KR102017776B1

KR102017776B1 - 휴면 세포 전환법을 이용한 ｄ-카이로 이노시톨의 생산 방법

Info

Publication number: KR102017776B1
Application number: KR1020120147672A
Authority: KR
Inventors: 명현군; 윤상활; 이현서
Original assignee: 주식회사 디와이내츄럴
Priority date: 2012-12-17
Filing date: 2012-12-17
Publication date: 2019-09-03
Also published as: WO2014098453A1; KR20140078381A

Abstract

본 발명은 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 재조합 세포의 휴면세포를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면, 최소배지를 이용하고, 휴면세포의 반복사용이 가능하며, 완전배지 사용과 비교하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨 전환 수율도 동등하므로, D-카이로-이노시톨의 대량 생산시 제조비용을 크게 절감할 수 있다. 또한, 최소 배지를 배양에 사용하므로, 완전 배지의 사용과 비교하여 D-카이로-이노시톨의 정제 효율도 크게 향상시킬 수 있다.

Description

휴면 세포 전환법을 이용한 Ｄ-카이로 이노시톨의 생산 방법{Method for Producing Ｄ-Chiro-Inositol by Using the Resting Cell Conversion}

본 발명은 재조합 세포의 휴면세포를 이용한 Ｄ-카이로 이노시톨의 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 마이오-이노시톨(myo-inositol)로부터 D-카이로-이노시톨(D-chiro-inositol)로 전환시키는 효소를 발현하도록 제조한 재조합 세포의 휴면세포를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로 이노시톨을 생산하는 방법에 관한 것이다.

D-카이로-이노시톨(D-chiro-inositol)은 마이오-이노시톨(myo-inositol)의 스테레오이소머로서 3번 하이드록실 그룹이 에피머화된 형태이다(도 1). D-카이로-이노시톨은 이노시톨 포스포글리칸(IPG)의 주요 구성성분으로 인슐린 신호전달의 중요한 매개체로 보고되어 있으며, 제2형 당뇨의 치료에 효과가 있다고 알려져 있다. D-카이로-이노시톨은 주로 진핵생물에서 발견되며, 마이오-이노시톨의 에피머화에 의해 생합성된다. D-카이로-이노시톨은 주로 피니톨(D-pinitol)이나 카스가마이신(kasugamycin)의 염산 가수분해에 의해 생산하고 있다(U.S. Pat No. 5827896, U.S. Pat No. 5091596, U.S. Pat No. 5463142, U.S. Pat No.5714643). 그러나, 원료인 피니톨이나 카스가마이신이 고가이며, 유기합성법(U.S. Pat No. 5406005, WO 96/25381)도 알려져 있으나, 부산물의 분리가 용이하지 않아 경제성이 낮다. Yamamoto 등은 Agrobacterium sp. AB10121의 MI 에피머라제(epimerase)를 발현시킨 세균을 이용하여 마이오-이노시톨로부터 카이로-이노시톨로 전환하는 방법을 제시하였다(JP2001-006878, WO 2002/055715). Yamamoto 등에 의한 방법은 마이오-이노시톨로부터 약 15％ 수율로 D-카이로-이노시톨을 생산할 수 있으나, 보다 개선된 방법에 의한 D-카이로-이노시톨 생산 방법의 개발이 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조 되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 재조합 세포를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 높은 수율로 생산할 수 있는 기술을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 마이오-이노시톨 트랜스포터(myo-inositol transporter), 이노시톨 디하이드로게나아제(myo-inositol dehydrogenase) 및 이노소스 이소머라아제(inosose isomerase)를 발현하는 재조합 세포를 제조하고, 이 재조합 세포의 휴면세포(resting cell)를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하면, D-카이로-이노시톨의 제조비용 감소 및 정제 효율의 증대 효과가 있음을 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 재조합 세포의 휴면세포를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 휴면세포를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 재조합 세포를 준비하는 단계; (b) 상기 재조합 세포를 마이오-이노시톨을 포함하는 배지에서 정지기(stationary phase) 까지 배양하여 휴면세포(resting cell) 상태로 유도하는 단계; 및 (c) 상기 휴면세포를 회수하고 마이오-이노시톨을 포함하는 최소 배지(minimal medium)에서 배양하여 D-카이로-이노시톨을 생성시키는 단계.

이하에서 본 발명을 각 단계에 따라 보다 상세하게 설명한다.

단계 (a) : 마이오-이노시톨 트랜스포터 , 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 재조합 세포를 준비하는 단계

본 명세서에서 용어 "마이오-이노시톨 트랜스포터(myo-inositol transporter)"는 마이오-이노시톨을 세포내로 이동시키는 수송효소를 의미한다. 대부분의 세포는 배지내의 이노시톨을 세포내로 흡수하는 이노시톨 수송 시스템을 갖고 있으며, 마이오-이노시톨 트랜스포터는 포유동물 세포에서부터 박테리아에 이르기 까지 다양한 세포에서 확인되어 있다. 에어로박터 에어로게네스(Aerobacter aerogenes) [Deshusses, J., and Reber, G., 1972, Biochim. Biophys. Acta 274, Bacteriol. 126, 243-250], 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) [Reber, G., Belet, M., and Deshusses, J., 1977, J. Bacterol. 131, 872-875], 슈도모나스(Pseudomonas) 종 [Gauchat-Feiss, D., Frey, J., Belet, M., and Deshusses, J., 1985, J. Bacteriol. 162, 324-327]와 같은 박테리아에서 마이오-이노시톨 트랜스포터 유전자가 분리되었다고 보고되었으며, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) (Nikawa, J., Nagumo, T., and Yamashita, S. (1982) J. Bacteriol. 150, 441-446)와 같은 효모에서도 마이오-이노시톨 트랜스포터 유전자가 분리되어 보고되었다. 또한, 마이오-이노시톨 트랜스포터는 주타입(major type)과 부타입(minor type)이 존재하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 마이오-이노시톨 트랜스포터는 포유동물 세포, 효모세포 또는 박테리아로부터 유래된 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 마이오-이노시톨 트랜스포터는 박테리아 유래의 것을 사용한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 마이오-이노시톨 트랜스포터는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium) 또는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)으로부터 분리된 것을 사용한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 마이오-이노시톨 트랜스포터는 살모넬라 티피무리엄(S. typhimurium) 유래의 트랜스포터를 사용한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 마이오-이노시톨 트랜스포터는 서열번호 1 및 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 갖는다.

본 명세서에서 용어 "이노시톨 디하이드로게나아제(inositol dehydrogenase)"는 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이 마이오-이노시톨을 NAD⁺ 의존성 산화작용에 의해 2-케토-마이오-이노시톨(2-keto-myo-inositol)로 변환시키는 화학반응 또는 이의 역방향 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소이다. 본 명세서에서 "이노시톨 디하이드로게나아제"와 관련하여 이를 코딩하는 유전자 명칭은"iolG"으로 기재한다.

[반응식 1]

마이오-이노시톨 + NAD⁺ ↔ 2-케토-마이오-이노시톨 + NADH + H⁺

이노시톨 디하이드로게나아제는 에어로박터 에어로게네스(Aerobacter aerogenes) [Berman T, Magasanik B (1966). J. Biol. Chem. 241 (4): 800-806; LARNER J, JACKSON WT, GRAVES DJ, STAMER JR (1956). Arch. Biochem. Biophys. 60 (2): 352-363)과 효모 크립토코커스 멜리비오숨(Cryptococcus melibiosum)[Vidal-Leiria M, van Uden N (1973). Biochim. Biophys. Acta. 293 (2): 295-303]에서 분리되었다고 보고되어 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 이노시톨 디하이드로게나아제는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 클루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로 부터 분리된 것이다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 이노시톨 디하이드로게나아제는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나를 사용한다.

본 명세서에서 용어 "이노소스 이소머라아제(inosose isomerase)"는 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 2-케토-마이오-이노시톨을 1-케토-D-카이로-이노시톨(1-keto-D-chiro-inositol)로 전환하는 이성질체화 반응 또는 이의 역방향 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소이다. 본 명세서에서 "이노소스 이소머라아제"와 관련하여 이를 코딩하는 유전자 명칭은 "iolI"로 기재한다.

[반응식 2]

2-케토-마이오-이노시톨 ↔ 1-케토-D-카이로-이노시톨

본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 이노소스 이소머라아제는 박테리아 유래의 것을 사용한다. 본 발명의 다른 일 구현예에 의하면, 본 발명의 이노소스 이소머라아제는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로부터 분리된 것이다. 본 발명의 다른 일 구현예에 의하면, 본 발명의 이노소스 이소머라아제는 서열번호 5, 서열번호 7, 및 서열번호 9에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나를 사용한다.

상기 반응식 2에 의해 생성된 1-케토-D-카이로-이노시톨은 하기 반응식 3에 의해 본 발명의 최종산물인 D-카이로-이노시톨을 생성한다. 하기 반응식 3의 반응은 앞서 설명된 효소인 "이노시톨 디하이드로게나아제" 가 촉매한다.

[반응식 3]

1-케토-D-카이로-이노시톨 + NADH + H⁺ ↔ D-카이로-이노시톨 + NAD⁺

상기 "마이오-이노시톨 트랜스포터", "이노시톨 디하이드로게나아제" 및 "이노소스 이소머라아제"를 발현하는 재조합 세포는 상기 반응식 1 내지 반응식 3의 연속적인 반응을 통해 배지에 포함된 마이오-이노시톨을 D-카이로-이노시톨로 전환한다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 재조합 세포는 마이오-이노시톨 트랜스포터를 코딩하는 DNA 서열, 이노시톨 디하이드로게나아제를 코딩하는 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 서열을 발현가능한 형태로 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포이다.

본 발명의 다른 구현예에 의하면, 마이오-이노시톨 트랜스포터를 코딩하는 DNA 서열, 이노시톨 디하이드로게나아제를 코딩하는 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 서열은 단일의 재조합 벡터에 발현 가능한 형태로 포함될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 상기 DNA 서열들은 각각의 상이한 재조합 벡터에 발현 가능한 형태로 포함될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 본 발명의 재조합 벡터는 (i) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시톨 트랜스포터 코딩 DNA 서열을 포함하는 제1의 재조합 벡터; 및 (ⅱ) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시톨 디하이드로게나아제 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 서열을 포함하는 제2의 재조합 벡터로 이루어진다.

본 발명에서 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제, 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 서열은 재조합 벡터내에서 프로모터에 작동적으로 결합되어 있다.

본 명세서에서 용어"작동적으로 결합된(operatively linked)"은 DNA 서열의 발현조절 서열(예를 들어 프로모터)과 기능적으로 결합되어 있다는 의미로서, 기능적 결합에 의해 DNA 서열의 발현이 발현조절 서열에 의해 조절된다.

본 명세서에서 용어 "프로모터"는 유전자 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다.

본 발명에서의 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 재조합 벡터는 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있으며, 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)가 이용되는 경우, 대장균(E. coli) 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 항생제 내성 유전자는 이의 발현을 위한 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다.

바람직하게는 본 발명의 벡터는 원핵세포용 벡터이며, 원핵 숙주세포, 특히 대장균(E. coli)에서 복제가 가능하도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 벡터는 colA, colE1 또는 p15A의 박테리아의 복제 원점 또는 f1 origin과 같은 박테리오파아지의 복제 원점을 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있다. 예를 들어, 포유동물세포, 곤충세포, 효모와 같은 진핵세포 또는 원핵세포를 들 수 있으나, 바람직하게는 원핵세포를 사용한다. 원핵세포로서는 예컨대, 대장균인 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스, 코리네박테리움 글루타미쿰 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic.Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 상기 재조합 세포는 마이오-이노시톨 트랜스포터를 코딩하는 DNA 서열, 이노시톨 디하이드로게나아제를 코딩하는 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 서열이 발현 가능한 형태로 세포의 염색체안으로 삽입된 형태의 세포이다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 재조합 세포는 동물세포, 곤충세포, 효모 또는 원핵세포이다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 재조합 세포는 원핵세포이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 재조합 세포는 박테리아 세포이다.

