の一部分であることが明らかとなった。
(4)D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニット遺伝子の部分的配列のクローニング
(i)前項(2)(i)で示したαユニット遺伝子の一部分のクローニングと同じ手法を用いて、β遺伝子の部分的配列をクローニングするためにアグロバクテリウム・エスピーAB10121株から直接に分離および精製されているD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニットタンパク質のN末端アミノ酸8残基の配列Thr Val Lys Ile Gly Val Ile Glyとβ−ユニットタンパク質のペプシン分解物の内部ペプチドのアミノ酸7残基の配列Thr Asp Trp Lys Asp Arg Pheから以下のようなプライマーBepi−1FおよびBin−2Rを設計し作製した(配列番号6および7参照)。
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために混合塩基あるいはイノシンを使用した。
次に、このプライマー2種すなわちBepi−1FおよびBin−2Rを用いてかつアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNA(前記の(1)項で得たもの)をテンプレートとして用いてPCRを行なった。PCR用の反応液組成は、LA Taq polymerase反応用緩衝液(宝酒造)、2.5mM MgCl2、dNTP混合液(各0.4mM),LA Taq polymerase2.5ユニットからなるものとした。
PCR反応は、PCR増幅装置(Biometra社 T Gradient)を用い、初めに変性を95℃、3分、さらに変性を94℃、30秒間、アニーリングを50℃、2分間、伸長を68℃、1分間行う3段階の反応を35回繰り返し、最後に72℃で伸長反応を1分間行うことにより実施した。
上記のPCR反応によって約800 bpの大きさのDNA断片(以下DNA断片−Bと称す)が増幅したが、このDNA断片−Bはβユニット遺伝子の一部分である可能性が高い。このPCR増幅反応液をアガロースゲル電気泳動法により分画した。その後、上記の約800 bpの大きさのDNA断片(DNA断片−B)をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出によりDNAを精製し、エタノール沈澱させた。精製したDNA断片−BをTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解した。
(ii)このPCR増幅されたDNA断片−BをPCR産物のクローニング用のベクターであるpT7Blue T vectorに、次のように連結した。すなわち、プラスミドベクターpT7Blue T vectorにDNA断片−BをDNA Ligation kit ver.2(宝酒造)を用いて連結し、大腸菌JM109株を形質転換した。
すなわち、精製したPCR増幅DNA(DNA断片−B)溶液とpT7Blue Tベクター溶液を混合し、等量のDNA Ligation kit ver.2のSolution Iを加え、16℃、一晩保温して、ベクターDNAとDNA断片−Bとの連結反応を行った。こうして得られた連結DNA溶液と大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合し、氷中で30分間、42℃で40秒間、さらに氷中で2分間静置した。
その後、SOC培地(2%バクト−トリプトン、0.5%酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース、10mM MgSO4、10mM MgCl2)を加えて、37℃で1時間大腸菌を振とう培養した。この培養液をアンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml)、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)を含むLB寒天培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.0、1.5%寒天)に塗布し、37℃、16時間培養した。この培養により、白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドの導入で形質転換した大腸菌が得られるから、これを選択して分離した。
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml)を含むLB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌菌体からプラスミド精製キット(QIA filter Plasmid Midi Kit,QIAGEN社)によりプラスミドDNAを分離および精製した。こうして得られたプラスミドは、目的とするエピメラーゼβユニット遺伝子の部分的配列を含有するDNA断片−Bをその中に挿入されてあり、このDNA断片−BはPCR反応で増幅された約800 bpのDNA断片と考えられた。
(5)クローニングされたDNA断片−Bの塩基配列の解析
前項(4)(ii)でクローニングされたプラスミドDNAの挿入DNA断片の全塩基配列を解析した。これにより、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニットタンパク質遺伝子の部分配列に該当すると判定できる挿入DNA配列の塩基配列を決定した。この塩基配列解析は、DNA塩基配列解析装置(PE Biosystems 377XL)を用い、ダイターミネーター サイクル シークエンス法で行った。
塩基配列解析の結果、クローニングされた822 bpのDNA断片−Bの塩基配列が明らかとなった。この822 bpのDNA配列をアミノ酸に置換したところ1種のオープンリーディングフレームに翻訳することができた。クローニングされた前記の822 bpのDNA配列の両端には前記のPCRの時に使用した2種類のプライマーの配列が見い出されたので、前記のPCR反応ではDNA断片−Bがこの2種類のプライマー特異的に増幅したことが明らかとなった。
クローニングした822 bpのDNA配列をアミノ酸へ置換したところ、N末端アミノ酸配列の9番目から15番目の配列はThr Gly Ala Ile Gly Arg Aspであり、これはアグロバクテリウム・エスピーAB10121株から分離精製したD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニットタンパク質のN末端アミノ酸解析から得られた結果と一致している。DNA断片−Bとして、クローニングしたDNA配列はアグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ βユニットタンパク質をコードする遺伝子の一部分であることが明らかとなった。
実施例3
本例では、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの両方をコードする遺伝子の全DNAの塩基配列解析を行った。
前記の実施例1のようにして、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的配列およびβユニット遺伝子の部分的配列が決定されたのでインバースPCR法(細胞工学14巻、p.591−593、1995年)によって、クローニング断片の上流、下流域に広がるαユニットあるいはβユニットの全DNA塩基配列を増幅、クローニング、配列解析した。すなわち、すでに前述のクローニングしたDNA断片を切断しないような制限酵素を選択してこれを用いて、染色体DNAを切断し、その切断断片の両端を連結して自己環状化する。次に、クローニングしたDNA断片の両端方向(外側)に向かってプライマーをそれぞれ設計してPCR反応にかけると、クローニングされていない上流、下流に連続して存在する未知領域がテンプレートが環状化しているために増幅される。すなわち、たとえばアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAのαユニット蛋白質タンパク質の部分的DNA配列をもとにしてその上流、下流領域の配列を決定することができる。
(1)具体的には、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNA(実施例2の(1)参照)をH緩衝液(50mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、100mM NaCl)中で制限酵素EcoRIで完全に消化した。得られたEcoRI切断DNA断片をフェノール抽出、クロロホルム抽出を行いDNAを精製し、エタノール沈澱後、TE緩衝液にDNAを溶解した。このDNA溶液をDNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)のSolution Iと等量ずつ混合し16℃、16時間保温してDNA断片を自己環状化させた。フェノール抽出、クロロホルム抽出を行い精製した。エタノール沈澱で再びDNAを回収後、TE緩衝液に溶解し、これをテンプレートとして次のPCR反応に用いた。
(2)他方、αユニット遺伝子の部分配列から、以下のようなプライマーAepi−4FおよびAepi−3Rを設計し作製した(配列番号8および9参照)。
