JP4276886B2 - シロ−イノソースとｄ−キロ−１−イノソースとの相互変換作用を有する酵素とその製造および応用 - Google Patents
シロ−イノソースとｄ−キロ−１−イノソースとの相互変換作用を有する酵素とその製造および応用 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シロ−イノソースをD−キロ−1−イノソースへ変換させ且つD−キロ−1−イノソースをシロ−イノソースへ変換させる平衡的反応を触媒する酵素作用を有する酵素であるシロ−イノソースイソメラーゼに関する。さらに、本発明は、遺伝子組換えによりシロ−イノソースイソメラーゼ産生能を付与された細菌形質転換体からのシロ−イノソースイソメラーゼの製造方法に関する。本発明は、またシロ−イノソースイソメラーゼをシロ−イノソースに作用させてD−キロ−1−イノソースを生成し、次いでD−キロ−1−イノソースを化学的に還元することから成るD−キロ−イノシトールの製造方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、シロ−イノソースイソメラーゼをコードするDNAよりなる遺伝子を包含し、またシロ−イノソースイソメラーゼをコードするDNAの導入で組換えたベクター、ならびに該ベクターで形質転換された細菌宿主細胞、特にバチルス属細菌宿主細胞に関する。
【０００３】
さらに、本発明は、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を染色体中にもつバチルスsp. OK-3-2-2株を包含する。
【０００４】
【従来の技術】
D−キロ−イノシトールは、経口的または非経口的に投与されると、細胞内情報伝達を活性化するイノシトールリン脂質系に作用して、II型糖尿病に改善効果をもたらすこと（特許文献1：特表平4−505218号参照）、および、多嚢胞生卵巣症候群に改善効果をもたらすこと（特許文献２：USP5906979号参照、非特許文献１：The New England Journal of Medicine、J. E. Nestler et al、1999年、340巻、1314頁参照）が提唱されている治療剤である。D−キロ−イノシトールは機能的には、広範な代謝系疾患に関与すると考えられ、今後その適応が拡大する可能性が期待される物質である。
【０００５】
D−キロ−イノシトール（DCIと略記することがある）は、９種類あるイノシトール立体異性体の一つである。それの製造方法は、これまで、抗生物質であるカスガマイシンの加水分解によりDCIを製造する方法（特許文献３：USP5091596号参照、特許文献４：USP5463142号参照、特許文献５：USP5714643号参照、特許文献６：USP6342645号参照）、マメ科植物に含有されるD−ピニトールを加水分解してDCIを製造する方法（特許文献７：USP5827896号参照、特許文献８：PCT/US01/15353参照、特許文献９：特開平13−261600号参照）、有機合成によりDCIを製造する方法（特許文献10：USP5406005号、特許文献11：WO96/25381号参照、特許文献12：特表平8−502255号参照、特許文献13：特開平11−280068号参照）、微生物をミオイノシトールに作用させることにより、ミオ−イノシトールから D−キロ−イノシトールへ変換させるDCIの製造方法（特許文献14：特開平９−140388号参照）などが知られる。
【０００６】
しかしながら、カスガマイシンやＤ−ピニトールを出発原料として用いてDCIを製造する場合、これらの原料物質が高価である。また、有機合成により製造する場合もDCIの収率および光学純度が低く、最終産物であるDCIは高価なものになる。さらに、ミオイノシトールへ微生物を作用させてD−キロ−イノシトールへ変換させる反応は、変換の制御が困難であり、微生物により他の代謝産物も同時に生産されるため、D−キロ−イノシトールの単離と精製が困難である。
【０００７】
また、近年、アグロバクテリウム属に属し且つミオ−イノシトールをD−キロ−イノシトールに変換できる構成酵素としてのＤ−ミオ−イノシトール １−エピメラーゼを生産できる性能を有する細菌を利用してミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールを製造する方法が知られている（特許文献15：特開2001−8694号および特許文献16：WO 02/055715号パンフレット参照）。しかしながら、その細菌を培養しながらミオ−イノシトールに作用させてミオ−イノシトールをD−キロ−イノシトールに変換する方法では、高い基質濃度で細菌を作用させることが困難であり、そのため、膨大な培地の量を取り扱わなくてはならない。
【０００８】
また、ミオ−イノシトールにシュードモナスsp. AB10064株（FERM P−18330）またはアセトバクターsp. AB10253株（FERM P−18868）を作用させて、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成する方法が提案された（特許文献17：2002年6月25日出願の特願2002−184912号参照）。特許文献17にも記載されるように、ミオ−イノシトールを酸化してシロ−イノソースへ変換する酵素、ミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼは、自然界に広く存在しており、酵母、細菌にも存在することが知られる（例えば非特許文献２：Journal of Bacteriology、131巻872〜875頁（1977）参照）。
【０００９】
さらに、標準株として、バチルス ズブチリスATCC 6633が知られており、これの染色体DNAの全塩基配列が公開されている。公開された塩基配列のイノシトール代謝オペロン内に存在する12種類のオープンリーディングフレーム（ORF）の中のDNA配列の内部には、iol E、iol F、iol G、iol H、iol Iのなどの幾つかの遺伝子があることが知られる。iol E、iol H、iol Iの３つの遺伝子の機能は不明である。iol I遺伝子でコードされる酵素は、2002年に、Ｘ線構造解析されているが、その酵素の機能は不明のままである（非特許文献３：Proteins、2002年、48巻、423〜426頁）。
【００１０】
また、枯草菌（バチルス ズブチリス）の中には、iol G遺伝子が存在し、ミオ−イノシトールを酸化してシロ−イノソースを生成させるミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼが存在することが知られる（非特許文献４：Journal of Biological Chemistry, 254巻7684〜7690頁（1979）参照）。
【００１１】
【特許文献１】
特表平4−505218号公報（全文：II型糖尿病に対するＤ−キロ−イノシトールの効果）
【００１２】
【特許文献２】
USP5906979号明細書（全文：多嚢胞生卵巣症候群に対するＤ−キロ−イノシトールの効果）
【００１３】
【特許文献３】
USP5091596号明細書（全文：カスガマイシンの加水分解によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１４】
【特許文献４】
USP5463142号明細書（全文：カスガマイシンのアセチル化分解によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１５】
【特許文献５】
USP5714643号明細書（全文：カスガマイシンの加水分解によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１６】
【特許文献６】
USP6342645号明細書（全文：カスガマイシンの加水分解によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１７】
【特許文献７】
USP5827896号明細書（全文：ピニトールを加水分解してＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１８】
【特許文献８】
PCT/US01/15353号明細書（全文：大豆種皮から得られるピニトールを加水分解してＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１９】
【特許文献９】
特開平13−261600号公報（全文：食用資源から得られるピニトールを加水分解してＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００２０】
【特許文献１０】
USP5406005号明細書（全文：グルクロン酸から１０工程でＤ−キロ−イノシトールを合成する方法）
【００２１】
【特許文献１１】
WO96/25381号パンフレット（全文：ジアルドースから有機合成によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００２２】
【特許文献１２】
特表平8−502255号公報（アセトニドから有機合成によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００２３】
【特許文献１３】
特開平11−280068号公報（ミオ−イノシトールから有機合成によりD−キロ−イノシトールを得る方法）
【００２４】
【特許文献１４】
特開平9−140388号公報（全文：ミオ−イノシトールにアグロバクテリウム属細菌を培養しながら作用させることによりDCIを製造する方法）
【００２５】
【特許文献１５】
特願2001−8694号明細書（全文：（アグロバクテリウム）sp. AB10121株を培養しながら作用させることによりDCIを製造する方法）
【００２６】
【特許文献１６】
WO 02/055715号パンフレット（全文：遺伝子組換でエピメラーゼ生産能を発現させた大腸菌を培養してミオ−イノシトールに作用させることによりDCIを製造する方法）
【００２７】
【特許文献１７】
WO 00/75355号パンフレット（全文）
【００２８】
【特許文献１８】
特開2002−285号公報（全文）
【００２９】
【特許文献１９】
特願2002−184912号明細書（全文）
【００３０】
【非特許文献１】
The New England Journal of Medicine、J. E. Nestler et al、1999年、340巻、1314頁（全文：多嚢胞生卵巣症候群に対するＤ−キロ−イノシトールの効果）
【００３１】
【非特許文献２】
Journal of Bacteriology、131巻872〜875頁（1977）（全文：バチルス ズブチリスのイノシトール代謝オペロンに関する）
【００３２】
【非特許文献３】
Proteins、2002年、48巻、423〜426頁（全文：バチルス ズブチリスのイノシトールオペロンのiol I遺伝子に由来する酵素のＸ線構造解析）
【００３３】
【非特許文献４】
Journal of Biological Chemistry, 254巻7684〜7690頁（1979）（全文がミオ
イノシトール 2−デヒドロゲナーゼに関する）
【００３４】
【発明が解決しようとする課題】
安価な原料としてミオ−イノシトールを用いてD−キロ−イノシトールを製造する方法において、効率的にD−キロ−イノシトールを生成でき且つ生成されたD−キロ−イノシトールの単離と精製を容易に行い得るD−キロ−イノシトール製造の新しい方法が望まれていた。
【００３５】
本発明者らは、酵素を反応に用いることにより、高い基質濃度で酵素を作用させてD−キロ−イノシトールを効率的に製造することが可能であると考えた。そこで酵素を用いてミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールを製造する新しい方法を開発することを課題または目的として、研究を重ねた。また、ミオ−イノシトールからDCIを製造する方法で利用できる新しい酵素を得るための研究も行った。
【００３６】
先ず、ミオ−イノシトールからDCIを生成するのに利用できる１種または数種の酵素を産生する能力を有する新しい微生物を見出すための研究を行った。この研究の一環として、55℃で生育できる中度好熱性の土壌細菌のうちから、ミオ−イノシトールをDCIに変換できる一連の酵素を産生する能力をもつ細菌種を見出すための一連の実験を行った。これらの菌スクリーニング実験においては、滅菌した寒天1.5％を含む農研培地をシャーレに入れて固化させた培地に、各種の土壌サンプルの水懸濁液の希釈液をそれぞれプレーティングし、植菌された一連の培地をそれぞれ55℃で培養し、増殖する菌をそれぞれ培地から分離した。次に、それぞれの単離した菌株を、ミオ−イノシトールを４％含有する基本液体培地（酵母エキス0.4％、グルコース0.5％、硫酸アンモニウム0.1％、MgSO4 0.01％、KH2PO4 0.07％,K2HPO4 0.02％）に植菌した。55℃で４日間培養した後、それぞれの菌株の培養液を遠心し、それぞれの上清を得てHPLC分析した。HPLCの分析条件は、カラム：Wakosil NH2、溶離液：80％アセトニトリル、流速2.0ml/min、検出器：RI検出器であった。それぞれの上清からミオ−イノシトールと、D−キロ−イノシトールを分離して定量した。
