JP2005087149A - D−キロ−イノシトールの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 D−キロ−1−イノソースまたはミオ−イノシトールから出発して、酵素反応だけによりD−キロ−イノシトールを製造できる方法が提供された。前記のD−キロ−イノシトール製造方法で利用できる酵素としてのミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼおよびシロ−イノソース イソメラーゼの新しい製造方法が提供された。
【選択図】 なし
Description
のD−キロ−1−イノソースにミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼと補酵素として還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)とを反応させて次式(IV)
のD−キロ−イノシトールを生成させ、得られた反応液からD−キロ−イノシトールを回収することを特徴とする、D−キロ−イノシトールの製造方法が提供される。
のミオ−イノシトールにミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼと、補酵素として知られる酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)とを水性反応媒質中で反応させて次式(II)
のシロ−イノソースを生成させる第1の反応ステップを行った。続いて、得られた式(II)のシロ−イノソースに、バチルス ズブチリス染色体中に存在する既知のiolI遺伝子のコードする酵素、すなわちシロ−イノソース イソメラーゼを水性反応媒質中で反応させて次式(III)
のD−キロ−1−イノソースを生成させる第2の反応ステップを実験し、さらに得られた式(III)のD−キロ−1−イノソースに、第1の反応ステップで使用したものと同じミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼと、を還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)とを水性反応媒質中で反応させて次式(IV)
のD−キロ−イノシトールを生成させる第3の反応ステップを実験したところ、第3の反応ステップの反応溶液中に式(IV)のD−キロ−イノシトールが生成できることを知見した。
のミオ−イノシトールにミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼと酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)とを水性反応媒質中で反応させて次式(II)
のシロ−イノソースを生成させる第1の反応ステップを行い、式(II)のシロ−イノソースに、バチルス ズブチリス染色体中に存在する既知のiolI遺伝子のコードする酵素、シロ−イノソース イソメラーゼを水性反応媒質中で反応させて次式(III)
のD−キロ−1−イノソースを生成させる第2の反応ステップを行い、式(III)のD−キロ−1−イノソースに、第1の反応ステップで使用したものと同じミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼと、還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)とを水性反応媒質中で反応させて次式(IV)
のD−キロ−イノシトールを生成させる第3の反応ステップを行い、第3の反応ステップの反応溶液から式(IV)のD−キロ−イノシトールを回収する工程を行うことから成る、D−キロ−イノシトールの製造方法が提供される。
(a) 粗酵素抽出液の調製
トリプトン 1.0%、酵母抽出物 1.5%、KH2PO4 0.23%、K2HPO4 1.25%、MgCl2 0.1%を含み且つミオ−イノシトール2%を添加された液体培地(pH7.0)の100mlづつを10本の坂口フラスコに入れ、121℃、15分間、オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却した。フラスコ10本の中の培地に、それぞれバチルス ズブチリスATCC6633株のスラント培養物から1白金耳加えて、接種した。その後、接種された培地(計1000ml)をレシプロシェーカー上で36℃で16時間振とう培養した。得られた培養液は、次に、ジャーファメンター中で上記と同じ組成をもち且つオートクレーブ滅菌された100リットルの培地に、無菌的に加えた。このように接種された培地をジャーファーメンター中で200rpmの攪拌下、通気量1vvmにて、36℃で7時間好気的に培養した。得られた培養液は、遠心分離して、菌体を集め、集菌した菌体(湿重量約400g)を400mlの水に懸濁した。この菌体懸濁液を10℃以下の温度で、超音波破砕装置(出力600W・冷却水循環型)に流速50ml/分の流速でポンプで送り、菌体を破砕した。破砕装置の洗浄に100mlの水を使用して、その洗液を菌体破砕液に加えた。得られた菌体破砕液を、遠心分離して不溶固体を捨て且つ500mlの上清を取り出した。この上清は、ミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼとシロ−イノソース イソメラーゼを含有する粗酵素抽出液(500ml)である。