단계 (b) : 상기 재조합 세포를 마이오-이노시톨을 포함하는 배지에서 정지기까지 배양하여 휴면세포 상태로 유도하는 단계

상기 단계 (a)에서 제조한 재조합 세포를 휴면세포(resting cell) 상태로 유도하기 위해 상기 재조합 세포를 마이오-이노시톨을 포함하는 완전 배지(complete medium)하에서 정지기(stationary phase) 까지 배양한다.

본 발명에서 재조합 세포의 배양에 사용하는 배지는 당업계에 공지된 통상의 미생물 배양 배지를 사용할 수 있다. 재조합 세포가 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 포함한다면 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 배양은 탄소원, 질소원 및 무기염류가 풍부하게 존재하는 완전배지(complete medium)을 사용하여 행한다. 배지에 포함될 수 있는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 또는 락토오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올, 글리세롤과 같은 알코올 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄, 암모늄설페이트, 암모늄아세테이트 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄염; 펩톤, 육추출물(meat extract), 효모추출물(yeast extract), 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두추출물, 대두가수분해물; 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 무기염은 포타슘다이하이드로젠 포스페이트, 다이포타슘하이드로젠 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 소디엄 클로라이드, 망간 설페이트, 구리 설페이트, 칼슘 카보네이트 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 배지에는 재조합 세포에 도입한 효소의 기질인 마이오-이노시톨을 첨가하여 배양한다. 마이오-이노시톨의 배지내의 농도는 특별히 한정되지 않으나, 1-30％(w/v)이다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 마이오-이노시톨의 배지내의 농도는 5-20％(w/v)의 범위내에서 적합한 농도를 선택하여 사용한다.

본 발명에서 재조합 세포의 배양 방법은 공지된 세포 배양 방법 또는 이를 변형한 방법을 이용하여 행할 수 있다. 재조합 세포의 배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전배양과 같은 호기성 조건 하에서 행한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 배양 온도는 10 - 40℃의 범위에서 적합한 농도를 선택한다. 배양시간은 배양의 규모에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 배양시간은 5 시간 - 7 일의 범위 내에서 적합한 시간을 선택한다. 배지의 pH는 배양 중에서 3.0 - 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배지에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 항생제가 첨가될 수 있으며, 예를 들어, 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 또는 테트라사이클린가 첨가될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 배양하는 경우에는 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 배지에는 탄소원인 동시에 발현 유도제로서 락토오스(lactose)를 사용한다.

본 명세서에서 용어 "휴면세포(resting cell)" 는 더 이상 증식하지 않는 상태의 배양 세포를 의미한다. 본 명세서에서 용어 "정지기(stationary phase)"는 세포를 배양하는 경우 대수기(exponential phase)를 지나 세포의 분열 및 증식이 정지하여 세포 개체 수의 증가가 나타나지 않으며, 세포 성분의 합성과 분해가 균형을 이룬 상태를 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 재조합 세포의 휴면 세포는 균체성장이 완료되고, 세포내에서 원하는 단백질의 발현이 충분히 이루어졌으며, 고농도의 마이오-이노시톨에 적응된 세포를 의미한다. 당업자는 배양액내의 다양한 파라미터를 측정하여 재조합 세포가 정지기에 들어간 휴면세포 상태임을 판단할 수 있다. 본 발명의 일 구현예 의하면, 상기 정지기는 배양 배지내에서 마이오-이노시톨의 농도 및 D-카이로-이노시톨의 농도가 평형 농도에 이른 상태를 의미한다. 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 본 발명의 재조합 세포는 마이오-이노시톨을 포함하는 배지에서 마이오-이노시톨을 D-카이로 이노시톨로 전환하여 생성한다. 배양 배지내에서 기질인 마이오-이노시톨의 농도와 생성물인 D-카이로-이노시톨의 농도가 평형 상태에 이른 경우 정지기에 도달한 것으로 판단할 수 있다. 본 명세서에서 배양액 중의 이노시톨의 농도의 "평형상태"는 이노시톨의 농도가 더 이상 변화되지 않는 상태를 의미한다. 본 발명의 다른 일 구현예에 의하면, 배양액내의 세포농도를 측정한 OD₆₀₀값이 6-12 범위, 보다 더 바람직하게는 6-10의 범위에 있는 경우 재조합 세포가 휴면세포 상태인 것으로 결정할 수 있다.

단계 (c) : 상기 휴면세포를 회수하고 마이오-이노시톨을 포함하는 최소 배지에서 배양하여 D-카이로-이노시톨을 생성시키는 단계

상기 단계 (b)에서 휴면세포로 유도된 재조합 세포의 배양균체를 회수하여 마이오-이노시톨을 포함하는 최소배지에서 배양하면서 D-카이로-이노시톨을 생성시킨다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 재조합 세포의 휴면세포를 회수한 후 완전 배지에 포함된 성분을 제거하기 위해 세척하는 단계를 포함한다. 상기 세척은 마이오-이노시톨을 포함하는 최소배지를 사용하여 현탁시킨 후 원심분리하는 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "최소배지"는 재조합 세포의 휴면세포를 유지시키는데 있어서 필요한 최소한의 성분을 갖는 배지를 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 최소배지는 탄소원 및 무기염을 포함하는 배지를 의미한다. 최소 배지에는 재조합 세포에 도입한 효소의 기질인 마이오-이노시톨을 첨가한다. 마이오-이노시톨의 최소 배지내의 농도는 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 최소배지에서의 마이오-이노시톨의 농도는 1-30％(w/v)의 범위내에서 적합한 농도를 선택하여 사용한다. 본 발명의 다른 일 구현예에 의하면, 마이오-이노시톨의 최소 배지내의 농도는 5-20％(w/v)이다. 최소배지에 포함되는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 또는 락토오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올, 글리세롤과 같은 알코올 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 탄소원은 락토오스이다. 무기염은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 다이소디엄포스페이트(Na₂HPO₄), 모노포타슘포스페이트(KH₂PO₄), 소디엄클로라이드(NaCl), 암모늄클로라이드(NH₄Cl), 칼슘클로라이드(CaCl₂), 또는 마그네슘설페이트(MgSO₄)을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 최소배지에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지를 위해 상기 탄소원과 무기염 이외에 항생제가 추가로 첨가될 수 있다. 항생제는 예를 들어, 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 또는 테트라사이클린가 첨가될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 재조합 세포가 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포인 경우 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다. 바람직하게는 배지에는 탄소원인 동시에 발현 유도제로서 락토오스(lactose)를 사용할 수 있다. 본 발명의 휴면세포로 유도된 재조합 세포를 마이오-이노시톨이 포함된 최소배지에서 배양하면, 숙주 세포내에 이미 발현되어 있는 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제에 의해 마이오-이노시톨이 D-카이로-이노시톨로 빠른 속도로 전환된다. 이러한 전환속도는 일정 수준의 균체 농도에서의 배양법에 의한 전환속도와 비교하여도 매우 빠른 속도이다.

단계 (d) : 상기 단계 (c) 이후에, 배양한 휴면세포를 회수하고, 마이오-이노시톨을 포함하는 최소 배지에서 다시 배양하여 D-카이로-이노시톨을 생성시키는 단계

상기 단계 (c)를 행한 이후에, 최소배지에서 배양한 재조합 세포를 회수하고 마이오-이노시톨을 포함하는 최소 배지를 사용하여 다시 배양하여 D-카이로-이노시톨을 생성시킨다. 상기 단계 (c)에서 D-카이로-이노시톨로의 전환에 사용하였던 재조합 세포의 휴면세포 균체를 회수하여 재사용이 가능하다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 단계 (d)를 1 - 50회의 범위에서 반복하여 행한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 단계 (d)를 1 - 40회 범위에서 반복하여 행한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 단계 (d)를 1 - 30회 범위에서 반복하여 행한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 단계 (d)를 1 - 20회 범위에서 반복하여 행한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 단계 (d)를 1 - 7회 반복하여 행한다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 방법은 상기 휴면세포를 최소배지에서 배양한 후에, 배지에 생성된 D-카이로-이노시톨을 배양액으로부터 분리하여 정제하는 단계를 더 포함한다. D-카이로-이노시톨의 분리 정제를 위해, 먼저 배양액으로부터 배양된 재조합 세포의 휴면세포를 제거한다. 휴면세포는 예를 들어 원심분리 또는 마이크로여과(microfiltration) 방법에 의해 배양액으로부터 제거하고, 휴면세포가 제거된 배양액의 상층액을 얻는다. 배양 상층액으로부터 D-카이로-이노시톨을 얻는 방법은 종래의 공지된 당(sugar) 또는 탄수화물의 분리 정제 방법 또는 이를 변형한 방법을 이용할 수 있다. 종래 공지된 당의 분리 정제방법으로는, 제올라이트 분자체를 이용한 선택적 흡착 방법에 의한 분리방법(미국특허 제 4,482,761호), 양이온교환수지를 이용한 컬럼크로마토그래피에 의한 분리방법(미국특허 제 5,096,594호), 음이온 교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의한 분리방법(미국특허 제 5,482,631호), 활성탄에 의한 흡착 및 유기용매에 의한 용출 방법(대한민국특허 제10-0753982호), 동결건조 및 재결정화 방법 등이 있으며, 이러한 방법을 이용하거나 이 방법의 변형된 방법 및 이 방법들을 조합하여 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 설명된 단계 (c) 또는 (d) 이후에, 다음의 단계를 더 포함하는 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법을 제공한다: (e) 상기 휴면세포 배양이 완료된 최소배지에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계; (f) 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (g) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.

단계 (e): 상기 휴면세포 배양이 완료된 최소배지에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계

휴면세포 배양이 완료된 최소배지에서 D-카이로-이노시톨의 분리 및 정제는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도 차이를 이용하여 행한다. 물을 용매로 사용한 수용액중에서 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도 차이는 도 6에 나타나 있으며, D-카이로-이노시톨의 용해도가 마이오-이노시톨에 비해 훨씬 높다는 것을 알 수 있다. 배양이 완료된 최소배지에 유기용매를 첨가한다. 이러한 유기용매의 첨가에 의해 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 침전이 유도된다. 유기용매 첨가에 의해 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 침전율이 모두 증가되지만, D-카이로-이노시톨에 비해 마이오-이노시톨의 침전율이 훨씬 크게 증가한다(도 8 참조). 휴면세포 배양이 완료된 최소배지에 유기용매를 첨가하여 D-카이로-이노시톨 보다 마이오-이노시톨을 더 많은 양으로 침전시켜 용액중의 D-카이로-이노시톨의 농도를 증대시킬 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 유기용매는 D-카이로-이노시톨의 침전율 보다 마이오-이노시톨의 침전율을 더욱 크게 유도할 수 있는 특성을 갖는 것이면 특별하게 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 유기용매로서 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜 또는 에테르를 사용한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 유기용매로서 탄소수 2-6개의 알코올을 사용한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 유기용매로서 에탄올, 이소프로판올, 아세톤을 사용한다. 휴면세포 배양 완료된 최소배지에 첨가하는 유기용매의 양은 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 유기용매는 최소 배지 대비 0.1 - 9배(v/v)의 범위 내에서 적합한 양을 선택하여 첨가한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 유기용매는 최소 배지 대비 0.1 - 6배(v/v)의 양으로 첨가한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 유기용매는 최소 배지 대비 0.1 - 4배(v/v)의 양으로 첨가한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 유기용매는 최소 배지 대비 0.1 - 2배(v/v)의 양으로 첨가한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 유기용매는 최소 배지 대비 0.1 - 1.5배(v/v)양으로 첨가한다. 유기용매의 첨가에 의해 유도되는 이노시톨 침전물에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 모두 포함되어 있으나, 마이오-이노시톨의 침전율이 더 높으므로, 마이오-이노시톨이 더 많은 양으로 포함되어 있다.

단계 (f): 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계

상기 단계 (e)를 통해 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리한다. 상기 이노시톨 침전물은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전물이지만, 마이오-이노시톨이 더 큰 침전율을 나타내므로, D-카이로-이노시톨 보다는 마이오-이노시톨이 더욱 많은 양으로 포함되어 있다. 마이오-이노시톨의 다량 침전으로 인해 상층액 중에는 마이오-이노시톨의 농도가 낮아지게 되며, D-카이로-이노시톨의 농도(순도)는 상대적으로 증가하게 된다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 이노시톨 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 또는 원심분리 방법을 사용한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 이노시톨 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 방법을 사용하여 행한다.