【００３７】
これらの菌株スクリーニング実験を通して、ミオ−イノシトールをDCIに変換できる能力を有するバチルス属新菌株を発見し、その菌学的性質を検査してバチルス リッチェフォーミスの新菌株であると同定することに成功した。この新菌株をバチルス リッチェフォーミスOK3−2−2株と命名した。さらに、ミオ−イノシトール4％を含有する前記の基本液体培地中で55℃で前記の新菌株、ＯＫ3−2−2株を4日間培養し、その培養液から菌体を分離し、得られた培養上清液中で生成されて存在する代謝生産物をHPLCを調べた結果、基質であるミオ−イノシトールが存在する他に、Ｄ−キロ−イノシトール（DCI）が生成されたことが見出された。
【００３８】
バチルス属細菌は、ミオ−イノシトールを酸化してシロ−イノソースに変換するミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼを産生することが既知である。このことを考えると、前記の新菌株OK 3−2−2株は、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースに酸化する酵素を産生し、しかもシロ−イノソースをＤ−キロ−1−イノソースに変換できる未知の酵素が前記の新菌株、ＯＫ3−2−2株によってミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼの他に、産生されていることが想定され、また、この未知の酵素によって、一旦生産されたシロ−イノソースがＤ−キロ−1−イノソースに変換され且つD−キロ−1−イノソースがDCIに変換されたと、本発明者らは想定した。
【００３９】
上記のＯＫ3−2−2株細菌中の未知の酵素が何であるか、その酵素の実体を調べて同定するために、本発明者は後記される考察と一連の遺伝子工学的実験を行った。
すなわち、前記の新菌株、OK3−2−2株はバチルス属に属するが、これと同じバチルス属に属しており且つ染色体DNAの全塩基配列が解明、公開されてある前記のバチルス ズブチリス ATCC 6633は、前記の新菌株OK3−2−2株と同様に、ミオ−イノシトールから生成されたシロ−イノソースを、Ｄ−キロ−1−イノソースに変換できる未知の酵素を産生していると想定した。
【００４０】
この想定の下に、バチルス ズブチリス ATCC 6633の染色体DNAのうちのイノシトール代謝オペロン中に存在する既知の12種類のＯＲＦのうちに存在するところの、12種類のタンパク質をそれぞれコードする12個のDNA配列に着目した。これらのDNA配列の中にある前記のiol E遺伝子、iol H遺伝子、iol I遺伝子によりコードされる３種の酵素は、その機能が今まで未知であったが、それら３種の酵素を収得して且つそれらの機能を調べる研究を行った。なお、この際に、既知のキシロ−スイソメラーゼのアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を有し且つタンパク質3Ｄ推定構造の点でも類似するタンパク質をコードできるDNA配列が前記のバチルス ズブチリス ATCC 6633の3種の遺伝子、iol E、iol H、iol IのそれぞれのDNA配列と多くの点で共通する事実があることを参考にした。
【００４１】
そこで初めに、バチルス ズブチリス ATCC 6633の染色体DNAのうちのiol E遺伝子、iol H遺伝子およびiol I遺伝子にそれぞれ相当する３種のDNA断片を遺伝子工学的手法により収得し、さらにこれら３種のDNA断片をそれぞれ包有する組換えプラスミドを構築し、これらプラスミドをそれぞれ別々に細菌宿主細胞中に導入し、宿主細胞形質転換体を培養し、３種のそれぞれのDNA断片でコードされる酵素を発現、生成させる遺伝子工学的手法を行う後記の実施例1の実験を実施した。
【００４２】
後記の実施例1の実験の方法は、概説すると、バチルス ズブチリス ATCC 6633の染色体DNAを抽出し、これを鋳型に用い且つ配列表の配列番号５および６のプライマーを用いるPCR法によって、iol E、iol H、iol Iの遺伝子に相当するDNAをそれぞれ作成し且つ単離し、それらDNAを発現ベクターに組み込み、得られた組換えベクターを宿主細胞に導入した後に、その形質転換宿主細胞を培養し、導入DNAから酵素を発現させることから成る方法である。得られた酵素の活性を測定したところ、iol I遺伝子に相当するDNAのみがシロ−イノソースイソメラーゼ活性をもつ酵素をコードすることが証明された。
【００４３】
さらに、前記の新菌株、バチルス リッチェニフォーミスOK3−2−2株（FERM P−19188）の染色体DNAを鋳型に用い且つ配列表の配列番号7および8のプライマーを用いるPCR法によって、前記iol I遺伝子のDNAときわめて高い類似性をもつ、すなわち高い相同性のあるDNA断片を作成し、このDNA断片を宿主細胞に導入し、その形質転換宿主細胞の培養により導入DNAから酵素を発現、生成させる遺伝子工学的手法を行う後記の実施例2の実験を実施した。実施例2で遺伝子工学的に得られたDNAも、シロ−イノソースイソメラーゼ活性をもつ酵素をコードすることを見出した。
【００４４】
後記の実施例１および実施例２でそれぞれ得られた酵素は、該酵素を含む粗酵素液100μl、10％シロ−イノソース溶液100μl、1Ｍトリス緩衝液（pH 7.5）100μl、100ｍＭ MnCl2溶液10μlおよび100ｍＭ ZnCl2溶液10μlを水と混ぜ、全容1mlの混合物を調製した後、この混合物液を27℃、16時間反応させ、反応後、1Ｍリン酸 pH 2.0 10μlを加えて、反応を停止させ、さらに、この反応溶液を70℃、10分加熱し、タンパク質を加熱変成により沈析させ、遠心分離し、得られた上清をHPLC分析する実験において、シロ−イノソースを基質にするとシロ−イノソースをＤ−キロ−1−イノソースに異性化させる反応を触媒すると共に、また、Ｄ−キロ−1−イノソースを基質にするとシロ−イノソースに異性化させる反応を触媒する酵素活性をもつ酵素である、すなわち換言すれば、シロ−イノソースイソメラーゼ活性をもつ酵素であることが判明した。
【００４５】
すなわち、後記の実施例１または実施例２で粗酵素液中に得られた目的の酵素は、下記のシロ−イノソース（I）と下記のＤ−キロ−1−イノソース（II）との平衡的変換反応
を触媒する作用をもつ酵素であること、すなわちシロ−イノソースイソメラーゼであることが判明した。また酵素の性質を試験したところ該酵素はpH 5〜pH 9、好ましくはpH 6〜pH 8の至適pHをもち、活性化因子としてMn2+、Zn2+、Co2+イオンによって活性化されることが判明した。
【００４６】
従って、第１の本発明においては、至適pHがpH 5〜pH 9の範囲にあり且つMn2+、Zn2+またはCo2+である活性化因子によって活性化される特性を有すると共に、下記の式（I）のシロ−イノソースを下記の式（II）のD−キロ−1−イノソースへ変換させ
且つ後者を前者に変換させる相互変換の平衡的反応を触媒する酵素作用をもつ特性を有するシロ−イノソースイソメラーゼとして使用されることを特徴とする、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する酵素タンパク質が提供される。
【００４７】
実施例1において、バチルス ズブチリス ATCC 6633のiol I遺伝子に相当するDNAを包有するDNA断片として、PCR法で作成された約850bpのDNA断片は、配列表の配列番号３で示す塩基配列をもつ837 bpのDNAを包有するDNA断片であるから、実施例１で収得された目的の酵素シロ−イノソースイソメラーゼは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列をもつタンパク質であると推定できる。
【００４８】
また、実施例２において、バチルス リッチェニフォーミスOK3−2−2株（FERM P−19188）のiol I遺伝子ホモログに相当するDNAを包有するDNA断片として、PCR法で作成された約850bpのDNA断片は、配列表の配列番号4で示す塩基配列をもつ837 bpのDNAを包有するDNA断片であるから、実施例2で収得された目的の酵素、シロ−イノソースイソメラーゼは、配列表の配列番号2に示すアミノ酸配列をもつタンパク質であると推定できる。
【００４９】
従って、第２の本発明(請求項１の発明)においては、至適pHがpH 5〜pH 9の範囲にあり且つMn2+、Zn2+またはCo2+である活性化因子によって活性化される特性を有すると共に、下記の式（I）のシロ−イノソースを下記の式（II）のD−キロ−1−イノソースへ変換させ
且つ後者を前者に変換させる相互変換の平衡的反応を触媒する酵素作用をもつ特性を有するシロ−イノソースイソメラーゼであることを特徴とする、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する酵素タンパク質が提供される。
【００５０】
第１の本発明の酵素、具体的には、実施例１または２で得た本発明酵素は、シロ−イノソースとＤ−キロ−1−イノソースの相互変換を触媒する作用を有するが、この作用は、イソメラーゼ作用またはエピメラーゼ作用のどちらかである。しかしながら、本酵素は次式（III）のＤ−(3−デオキシ)−2−ミオ−イノソースと次式（IV）のＤ−(3−デオキシ)−1−ミオ−イノソースの相互変換をも触媒することから、本発明酵素による変換反応は、ケトンの移動を伴うイソメラーゼ反応であることが判った。
【００５１】
また、バチルス ズブチリス ATCC 6633のiol I遺伝子の産物のＸ線構造解析（Proteine 2002年、48巻、423〜426頁）の結果に、本酵素を当てはめると、酵素の活性中心の金属イオン（Mnイオン）にケトンの酸素原子とOH基とが配位し、これによりケトンの移動を伴う遷移状態を安定化していると推定される。
【００５２】
さらに、配列表の配列番号1または2に示すアミノ酸配列と一部、僅かに異なるけれども、該アミノ酸配列に対して90〜100％相同性をもつタンパク質も、第1の本発明酵素と同じ酵素活性をもつと推定できる。
【００５４】
第1の本発明による酵素タンパク質、または第２の本発明によるシロ−イノソースイソメラーゼである酵素タンパク質は、バチルス ズブチリス ATCC 6633、または本発明者らによって単離された前記のバチルス属sp. OK3−2−2株（FERM P−19188）からiol I遺伝子またはiol I遺伝子ホモログをコードするDNAを遺伝子工学的に作成し、該DNAの導入により細菌形質転換体を作り、その細菌形質転換体を培養し、その培養された細胞菌体から、または培養液から、既知の酵素分離法により回収することによって製造できる。
【００５５】
本発明によるシロ−イノソースイソメラーゼを製造する方法においては、iol I遺伝子またはそのホモログのDNAの導入で形質転換された細菌、特に大腸菌属の細菌を、既知の細菌培養用液体培地中で30℃〜55℃の培養温度で培養する。得られた培養液から、培養された形質転換細菌の細胞の菌体を濾過または遠心分離法に分離できる。分離されたペレット状の菌体を水で洗浄後、遠心分離し、洗浄菌体を得ることができる。この洗浄菌体を1％トライトンＸ−100を含む100mMトリスバッファー（pH 7.5）に懸濁させ、超音波によって菌体を破砕する。菌体の破砕後、遠心分離し、上清にある酵素抽出液を得る。その後に、酵素抽出液に50％になるように硫酸アンモニウムを加えて、タンパク質を塩析させる。このようにして調製したタンパク質溶液を、さらに遠心分離し、タンパク質沈殿として目的の酵素を得る。これを100mMトリスバッファー（pH 7.5）に溶解して保存できる。
【００５６】
菌体からの前記した酵素抽出液に硫酸アンモニウムを加えてタンパク質を析出させる方法の他に、酵素抽出液から目的の酵素を回収する方法としては、酵素抽出液を、イオン交換樹脂に吸着後、塩濃度による直線濃度勾配を利用したカラムクロマトグラフィーにかけて分離して、精製することができる。
【００５７】
また、上記の形質転換細菌の培養液から目的の酵素を回収する場合には、培養液から培養細胞の菌体を分離した後に、得られ培養液上清を濃縮し、その濃縮液から硫安分画法によって目的の酵素を回収し、さらに精製することができる。
【００５８】
前記のバチルス属sp. OK3−2−2株は、以下の菌学的性質を以下に示した。 尚、本菌株の同定に当っては、新細菌培地学講座（第２版、近代出版）、医学細菌同定の手引き（第２版、近代出版）、細菌学実習提要（丸善）に準じて実験を行い、実験結果をBergey’s Manual of Systematic Bacteriology VOL. 1(1984)を参考にして本菌株を同定した。