次に、上記の粗酵素抽出液に、4℃で、450gの硫酸アンモニウムを加えて、タンパク質を塩析させた。得られた混合物を遠心分離して、タンパク質沈殿を得た。上清は捨てた。得られたタンパク質沈殿を300mlの水に溶解し、得られた水溶液中に生じる不溶物を遠心分離により除去した。ここで得られた上清を4℃でゲル濾過のためSephadex G100カラム(直径12cm 高さ50cm)を通して通過させ、次にカラムを20mMトリス緩衝液(pH7.0)で溶出することにより、カラムクロマトを行なった。カラム溶出液を10ml−フラクション別に分画すると、分子量100kダルトン以上の物質を含むフラクションとしてミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼの粗酵素溶液が得られ、また分子量20〜50kダルトンの物質を含むフラクションとしてシロ−イノソース イソメラーゼの粗酵素溶液が得られた。
分子量100kダルトン以上の上記フラクションを集めて得られた粗酵素溶液を、DEAEヨバールカラム(直径5cm高さ25cm)に通し、次に該カラムを20mMトリス緩衝液(pH7.0)でNaClの直線濃度勾配下に溶出することによって、カラムクロマトを行なった。カラム溶出液を10ml−フラクション別に分画すると、約250mM NaClの濃度で溶出したフラクションにミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼ活性が検出された。これらのフラクションを集めてミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼを含む精製酵素溶液の100mlを得た。この酵素溶液に50%濃度で硫安を加えると、ミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼの100mgが沈殿した。
分子量20〜50kダルトンの上記フラクションを集めて得られた粗酵素溶液をDEAEヨバールカラム(直径5cm高さ25cm)に通し、次に該カラムを20mMトリス緩衝液(pH7.0)でNaClの直線濃度勾配下に溶出することによって、カラムクロマトを行なった。カラム溶出液を10ml−フラクション別に分画すると、約300mM NaClの濃度で溶出されたフラクションにシロ−イノソース イソメラーゼ活性が検出された。これらのフラクションを集めて、シロ−イノソース イソメラーゼ酵素溶液100mlを得た。この酵素溶液に50%濃度で硫安を加えると、シロ−イノソース イソメラーゼ100mgが沈殿した。
ミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼ活性の検定は次のように行う。すなわち、酵素を含むフラクション溶液100μlと10%ミオ−イノシトール水溶液100μlと1Mトリス緩衝液(pH8.0)100μlと100mM MgSO4水溶液10μlと1%NAD+水溶液10μlとジアホラーゼ 5Uと1%NTB溶液2μlとの混合物に水を加えて全量1mlになるようにした反応混合物溶液を調製した。この反応混合物溶液を27℃、10分間保持して酵素反応させた。反応後、還元型NTBに由来する565nmの光における吸光度を測定することにより、ミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼ活性を検定できる。
100ml容の三角フラスコに、ミオ−イノシトール デヒドロゲナーゼ(Sigma社製、エンテロバクター由来)20ユニット、D−キロ−1−イノソース2g(純度97%、3%のシロ−イノソースを含む)、NADH(オリエンタル酵母社製)9g、100mM塩化マグネシウム溶液1mlおよび1Mトリス塩酸バッファー溶液(pH8.0)5mlを入れ、さらに100mlになるように水を加えて反応混合物溶液を調製した。この溶液を、36℃、16時間、静置にて酵素反応させた。
(1) 第1の反応ステップとしては、1リットル容の三角フラスコに、ミオ−イノシトール デヒドロゲナーゼ(Sigma社製、エンテロバクター由来)200ユニット、ミオ−イノシトール20g、NAD+(オリエンタル酵母社製)90g、100mM塩化マグネシウム溶液100mlおよび1Mトリス塩酸バッファー溶液(pH8.0)50 mlを入れて、1リットルになるように水を加えて反応混合物溶液を調製した。この調製された溶液を、36℃、16時間、静置にて酵素反応させた。
(a) ジャーファーメンター内で70℃の水1.7リットルにミオ−イノシトール1.0kg、硫酸マグネシウム・7水和物1.2g、塩化マンガン・4水和物0.1gを加えて溶解し、さらに総量が4.5リットルになるように水を加えて水溶液を作った。この水溶液を40℃まで冷却し、5%シロ−イノソース水溶液0.3リットルを加えた。得られた混合物溶液をさらに、36℃に冷却し、1NのNaOH水溶液の添加によりpHを8.0に調整した。次に、実施例1(c)および(d)で調製した2つの精製酵素溶液の各0.1リットル、すなわち、実施例1(c)で調製したミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼの精製酵素溶液0.1リットルと実施例1(d)で調製したシロ−イノソース イソメラーゼの精製酵素溶液0.1リットルとを前記の混合物溶液に加えた。上記の酵素溶液を入れた容器を0.02リットルの水で洗い、その洗液も加えた。酵素溶液の添加された上記の混合物溶液がpH8.0を示した段階で、NAD+(オリエンタル酵母社製)の粉末の0.2gを加え、溶解させた。ここで得られた反応混合物5.0リットル中のミオ−イノシトールの当初濃度は20%(重量)に相当した。