次に、上記のプライマー2種すなわちAepi−4FおよびAepi−3Rを用いてアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAを制限酵素EcoRIで消化した後に自己環状化したDNA自己環状化物をテンプレートとしてPCR反応を行なった。
PCR用の反応液組成は、LA Taq polymerase反応用緩衝液(宝酒造)、2.5mM MgCl2、dNTP混合液(各0.4mM)、LA Taq polymerase2.5ユニットからなるものとした。PCR反応は、PCR増幅装置(Biometra社 T Gradient)を用い、初めに変性を95℃、3分行い、その後変性を98℃、20秒間、アニーリングと伸長を68℃、5分間行う2段階の反応を30回繰り返すことにより実施した。
この結果、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株の染色体DNAのEcoRI消化、自己環状化物をテンプレートとしてで約2.5 kbのDNA増幅断片(以下、DNA断片−Cと称す)が得られた。
上記のPCR反応によって約2.5 kbの大きさのDNA断片(DNA断片−C)が増幅したが、これは、αユニット遺伝子のDNA配列およびその上流と下流領域を含むDNA配列を有するDNAである可能性が高い。
このPCR増幅反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて分画した。約2.5 kbpの大きさのDNA断片をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノール沈澱した。得られた精製品のDNA断片−CをTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解した。
(3)このPCR増幅したDNA断片−CをPCR産物のクローニング用ベクターであるpT7BlueT vectorでクローニングした。すなわち、プラスミドベクターpT7Blue T(Novagen社)にDNA断片−CをDNA Ligation kit ver.2(宝酒造)を用いて連結し、大腸菌JM109株を形質転換した。すなわち、精製したPCR増幅DNA断片−Cの溶液とpT7Blue Tベクター溶液を混合し、等量のDNA Ligation kit ver.2のSolution Iを加え、16℃、一晩保温して、ベクターDNAとDNA断片−Cとの連結反応を行った。
こうして得られた連結DNA溶液と大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合し、氷中で30分間、42℃で40秒間、さらに氷中で2分間静置した。その後、SOC培地(2%バクト−トリプトン、0.5%酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース、10mM MgSO4、10mM MgCl2)を加えて、37℃で1時間大腸菌を振とう培養した。
この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml)、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)含むLB寒天培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.0、1.5%寒天)に塗布し、37℃、16時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記の組換えプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択して分離した。
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml)を含むLB液体培地で培養して増殖した大腸菌菌体からプラスミド精製キット(QIA filter Plasmid Midi Kit,QIAGEN社)によりプラスミドDNAを精製した。
(4)DNA断片−C(約2.5 kbpのサイズ)の塩基配列の解析
前項(3)でクローニングにより得られたプラスミドの挿入DNAの全領域の塩基配列をDNA塩基配列解析装置により解析した。これによって、前述のプラスミドの中の挿入DNAの全塩基配列を決定することができた。その結果、前記の約2.5 kbpのDNA断片−CとDNA断片−Aの塩基配列を組合せることにより後記の配列表の配列番号1に示された2581 bpの塩基配列が得られた。
(5)前項(1)に示したと同様にしてアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAを制限酵素EcoRIで完全に消化した。得られたEcoRI切断断片をDNAリガーゼによって自己環状化させ、これをテンプレートとして用いた。
別途、βユニット遺伝子の部分配列を参考として、以下のようなプライマーBepi−4FおよびBepi−3Rを設計した(配列番号10および11参照)。
次に、これらプライマー2種と前記で得られたアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAを制限酵素EcoRIで消化した後に自己環状化したDNAをテンプレートとして用いてPCRを行なった。
PCR用の反応液組成は、LA Taq polymerase反応用緩衝液(宝酒造)、2.5mM MgCl2、dNTP混合液(各0.4mM)、LA Taq polymerase2.5ユニットよりなるものとした。PCR反応は、PCR増幅装置(Biometra社 T Gradient)を用い、初めに変性を95℃、3分、さらに変性を98℃、20秒間、アニーリングと伸長を68℃、5分間行う2段階の反応を30回繰り返すことにより実施した。
この結果、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNAのEcoRI消化、自己環状化物をテンプレートとしたPCR法により、約2.5 kbpのDNA増幅断片(DNA断片−Dと称す)が得られた。
上記のPCR反応によって約2.5 kbpの大きさのDNA断片(DNA断片−D)が増幅したが、これは、βユニット遺伝子のDNA塩基配列の未決定のDNA領域およびその周辺領域を含むDNAである可能性が高い。
このPCR増幅反応液をアガロースゲル電気泳動法により分画した。約2.5 kbpの大きさのDNA断片(DNA断片−D)をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノール沈澱した。得られた精製品のDNA断片−DをTE緩衝液に溶解した。
(6)このPCR増幅されたDNA断片−Dを、PCR産物のクローニング用ベクターであるpT7BlueT vectorでクローニングした。すなわち、プラスミドベクターpT7BlueT(Novagen社)に、DNA Ligation kit ver.2(宝酒造)によりDNA断片−Dを連結した。得られた連結DNAを、大腸菌JM109株を形質転換した。すなわち、精製したPCR増幅したDNA断片−Dの精製品の溶液とpT7Blue Tベクター溶液を混合し、等量のDNA Ligation kit ver.2のSolution Iを加え、16℃、一晩保温して、ベクターDNAとDNA断片−Dとの連結反応を行った。こうして得られた連結DNA溶液と大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合し、氷中で30分間、42℃で40秒間、さらに氷中で2分間静置した。その後、SOC培地(2%バクト−トリプトン、0.5%酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース、10mM MgSO4、10mM MgCl2)を加えて、37℃で1時間大腸菌を振とう培養した。
前記のプラスミドの導入により形質転換された大腸菌を含む培養液をアンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml)、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)含むLB寒天培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.0、1.5%寒天)に塗布し、37℃、16時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記の組換えプラスミドで形質転換した大腸菌が得られたので、これを選択して分離した。
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml)を含むLB液体培地で培養して増殖した大腸菌菌体からプラスミド精製キット(QIA filter Plasmid Midi Kit,QIAGEN社)によりプラスミドのDNAを分離および精製した。
(7)DNA断片−D(約2.5 kbpサイズ)の塩基配列の解析
前項(6)でクローニングにより得られたところの、上記のインバースPCRで増幅したDNA断片−Dの塩基配列を含有するプラスミドの中の挿入DNAの全塩基配列を解析した。塩基配列解析は、DNA塩基配列解析装置(PE Biosystems 377XL)を用い、ダイターミネーター サイクル シークエンス法で行った。
これによって、前述のプラスミドDNA中の挿入DNA配列の全塩基の全遺伝子配列を決定することができた。前記の約2.5 kbのDNA断片−DとDNA断片−Bの塩基配列を組合せると、後記の配列表の配列番号1に示された2581 bpの塩基配列と一致することが判明した。