【００５９】
OK3−2−2株の菌学的性質は次の通りである。
(a)形態的特徴
(1)細胞形態：桿菌、胞子を形成する
(2)運動性： +（懸滴法）
(3)普通寒天培地上での生育：５５℃での生育は速く、コロニー形態は薄く広がり不定形、色調は白色である。
【００６０】
(b)生理生化学的性状
(1)グラム染色： ＋
(2)OFテスト： O (Oxidative)
(3)好気条件での生育： ＋
(4)嫌気条件での生育： ＋
(5)生育温度：
20℃ −
30℃ ＋
40℃ ＋
45℃ ＋
55℃ ＋
65℃ −
(6)食塩耐性：
0％ ＋
5％ ＋
7％ ＋
10％ −
(7)生育ｐH：
ｐH 5.0 ＋
ｐH 6.0 ＋
ｐH 7.0 ＋
ｐH 8.0 ＋
(8)チトクロームオキシダーゼ： ＋
(9)カタラーゼ： ＋
【００６１】
(10)硝酸塩還元性： ＋
(11)硫化水素産生： −
(12)ゼラチンの液化： ＋
(13)カゼインの加水分解： ＋
(14)スターチの加水分解： ＋
(15)インドールの産生： −
(16)マロン酸の利用性： ＋
(17)ONPG分解性： −
(18)エスクリンの分解性： ＋
(19)クエン酸の利用性： ＋
(20)プロピオン酸の利用性： ＋
(21)デカルボキシラーゼ活性：
L-リジン −
(20)尿素の分解性： −
(21)各種糖から酸の生成：
D−グルコース ＋
D−キシロース ＋
D−マンニトール ＋
L−アラビノース ＋
(22)Ｖ−Ｐテスト ＋
(23)フェニルアラニンデアミナーゼ −
【００６２】
以上のとおり、OK3−2−2株の主性状は、グラム陽性の桿菌であり、生育適温は45℃〜55℃の中度好熱性微生物であって、本菌株の16SリボゾームRNAの塩基配列の相同性は、16Sリボゾーム塩基配列決定用プライマーとして、以下の配列：
5’-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3’
を有するプライマーを用いて、629塩基対までの範囲でシークエンスしたところ、バチルス ズブチリス （Bacillus subtilis）およびバチルス リッチェニフォーミス（Bacillus licheniformis）の２種類の菌株の16SリボゾームRNA塩基配列と100％一致した。
【００６３】
これらの菌学的性質と16SリボゾームRNAの塩基配列の相同性を総合して、OK3−2−2株はバチルス(Bacillus)属に属し、中度好熱性菌であるバチルス リッチェニフォーミス（Bacillus licheniformis）であると判断した。しかる後、本菌株をバチルス リッチェニフォーミスOK3−2−2株と命名し、産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−19188として寄託した（寄託日は平成15年１月17日）。
【００６４】
前述したところから明らかなように、第１の本発明のシロ−イノソースイソメラーゼ、あるいは第２の本発明のシロ−イノソースイソメラーゼは、これをシロ−イノソースに作用させると、シロ−イノソースをD−キロ−1−イノソースに変換できるから、シロ−イノソースからD−キロ−1−イノソースを製造できる。
【００６５】
従って、第３の本発明(請求項２の発明)においては、シロ−イノソースを含有する水溶液に、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質、あるいは配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質を、シロ−イノソースイソメラーゼとして使用し作用させて、シロ−イノソースをD−キロ−1−イノソースへ異性化させる酵素反応を行う工程と、その酵素反応溶液から酵素を回収する工程と、酵素の回収後に得た残液からD−キロ−1−イノソースを回収する工程と、回収したD−キロ−1−イノソースを精製する工程からなる、D−キロ−1−イノソースの製造方法が提供される。
【００６６】
第３の本発明方法に使用するシロ−イノソースの水溶液は、ミオ−イノシトールから微生物的変換により生成したシロ−イノソースの水溶液、あるいは、ミオ−イノシトールを酸化白金により酸化したシロ−イノソースの水溶液であることができる。シロ−イノソース水溶液は、反応開始時のシロ−イノソース濃度が１％〜15％、好ましくは10％であるのが望ましい。
【００６７】
このシロ−イノソース水溶液に作用させるシロ−イノソースイソメラーゼは、第1の本発明による単離されたシロ−イノソースイソメラーゼであることもでき、またはこれを含む粗酵素液であることもできる。
【００６８】
さらに、使用されるシロ−イノソースイソメラーゼは固定化酵素としても使用可能である。酵素固定化法としては、ゲル抱埋法、イオン交換樹脂吸着法など、一般の酵素固定化方法が適用できる。
【００６９】
使用されるシロ−イノソースの水溶液のpHは、シロ−イノソースイソメラーゼの至適pHであるpH５〜９、好ましくはpH５〜９、さらに好ましくはpH7.5に調整されてあるのが望ましい。また、活性化因子として、Mn2+とZn2+イオンを最終濃度0.01mM〜10mM、好ましくは0.5mMになるようにMn塩、Zn塩を添加、含有する方が望ましい。使用されるMn塩、Zn塩は水溶性の塩であれば使用することができる。また、反応温度は、バチルス由来シロ−イノソースイソメラーゼを使用する場合、20℃〜50℃、好ましくは40℃が望ましい。
【００７０】
シロ−イノソース水溶液に反応させるために抽出酵素液を使用する場合は、反応混合物が均一溶液のために攪拌する必要は無いが、温度を均一化するため攪拌した方が好ましい。反応はシロ−イノソースとＤ−キロ−１−イノソースが70：30の平衡値に達するまで進行させるのが好ましい。
【００７１】
反応終了後に、酵素回収は、酵素溶液を使用した場合、イオン交換樹脂カラムに反応溶液を通過させることにより酵素を回収することができる。固定化された酵素を使用した場合は、反応溶液を遠心分離、あるいはろ過操作することによって、固定化酵素を回収することができる。
【００７２】
このようにして、酵素を除いた後の残液である反応溶液は、未反応のシロ−イノソースと生成されたＤ−キロ−１−イノソースを含んでいる。次に、この溶液を、最初に加えたシロ−イノソースの重量の1.3倍〜2.5培、好ましくは1.7倍の重量までに濃縮し、その濃縮液を室温で静置する。この操作によりシロ−イノソースは、選択的に結晶化し、これを分別して、最初に加えたシロ−イノソースの25％に相当する水で結晶を洗浄し、この操作により、最初に加えたシロ−イノソースの約70％が回収される。結晶分別後の母液には、反応で生成したＤ−キロ−１−イノソースが溶解して居り、その生成量の内、約90％が含まれる。該母液を濃縮乾固すると、D−キロ−1−イノソースの無色粉末を回収できる。
なお、回収したシロ−イノソース結晶は再利用できる。
【００７３】
第３の本発明方法で収得できたD−キロ−1−イノソースは、これを化学的還元剤、例えばNaBH4で還元すると、D−キロ−イノシトールに転化できることが本発明者らによって見出された。
【００７４】
従って、第４の本発明(請求項３の発明)においては、シロ−イノソースを含有する水溶液に、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質、あるいは配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質を、シロ−イノソースイソメラーゼとして使用し作用させてシロ−イノソースをD−キロ−1−イノソースへ異性化させる酵素反応を行う第１の工程と、その酵素反応溶液から、シロ−イノソースイソメラーゼとして使用した酵素を回収する第２の工程と、その酵素回収後に、未反応のシロ−イノソースとD−キロ−1−イノソースを含む残液を濃縮する第３の工程と、その得られた濃縮液からシロ−イノソースを結晶化させてその結晶を分別する第４の工程と、その母液として得たD−キロ−1−イノソース含有溶液に還元剤を加え、D−キロ−1−イノソースを還元し、D−キロ−イノシトールを生成する第５の工程と、還元で生成したD−キロ−イノシトールを含む還元反応溶液からD−キロ−イノシトールを分離して精製する第６の工程とからなる、D−キロ−イノシトールの製造方法が提供される。
【００７５】
第４の本発明方法において、水溶液中のシロ−イノソースにシロ−イノソースイソメラーゼを作用させてD−キロ−1−イノソースに異性化させる第１工程と、その第１工程で得られた反応溶液から酵素を分離して回収する第２工程とは、第３の本発明によるシロ−イノソース製造方法におけるそれぞれ対応の工程と同様な要領で実施できる。
【００７６】
第４の本発明方法におけるD−キロ−1−イノソース含有の残液の濃縮の第３工程と、その濃縮液からのシロ−イノソースの結晶化およびその結晶の分離の第４の工程は、既知の手法で実施できる。第４の本発明方法におけるD−キロ−1−イノソース含有の水溶液に還元剤を加えて還元反応によりD−キロ−イノシトール（DCI）を生成する第５工程は、次の要領で実施できる。
すなわち、先行の第４工程で得られたD−キロ−1−イノソースを含有する母液は、そのまま第５工程の還元反応に使用することができる。しかし、該母液をpH調節して、pH6〜7、好ましくはpH6.5に調節するのが望ましい。この溶液に対して、還元剤、例えばNaBH4の粉末を直接にあるいは水溶液の形で添加する。還元剤はD−キロ−1−イノソースの0.25〜0.5モル、好ましくは0.3モル当量の量で添加する。その際、pHはpH6〜7の範囲で調整して還元反応を行うのが望ましい。
【００７７】
この還元反応によって、還元反応液中ではD−キロ−1−イノソースのうちの約50％が変換されてD−キロ−イノシトールが生成し、また残りはミオ−イノシトールに変換される。また、該母液中に共雑する残留のシロ−イノソースも還元され、シロ−イノソースの残留量のうちの60％がミオ−イノシトールに変換され且つ残りはシロ−イノシトールに変換される。従って、還元反応液は主生成物のD−キロ−イノシトールの他に、ミオ−イノシトールとシロ−イノシトールとを含む混合物溶液として得られる。
【００７８】
第４の本発明方法の第６工程は、第５工程で得た還元反応液からD−キロ−イノシトールの単離精製をする工程である。D−キロ−イノシトールを、共存するミオ−イノシトールおよびシロ−イノシトールとの混合物から単離する方法としては、該混合物をカラムクロマトグラフィーにかける分離方法が利用でき、また分別結晶化による分離方法も使用できる。また、これらの方法を組み合わせることができる。
【００７９】
前述したように、第１の本発明は、シロ−イノソースイソメラーゼとして使用できるところの、配列番号１のアミノ酸配列をもつ酵素タンパク質に関するものであり、またその第２の本発明は配列番号２のアミノ酸配列をもつ酵素タンパク質であって、シロ−イノソースイソメラーゼである酵素タンパク質に関するものである。これらの第１および第２の本発明による酵素タンパク質は、シロ−イノソースイソメラーゼとして作用することができ、しかも、それぞれに配列番号３の塩基配列をもつDNA、および配列番号４の塩基配列をもつDNAによってコードされる（後記の実施例１および２、参照）。
【００８０】
従って、第５の本発明においては、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであって且つ配列表の配列番号３で表される塩基配列を有するDNAである、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子が提供される。
【００８１】
また、第６の本発明(請求項４の発明)においては、至適pHがpH 5〜pH 9の範囲にあり且つMn2+、Zn2+またはCo2+である活性化因子によって活性化される特性を有すると共に、下記の式（I）のシロ−イノソースを下記の式（II）のD−キロ−1−イノソースへ変換させ
且つ後者を前者に変換させる相互変換の平衡的反応を触媒する酵素作用をもつ特性を有するシロ−イノソースイソメラーゼとして作用できて、しかも配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質をコードし且つ配列表の配列番号４の塩基配列を有するDNAが提供される。
【００８２】
次に、第５の本発明による配列番号３の塩基配列をもつDNAよりなるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を見出して単離することに成功した本発明者の研究の経緯を説明する。
【００８３】
(a) シロ−イノソースイソメラーゼをコードする遺伝子の探索
(i) バチルス ズブチリス染色体上にあるイノシトールオペロンを構成するDNA配列には、12種類のオープンリーディングフレーム（ORF）を有することが知られる。またこの内に在るiol G遺伝子はミオ−イノシトール ２−デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.18）をコードするDNAから成ることが知られていることに本発明者は先づ着目した。