測定されたD−キロ−イノシトール(DCI)の変換率(%)と反応時間との関係を次表に示す。
実施例4(a)で10時間酵素反応して得た反応液から、酵素を沈殿させ且つ遠心分離により除去して得られた上清5.1リットルを本例では使用した。
上記の上清(5.1L)は、目的生成物であるD−キロ−イノシトールを含み、これに加えてミオ−イノシトール、D−キロ−1−イノソースおよびシロ−イノソースを含み、さらに金属イオン、NAD+およびNADHおよび疎水性物質を含む水溶液である。この上清から先ずD−キロ−1−イノソースおよびシロ−イノソースならびにイオン性物質および疎水性物質を除去するために、該上清(5.1L)を0.3リットルの強酸性イオン交換樹脂(デュオライトC20、H+タイプ)カラムと、0.4リットルの強塩基性イオン交換樹脂(デュオライトA116、OH-タイプ)カラムに流速5ml/分で順次通液し、また0.1リットルの活性炭カラムに順次、流速5ml/分で通液させた。活性炭カラムからの通過液(5.0リットル)を貯めた。
上記の(a)で得た上清として得たミオ−イノシトールおよびD−キロ−イノシトール水溶液に0.3リットルのイソプロパノールを攪拌しながら加えていった。イソプロパノールの混合に伴って、ミオ−イノシトール固体が析出した。この固体は遠心分離により分離できた。固体を含むその混合物全体を静置し、その上清をHPLC分析すると、上澄液中のミオ−イノシトール:D−キロ−イノシトール濃度比は46:54であった。
上記の(b)で得たところの、ミオ−イノシトール42gおよびD−キロ−イノシトール104gを含む結晶(146g)を、水に溶解して水溶液(0.3リットル)を調製した。
Claims (14)
- 反応は水性反応媒質中で行われる、請求項1に記載の方法。
- 使用されるミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼはバチルス ズブチリス由来またはエンテロバクター エアロゲネシス由来のミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼであり、好ましくはバチルス ズブチリス染色体中に存在する既知のiolG遺伝子のコードするミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼである、請求項1に記載の方法。
- 次式(I)
のミオ−イノシトールにミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼと酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)とを水性反応媒質中で反応させて次式(II)
のシロ−イノソースを生成させる第1の反応ステップを行い、式(II)のシロ−イノソースに、バチルス ズブチリス染色体中に存在する既知のiolI遺伝子のコードする酵素、シロ−イノソース イソメラーゼを水性反応媒質中で反応させて次式(III)
のD−キロ−1−イノソースを生成させる第2の反応ステップを行い、式(III)のD−キロ−1−イノソースに、第1の反応ステップで使用したものと同じミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼと、還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)とを水性反応媒質中で反応させて次式(IV)
のD−キロ−イノシトールを生成させる第3の反応ステップを行い、第3の反応ステップの反応溶液から式(IV)のD−キロ−イノシトールを回収する工程を行うことから成る、D−キロ−イノシトールの製造方法。 - 使用されるミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼはバチルス ズブチリス由来またはエンテロバクター エアロゲネシス由来のミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼであり、好ましくはバチルス ズブチリス染色体中に存在する既知iolG遺伝子のコードするミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼである、請求項4に記載の方法。
- ミオ−イノシトール水溶液に対してミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼおよび酸化型もしくは還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+もしくはNADH)ならびにシロ−イノソース イソメラーゼを添加し、得られた反応混合物中で、NAD+の作用とミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼの触媒作用によってミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成させる第1の反応と、NAD+からNADHへの変換反応と、シロ−イノソース イソメラーゼの触媒作用によってシロ−イノソースからD−キロ−1−イノソースを生成させる第2の反応と、生成したNADHの作用とミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼの触媒作用によりD−キロ−1−イノソースからD−キロ−イノシトールを生成させる第3の反応と、NADHからNAD+への変換反応とを行わせ、さらにそれら反応の終了後に、得られた反応液からD−キロ−イノシトールを回収することから成る、D−キロ−イノシトールの製造方法。