단계 (g): 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계

상기 단계 (f)에서 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는다. 상기 상층액의 건조는 상층액을 가열하면서 행할 수 있으며, 또는 진공상태에서 행할 수 있다. 상층액을 건조시켜 얻은 이노시톨 분말에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합되어 있으나, 상기 단계 (c) 또는 단계 (d)에서 배양이 완료된 최소배지와 비교하여 D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다.

본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 단계 (g) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법을 제공한다: (h) 상기 단계 (g)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하는 단계; (i) 상기 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계; (j) 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (k) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.

단계 (h) : 상기 단계 (g)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하는 단계

상기 단계 (g)에서 얻은 이노시톨의 분말을 물에 용해시켜 이노시톨이 용해된 수용액을 제조한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 물은 증류수이다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 이노시톨 분말을 물에 20％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 이노시톨 분말을 물에 0.1％(w/v) 이상 20％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 이노시톨 분말을 물에 0.1％(w/v)이상 18％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 이노시톨 분말을 물에 0.1％(w/v) 이상 15％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다.

단계 (i) : 상기 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계 상기 단계 (h)에서 얻은 이노시톨이 용해된 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨의 침전물을 생성시킨다. 유기용매는 상기 단계 (e)에서 설명된 내용과 동일하다. 유기용매는 D-카이로-이노시톨의 침전 보다 마이오-이노시톨의 침전을 더욱 크게 유도할 수 있는 특성을 갖는 것이면 특별하게 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 유기용매로서 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜 또는 에테르를 사용한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 유기용매로서 탄소수 2-6개의 알코올을 사용한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 유기용매로서 에탄올, 이소프로판올, 아세톤을 사용한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 수용액에 첨가되는 유기용매의 양은 수용액 대비 0.1 - 10배(v/v)의 범위 내에서 적합한 양을 선택하여 첨가한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 유기용매는 수용액 대비 1.5 - 9배(v/v)의 양으로 첨가한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 유기용매는 수용액 대비 9배 (v/v)의 양으로 첨가한다. 상기 이노시톨 침전물은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전물이지만, 마이오-이노시톨이 더 큰 침전율을 나타내므로, D-카이로-이노시톨 보다는 마이오-이노시톨이 더욱 많은 양으로 포함되어 있다.

단계 (j) : 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계

상기 단계 (i)를 통해 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리한다. 이노시톨 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 또는 원심분리 방법을 사용한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 이노시톨의 침전물로부터 상층액의 분리는 여과방법을 사용하여 행한다. 이노시톨 침전물에는 D-카이로-이노시톨 보다 마이오-이노시톨이 더욱 다량 포함되어 있으므로 상층액에는 D-카이로-이노시톨의 순도가 증가된다.

단계 (k) : 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계

상기 단계 (j)에서 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는다. 상기 상층액의 건조는 상층액을 가열하면서 행할 수 있으며, 또는 진공상태에서 행할 수 있다. 상층액을 건조시켜 얻은 이노시톨 분말에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합되어 있으나, D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 단계 (g) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법을 제공한다: (h)′상기 단계 (g)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하고 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계; (i)′상기 수용액에서 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (j)′상기 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.

단계 (h)′: 상기 단계 (g)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하고 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계

상기 단계 (e)에서 얻은 이노시톨의 분말을 물에 용해시켜 이노시톨이 용해된 수용액을 제조한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 물은 증류수이다. 본 발명의 다른 일 구현예에 의하면, 이노시톨 분말을 물에 20％(w/v) 초과의 고농도로 용해시킨다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 이노시톨 분말을 물에 20％(w/v) 초과 80％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 이노시톨 분말을 물에 30％(w/v) 이상 70％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 하기 구체적인 실시예에 의하면, 물에 대한 마이오-이노시톨의 용해도는 최대 약 15％이며, D-카이로-이노시톨의 용해도는 최대 약 55％이므로, 상기 단계 (g)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 70％의 고농도로 용해시키는 경우 마이오-이노시톨은 최대 15％ 농도로 용해될 것이며, 나머지 용해되지 않은 마이오-이노시톨은 침전물로 생성된다. D-카이로-이노시톨은 최대 55％의 용해도이므로 이노시톨 분말 중의 거의 모든 D-카이로-이노시톨이 물에 용해된다.

단계 (i)′: 상기 수용액에서 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계

상기 단계 (h)′에서 생성된 이노시톨의 침전물로부터 상층액을 분리한다. 이노시톨 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 또는 원심분리 방법을 사용한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 이노시톨 침전물로부터 상층액의 분리는 여과방법을 사용하여 행한다. 이노시톨 침전물에는 대부분이 마이오-이노시톨이 포함되어 있을 것이며, 이노시톨 혼합물이 용해된 상층액에는 D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다.

단계 (j)′: 상기 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계

상기 단계 (i)′에서 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는다. 상기 상층액의 건조는 상층액을 가열하면서 행할 수 있으며, 또는 진공상태에서 행할 수 있다. 상층액을 건조시켜 얻은 이노시톨 분말에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합되어 있으나, D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다. 하기 구체적인 실시예에 의하면, 상기 단계 (h)′에서 이노시톨 분말을 물에 약 70％(w/v)의 고농도로 용해시킨 경우 건조된 분말에서의 D-카이로-이노시톨의 순도는 약 78.5％가 된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(i) 본 발명은 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 재조합 세포의 휴면세포를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 제조하는 방법에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명은 재조합 세포의 휴면세포를 마이오-이노시톨을 포함하는 최소 배지에서 1회 배양 또는 2회 이상의 계대 배양에 의해 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 고수율로 전환시킬 수 있다.

(ⅲ) 휴면세포를 최소 배지에서 배양하는 본 발명의 방법은 완전 배지에서의 배양과 동등한 수율로 D-카이로-이노시톨을 얻을 수 있다.

(ⅳ) 본 발명은 완전 배지가 아닌 최소 배지를 사용하고, 휴면세포를 반복하여 사용할 수 있으므로 D-카이로-이노시톨의 제조비용을 낮출 수 있으며, 완전배지를 이용한 방법에서 발생하는 균체 성장에 필요한 시간을 절약할 수 있다.

(ⅴ) 본 발명은 영양 성분이 최소로 포함된 최소 배지를 이용하므로 완전 배지에 비해 배양 완료 배양액으로부터 D-카이로-이노시톨의 정제 효율을 향상시킬 수 있다.

(ⅵ) 본 발명의 방법은 유기용매의 첨가, 상층액 분리 및 건조와 같은 간단하고 저비용 공정을 통해 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합된 최소배지로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 분리할 수 있다.

(ⅶ) 본 발명의 방법은 D-카이로-이노시톨로부터 분리된 마이오-이노시톨은 기질로서 재사용이 가능하다.

본 발명은 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 재조합 세포의 휴면세포를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면, 최소배지를 이용하고, 휴면세포의 반복사용이 가능하며, 완전배지를 사용하는 경우와 비교하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨 전환 수율도 동등하므로, D-카이로-이노시톨의 대량 생산시 제조비용을 크게 절감할 수 있다. 또한, 최소 배지를 사용하므로, 완전 배지의 사용과 비교하여 D-카이로-이노시톨의 정제 효율도 향상시킬 수 있다. 본 발명에 의하면 유기용매의 첨가, 상층액 분리 및 건조와 같은 간단하고 저비용의 공정을 통해 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합된 배지부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 분리할 수 있다. D-카이로-이노시톨로부터 분리된 마이오-이노시톨은 기질로서 재사용이 가능하다.

도 1은 입체이성질체인 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 화학 구조이다.
도 2는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨 및 이들의 입체이성질체 또는 유도체들에 관한 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 3은 본 발명의 휴면세포 전환방법에 의해 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 전환한 결과를 보여준다. 실험에 사용한 재조합 균주는 다음과 같다.
■: pCOLAD-Cgiep-PaiolI/pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)/BL21(DE3)균주,
○: pCOLAD-BsiolG-BsiolI/pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)/BL21(DE3) 균주,
▲: pCOLAD-AGRL628-AGRL627/pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)/BL21(DE3) 균주,
▽: pCOLAD-PaiolG-PaiolI/pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)/BL21(DE3) 균주.
도 4는 본 발명의 휴면세포 전환방법에서 배지의 종류에 따른 전환 결과를 보여준다. 재조합 균주는 pCOLAD-Cgiep-PaiolI/pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)/BL21(DE3)균주을 사용하였으며, 각 배지의 조성은 다음과 같다. ■: 0.5％ 락토오스가 첨가된 M9 최소배지, ○: 0.85％ NaCl 및 0.5％ 락토오스만 포함된 배지, ▲: 0.85％ NaCl 및 0.5％ 글루코오스만 포함된 배지, ▽: 0.85％ NaCl 및 1.0％ 글루코오스만 포함된 배지, ◆: 0.5％ 글루코오스만 포함된 증류수.
도 5는 재조합 균주 pCOLAD-Cgiep-PaiolI/pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)/BL21(DE3)을 사용하여 균체의 농도에 따른 휴면세포 전환속도를 비교한 결과이다. 휴면세포의 균체의 농도는 다음과 같다. ■: OD 1.5, ○: OD 3, ▲: OD 4.5, ▽: OD 6, ◆: OD 7.5, ◁: OD 12, ▶: OD 15, ☆: OD 20.
도 6은 25℃ 증류수에서 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도를 보여준다. ■: 마이오-이노시톨의 용해도, ○: D-카이로-이노시톨의 용해도.
도 7은 휴면세포 배양을 완료한 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 포함된 M9 최소배지에 에탄올을 첨가하여 얻은 결과이다. 에탄올 첨가에 의해 이노시톨을 침전시키고, 이노시톨 침전물을 제거하여 얻은 상층액에서 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 농도를 측정하였다. ■: 마이오-이노시톨의 농도, ○: D-카이로-이노시톨의 농도.
도 8은 휴면세포 배양을 완료하여 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 포함된 M9 최소배지에 에탄올을 첨가하여 얻은 결과이다. 에탄올 첨가에 의해 이노시톨을 침전시킨 경우, 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 침전율을 측정하였다. ■: 마이오-이노시톨의 침전율, ○: D-카이로-이노시톨의 침전율.
도 9는 휴면세포 배양을 완료한 M9 최소배지에 에탄올을 첨가하여 D-카이로-이노시톨을 분리 정제한 결과이다. 휴면세포 배양을 완료한 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 포함된 M9 최소배지에 에탄올을 첨가하여 이노시톨을 침전시켰다. 침전물을 제거하고 얻은 배양 상층액을 건조하여 이노시톨 분말을 얻었다. 이노시톨 분말에서의 D-카이로-이노시톨의 순도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다.
도 10은 1차 에탄올을 첨가하여 얻은 상층액의 건조 분말(마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말)을 물에 다시 용해한 경우의 각 이노시톨의 용해 특성을 보여준다. 패널 A는 수용액 상층액중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 농도를 보여준다. 패널 B는 수용액의 상층액중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 용해도를 보여준다. 패널 C는 수용액의 상층액중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전율을 보여준다. 패널 D는 수용액의 상층액 중의 D-카이로-이노시톨의 순도를 보여준다. ■: 마이오-이노시톨, ○: D-카이로-이노시톨.
도 11은 1차 에탄올을 첨가하여 얻은 상층액의 건조 분말인 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말을 약 12％ 함유하는 수용액에 다양한 양의 에탄올을 첨가한 경우의 침전 및 정제 특성을 측정한 결과이다. 패널 A는 상층액 중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 농도를 측정한 결과이다. 패널 B는 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전율을 측정한 결과이다. 패널 C는 상층액내의 D-카이로-이노시톨의 순도를 나타낸 결과이다. ■: 마이오-이노시톨, ○: D-카이로-이노시톨.
도 12는 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 약 13:2의 중량비율로 용해된 M9 최소배지에 다양한 유기용매를 첨가한 경우에 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전 특성을 측정한 결과이다. 패널 A는 에탄올, 이소프로판올 및 아세톤을 첨가한 경우의 침전특성이다. 여기에서 흰색 막대는 마이오-이노시톨의 농도를, 진회색 막대는 D-카이로-이노시톨의 농도를 나타낸다. 패널 B는 에탄올에 대한 이소프로판올 및 아세톤의 상대적인 침전 특성을 보여준다. 여기에서 연회색 막대는 D-카이로-이노시톨이고, 진회색 막대는 마이오-이노시톨을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 마이오-이노시톨을 D-카이로-이노시톨로 전환하는 유전자의 클로닝 및 이를 포함하는 재조합 벡터의 제작