【００８４】
次に、上記のORFの中に在ってミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼ以外の他の酵素をコードする残り11個の遺伝子の中から、イソメラーゼをコードする遺伝子またはDNAを見出すために、それら11個の遺伝子DNAを、代表的な糖のイソメラーゼであって、3D構造が良く知られているキシロースイソメラーゼ（EC5.3.1.5）をコードする遺伝子のDNAとそれらの相同性について比較した。しかしながら、塩基配列や、アミノ酸配列における相同性の点で比較を行ったところ、これらの点で高い相同性を有する遺伝子は認められなかった。
【００８５】
一方、インターネット3D-PSSMサイト（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~3dpssm /）において、コードされるアミノ酸配列から推定される推定3D構造の点でキシロースイソメラーゼに対して形の類似性がある遺伝子が、上記のORF中の残り11個の遺伝子のうちに３つ存在することを見出した。
【００８６】
これら３つの遺伝子はiol E(Entry No. BG11121)、iol H(Entry No. BG11123)、iol I(Entry No. BG11124)の３種類である。これらの３つの遺伝子の中に、目的のシロ−イノソースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードするものが存在すると本発明者らは推定した。
【００８７】
(ii) iol E、iol Hおよびiol I遺伝子の単離
iol E、iol H、iol Iの各遺伝子のそれぞれの単離のためには、バチルス ズブチリス染色体から抽出したゲノムDNAを鋳型にして用い且つ適当なプライマーを用いるポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）法により、iol E、iol H、 iol Iの各遺伝子にそれぞれ相当するDNAを包有していると推定できる３種類の、約850bpのDNA断片を単離した。この際には、制限酵素反応でPCR法のDNA断片を切断し且つ適当な方法、例えばアガロース電気泳動法で望みのDNA断片を選別する方法を利用した。
PCR法により、iol I遺伝子に相当するDNA断片を収得して、さらに単離する方法の詳細は、後記の実施例１に記載される。
【００８８】
(iii) iol E、iol Hおよびiol Iの各遺伝子に相当するDNAをそれぞれ連結された３つの組換えベクターの構築と、組換えプラスミドの構築
上記の(ii)で得た３つの遺伝子にそれぞれ相当する３種のDNA断片（約850bpのサイズ）は、各々別々に発現プラスミドベクターに組み込むため、あらかじめそれぞれのDNA断片の末端に、適切な制限酵素サイトを設定してある。これらDNA断片をそれぞれプラスミドベクターの同じ制限酵素サイトへ挿入して連結後、得られた組換えベクターをライゲートさせることによって、組換えプラスミドを構築できる。
【００８９】
この際に使用するプラスミドベクターとしては、好ましくは、マルチクローニングサイトを有する発現プラスミドベクターが使用される。酵素を発現させることが可能であり、かつ、適当な制限酵素サイトを有する他のプラスミドベクターも使用できる。
【００９０】
また、組換えプラスミドに組み込まれた遺伝子を発現させるために使用されて該プラスミド中に挿入されるプロモーターは、該プラスミドで形質転換した宿主微生物中で該遺伝子が発現することを可能にするプロモーターであれば、特に制限はない。例えばlacプロモーター、tacプロモーターなどが使用できる。
【００９１】
(iv) 上記３つの遺伝子に相当する各DNAを組み込まれた３種の組換えプラスミドによりそれぞれ形質転換された宿主細細胞の作製
(iii)のように調製された組換えプラスミドを、宿主細菌に導入するのは常法で行う。この際用いられる宿主細菌としては、組換えプラスミドが安定でかつ自律的に増殖可能である細菌であれば特に制限されず、通常の遺伝子組換えに用いられているもの、例えばエッシェリヒア属細菌またはバチルス属細菌などが好ましく使用される。
【００９２】
宿主細菌に(iii)で得た組換えプラスミドを導入する方法としては、例えば宿主細菌がエシェリヒア属に属するの場合には、カルシウムイオンの存在下に組換えプラスミドの導入を行ってもよい。コンピテントセル法を用いてもよく、またバチルス属に属する微生物の場合には、コンピテントセル法またはプロトプラスト法などを用いることができるし、エレクトロポレーション法あるいはマイクロインジェクション法を用いてもよい。宿主細菌への所望の組換えプラスミド導入の有無の検定については、組換えプラスミドを構成するベクターの薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で、プラスミド導入反応後の宿主微生物を培養し、選択培地上で生育できた宿主微生物を選択すればよい。
【００９３】
(b) 形質転換された宿主細菌中の導入遺伝子のDNAの発現による酵素の産生の検定
(i) 上記の(a)(iv)で得た形質転換細菌を培地上で培養すると、該細菌の形質転換のため導入された遺伝子（DNA）は発現して、その遺伝子（DNA）でコードされる酵素を産生する。酵素を発現誘導するために使用される培地は、形質転換細菌が安定して増殖する培地であれば、特に限定されない。例えば、Nutrient Broth、L-Broth、などを使用することができる。また、プラスミドベクターの種類によっては、培地中に遺伝子を発現させるためにイソプロピルチオガラクトピラノシド（IPTG）のようなインデューサーを加えてもよいし、培養の途中にインデューサーを加えても良い。
【００９４】
(ii) 上記の形質転換細菌の培養により、導入した遺伝子からの酵素の発現は次のようにして確認できる。iol E、iol H、iol Iの各遺伝子に相当するDNAをそれぞれもつ組換えプラスミドを導入した３種の形質転換株の細胞を別々に培養する。これにより、３つの酵素がそれぞれ発現される。発現した酵素を含有する細菌菌体は、遠心分離され、培地を除去し、さらに、ペレット状の菌体を水で洗浄後、遠心分離し、洗浄菌体を得ることができる。この洗浄菌体を１％トライトンX-100を含む100mMトリスバッファー（pH7.5）に懸濁させる。超音波によって菌を破砕する。破砕後、遠心分離し、上清液として粗酵素溶液を得る。その後に、50％になるように硫酸アンモニウムを加えて、タンパク質を塩析させる。このようにして調製したタンパク質溶液を、さらに遠心分離し、タンパク質沈殿を得る。これを100mMトリスバッファー（pH7.5）に溶解すると、iol E、iol H、iol Iの各遺伝子からそれぞれ発現誘導されたリコンビナート酵素を含む３種の粗酵素溶液を得ることができる。
【００９５】
これらの酵素液の各々と10％シロ−イノソース溶液または10％D−キロ−1−イノソース溶液をそれぞれ混合し、27℃、16時間反応させる。得られた酵素反応液を前述したHPLC条件で分析したところ、iol Eとiol Hとの各遺伝子に由来するリコンビナート酵素は、シロ−イノソースをD−キロ−1−イノソースに変換される活性をもたないことが確認された。iol I遺伝子に由来するリコンビナート酵素は、シロ−イノソースからD−キロ−1−イノソースへ変換させ且つD−キロ−1−イノソースからシロ−イノソースへ変換させる活性を有することが確認された。従って、バチルス ズブチリスのiol I遺伝子に相当するDNAの発現に由来するリコンビナート酵素は、シロ−イノソースとD−キロ−1−イノソースとを相互変換する酵素、すなわち本発明のシロ−イノソースイソメラーゼであることが判明した。
【００９６】
更に、第６の本発明（請求項４の発明）による配列番号4の塩基配列をもつDNAを、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子として見出して単離することに成功した本発明者の研究の経緯を説明する。
【００９７】
前記に説明するように、バチルス ズブチリスのiol I遺伝子（配列番号3のDNA）にコードされる酵素がシロ−イノソースイソメラーゼと証明された。このことから、他のバチルス属細菌もiol I遺伝子に似る遺伝子を有し、これによってシロ−イノソースイソメラーゼを産生することが推定できる。
【００９８】
上記の知見に基づいて、本発明者が分離したバチルス属sp. OK3−2−2株からのiol I遺伝子ホモログを得るために実験を行った。すなわち、該OK3−2−2株のゲノムDNAを単離し精製し、そのゲノムDNAを鋳型として用い且つ配列表の配列番号5のプライマーおよび配列番号６のプライマーと同様な塩基配列をもつ配列番号7のプライマーおよび配列番号8のプライマーを用いるPCR法を行うことによって、全く同様の操作によって、該OK3−2−2株上にあるiol I遺伝子ホモログに相当するDNA断片を得ることができた。
【００９９】
このようにPCR法によって、OK3−2−2株のiol I遺伝子ホモログに相当するDNAを包有するDNA断片を収得して単離する方法の詳細は、後記の実施例2に記載される。
【０１００】
このOK 3-2-2株のiol I遺伝子ホモログに相当するDNAの塩基配列は、配列表の配列番号4に記載される塩基配列を有していることが認められた。
【０１０１】
配列表の配列番号3の塩基配列をもつDNA（バチルス ズブチリス由来）と、配列番号4の塩基配列をもつDNA（バチルス リッチェニフォーミスOK3−2−2株由来）との違いは、塩基の位置番号78、102、105、192、234、295、426、480、510、696、711、729および810の13個所で塩基の種類が異なることである。その相違点を下記の表１に示す。
【０１０２】
【表１】
【０１０３】
配列番号3のDNAの塩基配列と配列番号4のDNAとの塩基配列の相同性は98％である。配列番号3のDNAでコードされるアミノ酸配列（配列番号1）の18番目はロイシンで99番目はリジンであるが、配列番号4のDNAでコードされるアミノ酸配列（配列番号2）の18番目はグルタミンで99番目がグルタミンである点で2個所で異なって居り、アミノ酸配列の相同性は99％であった。
【０１０４】
配列番号4のDNA（OK3−2−2株由来）の導入により形質形換された細菌による酵素の発現も、前記と同様の操作によって行うことができた。酵素活性の測定から、このリコンビナント酵素もまた、シロ−イノソースイソメラーゼであることが証明された（実施例2、参照）。
【０１０５】
また、本酵素の至適pHはpH7〜8にあり、Mn2+、Zn2+、Co2+イオンの存在下に活性化されることが判った。本酵素の熱安定性は45℃10minの熱処理で活性は100％であり、10分間の熱処理で活性が50％になる温度は54℃であった。
【０１０６】
さらにまた、第７の本発明においては、配列表の配列番号3または4に示す塩基配列をもつDNAであるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を導入された組換えベクターが提供される。
【０１０７】
配列番号3または4に記載のDNAは、その末端に適切な制限酵素、例えばHindIIIおよびBamHIによる切断サイトが設定されてある。ここで使用されるベクターは、既知の発現用ベクター、例えばプラスミドベクターpUC119であることができ、これに対して、配列番号３または４のDNAを遺伝子工学的手法の常法で結合して導入できる。
【０１０８】
プラスミドベクターに組み込むためには、あらかじめDNA断片の末端を適切な制限酵素で切断しておき、これをプラスミドベクター上にある同じ制限酵素サイトへ挿入し連結して組換えベクターを作成できる。また、適当なプロモーター等もライゲートさせることによって、組換えプラスミドを構築できる。この際に使用するプラスミドは、好ましくは、マルチクローニングサイトを有する発現プラスミドベクターが使用される。
【０１０９】
さらに、第８の本発明においては、配列表の配列番号3または4に示す塩基配列をもつDNAであるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を包有する第７の本発明の組換えベクターを、導入することにより形質転換された細菌宿主細胞が提供される。
【０１１０】
使用される宿主細菌は、大腸菌、例えばコンピーテントセルである大腸菌JM109株であることができ、組換えベクターの導入は既知の遺伝子工学的手法で行いうる。
【０１１１】