- ミオ−イノシトール水溶液に当初から(1)NAD+もしくはNADHを0.0001%〜0.2%の濃度で、好ましくは0.004%の濃度で添加すること、(2)Mg2+イオンが0.001mM〜10mM、好ましくは1mMの濃度になるようにMg塩を添加すること、(3)Mn2+イオンが0.0001mM〜1mM、好ましくは0.1mMの濃度になるようにMn塩を添加すること、及び(4)反応混合物のpHをpH7.0〜9.0、好ましくはpH7.7〜8.3に保つことを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- ミオ−イノシトール水溶液に、当初からシロ−イノソースを0.0001%〜10%(重量)、好ましくは0.3%(重量)の濃度で添加する、請求項6に記載の方法。
- ミオ−イノシトールの水溶液に当初に添加されるミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼおよびシロ−イノソース イソメラーゼは、これら2つの酵素を共に生産する能力を有する細菌としてのバチルス ズブチリスを培養して該細菌の細胞内に前記2つの酵素を蓄積させ、前記の培養された細胞を破砕し、得られた細胞破砕液から抽出することにより得られた前記2つの酵素を含む粗酵素液の形であるか、もしくは前記の細胞破砕液から、既知の酵素分離法および酵素精製法でそれぞれに単離され精製したミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼと精製したシロ−イノソース イソメラーゼの形である、請求項6に記載の方法。
- ミオ−イノシトールとD−キロ−イノシトールとを80:20〜90:10の重量比で含有する水溶液に、イソプロパノールまたはn−プロパノールもしくはそれら両者を混合し、得られた混合物からミオ−イノシトールを優先的に析出させ、D−キロ−イノシトールを水溶液中に溶解したまま残すことから成る、ミオ−イノシトールとD−キロ−イノシトールとを含有する混合物からミオ−イノシトールを分離する方法。
- 用いられるミオ−イノシトールとD−キロ−イノシトールとを含有する水溶液は、ミオ−イノシトールとD−キロ−イノシトールを80:20〜90:10の重量比で含有し且つミオ−イノシトールおよびD−キロ−イノシトールの合計の濃度が40〜60重量%であって水含量が60〜40重量%である水溶液であり、該水溶液に30%〜100%(容量)の量のイソプロパノールまたはn−プロパノールを攪拌下に添加する、請求項10に記載の分離方法。
- 用いられるミオ−イノシトールとD−キロ−イノシトールとを含有する水溶液は、ミオ−イノシトールの水溶液に当初からミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼおよびシロ−イノソース イソメラーゼの両者ならびにNAD+もしくはNADHを添加して、これにより請求項6に記載の第1、第2および第3の反応ステップを順次進行させて行うことから成る請求項6に記載の方法の実施により得られた最終の反応液から、酵素を除き且つイオン性物質およびイノソース化合物ならびに疎水性物質を除いた残りの溶液であるところの、請求項10に記載の分離方法。
- ミオ−イノシトールとD−キロ−イノシトールとを20:80〜30:70の重量比で含有し且つミオ−イノシトールとD−キロ−イノシトールとの合計の濃度が30〜80%(重量)であるミオ−イノシトールおよびD−キロ−イノシトールの水溶液を調製し、そして該水溶液を強塩基性イオン交換樹脂カラムによるクロマトグラフィーにかけてミオ−イノシトールのみを含む溶出液画分と、D−キロ−イノシトールのみを含む溶出液画分とを別々に収得し、後者の画分を濃縮し、その濃縮液からD−キロ−イノシトールを単離することから成る、ミオ−イノシトールおよびD−キロ−イノシトールを含む水溶液からD−キロ−イノシトールの分離方法。
- バチルス ズブチリスの染色体中に存在する既知のiolG遺伝子のコードするミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼと、該染色体中に存在する既知のiolG遺伝子のコードする酵素、シロ−イノソース イソメラーゼとの両者を生産する能力をもつバチルス属細菌、特にバチルス ズブチリスを培養し、培養された細胞内に前記2つの酵素を蓄積させ、次いで、培養された細胞を集菌し、集菌した菌体を緩衝液中で破砕し、得られ細胞破砕液を遠心分離し、上清として得られた粗酵素抽出液から前記の2つの酵素を別々に採取することを特徴とする、ミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼおよびシロ−イノソース イソメラーゼの製造法。
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