(8)D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットタンパク質およびβユニットタンパク質をコードする遺伝子の判定
配列表の配列番号1に示された2581 bpの塩基配列から、それのコードする領域によってコードされるアミノ酸配列を判定すると、配列番号1のDNA配列の587番目の塩基Aから1594番目の塩基Gまでの1008 bpのDNA配列によってコードされる336個のアミノ酸の配列−βと、配列番号1の1606番目の塩基Aから2388番目の塩基Aまでの783 bpのDNA配列によってコードされる261個のアミノ酸の配列−αとがあることが判明した。
アグロバクテリウム・エスピーAB10121株から直接に分離されたD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットタンパク質およびβユニットタンパク質のN末端アミノ酸配列の化学分析の結果を参照すると、上記の336個のアミノ酸の配列−βは、βユニットタンパク質のアミノ酸配列に相当するものであり、かつ、上記の261個のアミノ酸の配列−αはαユニットタンパク質のアミノ酸配列に相当するものであると判断できた。
以上のようにして、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットタンパク質をコードする遺伝子のDNA配列およびβユニットタンパク質をコードする遺伝子のDNA配列は、それぞれに、配列表の配列番号1に示される2581 bpのDNA配列の内部に含有されており、そしてそれぞれが、配列番号1のDNA配列の1606番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る783 bpのサイズのDNA配列と、587番目の塩基Aから1594番目の塩基Gに至る1008 bpのサイズのDNA配列であると決定された。
その結果、αユニット遺伝子およびβユニット遺伝子のDNAの全塩基配列が決定された。
αユニット遺伝子は、ATGを開始コドンとして有する783 bpの塩基からなり、261個のアミノ酸残基(分子量27700)からなるタンパク質をコードしている(配列番号3参照)。
βユニット遺伝子は、ATGを開始コドンとして有する1008bpの塩基からなり、336個のアミノ酸残基(分子量36150)からなるタンパク質をコードしている(配列番号2参照)。
さらに、αユニット遺伝子とβユニット遺伝子は相互に近接してアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体上に存在する。βユニット遺伝子がαユニット遺伝子の上流に正方向に位置し、その下流にαユニット遺伝子が同じ方向にあり、両遺伝子間のDNA配列はGGTCTTTCの8塩基だけから成るものであることが判明した。
配列番号1および3に示されたαユニット遺伝子のアミノ酸配列について、相同性のあるタンパク質を検索したところ、相同性のあるタンパク質は見い出されなかった。
また、配列番号1および2に示されたβユニット遺伝子のアミノ酸配列について、相同性のあるタンパク質を検索したところ、バチラス サチラス由来のD−ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼと54%の高い相同性が認められた。
実施例4
本例は、本発明により得られたところの、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニット遺伝子とβユニットの両方を含有するDNA断片を導入されて有するプラスミドpBA19を構築する方法を例示する。
(i)実施例3に記したアグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ αユニット遺伝子およびβユニット遺伝子の両方を内部に含有するDNA断片の塩基配列(配列番号1の2581 bpのDNA配列)を参考として用いて、βユニット遺伝子とαユニット遺伝子との両方を含有するDNA断片をサブクローニングする操作を次に行う。このために、以下のような5’末端にEcoRI siteあるいはBamHI siteを付加したプライマー(Bepi−8F/Aepi−6R)を設計し作製した(配列番号12および13参照)。
次に、このプライマー2種すなわちBepi−8FおよびAepi−6Rを用いてかつアグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体DNA(実施例2の(1)参照)をテンプレートとして用いてPCRを行なった。
PCR用の反応液組成は、LA Taq polymerase反応用緩衝液(宝酒造)、2.5mM MgCl2、dNTP混合液(各0.4mM)、LA Taq polymerase2.5ユニットから成るものとした。PCR反応は、PCR増幅装置(Biometra社 T Gradient)を用い、初めに変性を95℃、3分、さらに変性を94℃、30秒間、アニーリングを55℃、1分間、伸長を68℃、2分間行う3段階の反応を30回繰り返し、最後に72℃で伸長反応を2分間行うことにより実施した。
上記のPCR反応によって約2.0 kbpの大きさのDNA断片が増幅した。このPCR増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてDNA増幅生成物を分画した。
上記の約2.0 kbpの大きさのDNA断片をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈澱した。得られたDNA断片の精製品をTEバッファー緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解した。
さらに、このPCR増幅DNAをK緩衝液(20mM Tris−HCl、pH8.5、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトール、100mM KCl)中で制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、5’側にEcoRI部位、3’側にBamHI部位を持つ1932 bpのサイズのDNA断片(DNA断片−Eと称する)を得た。
このDNA断片−Eは、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニットの遺伝子(すなわちβユニット遺伝子)とαユニットの遺伝子(すなわちαユニット遺伝子)との両方を内部に含有するDNAである。DNA断片−Eは1932 bpの塩基配列から成り、それの塩基配列を解析すると、前記したとおり、配列表の配列番号1に示される塩基配列の部分配列であると判明した。
アグロバクテリウム・エスピーAB10121株染色体からクローニングしたエピメラーゼβユニットおよびαユニットの遺伝子の全長は1931bpであるが、これを大腸菌内で発現させるためにベクタープラスミドへ挿入させる過程で「のりしろ」となる制限酵素切断部位を付加させた遺伝子をPCR法で作製した。そのために5’末端に1塩基付加され1932bpとなった。
(ii)一方、βおよびα遺伝子を大腸菌で発現させるためのプラスミドを次のように作製した。すなわち、プラスミドベクターpUC18に前記のDNA断片−Eを連結させる。このために、先ずベクターpUC18をK緩衝液(20mM Tris−HCl、pH8.5、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトール、100mM KCl)中で制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、ベクター消化物を得た。
前記のDNA断片−EとEcoRIとBamHIで消化されたプラスミドベクターpUC18のベクター消化物とを、DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)により連結した。これによって、βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の両方を内部に含有するDNA断片−Eと、ベクターpUC18との連結体である4597 bpのサイズのプラスミド(プラスミドpBA19と称する)が構築された。このプラスミドpBA19の図を添付図面の図1に示す。
(iii)このプラスミドpBA19を、実施例3の(3)に記載したと同じ要領で大腸菌JM109株の菌体に導入した。プラスミドpBA19の導入により形質転換された大腸菌を、大腸菌JM109−pBA19株と称する。
この大腸菌JM109−pBA19株をLB液体培地中で培養した。培養した大腸菌菌体からプラスミドpBA19を抽出した。こうしてβユニット遺伝子とαユニット遺伝子との両方の遺伝子を含有するDNA断片−Eを内部に有するプラスミドpBA19がサブクローニングできた。
したがって、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの上記のβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子が大腸菌内でクローニングする事が可能になった。
実施例5
本例においては、実施例4で得られたところの、βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を内部に含有するDNA配列(前記のDNA断片−Eに相当する)を含有するプラスミドDNApBA19の導入により形質転換された大腸菌JM109−pBA19株が、上記の両遺伝子の発現によって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニットタンパク質およびαユニットタンパク質を産生できるかを試験した。