また、第９の本発明（請求項５の発明）においては、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質であるシロ−イノソースイソメラーゼをコードし且つ配列表の配列番号４の塩基配列をもつDNA配列を包有する組換えベクターの導入により形質転換された細菌宿主細胞を培養し、その培養された細胞菌体の破砕物からまたは培養液から、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質としてのシロ−イノソースイソメラーゼを回収することを特徴とする、前記シロ−イノソースイソメラーゼの製造方法が提供される。
【０１１２】
さらにまた、第10の本発明（請求項６の発明）においては、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであって且つ配列番号４で表される塩基配列を有するDNAを、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子として、染色体中に持つ中度好熱性のバチルス・リッチェニフォーミスOK3-2-2株（FERM P-19188として寄託）が新規微生物として提供される。
【０１１３】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を実施例について具体的に説明する。
【０１１４】
【実施例１】
バチルス ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラー
ゼの発現
（a）バチルス ズブチリスのゲノムDNAの調製
LBフラスコ培地100ml（1％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0）中に、LBスラント培地（1％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0、1.5％寒天）で培養したバチルス ズブチリスATCC 6633を一白金耳接種し、4時間、36℃で好気的に培養し、培養液から集菌した。得られた菌体ペレットに、15mlのSaline−EDTA溶液（0.15M NaCl、0.1M EDTA、pH8.0）とリゾチーム50mgを加えて菌体を懸濁し、菌体にリゾチームを37℃、2時間作用させた。処理後、得られた菌体溶解液に25％SDS溶液0．5mlを加えて完全に溶菌させた。次に、フェノールを3ml加えて、タンパク質を変成させた後に、遠心分離した。上清を取り出し、この上清液に20mlの2−プロパノールを加えて、粗ゲノムDNAを析出させた。析出した粗ゲノムDNAを遠心分離により沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。
【０１１５】
乾燥した粗ゲノムDNAは、さらに3mlTE液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0）に溶解後、その溶液に0.01mgのRNAaseを加え、36℃、2時間反応させてRNAを分解させた。さらに、0.01mgのプロテイナーゼKを加えて、36℃、2時間反応させてタンパク質を分解させた。次に、そのタンパク質分解反応液に1mlのフェノール−クロロホルム（1：1）混液を加えて、得られた混合物をゆっくりと攪拌し、RNAaseと、プロテイナーゼKを変成させた。次いで、混合物を遠心分離した。2相に分離したうちの、水性の上層を取り出した。これに3M酢酸Na溶液を0.3ml加えて、pH5.2に調整した。これに3mlの2−プロパノールを加えて、ゲノムDNAを析出させた。
【０１１６】
析出したゲノムDNAを遠心分離により沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥したゲノムDNAは、3mlTE液に溶解させ、さらにその溶液に1mlのフェノール−クロロホルム（1：1）混液を加える操作から、3mlTE液に溶解させる過程までを、再度繰り返した後に、遠心分離を行い、同様にpH5.2にて、上清に等量の2−プロパノールを加えて、バチルス ズブチリスのゲノムDNAの溶液を調製した。このようにして得られたゲノムDNAを、PCR反応のための鋳型として用いるDNAの溶液とした。
【０１１７】
（b）バチルス ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼに相当するDNA配列のクローニング
バチルス ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼに相当するDNA配列のクローニングを行うために、配列番号5と6との塩基配列を有する下記の2つのプライマーを用いて、PCR反応を行った。
iolIB.sub.-Fプライマー： 5'-ccccaagcttgatgaaactttgttttaatgaag-3'（配列No.5）
iolIB.sub.-Rプライマー： 5'-cgggatccttacatgctgaagtattttg-3''（配列No.6）
【０１１８】
PCR反応は次のように行った。すなわち宝酒造社のEx taq反応用溶液を使用し、該溶液の組成はTakara ExTaq Buffer×10倍液 5μl、dNTP mixture 4μl、鋳型DNA 30ng、10μM プライマー溶液 各1μl、Takara ExTaq 0．5μlを全体が50μlになるように水を加えて混合し、さらに30μlのミネラルオイルを重層することにより調製した。反応条件は、PCR増幅装置（ASTEC社 PC-700）を用い、変成を94℃，30秒、アニ―リングを40℃，1分、伸長を72℃，1分、の3段階の反応を35回繰返し行った。上記のPCR反応によって、約0.85kbpの大きさのDNA断片が増幅した。
【０１１９】
増幅反応後、重層したミネラルオイルを0.3mlのヘキサンで抽出し且つヘキサン層を除去する操作を3回繰返し、1分間減圧することにより、ミネラルオイルを除去した。この様にして得られた増幅反応液50μlから、ジーンクリーンキット（Bio101社製）を用いてPCR法で得たDNA断片を分離し精製した。すなわち、ジーンクリーンキット添付のNaI溶液の300μlを増幅反応液に加えて混合し、10μlガラスビーズ溶液を加えて混合し、得られた混合物を4℃、15分静置した後に、遠心分離した。こうして、増幅されたDNA断片の吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μlを該ガラスビーズに加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液によるガラスビーズ洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μlの滅菌水を加えて、混合することにより懸濁した。得られたガラスビーズ懸濁液を55℃で、15分加温した後、遠心分離を行い、増幅された約0.85 kbpのDNA断片を含む上清12μlを得た。
【０１２０】
（c）バチルス ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼをコードするDNAを含有する組換えベクターの調製と、それによる大腸菌の形質転換
（i）上記（b）で増幅され且つ精製されたDNA断片を、発現ベクターに組み込む操作は以下のように行った。すなわち、上記のDNA断片溶液10μlに対して、発現用プラスミドベクターとしてのベクターpUC119の0.5μgと、宝酒造社製の制限酵素Hind IIIおよびBam HIの各1μlと、宝酒造社製の制限酵素用緩衝液K buffer×10倍液 2μlとを加え、全体が20μlになるように滅菌水を加え、混合した。得られた混合液を36℃、16時間保って制限酵素を反応させた。
【０１２１】
（ii）上記の制限酵素反応を行った後、ジーンクリーン・キットを用いて、DNA断片と発現ベクターとを単離させた。すなわち、得られた制限酵素反応液20μlにキット添付のNaI溶液を300μl加えて混合し、次いで10μlガラスビーズ溶液を加えて混合し、さらに4℃、15分静置した後に、遠心分離し、DNA断片と発現ベクターの吸着したガラスビーズが沈殿させられた。上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μlを加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液によるガラスビーズ洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μlの滅菌水を加えて、懸濁し、55℃で、15分加温した後、遠心分離を行うと、DNA断片と発現ベクターとを含む上清12μlを得た。この操作により、制限酵素によって生じた約50bp以下の不要な小さなDNA断片は取り除かれ、目的とするDNA断片と、発現ベクターとが得られた。
【０１２２】
（iii）このようにして得たDNA断片と発現ベクターとを連結（ライゲーション）させるために、上記で調製したDNA断片とベクターとの溶液10μlにTakara Ligation kit−I溶液（宝酒造社）を10μl加えた。次いで、16℃、1時間反応させた。生成された組換えベクターを含むライゲーション反応溶液を用いて、コンピテントセルとして大腸菌JM109の形質転換を行った。すなわち、4℃で解凍したコンピテントセル溶液60μlに前記のライゲーション反応溶液を5μl加え、混合した。その混合物を、0℃，30分後、42℃，45秒、0℃，2分の処理にかけ、次いで、これに500μlのSOC溶液（2％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース、10mM MgSO4、10mM MgCl2）を加えて、36℃で1時間回復培養させた。この培養液100μlを、50μg/mlアンピシリン、40μg/ml X-gal（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside）、1mM IPTG（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を含むLB寒天培地（1％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0、1.5％寒天）に塗布した。さらに37℃、16時間培養した。この培養により、白色に発色したコロニーとして、前記の組換えプラスミドベクターの導入で形質転換された大腸菌が得られたので、これを選択した。
【０１２３】
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーを、アンピシリン（50μg/ml）を含むLB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体から、プラスミド精製キット（QIA filter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）によりプラスミドDNAの分離および精製を行った。こうして得られたプラスミドDNAは、目的とするシロ−イノソースイソメラーゼをコードする配列番号3の塩基配列をもつDNAを包有する約0.8kbpのDNA断片を含有することが確認された。
【０１２４】
（d）バチルス ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼの発現
（i）上記の（c）で白色発色したコロニーとして単離した大腸菌形質転換菌株を50μg/mlアンピシリンを含む100mlLB培地（1％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0）に移植し、36℃7時間培養した。この培養液に200mMイソプロピルチオガラクトピラノシド溶液を0.3ml加え、さらに36℃3時間培養した。培養終了後、遠心分離により、菌体を集めた。菌体を生理食塩水で1回洗浄した。さらに、洗浄菌体を0.6％トライトンX100溶液3mlに懸濁し、4℃で超音波により菌体を破砕した。この溶液を遠心分離し、上清としての酵素溶液2.8mlを取り出した。上清に1.2g硫安を加え、4℃でタンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、上清を除去した。この沈殿したタンパク質を2.5mlの20mMトリス緩衝液（pH7.0）に溶解させ、再度、遠心分離を行い、上清を20mMトリス緩衝液（pH7.0）で平衡化したShephadex G-25カラム（14ml）にアプライし、20mMトリス緩衝液（pH7.0）で溶出させ、脱塩を行なった。この操作により、シロ−イノソースイソメラーゼの粗酵素液3.5mlを得た。
【０１２５】