마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨로 전환에 관여하는 효소인, 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제, 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 분자를 클로닝하고, 이를 발현 가능한 형태로 포함하는 재조합 플라스미드 벡터를 제조하였다. 마이오-이노시톨 트랜스포터를 코딩하는 유전자(iolT)는 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium) 균주로부터 클로닝하였다. 살모넬라 티피무리엄 균주의 지놈 DNA로부터 마이오-이노시톨 트랜스포터의 주타입에 해당하는 StiolT1 유전자와 부타입에 해당하는 StiolT2 유전자를 증폭한 후에, 이를 pACYCDuet-1 발현벡터(Novagen)에 도입하여 재조합 플라스미드 벡터를 제조하였다. 마이오-이노시톨 트랜스포터에 의해 세포 내로 도입된 마이오-이노시톨은 하기 반응식 1 내지 반응식 3의 연속적 반응을 통해 D-카이로-이노시톨이 전환된다. 반응식 1 및 반응식 3의 반응은 이노시톨 디하이드로게나아제에 의해 촉매되고, 반응식 2의 반응은 이노소스 이소머라아제에 의해 촉매된다.

[반응식 1]

[반응식 2]

2-케토-마이오-이노시톨 ↔ 1-케토-D-카이로-이노시톨

[반응식 3]

이노시톨 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(iolG)는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)으로부터 클로닝하였다.

이노소스 이소머라아제를 코딩하는 유전자(iolI)는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로부터 각각 클로닝하였다.

상기 균주들의 지놈 DNA로부터 iolG 유전자 및 iolI에 해당하는 유전자를 증폭한 후에, iolG 및 iolI 유전자의 조합을 pCOLADuet-1 발현벡터(Novagen)에 삽입하여 재조합 플라스미드 벡터를 제작하였다.

iolG 및 iolI 유전자들의 조합은 다음과 같다. 첫째, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 iolG 해당 유전자와 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)의 iolI 해당 유전자의 조합, 둘째, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 iolG와 iolI 해당 유전자의 조합, 셋째, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 iolG와 iolI 해당 유전자의 조합, 넷째, 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)의 iolG와 iolI 해당 유전자의 조합이다. 상기 클로닝한 StiolT1과 StiolT2 및 iolG 와 iolI에 해당하는 유전자 정보는 하기 표 1에 나타내었다.

1-1. 마이오-이노시톨 트랜스포터 코딩 DNA 분자를 포함하는 재조합 벡터의 제조

마이오-이노시톨 트랜스포터의 클로닝을 위해서 살모넬라 티피무리움(S. Typhimurium)의 지놈 DNA로부터 주 타입 트랜스포터(iolT1) 및 부 타입 트랜스포터(iolT2)를 증폭한 후에, 이를 pACYCDuet-1 발현 벡터에 도입하여, pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)를 제작하였다. 보다 상세히 설명하면, 살모넬라 티피무리엄(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2 ATCC700720 (taxid:99287; GenBank NID: NC_006511, ATCC700720)의 지놈 DNA로부터 PCR용 프라이머 StiolT1-F2 및 StiolT1-R을 이용하여 StiolT1을 증폭하고, PCR용 프라이머 StiolT2-F와 StiolT2-R을 이용하여 StiolT2를 증폭하였다. 상기 증폭된 StiolT1를 NcoI과 BamHI으로 절단하여 pACYCDuet-1벡터(Novagen)의 NcoI과 BamHI 부위에 삽입하여 pACYCD-StiolT1(F2)를 제작하였다. 이어서, 상기 증폭된 StiolT2를 NdeI과 SalI으로 절단하여 상기 제작한 벡터 pACYCD-StiolT1(F2)의 NdeI과 XhoI 부위로 삽입하여 pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)를 제작하였다.

1-2. 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 분자를 포함하는 재조합 벡터의 제조

다양한 박테리아로부터 이노시톨 디하이드로게나아제(iolG) 및 이노소스 이소머라아제(iolI)를 코딩하는 유전자를 클로닝하였다. 첫 번째로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터 iolG 해당 유전자를 클로닝하였고, 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)으로부터 iolI 해당 유전자를 클로닝하여 제조합 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)의 지놈 DNA로부터 iolG 유전자인 Cgiep (NCgl2957 또는 GI:19554252)를 클로닝 하였고, 판토에아 아나나티스(P. ananatis)의 지놈 DNA로부터 iolI 유전자인 PaiolI를 클로닝하였다. 보다 상세히 설명하면, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (taxid:196627; GenBank NID:NC_003450, ATCC13032)의 지놈 DNA로부터 PCR용 프라이머 Cgiep-F와 Cgiep-R을 이용하여 Cgiep를 증폭한 후 제한효소 BspHI과 NotI으로 처리하여 절단하고, 이를 pCOLADuet-1(Novagen)의 NcoI과 NotI 부위로 삽입하여 pCOLAD-Cgiep를 제작하였다. 또한, Pantoea ananatis LMG 20103 (taxid:706191, GenBank NID:NC_013956, KCCM40419)의 지놈 DNA로부터 PCR용 프라이머 PaiolI-F 및 PaiolI-R을 이용하여 PaiolI를 증폭하고, NdeI과 PacI으로 처리하여 절단한 후, 상기 제작한 벡터 pCOLAD-Cgiep의 NdeI과 PacI 부위로 삽입하여 최종적으로 pCOLAD-Cgiep-PaiolI 벡터를 제작하였다.

두 번째로, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)으로부터 iolG 및 iolI 해당 유전자를 클로닝하여 재조합 벡터를 제작하였다. 먼저, Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168의 지놈 DNA로부터 BsiolG-F 및 BsiolG-R 프라이머를 이용하여 iolG에 해당하는 BsiolG를 증폭한 후, 제한효소 PciI과 NotI으로 절단하여 pCOLADuet-1의 NcoI과 NotI 부위로 삽입하여 pCOLAD-BsiolG를 제작하였다. 또한, BsiolI-F와 BsiolI-R 프라이머를 이용하여 iolI에 해당하는 BsiolI를 증폭하고 이를 제한효소 NdeI과 PacI으로 처리하여 앞서 구축한 플라스미드 pCOLAD-BsiolG의 동일 제한효소 부위로 삽입하여 pCOLAD-BsiolG-BsiolI를 제작하였다.

세 번째로 아그로박테리움 튜메파시엔스(A. tumefaciens)으로부터 iolG 및 iolI 해당 유전자를 클로닝하여 재조합 벡터를 제작하였다. 먼저, Agrobacterium tumefaciens str. C58(taxid:176299; GenBank NID: NC_003062)의 지놈 DNA로부터 프라이머 AGRL628-F와 AGRL628-R을 이용하여 iolG에 해당하는 AGRL628 유전자를 증폭하였고, 이것을 제한효소 PciI과 SacI으로 절단하여 pCOLADuet-1(Novagen)의 NcoI과 SacI 부위에 도입하여 pCOLAD-AGRL628을 제작하였다. 또한, AGRL627-F와 AGRL627-R 프라이머를 이용하여 iolI에 해당하는 AGRL_627을 증폭하고 이를 제한효소 NdeI과 SalI으로 절단하여 pCOLAD-AGRL628의 NdeI과 XhoI 부위에 삽입하여 pCOLAD-AGRL628-AGRL627 재조합 벡터를 제작하였다.

네 번째로, 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)으로부터 iolG 및 iolI 해당 유전자를 클로닝하여 재조합 벡터를 제작하였다. Pantoea ananatis LMG 20103 (taxid:706191, GenBank NID:CP001875)의 지놈 DNA로부터 Paidh-F와 Paidh-R 프라이머를 이용하여 iolG에 해당하는 Paidh를 증폭한 후, 제한효소 PciI과 NotI으로 절단하여 pCOLADuet-1의 NcoI과 NotI 부위로 삽입하여 pCOLAD-Paidh를 제작하였다. 또한, PaiolI-F와 PaiolI-R 프라이머를 이용하여 iolI에 해당하는 PaiolI를 증폭하고 이를 NdeI과 PacI으로 처리한 후, 상기 제작한 벡터 pCOLAD-Paidh의 동일한 제한효소 부위로 삽입하여 pCOLAD-Paidh-PaiolI를 제작하였다. 클로닝에 사용된 프라이머 정보는 하기 표 2에 나타내었다.

실시예 2: 재조합 균주의 휴면 세포의 제조

상기 실시예 1에서 제작한 재조합 플라스미드 벡터인 pCOLAD-Cgiep-PaiolI, pCOLAD-BsiolG-BsiolI, pCOLAD-AGRL628-AGRL627, pCOLAD-PaiolG-PaiolI를 각각 pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)와 함께 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하여 상기 재조합 플라스미드 벡터를 동시에 갖는 형질전환 대장균 균주들을 제작하였다. 제작한 대장균 균주들은 다음과 같다:

① pCOLAD-Cgiep-PaiolI/pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)/BL21(DE3) 균주,

② pCOLAD-BsiolG-BsiolI/pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)/BL21(DE3) 균주,

③ pCOLAD-AGRL628-AGRL627/pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)/BL21(DE3) 균주,

④ pCOLAD-PaiolG-PaiolI/pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)/BL21(DE3) 균주.

상기 제작한 형질전환 대장균의 휴면세포를 제조하기 위해 완전배지를 사용하여 배양하였다. 보다 상세히 설명하면, 300 mL의 홈이 파인(baffled) 삼각 플라스크에서 50 mL 부피로 배양하였으며, 15％(w/v) 마이오-이노시톨, 0.5％(w/v) 락토오스, 50 mg/L 클로람페니콜, 50 mg/L 카나마이신을 함유한 TB 배지[Terrific Broth; 1.2％(w/v) 트립톤, 2.4％ 효모추출물, 0.4％ 글리세롤, 0.17 M KH₂PO₄(제1인산칼륨), 0.72M K₂HPO₄(제2인산칼륨)]를 이용하여 37℃, 180 rpm의 조건에서 약 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양 상층액에서 D-카이로-이노시톨과 마이오-이노시톨이 평형 농도에 도달했음을 확인한 후 균체를 회수하였다. 배양액 중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 분석은 다음과 같이 행하였다. 우선, 배양액을 원심분리한 후 배양 상층액 1 mL을 취하고 10분간 끓인 후 다시 원심분리하여 상층액 500μL를 취하였다. 전처리한 배양 상층액을 HPLC(Shimadzu LC10Avp)로 분석하였으며, 분석조건은 Kromasil 5NH2 칼럼(4.6 mm x 250 mm), 이동상 75％ 아세토니트릴, 칼럼 온도 40℃, RI 검출기를 이용하였다. 후술하는 모든 실험에서 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 분석은 상기의 방법을 이용하여 행하였다. 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨 농도가 평형에 도달함을 확인한 후 배양액을 원심분리하였다. 원심분리는 3,000rpm에서 30분 동안 수행하였으며, 온도 차이에 의한 마이오-이노시톨의 침전과 균체의 저온 충격(cold shock)을 방지하기 위하여 37℃를 유지하도록 하였다. 회수한 균체에 영양성분이 많은 TB 배지의 잔여 성분이 남아있을 경우, 실제 휴면 균체에 의한 전환효과를 기대하기 어려우므로, 균체를 2회 세척하여 TB 배지 성분을 완전히 제거하였다. 세척은 수집한 균체를 전환반응에 사용할 기질이 포함된 완충액(최소배지)로 현탁한 후 상기한 원심분리 조건하에서 원심분리하여 다시 균체를 회수하는 방법으로 하였다. 이하 모든 실험에서 휴면세포 전환방법에 사용하기 위한 균체는 모두 상기 방법을 이용하여 2회 세척하여 사용하였다.