すなわち、本例では、形質転換大腸菌JM109−pBA19株を、培地中で遺伝子産物の誘導物質としてのIPTG(すなわちイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)の存在下または非存在下で培養し、αユニット遺伝子およびβユニット遺伝子を発現できるかをみた。その産物であるタンパク質の発現はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(以下、SDS−PAGE)で確認した。具体的には、次の方法を行った。
(1)βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を内部に含有するプラスミドDNA pBA19の導入により得られた前記の形質転換大腸菌JM109−pBA19株を、LB培地(アンピシリン50μg/ml含有)で37℃、16時間、前培養した。新しいLB培地(アンピシリン50μg/ml)に、その前培養した菌体を含む培養液を培地量の1/200量で添加して菌体数が吸光度でA600=1.0になるまで培養した。次いで、IPTG(最終濃度1mM)を培地に添加後、さらに24時間培養して遺伝子発現を誘導した。また、IPTGを添加しなかった比較実験も行った。得られた培養液を遠心分離(6000回転、10分間)にて菌体を集め、BugBuster Protein Extraction Reagent(Novagen社)に菌体を懸濁して、菌懸濁液を室温でゆっくりと振とうさせ溶菌させた。得られた溶菌液を遠心(15000回転、20分間)すると、上清である菌体の可溶性画分を得た。得られた可溶性画分(上清)を10〜20%のグラジエントゲル(マルチゲル、第一化学薬品(株))を用いるSDS−PAGEにかけた。
コントロールとして、ベクタープラスミドpUC18だけを導入されて保持する大腸菌JM109株の形質転換体を用いて、同様の実験を行った。
(2)βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を導入された形質転換大腸菌JM109−pBA19株の培養をIPTGの添加、存在下で行った場合には、その得られた培養菌体の可溶性画分のSDS−PAGEにおいて分子量約4万と3万の位置にタンパク質の顕著なバンドが検出された。
他方、形質転換大腸菌JM109−pBA19株の培養をIPTGの無添加で行った比較実験の場合には、得られた培養菌体の可溶性画分のSDS−PAGEにおいて、分子量約4万と分子量3万の位置にタンパク質の弱いバンドしか検出できなかった。さらに、コントロールとして、ベクタープラスミドpUC18だけの導入を受けた大腸菌JM109株の前記の形質転換体を、IPTGの存在下で培養した場合には、得られた培養菌体中には、前記の分子量4万と分子量3万のタンパク質の産生を検出できなかった。
従って、形質転換大腸菌JM109−pBA19株の菌体のIPTGの存在下における培養により産生された分子量4万のタンパク質と分子量3万のタンパク質は、大腸菌JM109−pBA19株のβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の発現によって特異的に誘導されたタンパク質であることが判る。
アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニットタンパク質およびαユニットタンパク質は、配列表の配列番号1のDNA配列中にあるその遺伝子の大きさから、それぞれ36100、27700と推定される。前記のSDS−PAGEによって検出された大きい方(4万)の蛋白質は1−エピメラーゼのβユニット、小さい方(3万)はαユニットに相当すると思われた。上記の実験から、形質転換大腸菌JM109−pBA19株の菌体中に本発明により導入されたところのアグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ αユニット遺伝子およびβユニット遺伝子は大腸菌内でそのコードするタンパク質を発現することが認められた。
実施例6
本例では、実施例4で得られた形質転換大腸菌JM109−pBA19株の菌体に本発明により導入されているD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ遺伝子が大腸菌内で実際にD−キロ−イノシトールを異性化するエピメラーゼ活性を有する1位エピメラーゼを発現することを確認する実験が行れたものである。実験は、大腸菌JM109−pBA19株の菌体を、基質としてD−キロ−イノシトールを含んだ緩衝液中で反応させる緩衝液中の変換反応法(イ)と、基質を含む培地中でJM109−pBA19株を培養しながら菌体を基質に反応させる培地中の変換反応法(ロ)の2通りを行った。
(イ)緩衝液中の変換反応法(その1)
(i)実施例4で得られた形質転換大腸菌JM109−pBA19株の菌体をLB液体培地(アンピシリン50μg/mlを含有)で菌体量が吸光度A 600=1.0になるまで培養した。その後に、培地にIPTG(最終濃度1mM)を添加した。さらに24時間培養して遺伝子発現を誘導した。得られた培養液を遠心分離(6000回転、10分間)にて菌体を集め、リン酸緩衝液(50mM、pH8.5)で洗浄して、洗浄菌体を得た。
(ii)こうして得られた大腸菌JM109−pBA19株の洗浄菌体を、変換反応用の緩衝液(50mMリン酸バッファー、pH8.5;10mg/mlのD−キロ−イノシトールおよび4mg/mlのNADを含有)に懸濁した。この懸濁液中で菌体を基質に37℃、24時間反応させた。反応液を遠心分離(16000回転、5分間)して上清を得た。この上清中の生産物を薄層シリカゲルクロマトグラフィー(Merck社 Art5715、以下、TLC)にかけ、展開溶媒クロロホルム−メタノール−水(5:5:1)で展開した。薄層に過マンガン酸カリウム水溶液を噴霧させてスポットを発色させた。
添加されたIPTGの存在下に培養されて遺伝子の発現を誘導された大腸菌JM109−pBA19株の菌体から洗浄により得た洗浄菌体を、上記の緩衝液中で基質D−キロ−イノシトールに反応させた場合、得られた反応液をTLCにかけたシリカゲル薄層上では、D−キロ−イノシトールのスポットがほとんど消失しており、またD−キロ−イノシトールから変換されたD−ミオ−イノシトールに相当するスポットが認められた。
他方、IPTGを添加しないで培養されて、遺伝子の発現を誘導されなかった大腸菌JM109−pBA19株の洗浄菌体を、上記の緩衝液中で基質D−キロ−イノシトールに作用させた場合には、その反応液を上記のTLCにかけて調べると、シリカゲル薄層上で基質D−キロ−イノシトールのスポットが多く残っており、D−ミオ−イノシトールのスポットは小さかった。
上記の観察事実は、前記の実施例5の(2)で調べたところの、形質転換大腸菌JM109−pBA19株の培養をIPTGの存在下で行い、遺伝子の発現を誘導し、そして菌体の可溶性画分をSDS−PAGEにかけてタンパク質のバンドを検出した時のタンパク質発現の結果と一致していた。大腸菌JM109−pBA19株でのαユニットおよびβユニットのタンパク質の発現量の増大にともなって緩衝液中での基質の変換反応も進んだことを示している。
このことは、本発明によりクローニングしたエピメラーゼのαおよびβ遺伝子はこれら遺伝子の導入された形質転換大腸菌JM109−pBA19株の菌体内で発現してエピメラーゼ活性を発現できることを示している。
(ロ)培地中での変換反応法
実施例4で得られた形質転換大腸菌JM109−pBA19株を基質D−キロ−イノシトール(8mg/ml)およびアンピシリン50μg/mlを添加されたLB液体培地で培養した。菌体量が吸光度A 600=1.0になるまで培養した後に、培地にIPTG(最終濃度1mM)を添加した。その後、37℃で培養を続けた。培養液を経時的にサンプリングし、培養液サンプルを遠心(16000回転、5分間)して上清を得た。この上清中の生産物をシリカゲルTLC(Merck社、Art5715)にかけ、展開溶媒クロロホルム−メタノール−水(5:5:1)で展開した。シリカゲル薄層に過マンガン酸カリウム溶液を噴霧させてスポットを発色させた。
培養開始から24時間、あるいは48時間後の培養液から取られたサンプルの上清中には基質D−キロ−イノシトールがほとんど未反応で残存した。しかし、培養72時間後の培養液中では、基質の約30%がD−ミオ−イノシトールに変換されたことが認められた。
なお、緩衝液中の変換反応(その2)を次の通り行った。すなわち、本例の前項(イ)の緩衝液変換反応法の(ii)で用いた変換反応用の緩衝液に基質として添加された10mg/mlのD−キロ−イノシトールに代えて、10mg/mlのD−ミオ−イノシトールを基質として添加した。前項(イ)(ii)と同じ要領で、大腸菌JM109−pBA19株の洗浄菌体の10mgを変換反応用の緩衝液の0.5mlに懸濁して、37℃、24時間にわたってD−ミオ−イノシトールに菌体を作用させた。
反応液を遠心分離して上清を得た。上清を薄層シリカゲルクロマトグラフィーにかけて、展開溶媒クロロホルム−メタノール−水(5:5:1)で展開し、さらに過マンガン酸カリウム水溶液で発色させた。基質のD−ミオ−イノシトールのスポットと、D−キロ−イノシトールのスポットが認められた。
実施例7
Error prone法によるD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ遺伝子の改変