（ii）シロ−イノソースイソメラーゼ活性の測定は、次のように行った。すなわち、上記の粗酵素液100μl、10％シロ−イノソース溶液100μlまたは10％D−キロ−1−イノソース100μl、1Mトリス緩衝液（pH7.5）100μl、100mM MnCl2溶液 10μl、100mM ZnCl2溶液 10μlを全体が1mlになるように水を加えて混合した後、このように得た基本反応液を27℃、16時間反応させ、反応後、1Mリン酸（pH2.0）10μlの添加により反応を停止させた。さらに、この反応後の溶液は70℃10分加熱し、タンパク質を加熱変成させ、次いで遠心分離によりタンパク質沈殿を除き、上清をHPLC分析した。HPLC条件としては、WakosilNH2カラム（内径4.6mm×25cm）を用い、移動相は80％アセトニトリル水溶液、カラム温度20℃、流速2ml／min、検出器はUV検出器、OR検出器を用いた。
【０１２６】
その結果として、バチルス ズブチリスのiolI遺伝子から遺伝子工学的手法で得た配列番号3のDNAでコードされたリコンビナント酵素は、シロ−イノソースを基質にすると、D−キロ−1−イノソースに異性化させる反応を触媒することが判明した。また、反応は可逆的で、D−キロ−1−イノソースを基質にするとシロ−イノソースに異性化させることが判明した。平衡状態では1％のシロ−イノソースを基質にすると、シロ−イノソース：D−キロ−1−イノソース＝70：30の平衡に達することが判った。
【０１２７】
（e）バチルス ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼの諸性質
上記の（d）(ii)に示した基本反応液組成の内、1Mトリス緩衝液（pH7.5）100μlに代えて、pH4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5の1Mリン酸緩衝液100μl、あるいは、pH7.0、8.5、9.0の1Mトリス緩衝液100μlを用いて、変換活性を測定したところ、pH7.0〜8.0に最大活性を有していたことから、上記（d）のシロ−イノソースイソメラーゼの至適pHはpH7.0〜8.0であることが判った。
【０１２８】
さらに、上記の基本反応液組成の内、100mM MnCl2溶液 10μl、100mM ZnCl2溶液 10μlの合計20μlの重金属塩溶液の添加に代えて、重金属塩無添加、あるいは50mM MnCl2溶液 20μl、50mM ZnCl2溶液 20μl、50mM CoCl2溶液 20μl、50mM PbCl2溶液 20μl、50mM CuSO4溶液 20μl、50mM FeSO4溶液 20μl、50mM CaCl2溶液 20μl、50mM SnCl2溶液 20μl、50mM CdCl2溶液 20μl、50mM NiCl2溶液 20μl、もしくは、50mM MgCl2溶液 20μlを用いて変換活性を測定したところ、Mn2+、Zn2+、Co2+を含有する試験区で、それぞれ対象となる重金属塩無添加区よりも、120〜150％酵素活性が増加することから、本酵素はMn2+、Zn2+、Co2+を要求する金属酵素であることが判明した。
【０１２９】
【実施例２】
バチルス リッチェニフォーミスOK3−2−2株由来シロ−イノソースイソメラーゼの発現
（a）バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株のゲノムDNAの調製
LBフラスコ培地100ml（1％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0）中に、LBスラント培地（1％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0、1.5％寒天）で培養したバチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株を一白金耳接種し、4時間、55℃で好気的に培養し、培養液から集菌した。この菌体ペレットに、15mlのSaline−EDTA溶液（0.15M NaCl、0.1M EDTA、pH8.0）とリゾチーム50mgを加えて菌体を懸濁し、菌体にリゾチームを37℃、2時間作用させた。処理後、得られた菌体溶解液に25％SDS溶液を0.5ml加えて完全に溶菌させた。次にフェノールを3ml加えて、タンパク質を変成させた後に、遠心分離した。上清を取り出し、この上清に20mlの2−プロパノールを加えて、粗ゲノムDNAを析出させた。析出した粗ゲノムDNAを遠心分離により沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。
【０１３０】
乾燥した粗ゲノムDNAは、さらに3mlTE液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0）に溶解後、その溶液に0.01mgのRNAaseを加え、36℃、2時間反応させ、RNAを分解させた。さらに、0.01mgのプロテイナーゼKを加えて、36℃、2時間反応させ、タンパク質を分解させた。次に、そのタンパク質分解反応液に1mlのフェノール−クロロホルム（1：1）混液を加えて、得られた混合物をゆっくりと攪拌し、RNAaseと、プロテイナーゼKを変成させた。その変成混合物を遠心分離し、2相に分離した内の水相である上層を取り出した。、これに3M酢酸Na溶液を0.3ml加えて、pH5.2に調整した。これに3mlの2−プロパノールを加えて、ゲノムDNAを析出させた。
【０１３１】
析出したゲノムDNAを遠心分離により沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥したゲノムDNAは、3mlTE液に溶解させ、さらにその溶液に1mlのフェノール−クロロホルム（1：1）混液を加える操作から、3mlTE液に溶解させる過程までを、再度繰り返した後に、遠心分離を行い、同様にpH5.2にて、上清に等量の2−プロパノールを加えて、バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株のゲノムDNAの溶液を調製した。このようにして得られたゲノムDNAを、PCR反応のための鋳型として用いるDNAの溶液とした。
【０１３２】
（b）バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株由来シロ−イノソースイソメラーゼに相当するDNA配列のクローニング
バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株由来シロ−イノソースイソメラーゼ配列のクローニングを行うために、配列番号7と8の塩基配列を有する下記の2つのプライマーを用いて、PCR反応を行った。
iolIOK3 − 2 − 2-Fプライマー： 5’- ccccaagcttgatgaaactttgttttaatgaag -3’（配列No.7）
iolI OK3 − 2 − 2-Rプライマー： 5’- cgggatccttacatgctgaagtattttg -3’（配列No.8）
【０１３３】
PCR反応は次のように行った。すなわち宝酒造社のEx taq反応用溶液を使用し、該溶液の組成はTakara ExTaq Buffer×10倍液 5μl、dNTP mixture 4μl、鋳型DNA 30ng、10μM プライマー溶液 各1μl、Takara ExTaq 0．5μlを全体が50μlになるように水を加えて混合し、さらに30μlのミネラルオイルを重層することにより調製した。反応条件は、PCR増幅装置（ASTEC社 PC-700）を用い、変成を94℃，30秒、アニーリングを40℃，1分、伸長を72℃，1分、の3段階の反応を35回繰返し行った。上記のPCR反応によって、約0.85 kbpの大きさのDNA断片が増幅した。
【０１３４】
増幅反応後、重層したミネラルオイルを0.3mlのヘキサンで抽出し且つヘキサン層を除去する操作を3回繰返し、1分間減圧することにより、ミネラルオイルを除去した。この様にして得られた増幅反応液50μlから、ジーンクリーンキット（Bio101社製）を用いてPCR断片を分離して精製した。すなわち、キット添付のNaI溶液を増幅反応液に300μl加えて混合し、10μlガラスビーズ溶液を加えて混合し、得られた混合物を4℃、15分静置した後に、遠心分離した。こうして増幅したDNA断片の吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μlを該ガラスビーズに加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液によるガラスビーズ洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μlの滅菌水を加えて、懸濁し混合することにより55℃で、15分ガラスビーズ懸濁液を加温した後、遠心分離を行い、増幅された約0.85 kbpのDNA断片を含む上清12μlを得た。
【０１３５】
（c）バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株由来シロ−イノソースイソメラーゼをコードするDNAを含有する組換えベクターの調製と大腸菌の形質転換
（i）上記（b）で得た精製されたDNA断片を、発現ベクターに組み込む操作は以下のように行った。すなわち、上記のDNA断片溶液10μlに対して、発現用プラスミドベクターとしてベクターpUC119の0.5μgと、宝酒造社製の制限酵素Hind IIIとBam HIの各1μlと、宝酒造社製の制限酵素用緩衝液K buffer×10倍液 2μlとを加え、全体が20μlになるように滅菌水を加え、混合した。得られた混合液を36℃、16時間保って制限酵素反応を行った。
【０１３６】
（ii）上記の制限酵素反応の後、ジーンクリーン・キットを用いて、DNA断片と発現ベクターとを単離した。すなわち、得られた制限酵素反応液20μlにキット添付のNaI溶液を300μl加えて混合し、次いで10μlガラスビーズ溶液を加えて混合し、4℃、15分静置した後に、遠心分離すると、DNA断片と発現ベクターの吸着したガラスビーズが沈殿させられた。上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μlをガラスビーズに加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液によるガラスビーズ洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μlの滅菌水を加えて、懸濁し、55℃で、15分加温した後、遠心分離を行うと、DNA断片と発現ベクターを含む上清12μlを得た。この操作により、制限酵素によって生じた約50bp以下の小さなDNA断片は取り除かれ、目的とするDNA断片と、発現ベクターとが得られた。
【０１３７】
（iii）上記で得たDNA断片と発現ベクターとをライゲートするために、上記で調製したDNA断片とベクターとの溶液10μlにTakara Ligation kit−I溶液（宝酒造社）を10μl加え、16℃、1時間反応させた。生成された組換えベクターを含むライゲーション反応溶液を用いて、コンピテントセルとしての大腸菌JM109の形質転換を行った。すなわち、4℃で解凍したコンピテントセル溶液60μlに前記のライゲーション反応溶液を5μl加え、混合し、0℃，30分、42℃，45秒、0℃，2分の処理にかけ、次いで、これに500μlのSOC溶液（2％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース、10mM MgSO4、10mM MgCl2）を加えて、36℃で1時間回復培養させた。
【０１３８】
この培養液100μlを、50μg/mlアンピシリン、40μg/ml X-gal（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside）、1mM IPTG（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を含むLB寒天培地（1％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0、1.5％寒天）に塗布した。さらに37℃、16時間培養した。この培養により、白色に発色したコロニーとして前記の組換えベクターの導入で形質転換された大腸菌が得られたため、これを選択した。
【０１３９】
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーを、アンピシリン（50μg/ml）を含むLB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（QIA filter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）によりプラスミドDNAの分離および精製を行った。こうして得られたプラスミドDNAは、目的とするシロ−イノソースイソメラーゼをコードする配列番号4のDNAを包有する約0.8kbpのDNA断片を有することが確認された。
【０１４０】
（d）バチルス リッチェニフォーミス（OK3-2-2）由来シロ−イノソースイソメラーゼの発現