실시예 3 : 휴면세포 전환법에 의한 D-카이로-이노시톨의 생산

휴면세포의 균체를 사용하여 최소 배지에서 생장이 정지된 상태 즉, 휴면세포 상태로 마이오-이노시톨을 D-카이로-이노시톨로 전환시켰다. 보다 상세히 설명하면, 300 mL의 홈이 파인(baffled) 삼각플라스크에서 50 mL 용량으로 배양하였다. 기질인 15％(w/v) 마이오-이노시톨, 탄소원 및 발현 유도제인 0.5％(w/v) 락토오스, 50 mg/L 클로람페니콜, 50 mg/L 카나마이신을 함유한 M9 최소 배지[6.4％(w/v) Na₂HPO₄·7H₂O, 1.5％(w/v) KH₂PO₄, 0.25％(w/v) NaCl, 0.5％(w/v) NH₄Cl, 2 mM MgSO₄, 0.1 mM CaCl₂]에 실시예 2에서 수득한 휴면세포 균체를 접종하여 37℃, 180 rpm에서 약 24시간 동안 진탕 배양하였다. 전환이 종료된 후, 37℃, 3,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 상기한 조성의 배지에 다시 현탁하여 동일한 방법으로 24 시간 동안 전환을 실시하였다. 이러한 전환 과정을 5회 내지 7회 반복하였다. 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 분석은 상기 실시예 1에서와 설명된 방법으로 행하였다. 각각의 다른 유전자의 조합을 갖는 재조합 균주의 휴면세포를 사용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨로 전환을 분석한 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3의 결과에 의하면, iolG 및 iolI 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)의 Cgiep와 판토에아 아나나티스(P. ananatis)의 PaiolI으로 구성한 조합인 pCOLAD-Cgiep-PaiolI/pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)/BL21(DE3) 재조합 균주의 휴면세포에서 가장 안정적인 전환율이 확인되었다. 이 경우, 배양액내 D-카이로-이노시톨의 생산량은 24 시간(1일) 부터 192 시간(8일)까지 약 10-15％ 정도를 유지하였으나, 계대수가 증가함에 따라 약간 감소하는 양상을 보였다(도 3의 패널 A 참조). 균체 농도 역시 점차 감소하는 양상을 나타내었다(도 3의 패널 B 참조). 그러나, 균체 농도에 대비한 전환율은 대체로 유지되는 양상을 보였으므로(도 3의 패널 C 참조), D-카이로-이노시톨의 생산성 감소는 휴면세포 균체 농도의 감소에 따른 영향으로 추정된다. 휴면세포 균체를 계대하는 과정에서 원심분리 단계를 거치게 된다. 원심분리 공정은 균체 자체에 물리적인 충격을 가할 수 있다. 균체에 충격을 주지 않기 위해 원심분리는 최대한 약하게 행하였으며, 이로 인해 원심분리 후 상등액을 제거하는 과정에서 균체의 손실이 나타났다. 이러한 균체 손실에 의한 균체량 감소가 D-카이로-이노시톨의 전환속도에 영향을 미친 것으로 생각된다. 또한, pCOLAD-Cgiep-PaiolI/pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)/BL21(DE3) 균주의 경우 적어도 7회 계대(192시간 배양)에 의한 전환까지는 균체 자체와 균체내에서 발현된 효소가 안정되게 기능을 수행한 것으로 확인하였다.

한편, 도 3의 결과에서 나타난 바와 같이, iolG 및 iolI의 유전자로서 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 아그로박테리움 튜메파시엔스(A. tumefaciens), 판토에아 아나나티스(P. ananatis)의 iolG와 iolI의 유전자가 도입된 재조합 균주의 경우에는 48 시간, 또는 72 시간부터 D-카이로-이노시톨의 생산량이 급격히 감소하였다(도 3의 패널 A 참조). 균체 농도의 경우 대체로 pCOALD-Cgiep-PaiolI가 도입된 경우와 크게 차이가 나지 않았으므로(도 3의 패널 B), 상기 결과는 해당 효소의 활성이 급격히 감소한 것이 원인인 것으로 사료된다. 이로서 휴면세포 전환법에서 가장 우수한 활성을 가지는 iolG 및 iolI 유전자는 각각 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)의 Cgiep와 판토에아 아나나티스(P. ananatis)의 PaiolI인 것으로 확인되었다.

실시예 4 : 전환 배지에 따른 D-카이로-이노시톨로의 전환 속도 비교

실시예 3에서 가장 안정적인 생산을 보인 pCOLAD-Cgiep-PaiolI 및 pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2) 재조합 벡터가 도입된 균주를 이용하여 전환배지의 조성을 다르게 하여 D-카이로-이노시톨(DCI)의 전환 양상을 확인하였다. 균체 성장과 재조합 단백질을 포함하여 세포내 단백질들의 발현이 충분히 이루어진 휴면 세포는 배양 시에 삼투압 조절과 최소의 탄소원 공급만이 요구될 수 있다. 전환 배지에 필요한 성분들을 확인하기 위해, 최소배지보다 단순한 다양한 종류의 배지를 조성하여 휴면세포 전환반응을 실시하였다. 전환배지 실험에서 M9 최소배지를 양성 대조구로 하여, 0.85％(w/v) NaCl이나 물만을 사용하고, 탄소원으로는 0.5％(w/v) 락토오스를 첨가하거나 포도당을 첨가하여 배지를 제조하였으며, 이러한 조건에서 휴면세포 전환반응을 실시하였다. 보다 상세히 설명하면, 제 1 실험군은 양성 대조군으로서 15％(w/v) 마이오-이노시톨, 0.5％(w/v) 락토오스, 50 mg/L 클로람페니콜, 및 50 mg/L 카나마이신을 함유한 M9 최소 배지이며, 제 2 실험군은 15％(w/v) 마이오-이노시톨, 0.5％(w/v) 락토오스, 50 mg/L 클로람페니콜, 50 mg/L 카나마이신 및 0.85％ NaCl 용액을 함유한 배지이며, 제 3 실험군은 제 2 실험군에서의 0.5％(w/v) 락토오스 대신 0.5％(w/v) 포도당을 함유한 배지이며, 제 4 실험군은 제 3 실험군의 0.5％(w/v) 포도당 대신 1.0％(w/v) 포도당을 함유한 배지이며, 제 5 실험군은 제 3 실험군의 0.85％ NaCl 용액 대신 물을 사용한 배지이다. 상기 각 실험군의 배지를 사용하여 실시예 2에서와 같이 2회 세척하여 초기 TB 배지 성분을 제거한 후 각 실험군의 배지를 이용하여 실시예 3에서와 같이 24시간 간격으로 5 내지 7회 휴면세포 전환반응을 실시하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4의 결과에서 나타난 바와 같이, 세포 성장에 필요한 최소한의 배지 성분이 휴면세포의 전환에도 필요한 것으로 보인다. 즉, M9 최소배지를 제외한 나머지 그룹에서는 2 내지 3회의 전환 후 급격히 전환 효율이 감소하는 것으로 나타났다(도 4의 패널 A). 또한, 탄소원으로서 락토오스의 경우가 포도당의 경우보다 전환율이 약간 높은 것으로 보이는데, 포도당의 경우 세포의 성장에 영향을 주어 균체 농도를 증가시킨 반면, 락토오스의 경우 균체 농도에는 상대적으로 영향을 덜 주면서 효소의 발현에 영향을 준 것으로 생각된다.

실시예 5 : 균체 농도에 따른 D-카이로-이노시톨로의 전환 속도 측정

균체량에 따른 마이오-이노시톨에서 D-카이로-이노시톨로의 전환 속도를 비교하였다. 고농도의 균체를 얻기 위하여 소용량 발효를 수행하였다. 발효는 MARADO-PDA [(주)씨엔에스, 대전, 한국] 3 리터 발효조에 1 리터 용량으로 실시하였다. 종배양(seed culture)은 2YT 배지[1.6％(w/v) 트립톤, 1％(w/v) 효모추출물, 0.5％(w/v) 염화나트륨]를 이용하였으며, 발효배지는 15％ 마이오-이노시톨, 0.5％ 락토오스를 첨가한 TB 배지를 사용하였다. OD (Optical Density) 3 까지 배양한 종배양액 50 mL을 온도, pH, DO를 안정화시킨 발효조에 접종한 후 약 20 시간 동안 배양하였다. 발효온도는 37℃로 조절하였고, pH는 암모니아수를 이용하여 7.0으로 유지하였으며, DO는 40％이하로 감소한 후부터 RPM을 증가시키면서 40％ 이상으로 유지하였다. 균체는 18 시간 배양한 후 최대 약 OD 18에 도달하였으며, D-카이로-이노시톨은 약 12 시간에 평형농도인 약 20 g/L에 도달한 후 이후로는 증가하지 않았다. D-카이로-이노시톨이 평형농도에 도달하고 발효가 종료된 균체 배양액을 37℃, 3,000rpm에서 30 분간 원심분리하여 균체를 회수하였으며, TB 배지 성분을 제거하기 위하여 15％(w/v) 마이오-이노시톨, 0.5％(w/v) 락토오스, 50 mg/L 클로람페니콜, 50 mg/L 카나마이신을 함유한 M9 최소 배지를 사용하여 균체를 세척하였다. 회수 및 세척한 균체는 상기 조성의 M9 최소 배지에 균체 농도에 맞게 재현탁하였다. 균체량은 OD 1.5, 3, 4.5, 6, 7.5, 12, 15로 맞추어 직경 25 mm, 높이 150 mm의 유리 시험관에서 7 mL 부피로 37℃, 250 rpm 조건에서 약 7 시간 동안 배양하여 초기 전환속도를 측정하였다. 배양한 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5의 결과에 나타난 바와 같이, 균체량의 증가에 따라 D-카이로-이노시톨(DCI)의 전환속도가 증가하는 양상을 보여주었다. OD값이 1.5일 경우 7 시간에서의 최종 전환속도는 DCI 농도 2％로서, DCI 최종 평형 농도인 14％과 비교하여 1/7 수준으로서 매우 낮았다. 전환속도는 균체의 OD가 증가함에 따라 증가하여 OD가 15일 경우 7 시간에서 약 12％의 DCI 농도의 전환속도를 보였다. 그러나, 이 역시 DCI 최대 평형 농도인 14％에 도달하지 못하였다. 균체 OD가 20일 경우, 약 6시간에 DCI 평형 농도인 14％에 도달하였으며, 그래프의 양상으로 볼 때 약 5시간 이전에 평형에 도달한 것으로 보인다. 이상의 결과로 볼 때 균체농도가 최소 OD 20 이상일 때에 평형 농도 즉, 최대의 DCI 농도에 도달하게 되며, 도달 시간은 약 5 시간인 것으로 나타났다.

실시예 6 : 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도 측정

마이오-이노시톨(myo-inositol)과 D-카이로-이노시톨(D-chiro-inositol)의 용해도를 측정하였다. 먼저 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨을 상온(약 25℃)에서 1차 증류수에 각각 5％(w/v) 내지 80％(w/v)의 농도가 되도록 용해시켰다. 각 용액에서 용해되지 않고 침전된 부분을 원심분리를 통하여 분리하고 이노시톨이 완전히 용해된 상층액 부분을 취하여 각각의 농도를 HPLC로 분석하였다. 분석조건은 HPLC(Shimadzu LC10Avp)를 이용하여, Kromasil 5NH2 칼럼(4.6 mm X 250 mm), 이동상 75％ 아세토니트릴, 칼럼 온도 40℃, RI 검출기를 이용하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다. 마이오-이노시톨의 용해도는 25℃에서 약 15％(w/v)로 나타났으며, D-카이로-이노시톨의 경우 약 55％(w/v) 전후로 나타나, 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도 차이가 매우 큰 것으로 확인하였다.