(1)D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニット遺伝子及びαユニット遺伝子をコードするプラスミドDNA pBA19をテンプレートとして用いて、βユニット遺伝子とαユニット遺伝子をPCRで増幅した。この際、鋳型となるDNAに対して間違った塩基がDNA1分子当たり1〜数カ所ランダムに入るような条件でPCRを行った。このために、以下のような5’末端にEcoRI siteあるいはBamHI siteを付加したプライマー(Bepi−8F/Aepi−9R)を設計し作製した。
次に、このプライマー2種すなわちBepi−8FおよびAepi−9Rを用いてかつ前記エピメラーゼβユニット遺伝子及びα遺伝子を保有するプラスミドDNA−:pBA19をテンプレートとして用いてPCRを行なった。
PCR用の反応液組成は、通常の反応液組成の中にMnCl2を添加し、さらに4種のdNTPの割合を変えたものを用いた。すなわち、LA Taq polymerase反応用緩衝液(宝酒造)、2.5mM MgCl2、0.1〜0.3mM MnCl2、0.2mM dATP、dGTP、0.5mM dCTP、dTTP、LA Taq polymerase2.5ユニットから成るものとした。
PCR反応は、PCR増幅装置(Biometra社 T Gradient)を用い、変性を98℃、20秒間、アニーリングを50℃、1分間、伸長を68℃、2分間行う3段階の反応を25回繰り返し、最後に72℃で伸長反応を2分間行うことにより実施した。
上記のPCR反応によって約2kbpの大きさのDNA断片が増幅した。このPCR増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてDNA増幅生成物を分画した。上記の約2 kbpの大きさのDNA断片をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈澱した。得られたDNA断片の精製品をTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解した。
さらに、このPCR増幅DNAを、K緩衝液(20mM Tris−HCl,pH8.5,10mM MgCl2,1mMジチオスレイトール、100mM KCl)中で制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、5’側にEcoRI部位、3’側にBamHI部位を持つDNA断片を得た。
このDNA断片は、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニットの遺伝子(すなわちβユニット遺伝子)とαユニットの遺伝子(すなわちαユニット遺伝子)との両方を内部に含有するDNAであり、その分子中にはランダムに1〜数カ所の塩基置換が生じた集合体である。
(2)一方、上で作製したβ遺伝子およびα遺伝子内に変異が生じたDNA断片を大腸菌で発現させるためのプラスミドを次のように作製した。すなわち、プラスミドベクターpUC18に前記のDNA断片を連結させる。このために、先ずベクターpUC18をK緩衝液(20mM Tris−HCl、pH8.5、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトール、100mM KCl)中で制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、ベクター消化物を得た。
前記のDNA断片とEcoRIとBamHIで消化されたプラスミドベクターpUC18のベクター消化物とを、DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)により連結した。すなわち、精製したPCR増幅DNA断片の溶液とプラスミドベクターpUC18のEcoRIおよびBamHI消化物を混合し、等量のDNA Ligation kit ver.2のSolution Iを加え、16℃、一晩保温して、ベクターDNAとDNA断片との連結反応を行った。これによって、その分子内に塩基置換が生じたβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の両方を内部に含有するDNA断片と、ベクターpUC18との連結体であるプラスミドが構築された。
このランダムに塩基置換が生じたβユニット遺伝子あるいはαユニット遺伝子を含有するプラスミドの集合体を、大腸菌JM109株の菌体に導入した。連結DNA溶液と大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合し、氷中で30分間、42℃で40秒間、さらに氷中で2分間静置した。その後、SOC培地(2%バクト−トリプトン、0.5%酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース,10mM MgSO4、10mM MgCl2)を加えて、37℃で1時間大腸菌を振とう培養した。
この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml)、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)含むLB寒天培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.0、1.5%寒天)に塗布し、37℃、16時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドDNAで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択して分離した。得られた形質転換体は、βユニット遺伝子及びαユニット遺伝子のいろいろな箇所の塩基が置換されたプラスミドを有しているライブラリーである。
(3)上記で得られた、βユニット遺伝子あるいはαユニット遺伝子内にランダムに塩基置換が生じた形質転換大腸菌ライブラリーを、基質D−ミオ−イノシトール(8mg/ml)、アンピシリン50μg/ml及びIPTG 1mMを添加されたLB液体培地で培養した。37℃、3日間培養した後に培養液をシリカゲルTLC(Merck社、Art5715)にかけ、展開溶媒クロロホルム−メタノール−水(5:5:1)で展開した。シリカゲル薄層に過マンガン酸カリウム溶液を噴霧させてスポットを発色させた。コントロールとして変異の入っていないエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を含有するプラスミドpBA19の形質転換大腸菌JM109−pBA19の培養液を用いた。
TLC上でコントロールより生成物であるD−キロ−イノシトールの発色スポットが大きくなったものを選別した。選別したクローンについて、再度培養を行い活性の再現性を確認し、再現性が得られたものについて培養液上清をHPLCで分析した。HPLC分析にてD−ミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールへの変換率がコントロールと比較して1.2倍以上あったものについて複数本培養を行い、統計的に有為に変換率が高まったものをさらに選別した。これらのクローンについてはエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の塩基配列を解析して、変異箇所を同定した。塩基配列解析は、DNA塩基配列解析装置(PE Biosystems 377XL)を用い、ダイターミネーター サイクル シークエンス法で行った。
上記のようにD−ミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールへの変換が増大したクローンのスクリーニングによって、変換率がコントロールと比較して1.3〜1.5倍程度統計的に有為に増大しているものとして、Y57−11E株が選別された。Y57−11E株の保有するプラスミドDNAを抽出してそのエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の塩基配列を解析したところ、βユニット遺伝子の106番目の塩基がGからAに置換し、アミノ酸としては36番目のアミノ酸がバリンからイソロイシンに変わっていた。Y57−11E株からプラスミドを抽出して大腸菌JM109へ再度形質転換させたものでも、D−ミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールへの変換活性は同程度に増大していた。すなわち、変換活性の増大は、βユニット遺伝子の36番目アミノ酸がバリンからイソロイシンに変わったことに由来していることが確認された。そこで、このβユニット遺伝子の36番目のアミノ酸をバリンやイソロイシン以外の18種類のアミノ酸に置換させて変換活性がどのように変化するか検討することとした。
実施例8
部位特異的総変異によるD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニット遺伝子36番目アミノ酸の置換
(1)実施例7でランダムに変異を導入することにより変換活性の増大したクローンが得られた。そのうちβユニット遺伝子の36番目アミノ酸が置換することによって変換活性が増大したことに着目して、36番目のアミノ酸を他のすべてのアミノ酸に置き換えて活性との相関を検討した。