（i）上記で白色発色したコロニーとして単離した大腸菌形質転換菌株を、50μg/mlアンピシリンを含む100mlLB培地（1％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0）に移植し、36℃7時間培養した。この培養液に200mMイソプロピルチオガラクトピラノシド溶液を0.3ml加え、さらに36℃3時間培養した。培養終了後、遠心分離により、菌体を集めた。これを生理食塩水で1回洗浄した。さらに、洗浄菌体を0.6％トライトンX100溶液3mlに懸濁し4℃で超音波により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、上清としての酵素溶液2.8mlを取り出した。上清に1.2g硫安を加え、4℃でタンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、上清を除去した。この沈殿したタンパク質を2.5mlの20mMトリス緩衝液（pH7.0）に溶解させ、再度、遠心分離を行い、上清を20mMトリス緩衝液（pH7.0）で平衡化したShephadex G-25カラム（14ml）にアプライし、20mMトリス緩衝液（pH7.0）で溶出させ、脱塩を行なった。この操作により、シロ−イノソースイソメラーゼの粗酵素液3.5mlを得た。
【０１４１】
（ii）シロ−イノソースイソメラーゼ活性の測定は、次のように行った。すなわち上記の粗酵素液100μl、10％シロ−イノソース溶液100μlまたは10％D−キロ−1−イノソース100μl、1Mトリス緩衝液（pH7.5）100μl、100mM MnCl2溶液 10μl、100mM ZnCl2溶液 10μlを全体が1mlになるように水を加えて混合した後、このように得た基本反応液を27℃、16時間反応させ、反応後、1Mリン酸（pH2.0）10μlを加えて、反応を停止させた。さらに、この反応溶液は70℃10分加熱し、タンパク質を加熱変成させ、遠心分離によりタンパク質を除いた。上清をHPLC分析した。HPLC条件としては、WakosilNH2カラム（内径4.6mm×25cm）を用い、移動相は80％アセトニトリル水溶液、カラム温度20℃、流速2ml／min、検出器はUV検出器、OR検出器を用いた。
【０１４２】
その結果として、バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株のiolI遺伝子ホモログから得た配列番号4のDNAでコードされたリコンビナント酵素は、シロ−イノソースを基質にすると、D−キロ−1−イノソースに異性化させる反応を触媒することが判明した。また、反応は可逆的で、D−キロ−1−イノソースを基質にすると、シロ−イノソースに異性化させることが判明した。平衡状態では1％のシロ−イノソースを基質にすると、シロ−イノソース：D−キロ−1−イノソース＝70：30の平衡に達することが判った。
【０１４３】
（e）バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株由来シロ−イノソースイソメラーゼの諸性質
上記の基本反応液組成の内、1Mトリス緩衝液（pH7.5）100μlに代えて、pH4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5の1Mリン酸緩衝液100μl、あるいはpH7.0、8.5、9.0の1Mトリス緩衝液100μlを用いて変換活性を測定したところ、pH7.0〜8.0に最大活性を有していたことから、本酵素の至適pHはpH7.0〜8.0であることが判った。
【０１４４】
さらに、上記基本反応液組成の内、100mM MnCl2溶液 10μl、100mM ZnCl2溶液 10μlの合計20μlの重金属塩溶液の添加に代えて、重金属塩無添加、あるいは50mM MnCl2溶液 20μl、50mM ZnCl2溶液 20μl、50mM CoCl2溶液 20μl、50mM PbCl2溶液 20μl、50mM CuSO4溶液 20μl、50mM FeSO4溶液 20μl、50mM CaCl2溶液 20μl、50mM SnCl2溶液 20μl、50mM CdCl2溶液 20μl、50mM NiCl2溶液 20μl、もしくは50mM MgCl2溶液 20μlを用いて変換活性を測定したところ、Mn2+、Zn2+、Co2+を含有する試験区で、それぞれ対象となる重金属塩無添加区よりも、120〜150％酵素活性が増加することから、本酵素はMn2+、Zn2+、Co2+を要求する金属酵素であることが判明した。
【０１４５】
【実施例３】
シロ−イノソースイソメラーゼの調製
実施例２で調製した組換えプラスミドを有する大腸菌形質転換菌株をLB培地１Ｌに移植し、好気条件で36℃，７時間培養した。得られた培養液に200mMイソプロピルチオガラクトピラノシド３mlを加え、同様に好気条件で36℃，３時間培養した。その培養後、得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め、この菌体を0.6％トライトンX100溶液50mlに懸濁し、その菌体懸濁液を４℃で超音波処理して菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を分離し、得られた上清のpHをpH7.5に調整し、上清を粗酵素液として得た。この粗酵素液は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列をもつタンパク質からなるシロ−イノソースイソメラーゼを含有するものである。
【０１４６】
前記の粗酵素液に対して、硫安濃度が80％になるように硫安を加え、タンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、集めたタンパク質を20mMトリス緩衝液pH7.0に溶解させると、シロ−イノソースイソメラーゼを含む粗酵素液が調製された。
【０１４７】
【実施例４】
シロ−イノソースからD−キロ−1−イノソースの製造
シロ−イノソース100ｇを熱水900mlに溶解して得られた水溶液を36℃まで冷却した。得られたシロ−イノソース水溶液をNaOH溶液で、pH7.5に調整した後、100mM MnCl2の水溶液50mlを加えた。さらに、このシロ−イノソース水溶液に、実施例３で調製したトリス緩衝液中の粗酵素液を加え、最終的に１Ｌになるように水を加えて、混合した。得られた混合液を36℃で24時間反応させた。
反応中に、経時的に反応溶液をサンプリングし、採取したサンプル液のHPLC分析を行ったところ、反応溶液中のシロ−イノソースの当初の量のうちの22％がD−キロ−1−イノソースになった時点で平衡に達した。
【０１４８】
反応終了後、6N硫酸５mlを加え、反応溶液をpH2.0に調整し、80℃まで加熱し、タンパク質を変成させた。この変成溶液を遠心分離してタンパク質を除いた。D−キロ−1−イノソースを含有する上清を、強酸性陽イオン交換樹脂50ml（Duolite-C20（H+タイプ））カラムと弱塩基性陰イオン交換樹脂100ml（Duolite-A368S（OH-タイプ））カラムとを通して連続的に通過させた。その後にこれらカラムに蒸留水250mlを通過させて交換樹脂カラム内に残留するイノソース異性体を溶出させて各画分を分離し、精製した。
【０１４９】
陰イオン交換樹脂カラムから溶出液として得られた透明な画分の溶液1.25Ｌを、エバポレーターを用いて溶液重量が180ｇになるまで減圧下に濃縮した。この段階で濃縮液からシロ−イノソースが析出し、濃縮液はスラリー状になった。このスラリーを16時間放置した後、ろ過操作を行い、固体とろ液に分別した。固体とろ液中に含まれるイノソース異性体は、HPLC分析によって、それらの組成分析および定量を行ったところ、ろ液中にD−キロ−1−イノソース19.2ｇ、シロ−イノソース17.6ｇが含まれていた。また、固体（58.2ｇ）中にはD−キロ−1−イノソース1.7ｇ、シロ−イノソース56.5ｇが含まれていた。
【０１５０】
【実施例５】
実施例４で得られたところの、D−キロ−1−イノソースおよびシロ−イノソース含有のろ液のpHを6.5に調整し、攪拌しながら該ろ液にNaBH4粉末2.45ｇを10回に分けて、添加した。添加する際には、5N HClの滴下によりpHを6.5〜7.0に保ち、また、温度は50℃以下に保って還元反応をさせた。反応溶液は室温まで冷却後、沈殿してくるシロ−イノシトール固体をろ過により除去した。
【０１５１】
得られたろ液を強酸性陽イオン交換樹脂50ml（Duolite-C20（H+タイプ））カラムと強塩基性陰イオン交換樹脂50ml（Duolite-A116（OH-タイプ）カラムとに連続的に通過させた後に、さらにイオン交換樹脂カラムに蒸留水100mlを通過させた。樹脂カラム内に残留するイノシトール異性体が溶出した。得られた溶出液中に含まれるイノシトール異性体は、HPLC分析によって、それらの組成分析を行ったところ、溶出液中にD−キロ−イノシトール12.5ｇ、ミオ−イノシトール17.3ｇ、シロ−イノシトール1.7ｇが含まれていた。
【０１５２】
上記の還元反応により、使用したシロ−イノソースの100ｇ当りにD−キロ−イノシトール12.5ｇが得られた。従って、反応収率は12.5％と見積もられた。
【０１５３】
前記の溶出液は、エバポレーターを用いて、減圧濃縮すると結晶化し始め、最終的にD−キロ−イノシトールとミオ−イノシトールとシロ−イノシトールとの混合結晶（31.5ｇ）が得られた。
【０１５４】
【実施例６】
Ｄ−キロ−イノシトールの単離と精製
実施例５で得られた混合結晶からのＤ−キロ−イノシトールの単離は、次のようにして行った。すなわち、混合結晶31.5ｇに30mlの水を加え、80℃に加熱溶解させ、この溶液を４℃に16時間放置し、結晶を析出させた。次に、この結晶を含む溶液をろ過して母液を得た。母液中にはＤ−キロ−イノシトール12.1ｇ、ミオ−イノシトール4.3ｇ、シロ−イノシトール0.7ｇが含まれていた。
次に、この母液45mlを、強塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）CG-400（OH―型）3000mlを充填したカラム（内径5.5cm、長さ85cm）に流し、さらにカラムを蒸留水で溶出し、溶出液を分画して集めた。Ｄ−キロ−イノシトールを含む画分を集め、これらを減圧下で濃縮した。その濃縮液20mlに室温でエタノール40mlを加え、その混合液を、徐々に冷却するとともに、結晶を析出させた。結晶を乾燥し、Ｄ−キロ−イノシトールの結晶11.2gを得た。このようにして得られたＤ−キロ−イノシトールの物理的性質は、比旋光度［α]D 25が＋65°（c＝1.0、H2O）であり、光学純度99％以上および融点238℃であり、Ｄ−キロ−イノシトール純品であると確認できた。
【０１５５】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シロ−イノソースをD−キロ−1−イノソースへ変換させ且つD−キロ−1−イノソースをシロ−イノソースへ変換させる平衡的反応を触媒する酵素作用を有する酵素であるシロ−イノソースイソメラーゼに関する。さらに、本発明は、遺伝子組換えによりシロ−イノソースイソメラーゼ産生能を付与された細菌形質転換体からのシロ−イノソースイソメラーゼの製造方法に関する。本発明は、またシロ−イノソースイソメラーゼをシロ−イノソースに作用させてD−キロ−1−イノソースを生成し、次いでD−キロ−1−イノソースを化学的に還元することから成るD−キロ−イノシトールの製造方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、シロ−イノソースイソメラーゼをコードするDNAよりなる遺伝子を包含し、またシロ−イノソースイソメラーゼをコードするDNAの導入で組換えたベクター、ならびに該ベクターで形質転換された細菌宿主細胞、特にバチルス属細菌宿主細胞に関する。
【０００３】
さらに、本発明は、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を染色体中にもつバチルスsp. OK-3-2-2株を包含する。
【０００４】
【従来の技術】
D−キロ−イノシトールは、経口的または非経口的に投与されると、細胞内情報伝達を活性化するイノシトールリン脂質系に作用して、II型糖尿病に改善効果をもたらすこと（特許文献1：特表平4−505218号参照）、および、多嚢胞生卵巣症候群に改善効果をもたらすこと（特許文献２：USP5906979号参照、非特許文献１：The New England Journal of Medicine、J. E. Nestler et al、1999年、340巻、1314頁参照）が提唱されている治療剤である。D−キロ−イノシトールは機能的には、広範な代謝系疾患に関与すると考えられ、今後その適応が拡大する可能性が期待される物質である。
【０００５】