실시예 7: 마이오-이노시톨의 분리를 위한 1차 에탄올 처리

휴면세포의 배양이 완료되어 생성물인 D-카이로-이노시톨과 기질인 마이오-이노시톨이 포함된 최소배지를 실험에 사용하였다. 상기 최소배지에 에탄올을 가하여, 최소배지:에탄올의 비율이 각각 10:0, 9:1(0.11배), 8:2(0.25배), 7:3(0.43배), 6:4(0.67배), 5:5(1배), 4:6(1.5배), 3:7(2.33배), 2:8(4배), 1:9(9배)로 되도록 하여 완전히 혼합한 후 실온(약 25℃)에서 1시간 동안 진탕하였다. 이를 3,500 rpm에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 HPLC로 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 농도를 분석하였다. HPLC분석 방법은 실시예 6에서 설명된 방법과 같다. 분석한 결과는 도 7, 도 8, 및 도 9에 나타내었다. 도 7은 에탄올 첨가한 후 생성된 침전물을 제거하여 얻은 상층액내에 남아있는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 농도를 나타낸 것이다. 마이오-이노시톨의 경우, 에탄올 첨가량에 따라 농도가 빠르게 감소하여, 약 1 배수의 에탄올을 첨가한 경우 마이오-이노시톨은 초기 126 g/L 농도로부터 약 99 g/L이 침전되어 약 27 g/L의 마이오-이노시톨이 남아 있는 것으로 나타났다. 이에 비해, D-카이로-이노시톨의 감소량은 매우 낮아서 약 1 배수의 에탄올을 첨가하면 초기 17 g/L의 농도에서 15 g/L으로 감소되어 약 2 g/L만이 침전되는 것으로 나타났다.

상기 도 7에 나타난 결과를 침전율로 환산하여 도 8에 나타내었다. 마이오-이노시톨의 침전율은 에탄올 첨가량에 따라 급격히 증가하였으며, 1 배수의 에탄올을 첨가하였을 때 모든 반응액 조건에서 비교적 유사하게 70-80％의 침전율을 보였고, 약 2.5 배 이상의 에탄올 첨가 조건에서는 대부분의 마이오-이노시톨이 침전되는 것을 확인하였다. 이에 반하여 D-카이로-이노시톨의 침전율은 약 1 배의 에탄올을 첨가할 때까지는 약 15％ 이하의 침전율을 보였으며, 2배 이상의 에탄올을 첨가한 경우 침전율이 비교적 크게 증가하였다.

상기 도 7 및 도 8에 나타난 실험 결과를 토대로 D-카이로-이노시톨의 순도를 계산하여 도 9에 나타내었다. D-카이로-이노시톨의 순도는 1 배수의 에탄올을 첨가하였을 경우 약 35 - 40％ 정도로 나타났으며, 그 이상의 양의 에탄올을 첨가하면 순도가 증가하지만, D-카이로-이노시톨의 손실율이 커지는 것으로 나타났다.

이상의 결과를 종합하면, 약 1 배수의 에탄올을 첨가할 경우 약 80％의 마이오-이노시톨이 침전되고, 이때 D-카이로-이노시톨의 침전율, 즉 손실율은 15％ 이하로 나타났으며, 초기 14％ 정도이었던 D-카이로-이노시톨의 순도를 약 30-40％로 증가시킬 수 있었다. 한편, 에탄올 첨가량이 1 배수를 초과할 경우 D-카이로-이노시톨의 침전율(손실율)이 급격히 증가므로, 약 1 배수의 에탄올을 첨가하는 경우 D-카이로-이노시톨의 손실율을 최소로 하면서 마이오-이노시톨을 침전시켜 분리 및 제거할 수 있는 것으로 확인되었다.

실시예 8 : 1차 에탄올 처리 후 상층액의 농축 건조 및 재용해

상기 실시예 7에서 설명된 방법과 같이, 배양이 완료된 최소배지에 동량(1:1)의 에탄올을 혼합한 후 침전물을 제거하여 얻은 상층액을 80℃로 가열하고 진공 상태에서 농축 및 건조하였다. 건조 후 얻은 이노시톨의 건조 분말(마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말)을 15％ - 70％의 다양한 농도로 증류수에 용해시켜 각 농도에서의 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해 특성을 관찰하였다. HPLC를 이용한 이노시톨의 분석 방법은 실시예 6에서 설명된 내용과 동일하다. 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해특성을 분석한 결과는 도 10에 나타내었다. 도 10의 패널 A는 상층액에서 각 이노시톨의 농도, 즉 용해도를 나타낸 것으로 마이오-이노시톨 용해도는 상기 실시예 6에서 나타난 바와 같이 약 15％ 이상으로는 더 증가하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 한편, D-카이로-이노시톨의 경우 용해도가 약 55％ 이므로 건조분말을 70％ 농도로 용해시킨 경우에서도 모든 D-카이로-이노시톨이 용해된 것을 확인할 수 있었다. 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해특성을 용해도와 침전율로 표시한 결과는 각각 도 10의 패널 B와 패널 C에 나타내었다. 마이오-이노시톨은 약 20％ 용액부터 용해도가 감소하기 시작하여 용액의 농도가 증가할수록 계속적으로 감소하였고, 침전율은 용액의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. D-카이로-이노시톨의 경우 용해도는 용액의 농도가 70％인 경우에 이르기까지 100％을 유지하였으며, 이에 따라 침전율도 0％로서 전혀 침전되지 않는 것으로 나타났다. 결론적으로 최대 70％ 용액을 제조하는 경우 마이오-이노시톨은 15％만이 용해되었고, D-카이로-이노시톨은 모두 용해되었으므로, D-카이로-이노시톨의 경우 순도는 약 73％ 정도인 것으로 나타났다(도 10의 패널 D).

실시예 9 : 저농도의 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 건조물 용액에 2차 에탄올을 처리한 경우의 정제 특성

상기 실시예 10에서 설명된 방법과 같이, 배양이 완료된 M9 최소배지에 동량(1:1)의 에탄올을 첨가한 후 침전물을 제거하여 얻은 상층액을 80℃로 가열하고 진공 상태에서 농축 및 건조하였다. 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 혼합 건조물을 저농도인 15％ 이하 농도의 용액으로 제조하여 여기에 에탄올을 첨가하는 실험을 수행하였다. 1차 에탄올 처리 후 상층액의 건조분말이 완전히 녹는 양의 물을 첨가하여 용해시켰으며, 이때 총 이노시톨 함량으로 약 11.5％가 되었고, 각각의 농도는 마이오-이노시톨 75 g/L 및 D-카이로-이노시톨 40 g/L 이었다. 이 혼합용액에 에탄올을 최대 19배 까지 첨가하면서 침전 및 분리 양상을 확인하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다. 도 11의 패널 A는 에탄올 첨가 후 상층액의 농도를 나타낸 것이며, 마이오-이노시톨의 경우 약 1 배수의 에탄올을 첨가할 때까지 큰 변화가 없었으나, 1.5 배의 에탄올이 첨가되면 절반 이상의 마이오-이노시톨이 침전되는 것으로 나타났다. 이에 반하여 D-카이로-이노시톨은 1.5 배수의 에탄올에서 약간 침전되는 것으로 나타났으며, 이후에도 침전량이 크게 증가되지는 않았다. 도 11의 패널 B는 침전율을 나타낸 것이며, 마이오-이노시톨의 경우 약 9 배의 에탄올을 첨가할 경우 90％ 이상 침전되었으며, 이때 D-카이로-이노시톨의 침전율은 약 20％인 것으로 나타났다. 따라서 약 9배 양의 에탄올을 첨가하면 대부분의 마이오-이노시톨을 제거하면서 D-카이로-이노시톨 손실율을 20％ 이하로 줄일 수 있고, D-카이로-이노시톨의 순도를 90％ 이상으로 정제 가능하였다(도 11 패널 C 참조).

실시예 10 : 에탄올 이외의 유기용매에 의한 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 선택적 침전