前記エピメラーゼβユニット遺伝子36番目のアミノ酸だけを特異的に変えるために以下のような手法を用いて実施した。エピメラーゼβユニット遺伝子の上流から36番目アミノ酸のコドンを混合塩基のNNNとして39番目アミノ酸までの上流領域断片を以下に示したBepi−16F/Bepi−14Rプライマーで増幅し、36番目アミノ酸のコドンを混合塩基のNNNとして33番目アミノ酸からαユニット遺伝子の最後までの下流領域断片をBepi−17F/Aepi−10Rプライマーで増幅した。
増幅したDNA断片は、そのβユニット遺伝子の36番目アミノ酸に相当する配列がいろいろなアミノ酸をコードする配列を有する集合体である。得られた上流領域断片と下流領域断片はβユニット遺伝子内の33番目アミノ酸から39番目アミノ酸までが重複しているのでこれらの断片をアニールさせたものをテンプレートとして、βユニット遺伝子の上流配列のプライマーBepi−16Fとαユニット遺伝子の下流配列のプライマーAepi−10RでPCRを行い、エピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の全長を得ることができた。
(2)一方、上で作製したβユニット遺伝子の36番目アミノ酸が置き換わったDNA断片を大腸菌で発現させるためのプラスミドを次のように作製した。すなわち、プラスミドベクターpUC18に前記のDNA断片を連結させる。このために、先ずベクターpUC18をK緩衝液(20mM Tris−HCl、pH8.5、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトール、100mM KCl)中で制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、ベクター消化物を得た。
前記のDNA断片とEcoRIとBamHIで消化されたプラスミドベクターpUC18のベクター消化物とを、DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)により連結した。すなわち、精製したPCR増幅DNA断片の溶液とプラスミドベクターpUC18のEcoRIおよびBamHI消化物を混合し、等量のDNA Ligation kit ver.2のSolution Iを加え、16℃、一晩保温して、ベクターDNAとPCR増幅DNA断片との連結反応を行った。これによって、36番目のアミノ酸が20種類のアミノ酸に置き換わったβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の両方を内部に含有するDNA断片と、ベクターpUC18との連結体であるプラスミドが構築された。
このランダムに塩基置換が生じたβユニット遺伝子あるいはαユニット遺伝子を含有するプラスミドの集合体を、大腸菌JM109株の菌体に導入した。連結DNA溶液と大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合し、氷中で30分間、42℃で40秒間、さらに氷中で2分間静置した。その後、SOC培地(2%バクト−トリプトン、0.5%酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース、10mM MgSO4、10mM MgCl2)を加えて、37℃で1時間大腸菌を振とう培養した。
この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml)、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)含むLB寒天培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.0、1.5%寒天)に塗布し、37℃、16時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記の組換えプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択して分離した。得られた形質転換体は、βユニット遺伝子の36番目アミノ酸が20種類のアミノ酸に置換されたプラスミドを有しているライブラリーである。
前記ライブラリーから白色コロニーを選別して、βユニット遺伝子の塩基配列を解析して、βユニット遺伝子の36番目アミノ酸がどのようなアミノ酸に置換されたか確認した。塩基配列解析は、DNA塩基配列解析装置(PE Biosystems 377XL)を用い、ダイターミネーター サイクル シークエンス法で行った。下記の第1表に示すようにβユニット遺伝子の36番目アミノ酸をコードする3塩基の並びが34種類の変異体が得られ、その結果、グルタミン、メチオニンを除く18種類のアミノ酸に置き換えることができた。
それぞれの変異株を基質D−ミオ−イノシトール(8mg/ml)、アンピシリン50μg/ml及びIPTG 1mMを添加したLB液体培地で37℃、4日間培養し、その培養上清を遠心回収して培養液中の基質D−ミオ−イノシトールの変換物をHPLCにて分析した。
コントロールとして、テンプレートとして用いたpBA19プラスミドを保持する大腸菌株pBA19−JM109とβユニット遺伝子の36番目アミノ酸がイソロイシンに置換したY57−11E株を培養して用いた。コントロールpBA19−JM109株のD−ミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールへの変換率を1.0とした時の変異株の変換率の相対値をもとめ添付の表に記した。その結果、36番目アミノ酸をイソロイシンに置き換えたものが最も変換活性が増大していた。
実施例9
集積培養菌からのエピメラーゼ相同遺伝子の単離
(1)アグロバクテリウム・エスピー10121株からクローニングしたD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ βユニット遺伝子あるいはαユニット遺伝子の配列を指標にして自然界の土壌に生息する菌からエピメラーゼ遺伝子に相同性のある遺伝子が得られるかを試行した。
土壌サンプルは、各地から採取して、約300mgを1mlの滅菌水に懸濁した。ボルテックスミキサーでよく混合して、室温で1時間静置してその上清10μlを以下に示す集積培地に添加した。集積培地はD−ミオ−イノシトールあるいはD−キロ−イノシトールを唯一の炭素源とする培地で、その組成は1リットル当たりの量として下記の通りである。
この集積培地2mlを遠沈管に入れ、上に記した土壌サンプル懸濁液を添加し、28℃で4〜7日間振とう培養し、新しい集積培地に培養液を植え継ぐ操作を繰り返した。
基質であるD−ミオ−イノシトールの方がD−キロ−イノシトールよりよく増殖しているもの、あるいはD−ミオ−イノシトールにのみ菌が増殖しているものを選別した。
(2)上で選別した菌の培養液を遠心して培養菌体を回収した。菌体からの染色体DNAの抽出は宝酒造(株)製の“Genとるくん”を使用してその使用説明書に従い、以下のように抽出、精製した。すなわち、培養液から得た菌体をGenTLE Yeast Solution I 180μlに懸濁した。GenTLE Yeast Solution IIを20μl加えvortexによりよく撹拌し、70℃で10分間加熱した。GenTLE Yeast Solution IIIを100μl加え、穏やかに混合する。マイクロチューブを氷中に置き、1分ごとに転倒混和しながら5分間冷却した。12000 rpmで遠心し、上清を新しいチューブに移してフェノール抽出を2回行った。クロロホルムで抽出後に、クロロホルム抽出液に、1/10容の3M酢酸ナトリウムを加えてから約2.5倍容のエタノールを加えてDNAを沈殿させた。沈澱させたDNAを乾燥後、TE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解した。この染色体DNAは次のPCRでテンプレートとして用いる。
炭素源としてD−ミオ−イノシトールを資化できる土壌由来の菌から染色体DNAを抽出したので、これをテンプレートとして用いてアグロバクテリウム・エスピー10121株からクローニングしたD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニットあるいはαユニット遺伝子に相同なDNA配列が得られるかどうかを、PCR法にて次のように試みた。
アグロバクテリウム・エスピー10121株ではエピメラーゼβユニット遺伝子とαユニット遺伝子がタンデムに近接して存在していたので、βユニット遺伝子とαユニット遺伝子を連結した状態で増幅できるか検討した。このために、βユニット遺伝子の開始コドンから21塩基のDNA配列にクローニング部位としてEcoRI siteをつなげた下記のプライマーBepi−10F、およびαユニット遺伝子のC末端配列18塩基と終止コドンにクローニング部位としてBamHI siteをつなげた下記のプライマーAepi−9Rを設計した。
PCR用の反応液組成は、LA Taq polymerase反応用緩衝液(宝酒造)、2.5mM MgCl2、dATP、dGTP、dCTP、dTTP混合溶液(各0.4mM)、LA Taq polymerase2.5ユニットから成るものとした。
PCR反応は、PCR増幅装置(Biometra社 T Gradient)を用い、変性を95℃、3分間、さらに、変性を94℃、30秒間、アニーリングを42℃、1分間、伸長を68℃、2分間行う3段階の反応を35回繰り返し、最後に72℃で伸長反応を2分間行うことにより実施した。
上記のPCR反応によって、独立して採取した土壌由来の菌すべてにβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の大きさの約2kbに相当するDNAが増幅した。このPCR増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてDNA増幅生成物を分画した。上記の約2.0kbpの大きさのDNA断片をアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈澱した。得られたDNA断片の精製品をTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解した。
さらに、このPCR増幅DNAをK緩衝液(20mM Tris−HCl、pH8.5、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトール、100mM KCl)中で制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、5’側にEcoRI部位、3’側にBamHI部位を持つDNA断片を得た。
(3)一方、土壌菌由来のエピメラーゼβユニット遺伝子及びαユニット遺伝子に相同なDNA断片を大腸菌で発現させるためのプラスミドを次のように作製した。すなわち、プラスミドベクターpUC18に前記のDNA断片を連結させる。このために、先ずベクターpUC18をK緩衝液(20mM Tris−HCl、pH8.5、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトール、100mM KCl)中で制限酵素EcoRIとBamHIで消化して、ベクター消化物を得た。
前記のDNA断片とEcoRIとBamHIで消化されたプラスミドベクターpUC18のベクター消化物とを、DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)により連結した。すなわち、精製したPCR増幅DNA断片の溶液とプラスミドベクターpUC18のEcoRIおよびBamHI消化物を混合し、等量のDNA Ligation kit ver.2のSolution Iを加え、16℃、一晩保温して、ベクターDNAとDNA断片との連結反応を行った。これによって、土壌菌由来のエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子に相同な配列を保有するプラスミドが構築された。
上記で作製したプラスミドを大腸菌JM109株の菌体に導入した。連結DNA溶液と大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)とを混合し、氷中で30分間、42℃で40秒間、さらに氷中で2分間静置した。その後、SOC培地(2%バクト−トリプトン、0.5%酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース、10mM MgSO4、10mM MgCl2)を加えて、37℃で1時間大腸菌を振とう培養した。
この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン(50μg/ml)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド;40μg/ml)、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;100μM)含むLB寒天培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.0、1.5%寒天)に塗布し、37℃、16時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記の組換えプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択して分離した。得られた形質転換体を基質D−ミオ−イノシトール(8mg/ml)、アンピシリン50μg/ml及びIPTG 1mMを添加したLB液体培地で37℃、4日間培養した。その培養上清を遠心回収して培養液中の基質D−ミオ−イノシトールの変換物をHPLCにて分析した。
コントロールとして、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のエピメラーゼ遺伝子を保持する大腸菌株pBA19−JM109を同時に培養した。土壌菌から得たエピメラーゼに相同なDNA配列を含有する大腸菌株においても、基質D−ミオ−イノシトールをD−キロ−イノシトールへ変換する活性を有していた。その変換活性は、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株からクローニングしたエピメラーゼ活性と同等であった。土壌菌由来のエピメラーゼ活性を発現しうるDNAの塩基配列を解析し、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株由来のエピメラーゼ遺伝子の塩基配列と比較した。塩基配列解析は、DNA塩基配列解析装置(PE Biosystems 377XL)を用い、ダイターミネーター サイクル シークエンス法で行った。その結果、βユニット遺伝子99番目の塩基GがTに置換しているだけで(アミノ酸としては、ロイシンのまま)他の領域の塩基配列は一致していた。
以上のように、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株よりクローニングしたD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子に相同なDNA配列は、自然界に広く存在し、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼ活性を発現させることが可能である。
実施例10
本例では、前記の実施例6(ロ)と同様にして、培地中で前記の形質転換大腸菌JM109−pBA19株を培養しながら菌体を基質D−ミオ−イノシトールに作用させる変換反応を用いて、D−ミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールを生成、単離する方法を行った。
すなわち、前記の実施例4で得られた形質転換大腸菌JM109−pBA19株を、アンピシリン50μg/ml添加したLB液体培地で、菌体量が吸光度A600=1.0になるまで前培養し、植菌用菌体溶液を調製した。本培養は、D−ミオ−イノシトール100g、Bacto Tripton 20g、Bacto Yeast Extract 50gおよび酢酸アンモニウム50g、MnCl2 10gを10Lの蒸留水に加えて、pH7.0に調整した後、オートクレーブにより滅菌し、冷却後、32℃に保温した培養液に、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドを1mMになるように加えた。これに上記の植菌用菌体溶液を100ml加えて培養した。
培養はジャーファメンターにて、通気、攪拌し、32℃で2日間培養を行った。培養2日後、基質として加えられたD−ミオ−イノシトールの内、15.5%がD−キロ−イノシトールに変換された。
培養液は連続遠心装置で、菌体と培養ろ液に分離し、培養ろ液を陽イオン交換樹脂(DuoliteC20−Htype:200ml)カラムと陰イオン交換樹脂(DuoliteA116−OHtype:200ml)カラムを通過させて脱塩し、さらに活性炭カラムを通過させて脱色した。このように調製した溶液を濃縮し、白色粉末95gを得た。これに125mlの蒸留水を加えて加熱溶解させた後、4℃まで冷却し、D−ミオ−イノシトールを結晶として析出させた。結晶はろ過により除去された。
得られたろ液をさらに40mlまで濃縮し、室温で析出するD−ミオ−イノシトールをさらにろ過により除去した。このろ液を陰イオン交換樹脂(AmberliteCG400−OHtype:3000ml)カラムに供し、蒸留水で溶出した。溶出液を分画し、D−ミオ−イノシトールとD−キロ−イノシトールを分離し、D−キロ−イノシトール含む画分を集めて濃縮し、D−キロ−イノシトールの白色粉末10.9gを得た。このようにして得られたD−キロ−イノシトールの物理的性質は、比旋光度[α]D 25が+65°(c=1.0,H2O)であり、光学純度99%以上、融点238℃であった。
実施例11
本例では、実施例6(ロ)と同様に、培地中で形質転換大腸菌JM109−pBA19株を培養しながら菌体を基質D−ミオ−イノシトールに作用させる変換反応を用いて、D−ミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールを生成、単離する方法を行った。
すなわち、実施例4で得られた形質転換大腸菌JM109−pBA19株を、アンピシリン50μg/ml添加したLB液体培地で、菌体量が吸光度A600=1.0になるまで前培養し、植菌用菌体溶液を調製した。本培養は、基質としてD−ミオ−イノシトール100g、Bacto Tripton 20g、Bacto Yeast Extract 50gおよび酢酸アンモニウム50g、MnCl2 10gを10Lの蒸留水に加えて、pH7.0に調整した後、オートクレーブにより滅菌し、冷却後、32℃に保温した培養液に、上記の植菌用菌体溶液を100ml加えて培養した。培養はジャーファメンターにて、通気、攪拌し、32℃で3日間培養を行った。培養3日後、基質として加えられたD−ミオ−イノシトールの内、15%がD−キロ−イノシトールに変換された。