상기 실시예 6 내지 실시예 9의 실험결과로부터 배양이 완료된 최소배지에 함유된 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨은 이들의 큰 용해도 차이에 의해 에탄올 첨가에 의한 분리가 가능함을 확인하였다. 2개의 탄소를 갖는 에탄올 이외의 다른 유기용매에 의해서도 이러한 분리가 가능한지 확인하기 위해 탄소수 3개의 알코올인 이소프로판올과 케톤인 아세톤을 이용하여 분리를 시도하였다. 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합용액 제조 시, 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 비율은 일반적인 반응 평형 도달 농도인 약 13:2로 하였으며, M9 최소배지 조건으로 전체 농도가 약 15％가 되도록 제조하였다. 제조한 이노시톨의 혼합용액에 동일부피의 에탄올, 이소프로판올, 아세톤을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 진탕한 후 원심분리하고, 그 상층액을 HPLC로 분석하였다. 결과는 도 12에 나타내었다. 도 12의 패널 A는 실제 상층액에 존재하는 이노시톨의 농도를 나타낸 것이다. 마이오-이노시톨의 경우 에탄올과 이소프로판올은 그 농도가 크게 차이나지 않았으나, 아세톤에서는 약간 낮게 나타났다. D-카이로-이노시톨의 경우, 이소프로판올에서 에탄올에 비해 농도가 낮았던 반면, 아세톤의 경우에는 유기용매를 처리하지 않았던 농도와 같게 나타나 전혀 침전되지 않은 것으로 나타났다. 즉, 이소프로판올은 에탄올과 비교할 때 마이오-이노시톨 침전율은 비슷하고, D-카이로-이노시톨의 침전율(손실율)이 더 높았던 반면, 아세톤은 마이오-이노시톨에 대한 침전율이 더 높고, D-카이로-이노시톨의 손실율이 적은 것으로 보인다. 이는 에탄올의 침전율에 대한 상대값을 나타낸 도 12의 패널 B에서 쉽게 볼 수 있다. 이소프로판올은 에탄올에 대하여 마이오-이노시톨의 침전율은 동일하고, D-카이로-이노시톨의 침전율은 약 0.7 수준으로 높다. 반면 아세톤의 경우는 마이오-이노시톨의 침전율이 약 0.1배 높으며, D-카이로-이노시톨에 대해서는 약 1배 수준이 낮은 것으로 나타났다. 따라서 에탄올 이외의 유기용매가 에탄올과 같이 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 분리에 사용할 수 있는 것을 확인하였으며, 아세톤의 경우 에탄올에 비해 그 분리 특성이 유리할 수도 있다는 사실을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Solgent Co. Ltd., <120> Method for Producing D-Chiro-Inositol by Using the Resting Cell Conversion <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 477 <212> PRT <213> Salmonella typhimurium <400> 1 Met Ser Thr Ser Asp Ser Cys Tyr Asn Thr Gly Tyr Ile Leu Arg Ile 1 5 10 15 Cys Ala Ile Ala Ala Leu Gly Gly Ile Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Ala 20 25 30 Val Ile Ser Gly Ala Ile Gly Ser Leu Thr Ser Tyr Phe His Leu Ser 35 40 45 Pro Ala Glu Thr Gly Trp Ala Val Ser Cys Val Val Val Gly Cys Val 50 55 60 Ile Gly Ser Phe Ser Ala Gly Tyr Leu Ser Lys Arg Phe Gly Arg Lys 65 70 75 80 Lys Ser Leu Met Val Ser Ala Leu Leu Phe Thr Ile Ser Ala Val Gly 85 90 95 Thr Ser Leu Ser Tyr Thr Phe Thr His Phe Val Ile Tyr Arg Ile Ile 100 105 110 Gly Gly Leu Ala Val Gly Leu Ala Ala Thr Val Ser Pro Met Tyr Met 115 120 125 Ser Glu Val Ser Pro Lys Asn Met Arg Gly Arg Ala Leu Ser Met Gln 130 135 140 Gln Phe Ala Ile Val Phe Gly Gln Ile Leu Ile Phe Tyr Val Asn Tyr 145 150 155 160 Lys Ile Ala Ser Ile Ala Ala Asp Thr Trp Leu Ile Glu Leu Gly Trp 165 170 175 Arg Tyr Met Phe Ala Ala Gly Ile Ile Pro Cys Ile Leu Phe Cys Ile 180 185 190 Leu Val Phe Leu Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Met Met Met Ile Gly 195 200 205 Arg Glu Glu Glu Thr Leu Lys Ile Leu Thr Lys Ile Ser Asn Glu Glu 210 215 220 His Ala Arg His Leu Leu Ala Asp Ile Lys Thr Ser Leu Gln Asn Asp 225 230 235 240 Gln Leu Asn Ala His Gln Lys Leu Asn Tyr Arg Asp Gly Asn Val Arg 245 250 255 Phe Ile Leu Ile Leu Gly Cys Met Ile Ala Met Leu Gln Gln Val Thr 260 265 270 Gly Val Asn Val Met Met Tyr Tyr Ala Pro Ile Val Leu Lys Asp Val 275 280 285 Thr Gly Ser Ala Gln Glu Ala Leu Phe Gln Thr Ile Trp Ile Gly Val 290 295 300 Ile Gln Leu Ile Gly Ser Ile Ile Gly Ala Met Ile Met Asp Lys Met 305 310 315 320 Gly Arg Leu Ser Leu Met Arg Lys Gly Thr Ile Gly Ser Ile Ile Gly 325 330 335 Leu Leu Leu Thr Ser Trp Ala Leu Tyr Ser Gln Ala Thr Gly Tyr Phe 340 345 350 Ala Leu Phe Gly Met Leu Phe Phe Met Ile Phe Tyr Ala Leu Ser Trp 355 360 365 Gly Val Gly Ala Trp Val Leu Ile Ser Glu Ile Phe Pro Asn Arg Met 370 375 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20 25 30 Ala Asp Pro Phe Ile Glu Gly Ala Gln Arg Leu Ala Glu Ala Asn Gly 35 40 45 Ala Glu Ala Val Ala Ser Pro Asp Glu Val Phe Ala Arg Asp Asp Ile 50 55 60 Asp Gly Ile Val Ile Gly Ser Pro Thr Ser Thr His Val Asp Leu Ile 65 70 75 80 Thr Arg Ala Val Glu Arg Gly Ile Pro Ala Leu Cys Glu Lys Pro Ile 85 90 95 Asp Leu Asp Ile Glu Met Val Arg Ala Cys Lys Glu Lys Ile Gly Asp 100 105 110 Gly Ala Ser Lys Val Met Leu Gly Phe Asn Arg Arg Phe Asp Pro Ser 115 120 125 Phe Ala Ala Ile Asn Ala Arg Val Ala Asn Gln Glu Ile Gly Asn Leu 130 135 140 Glu Gln Leu Val Ile Ile Ser Arg Asp Pro Ala Pro Ala Pro Lys Asp 145 150 155 160 Tyr Ile Ala Gly Ser Gly Gly Ile Phe Arg Asp Met Thr Ile His Asp 165 170 175 Leu Asp Met Ala Arg Phe Phe Val Pro Asn Ile Val Glu Val Thr Ala 180 185 190 Thr Gly Ala Asn Val Phe Ser Gln Glu Ile Ala Glu Phe Asn Asp Tyr 195 200 205 Asp Gln Val Ile Val Thr Leu Arg Gly Ser Lys Gly Glu Leu Ile Asn 210 215 220 Ile Val Asn Ser Arg His Cys Ser Tyr Gly Tyr Asp Gln Arg Leu Glu 225 230 235 240 Ala Phe Gly Ser Lys Gly Met Leu Ala Ala Asp Asn Ile Arg Pro Thr 245 250 255 Thr Val Arg Lys His Asn Ala Glu Ser Thr Glu Gln Ala Asp Pro Ile 260 265 270 Phe Asn Phe Phe Leu Glu Arg Tyr Asp Ala Ala Tyr Lys Ala Glu Leu 275 280 285 Ala Thr Phe Ala Gln Gly Ile Arg Asp Gly Gln Gly Phe Ser Pro Asn 290 295 300 Phe Glu Asp Gly Val Ile Ala Leu Glu Leu Ala Asn Ala Cys Leu Glu 305 310 315 320 Ser Ala Gln Thr Gly Arg Thr Val Thr Leu Asn Pro Ala Asn Val 325 330 335 <210> 4 <211> 344 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 4 Met Ser Leu Arg Ile Gly Val Ile Gly Thr Gly Ala Ile Gly Lys Glu 1 5 10 15 His Ile Asn Arg Ile Thr Asn Lys Leu Ser Gly Ala Glu Ile Val Ala 20 25 30 Val Thr Asp Val Asn Gln Glu Ala Ala Gln Lys Val Val Glu Gln Tyr 35 40 45 Gln Leu Asn Ala Thr Val Tyr Pro Asn Asp Asp Ser Leu Leu Ala Asp 50 55 60 Glu Asn Val Asp Ala Val Leu Val Thr Ser Trp Gly Pro Ala His Glu 65 70 75 80 Ser Ser Val Leu Lys Ala Ile Lys Ala Gln Lys Tyr Val Phe Cys Glu 85 90 95 Lys Pro Leu Ala Thr Thr Ala Glu Gly Cys Met Arg Ile Val Glu Glu 100 105 110 Glu Ile Lys Val Gly Lys Arg Leu Val Gln Val Gly Phe Met Arg Arg 115 120 125 Tyr Asp Ser Gly Tyr Val Gln Leu Lys Glu Ala Leu Asp Asn His Val 130 135 140 Ile Gly Glu Pro Leu Met Ile His Cys Ala His Arg Asn Pro Thr Val 145 150 155 160 Gly Asp Asn Tyr Thr Thr Asp Met Ala Val Val Asp Thr Leu Val His 165 170 175 Glu Ile Asp Val Leu His Trp Leu Val Asn Asp Asp Tyr Glu Ser Val 180 185 190 Gln Val Ile Tyr Pro Lys Lys Ser Lys Asn Ala Leu Pro His Leu Lys 195 200 205 Asp Pro Gln Ile Val Val Ile Glu Thr Lys Gly Gly Ile Val Ile Asn 210 215 220 Ala Glu Ile Tyr Val Asn Cys Lys Tyr Gly Tyr Asp Ile Gln Cys Glu 225 230 235 240 Ile Val Gly Glu Asp Gly Ile Ile Lys Leu Pro Glu Pro Ser Ser Ile 245 250 255 Ser Leu Arg Lys Glu Gly Arg Phe Ser Thr Asp Ile Leu Met Asp Trp 260 265 270 Gln Arg Arg Phe Val Ala Ala Tyr Asp Val Glu Ile Gln Asp Phe Ile 275 280 285 Asp Ser Ile Gln Lys Lys Gly Glu Val Ser Gly Pro Thr Ala Trp Asp 290 295 300 Gly Tyr Ile Ala Ala Val Thr Thr Asp Ala Cys Val Lys Ala Gln Glu 305 310 315 320 Ser Gly Gln Lys Glu Lys Val Glu Leu Lys Glu Lys Pro Glu Phe Tyr 325 330 335 Gln Ser Phe Thr Thr Val Gln Asn 340 <210> 5 <211> 278 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 5 Met Lys Leu Cys Phe Asn Glu Ala Thr Thr Leu Glu Asn Ser Asn Leu 1 5 10 15 Lys Leu Asp Leu Glu Leu Cys Glu Lys His Gly Tyr Asp Tyr Ile Glu 20 25 30 Ile Arg Thr Met Asp Lys Leu Pro Glu Tyr Leu Lys Asp His Ser Leu 35 40 45 Asp Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Gln Thr His His Ile Lys Pro Leu Ala 50 55 60 Leu Asn Ala Leu Val Phe Phe Asn Asn Arg Asp Glu Lys Gly His Asn 65 70 75 80 Glu Ile Ile Thr Glu Phe Lys Gly Met Met Glu Thr Cys Lys Thr Leu 85 90 95 Gly Val Lys Tyr Val Val Ala Val Pro Leu Val Thr Glu Gln Lys Ile 100 105 110 Val Lys Glu Glu Ile Lys Lys Ser Ser Val Asp Val Leu Thr Glu Leu 115 120 125 Ser Asp Ile Ala Glu Pro Tyr Gly Val Lys Ile Ala Leu Glu Phe Val 130 135 140 Gly His Pro Gln Cys Thr Val Asn Thr Phe Glu Gln Ala Tyr Glu Ile 145 150 155 160 Val Asn Thr Val Asn Arg Asp Asn Val Gly Leu Val Leu Asp Ser Phe 165 170 175 His Phe His Ala Met Gly Ser Asn Ile Glu Ser Leu Lys Gln Ala Asp 180 185 190 Gly Lys Lys Ile Phe Ile Tyr His Ile Asp Asp Thr Glu Asp Phe Pro 195 200 205 Ile Gly Phe Leu Thr Asp Glu Asp Arg Val Trp Pro Gly Gln Gly Ala 210 215 220 Ile Asp Leu Asp Ala His Leu Ser Ala Leu Lys Glu Ile Gly Phe Ser 225 230 235 240 Asp Val Val Ser Val Glu Leu Phe Arg Pro Glu Tyr Tyr Lys Leu Thr 245 250 255 Ala Glu Glu Ala Ile Gln Thr Ala Lys Lys Thr Thr Val Asp Val Val 260 265 270 Ser Lys Tyr Phe Ser Met 275 <210> 6 <211> 367 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 6 Met Pro Gly Lys Thr Ala Ser Met Lys Ala Arg Val Ser Cys Ser Ala 1 5 10 15 Lys Pro Gly Asp Thr Ser Pro Asn Thr Gly Asn Glu Val Phe Gln Met 20 25 30 Thr Val Arg Ile Gly Val Val Gly Thr Gly Ala Ile Gly Arg Asp His 35 40 45 Ala Arg Arg Ile Asn Lys Val Leu Gly Gly Ala Lys Ile Val Ala Leu 50 55 60 Ser Asp Val Asn Arg Ala Ser Ala Glu Ala Val Lys Asn Asp Ile Ala 65 70 75 80 Pro Asp Ala Val Leu Phe Ala Thr Gly Glu Glu Leu Ile Ala Ser Pro 85 90 95 Asp Val Glu Ala Val Leu Val Thr Ser Trp Gly Ala Thr His Glu Gln 100 105 110 Tyr Val Leu Ala Ala Ile Ala Ala Gly Lys Pro Cys Phe Cys Glu Lys 115 120 125 Pro Leu Ala Thr Thr Ala Glu Gly Ala Arg Arg Ile Val Asp Ala Glu 130 135 140 Val Ala His Gly Lys Arg Leu Val Gln Val Gly Phe Met Arg Arg Tyr 145 150 155 160 Asp Ala Gly Tyr Val Ala Leu Lys Gln Ala Val Asp Asn Arg Ile Gly 165 170 175 Ala Pro Ile Met Val His Ala Ala His Arg Asn Pro Ser Val Pro Glu 180 185 190 Gln Tyr Val Thr Pro Met Ala Ile His Asp Thr Met Ile His Glu Ile 195 200 205 Asp Val Leu Arg Trp Leu Leu Asp Asp Asp Tyr Val Ser Ala Arg Val 210 215 220 Leu Phe Pro Arg Ser Ala Ala Arg Ser His Ala Lys Leu Lys Asp Pro 225 230 235 240 Gln Ile Val Ile Leu Glu Thr Ala Lys Gly Thr Ile Ile Asp Val Glu 245 250 255 Ile Phe Val Asn Cys His Tyr Gly Tyr Asp Ile Gln Cys Gln Val Val 260 265 270 Gly Glu Asp Gly Ile Ala Ser Leu Pro Glu Pro Met Ser Val Gln Thr 275 280 285 Arg Leu Gly Ala Arg Leu Gln Asn Asp Ile Leu Thr Asp Trp Lys Asp 290 295 300 Arg Phe Ile Ala Ser Tyr Asp Val Glu Leu Gln Asp Phe Ile His Ala 305 310 315 320 Ala Ala Lys Gly Thr Ala Ser Gly Pro Asn Ser Trp Asp Gly Tyr Val 325 330 335 Ala Ala Ile Ser Ser Asp Ala Cys Val Ala Ala Gln Glu Thr Gln Gly 340 345 350 Ala Ala Val Ala Ile Asp Leu Pro Ala Arg Pro Ala Leu Tyr Gln 355 360 365 <210> 7 <211> 265 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 7 Met Arg Ser Phe Met Arg Phe Ala Ile Asn His Ile Thr Ala Pro Lys 1 5 10 15 Leu Ser Leu Glu Gln Phe Phe Ala Thr Ala Arg Glu Leu Gly Leu Ala 20 25 30 Glu Val Glu Ile Arg Asn Asp Leu Pro Asp Ile Val Gly Thr Val Asp 35 40 45 Pro Ala Ala Val Lys Ala Ala Ala Glu Lys Ala Gly Val Thr Ile Ile 50 55 60 Ser Ile Asn Ala Leu Tyr Pro Phe Asn Val Trp Ser Gly Asp Leu Pro 65 70 75 80 Ala Arg Ala Val Ala Met Ala Asp Tyr Ala Ala Ala Ser Gly Ala Asn 85 90 95 Ala Leu Val Met Cys Pro Leu Asn Asp Gly Thr Ala Val Ser Phe Asp 100 105 110 Asn Leu Val Thr Ala Leu Lys Ala Met Lys Leu Ile Leu Glu Glu Arg 115 120 125 Gly Leu Thr Gly Leu Val Glu Pro Leu Gly Phe Pro Val Ser Ser Leu 130 135 140 Arg Thr Lys Ala Glu Ala Val Arg Ala Ile Asp Ala Ala Gly Gly Gly 145 150 155 160 Asp Val Tyr Lys Leu Val His Asp Thr Phe His His His Leu Ala Gly 165 170 175 Glu Thr Glu Leu Phe Pro Glu Arg Thr Gly Leu Val His Ile Ser Gly 180 185 190 Val Thr Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Asp Met Leu Asp Ala His Arg 195 200 205 Val Leu Val Asp Gly Asp Asp Arg Leu Glu Asn Ile Ala Gln Ile Lys 210 215 220 Thr Leu Glu Ala Ala Gly Tyr Lys Gly Pro Tyr Ser Phe Glu Pro Phe 225 230 235 240 Ala Thr Glu Val His Glu Leu Lys Asp Pro Ala Val Val Val Lys Asp 245 250 255 Ser Ile Asp His Ile Ser Arg Ala Leu 260 265 <210> 8 <211> 336 <212> PRT <213> Pantoea ananatis <400> 8 Met Ser Leu Lys Leu Gly Val Ile Gly Thr Gly Ala Ile Gly Gln Glu 1 5 10 15 His Ile Arg Arg Cys Asn Asn Val Leu Gln Gly Ala Arg Val Val Ala 20 25 30 Val Ser Asp Ile Asn Val Glu Gly Ala Gln Ala Ala Leu Gln Arg Leu 35 40 45 Asn Ser Asp Ala Gln Val Cys Lys Asp Gly Tyr Glu Val Ile Gln Ser 50 55 60 Pro Asp Val Asp Ala Val Leu Val Thr Ser Trp Asp Pro Thr His Glu 65 70 75 80 Glu Phe Thr Leu Ala Ala Ile Ala Ala Gly Lys Pro Val Phe Cys Glu 85 90 95 Lys Pro Leu Ala Met Ser Ala Glu Gly Cys Arg Arg Val Val Glu Ala 100 105 110 Glu Ile Gln His Gly Lys Arg Leu Val Gln Val Gly Phe Met Arg Pro 115 120 125 Tyr Asp Ala Gly Tyr Arg Ala Leu Lys Lys Val Ile Thr Asp Gly Glu 130 135 140 Ile Gly Glu Pro Leu Met Leu His Cys Ala His Arg Asn Pro Thr Val 145 150 155 160 Pro Glu Asn Tyr Asn Thr Glu Met Ala Ile Thr Asn Thr Leu Ile His 165 170 175 Glu Leu Asp Val Leu Arg Trp Leu Thr Ser Asp Asp Tyr Lys Ser Val 180 185 190 Gln Val Val Phe Pro Arg Val Ser Ser Lys Ala Arg Pro His Leu Lys 195 200 205 Asp Pro Gln Ile Val Leu Phe Glu Thr Gln Lys Gly Val Arg Ile Asp 210 215 220 Val Glu Ile Phe Val Asn Cys Thr Tyr Gly Tyr Asp Ile Gln Cys Glu 225 230 235 240 Val Val Gly Glu Glu Gly Ile Ala Arg Leu Pro Glu Pro Ser Ser Val 245 250 255 Gln Leu Arg Lys Gln Ala Lys Leu Ser Asn Thr Ile Leu Val Asp Trp 260 265 270 Lys Asp Arg Phe Ile Glu Ala Tyr Asp Val Glu Leu Gln Ala Phe Ile 275 280 285 Asn Asp Val Lys Ala Gly Gln Leu Thr Gly Pro Ser Ala Trp Asp Gly 290 295 300 Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Asp Ala Cys Ile Lys Ala Gln Lys Ser 305 310 315 320 Gly Ala Ile Glu Pro Ile Glu Met Pro Ala Arg Pro Ala Phe Tyr Asn 325 330 335 <210> 9 <211> 273 <212> PRT <213> Pantoea ananatis <400> 9 Met Thr Ile Ala Ala Glu Arg Phe Cys Ile Asn Arg Lys Ile Ala Pro 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Glu Ala Phe Phe Arg Leu Val Asn Gly Leu Gly Leu 20 25 30 Asn Lys Val Glu Leu Arg Asn Asp Leu Pro Ser Gly Asn Val Met Asp 35 40 45 Asn Leu Ser Ala Ala Gln Val Cys Ala Leu Ala Glu Arg Tyr Gly Ile 50 55 60 Asp Ile Ile Thr Ile Asn Ala Val Tyr Pro Phe Asn Gln Arg Thr Glu 65 70 75 80 Gln Val Arg Gln Leu Thr Glu Ser Leu Leu Ala Asp Ala Lys Ala Val 85 90 95 Gly Ala Arg Ser Leu Val Leu Cys Pro Leu Asn Asp Gly Ser Ser Val 100 105 110 Ala Pro Glu Val Thr Leu Asn Ala Leu Arg Asp Leu Ala Pro Leu Phe 115 120 125 Ala Thr Tyr Gly Ile Thr Gly Leu Val Glu Pro Leu Gly Phe Pro Gln 130 135 140 Ser Ser Leu Arg Ser Ala Ala Gln Ala Gln Lys Leu Ile Arg Asp Ala 145 150 155 160 His Val Pro Phe Lys Leu Leu Ile Asp Thr Phe His His His Leu Tyr 165 170 175 Pro Asp Ala Asp Ala Glu Phe Ser Gln Val Asp Ile Ala Gln Ile Gly 180 185 190 Leu Val His Leu Ser Gly Val Glu Asp Lys Arg Pro Arg Glu Ser Leu 195 200 205 Thr Asp Ala Glu Arg Ile Met Leu Thr Pro Glu Asp Arg Leu Phe Thr 210 215 220 Cys Arg Gln Val Lys Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Lys Gly Ile Tyr 225 230 235 240 Ala Phe Glu Pro Phe Ala Pro Glu Leu Ala Asp Trp Asp Glu Asn Lys 245 250 255 Ile Gln His Glu Ile Lys Asn Ser Ile Gln Leu Ile Gln His Ser Leu 260 265 270 Lys <210> 10 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 cgagaattcc atggcaggag gtaataaata tgtccacatc agatagttgt tataatacg 59 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 gatggatcct taatcagaat aacgttcggt ttg 33 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 gctggatcca ggaggtaata catatgtctc agagaagtaa gtac 44 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 gcagtcgact taggctatta catcgcgacg tttcc 35 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 gactcatgac tcttcgtatc gccc 24 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 ctagcggccg cttaactaga cgttgactaa acg 33 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 cgacatatga ccatcgccgc agaacg 26 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 cgattaatta atgcatcaac gaagcctggg c 31 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 gacacatgtc aatgagttta cgtattgg 28 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 19 ctagcggccg ccttcatatt ttcactcctc tg 32 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 20 cgacatatga aactttgttt taatgaagcg 30 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 cgattaatta attacatgct gaagtatttt gatacgac 38 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 cgaacatgtc tatgcctggg aagaccgcgt c 31 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 23 gcagagctct tattggtaaa gtgcgggacg g 31 <210> 24 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 ctaggatcca ggagatatac atatgaggtc tttcatgcgt tttg 44 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 25 cgagtcgact tagagcgccc gggagatatg gtc 33 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 26 gacacatgtc attgaaactt ggtgtgattg g 31 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 27 ctagcggccg cttagttata gaatgccgga cg 32