培養液は連続遠心装置で、菌体と培養ろ液に分離し、培養ろ液を陽イオン交換樹脂(DuoliteC20−Htype:200ml)カラムと陰イオン交換樹脂(DuoliteA116−OHtype:200ml)カラムを通過させて脱塩し、さらに活性炭カラムを通過させて脱色した。このように調製した溶液を濃縮し、白色粉末96gを得た。これに125mlの蒸留水を加えて加熱溶解させた後、4℃まで冷却し、D−ミオ−イノシトールを結晶として析出させた。結晶はろ過により除去された。
得られたろ液をさらに40mlまで濃縮し、室温で析出するD−ミオ−イノシトールをさらにろ過により除去した。このろ液を陰イオン交換樹脂(AmberliteCG400−OHtype:3000ml)カラムに供し、蒸留水で溶出した。溶出液を分画し、D−ミオ−イノシトールとD−キロ−イノシトールを分離し、D−キロ−イノシトールを含む画分を集めて濃縮し、D−キロ−イノシトールの白色粉末10.7gを得た。このようにして得られたD−キロ−イノシトールの物理的性質は、比旋光度[α]D 25が+65°(c=1.0,H2O)であり、光学純度99%以上、融点238℃であった。
産業上の利用可能性
本発明に従えば、特定のD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼをコードするDNA、その改変DNAが提供され、またそれらのDNAを利用したD−キロ−イノシトールの効率のよい製造方法が提供される。D−キロ−イノシトールは、II型糖尿病あるいは多嚢胞性卵巣症候群の治療剤として利用が期待される物質である。したがって、本発明は、例えば、医薬の製造において有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第1図は、第10の本発明方法で用いる大腸菌の形質転換株に利用できるプラスミドpBA19の構造図を示す。
Claims (15)
- D−ミオ−イノシトールを1−エピ化によりD−キロ−イノシトールに変換する酵素活性とD−キロ−イノシトールを6−エピ化によりD−ミオ−イノシトールに変換する酵素活性とを有するD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのβユニットタンパク質を構成するところの配列表の配列番号2に示されたアミノ酸配列をコードするDNA領域(i)と、前記D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットタンパク質を構成するところの配列表の配列番号3に示されたアミノ酸配列をコードするDNA領域(ii)とから成るDNA。
- 請求の範囲第1項に記載される配列表の配列番号2のアミノ酸配列をコードするDNA領域(i)は、配列表の配列番号1に示される2581 bpのサイズの塩基配列の587番目の塩基Aから1594番目の塩基Gに至る1008 bpのサイズのDNA配列であり、また請求の範囲第1項に記載される配列表の配列番号3のアミノ酸配列をコードDNA領域(ii)は、配列表の配列番号1に示される2581 bpのサイズの塩基配列の1606番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る783 bpのサイズのDNA配列であることを特徴とする、請求の範囲第1項に記載のDNA。
- 請求の範囲第1項に記載されるD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼは、産業技術総合研究所にブダペスト条約によりFERM BP−7679の受託番号で寄託されたアグロバクテリウム・エスピーAB10121株の細菌に由来するD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼである、請求の範囲第1項に記載のDNA。
- 請求の範囲第1項に記載のDNAを内部DNA領域として含有するDNA断片であって、配列表の配列番号1に記載される2581 bpのサイズの塩基配列の464番目の塩基Aから2394番目の塩基Gに至る1931 bpのサイズの塩基配列を有することを特徴とする、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの各遺伝子を内部に含有するDNA断片。
- 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列をコードするDNAであって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニットのタンパク質をコードするDNA。
- 配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列をコードするDNAであって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼαユニットのタンパク質をコードするDNA。
- 配列表の配列番号1に記載される2581bpのサイズの塩基配列の587番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る1802bpのサイズの塩基配列をもつDNAによってコードされるタンパク質であって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの酵素活性を有するタンパク質。
- 配列表の配列番号2に示される336個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列と、配列番号3に示される261個のアミノ酸によりなるアミノ酸配列とを含有する、請求の範囲第7項に記載のタンパク質。
- 配列表の配列番号1に記載される2581bpのサイズの塩基配列の587番目の塩基Aから1594番目の塩基Gに至る1008bpのサイズのDNAによってコードされるタンパク質であって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼβユニットの活性を有するタンパク質。
- 配列表の配列番号1に記載される2581bpのサイズの塩基配列の1606番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る783bpのサイズのDNAによってコードされるタンパク質であって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼαユニットの活性を有するタンパク質。
- 配列表の配列番号1に記載される2581bpのサイズの塩基配列の587番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る1802bpのサイズの塩基配列をもつDNAにおける1個もしくは数個の塩基が欠失、置換および(または)付加されることで形成された改変DNAであって、前記の1802bpのサイズの塩基配列をもつDNAに対してストリジェントな条件でハイブリダイズすることができ且つD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの酵素活性をもつタンパク質をコードする改変DNA。
- 配列表の配列番号1に記載される2581bpのサイズの塩基配列の587番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る1802bpのサイズの塩基配列をもつDNAにおける692番目の塩基Gが塩基Aにより置換されることにより形成された改変DNAである、請求の範囲第11項に記載の改変DNA。
- 配列表の配列番号1に記載される2581bpのサイズの塩基配列の587番目の塩基Aから2388番目の塩基Aに至る1802bpのサイズの塩基配列をもつDNAによりコードされるところの、配列番号1に記載の合計597個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列における36番目のアミノ酸、バリンがイソロイシンにより置換されることにより形成された組換タンパク質であって、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの酵素活性をもつ組換タンパク質をコードする、請求の範囲第12項に記載の改変DNA。
- 請求の範囲第1項に記載のDNA、あるいは該DNAの一部からなるDNAを、PCR法のためのプローブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、D−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAのクローニング方法。
- 制限酵素EcoRIとBamHIで消化されたプラスミドベクターpUC18のDNAの切断断片に対して、配列表の配列番号1に記載される2581bpのサイズの塩基配列のうちの464番目の塩基Aから2394番目の塩基Gに至る請求の範囲第4項に記載の1931bpのサイズの塩基配列を有して且つD−ミオ−イノシトール 1−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの各遺伝子を内部に含有するDNA断片を連結してなるプラスミドが、導入されることにより形質転換された宿主微生物を作成し、この形質転換した宿主微生物を培養して宿主菌体内に導入した遺伝子を発現させ、このように導入遺伝子を発現させた形質転換宿主微生物の菌体を、緩衝液または培地中でD−ミオ−イノシトールに作用させてD−キロ−イノシトールを生成することから成る、D−キロ−イノシトールの製造法。
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