Claims

다음의 단계를 포함하는 휴면세포를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법:
(a) 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 재조합 세포를 준비하는 단계;
(b) 상기 재조합 세포를 마이오-이노시톨을 포함하는 배지에서 정지기(stationary phase) 까지 배양하여 휴면세포(resting cell) 상태로 유도하는 단계; 및
(c) 상기 휴면세포를 회수하고 마이오-이노시톨을 포함하는 최소 배지(minimal medium)에서 배양하여 D-카이로-이노시톨을 생성시키는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c) 이후에, 배양한 휴면세포를 회수하고, 마이오-이노시톨을 포함하는 최소 배지에서 다시 배양하여 D-카이로-이노시톨을 생성시키는 단계 (d)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 단계 (d)를 1 - 50회 범위에서 반복하여 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항의 상기 단계 (c) 이후에, 또는 제 2 항 또는 제 3 항의 상기 단계 (d) 이후에 휴면세포를 배양한 최소 배지의 배양액으로부터 D-카이로-이노시톨을 정제하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 정지기는 재조합 세포를 배양한 배지에서 마이오-이노시톨의 농도와 D-카이로-이노시톨의 농도가 평형에 이른 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 최소 배지는 탄소원 및 무기염을 포함하는 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 최소 배지는 항생제 및 발현 유도제(inducer)를 더욱 포함한 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 무기염은 Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl, NH₄Cl, CaCl₂, 및 MgSO₄로 이루어지는 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 락토오스, 녹말, 녹말의 가수분해물, 아세트산, 프로피온산, 에탄올, 프로판올, 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 재조합 세포는 마이오-이노시톨 트랜스포터를 코딩하는 DNA 서열, 이노시톨 디하이드로게나아제를 코딩하는 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 서열을 발현 가능한 형태로 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 (i) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시톨 트랜스포터 코딩 DNA 서열을 포함하는 제1의 재조합 벡터; 및 (ⅱ) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시톨 디하이드로게나아제 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 서열을 포함하는 제2의 재조합 벡터로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 재조합 세포는 동물세포, 곤충세포, 효모 또는 원핵세포인 것으로 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 마이오-이노시톨 트랜스포터는 서열번호 1 및 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 이노시톨 디하이드로게나아제는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 이노소스 이소머라아제는 서열번호 5, 서열번호 7, 및 서열번호 9에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 1 항의 상기 단계 (c) 이후에, 또는 제 2 항의 상기 단계 (d) 이후에, 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(e) 상기 휴면세포 배양이 완료된 최소배지에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계;
(f) 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및
(g) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
제 16 항에 있어서, 상기 단계 (g) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(h) 상기 단계 (g)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하는 단계;
(i) 상기 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계;
(j) 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및
(k) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
제 17 항에 있어서, 상기 단계 (h)에서 이노시톨 분말을 20％(w/v) 이하의 농도로 물에 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 유기용매는 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜 또는 에테르인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 단계 (e)에서 유기용매의 첨가량은 배양이 완료된 최소 배지 대비 0.1 - 9배 (v/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 단계 (i)에서 유기용매의 첨가량은 수용액 대비 1 - 10배 (v/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 단계 (g) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(h)′ 상기 단계 (g)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하고 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계;
(i)′ 상기 수용액에서 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및
(j)′ 상기 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
제 22 항에 있어서, 상기 단계 (h)′에서, 이노시톨 분말을 20％(w/v) 초과 - 70％(w/v) 이하의 농도로 물에 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법.