D−キロ−イノシトール（DCIと略記することがある）は、９種類あるイノシトール立体異性体の一つである。それの製造方法は、これまで、抗生物質であるカスガマイシンの加水分解によりDCIを製造する方法（特許文献３：USP5091596号参照、特許文献４：USP5463142号参照、特許文献５：USP5714643号参照、特許文献６：USP6342645号参照）、マメ科植物に含有されるD−ピニトールを加水分解してDCIを製造する方法（特許文献７：USP5827896号参照、特許文献８：PCT/US01/15353参照、特許文献９：特開平13−261600号参照）、有機合成によりDCIを製造する方法（特許文献10：USP5406005号、特許文献11：WO96/25381号参照、特許文献12：特表平8−502255号参照、特許文献13：特開平11−280068号参照）、微生物をミオイノシトールに作用させることにより、ミオ−イノシトールから D−キロ−イノシトールへ変換させるDCIの製造方法（特許文献14：特開平９−140388号参照）などが知られる。
【０００６】
しかしながら、カスガマイシンやＤ−ピニトールを出発原料として用いてDCIを製造する場合、これらの原料物質が高価である。また、有機合成により製造する場合もDCIの収率および光学純度が低く、最終産物であるDCIは高価なものになる。さらに、ミオイノシトールへ微生物を作用させてD−キロ−イノシトールへ変換させる反応は、変換の制御が困難であり、微生物により他の代謝産物も同時に生産されるため、D−キロ−イノシトールの単離と精製が困難である。
【０００７】
また、近年、アグロバクテリウム属に属し且つミオ−イノシトールをD−キロ−イノシトールに変換できる構成酵素としてのＤ−ミオ−イノシトール １−エピメラーゼを生産できる性能を有する細菌を利用してミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールを製造する方法が知られている（特許文献15：特開2001−8694号および特許文献16：WO 02/055715号パンフレット参照）。しかしながら、その細菌を培養しながらミオ−イノシトールに作用させてミオ−イノシトールをD−キロ−イノシトールに変換する方法では、高い基質濃度で細菌を作用させることが困難であり、そのため、膨大な培地の量を取り扱わなくてはならない。
【０００８】
また、ミオ−イノシトールにシュードモナスsp. AB10064株（FERM P−18330）またはアセトバクターsp. AB10253株（FERM P−18868）を作用させて、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成する方法が提案された（特許文献17：2002年6月25日出願の特願2002−184912号参照）。特許文献17にも記載されるように、ミオ−イノシトールを酸化してシロ−イノソースへ変換する酵素、ミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼは、自然界に広く存在しており、酵母、細菌にも存在することが知られる（例えば非特許文献２：Journal of Bacteriology、131巻872〜875頁（1977）参照）。
【０００９】
さらに、標準株として、バチルス ズブチリスATCC 6633が知られており、これの染色体DNAの全塩基配列が公開されている。公開された塩基配列のイノシトール代謝オペロン内に存在する12種類のオープンリーディングフレーム（ORF）の中のDNA配列の内部には、iol E、iol F、iol G、iol H、iol Iのなどの幾つかの遺伝子があることが知られる。iol E、iol H、iol Iの３つの遺伝子の機能は不明である。iol I遺伝子でコードされる酵素は、2002年に、Ｘ線構造解析されているが、その酵素の機能は不明のままである（非特許文献３：Proteins、2002年、48巻、423〜426頁）。
【００１０】
また、枯草菌（バチルス ズブチリス）の中には、iol G遺伝子が存在し、ミオ−イノシトールを酸化してシロ−イノソースを生成させるミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼが存在することが知られる（非特許文献４：Journal of Biological Chemistry, 254巻7684〜7690頁（1979）参照）。
【００１１】
【特許文献１】
特表平4−505218号公報（全文：II型糖尿病に対するＤ−キロ−イノシトールの効果）
【００１２】
【特許文献２】
USP5906979号明細書（全文：多嚢胞生卵巣症候群に対するＤ−キロ−イノシトールの効果）
【００１３】
【特許文献３】
USP5091596号明細書（全文：カスガマイシンの加水分解によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１４】
【特許文献４】
USP5463142号明細書（全文：カスガマイシンのアセチル化分解によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１５】
【特許文献５】
USP5714643号明細書（全文：カスガマイシンの加水分解によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１６】
【特許文献６】
USP6342645号明細書（全文：カスガマイシンの加水分解によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１７】
【特許文献７】
USP5827896号明細書（全文：ピニトールを加水分解してＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１８】
【特許文献８】
PCT/US01/15353号明細書（全文：大豆種皮から得られるピニトールを加水分解してＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１９】
【特許文献９】
特開平13−261600号公報（全文：食用資源から得られるピニトールを加水分解してＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００２０】
【特許文献１０】
USP5406005号明細書（全文：グルクロン酸から１０工程でＤ−キロ−イノシトールを合成する方法）
【００２１】
【特許文献１１】
WO96/25381号パンフレット（全文：ジアルドースから有機合成によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００２２】
【特許文献１２】
特表平8−502255号公報（アセトニドから有機合成によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００２３】
【特許文献１３】
特開平11−280068号公報（ミオ−イノシトールから有機合成によりD−キロ−イノシトールを得る方法）
【００２４】
【特許文献１４】
特開平9−140388号公報（全文：ミオ−イノシトールにアグロバクテリウム属細菌を培養しながら作用させることによりDCIを製造する方法）
【００２５】
【特許文献１５】
特願2001−8694号明細書（全文：（アグロバクテリウム）sp. AB10121株を培養しながら作用させることによりDCIを製造する方法）
【００２６】
【特許文献１６】
WO 02/055715号パンフレット（全文：遺伝子組換でエピメラーゼ生産能を発現させた大腸菌を培養してミオ−イノシトールに作用させることによりDCIを製造する方法）
【００２７】
【特許文献１７】
WO 00/75355号パンフレット（全文）
【００２８】
【特許文献１８】
特開2002−285号公報（全文）
【００２９】
【特許文献１９】
特願2002−184912号明細書（全文）
【００３０】
【非特許文献１】
The New England Journal of Medicine、J. E. Nestler et al、1999年、340巻、1314頁（全文：多嚢胞生卵巣症候群に対するＤ−キロ−イノシトールの効果）
【００３１】
【非特許文献２】
Journal of Bacteriology、131巻872〜875頁（1977）（全文：バチルス ズブチリスのイノシトール代謝オペロンに関する）
【００３２】
【非特許文献３】
Proteins、2002年、48巻、423〜426頁（全文：バチルス ズブチリスのイノシトールオペロンのiol I遺伝子に由来する酵素のＸ線構造解析）
【００３３】
【非特許文献４】
Journal of Biological Chemistry, 254巻7684〜7690頁（1979）（全文がミオ
イノシトール 2−デヒドロゲナーゼに関する）
【００３４】
【発明が解決しようとする課題】
安価な原料としてミオ−イノシトールを用いてD−キロ−イノシトールを製造する方法において、効率的にD−キロ−イノシトールを生成でき且つ生成されたD−キロ−イノシトールの単離と精製を容易に行い得るD−キロ−イノシトール製造の新しい方法が望まれていた。
【００３５】
本発明者らは、酵素を反応に用いることにより、高い基質濃度で酵素を作用させてD−キロ−イノシトールを効率的に製造することが可能であると考えた。そこで酵素を用いてミオ−イノシトールからD−キロ−イノシトールを製造する新しい方法を開発することを課題または目的として、研究を重ねた。また、ミオ−イノシトールからDCIを製造する方法で利用できる新しい酵素を得るための研究も行った。
【００３６】
先ず、ミオ−イノシトールからDCIを生成するのに利用できる１種または数種の酵素を産生する能力を有する新しい微生物を見出すための研究を行った。この研究の一環として、55℃で生育できる中度好熱性の土壌細菌のうちから、ミオ−イノシトールをDCIに変換できる一連の酵素を産生する能力をもつ細菌種を見出すための一連の実験を行った。これらの菌スクリーニング実験においては、滅菌した寒天1.5％を含む農研培地をシャーレに入れて固化させた培地に、各種の土壌サンプルの水懸濁液の希釈液をそれぞれプレーティングし、植菌された一連の培地をそれぞれ55℃で培養し、増殖する菌をそれぞれ培地から分離した。次に、それぞれの単離した菌株を、ミオ−イノシトールを４％含有する基本液体培地（酵母エキス0.4％、グルコース0.5％、硫酸アンモニウム0.1％、MgSO4 0.01％、KH2PO4 0.07％,K2HPO4 0.02％）に植菌した。55℃で４日間培養した後、それぞれの菌株の培養液を遠心し、それぞれの上清を得てHPLC分析した。HPLCの分析条件は、カラム：Wakosil NH2、溶離液：80％アセトニトリル、流速2.0ml/min、検出器：RI検出器であった。それぞれの上清からミオ−イノシトールと、D−キロ−イノシトールを分離して定量した。
【００３７】
これらの菌株スクリーニング実験を通して、ミオ−イノシトールをDCIに変換できる能力を有するバチルス属新菌株を発見し、その菌学的性質を検査してバチルス リッチェフォーミスの新菌株であると同定することに成功した。この新菌株をバチルス リッチェフォーミスOK3−2−2株と命名した。さらに、ミオ−イノシトール4％を含有する前記の基本液体培地中で55℃で前記の新菌株、ＯＫ3−2−2株を4日間培養し、その培養液から菌体を分離し、得られた培養上清液中で生成されて存在する代謝生産物をHPLCを調べた結果、基質であるミオ−イノシトールが存在する他に、Ｄ−キロ−イノシトール（DCI）が生成されたことが見出された。
【００３８】
バチルス属細菌は、ミオ−イノシトールを酸化してシロ−イノソースに変換するミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼを産生することが既知である。このことを考えると、前記の新菌株OK 3−2−2株は、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースに酸化する酵素を産生し、しかもシロ−イノソースをＤ−キロ−1−イノソースに変換できる未知の酵素が前記の新菌株、ＯＫ3−2−2株によってミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼの他に、産生されていることが想定され、また、この未知の酵素によって、一旦生産されたシロ−イノソースがＤ−キロ−1−イノソースに変換され且つD−キロ−1−イノソースがDCIに変換されたと、本発明者らは想定した。
【００３９】
上記のＯＫ3−2−2株細菌中の未知の酵素が何であるか、その酵素の実体を調べて同定するために、本発明者は後記される考察と一連の遺伝子工学的実験を行った。
すなわち、前記の新菌株、OK3−2−2株はバチルス属に属するが、これと同じバチルス属に属しており且つ染色体DNAの全塩基配列が解明、公開されてある前記のバチルス ズブチリス ATCC 6633は、前記の新菌株OK3−2−2株と同様に、ミオ−イノシトールから生成されたシロ−イノソースを、Ｄ−キロ−1−イノソースに変換できる未知の酵素を産生していると想定した。
【００４０】
この想定の下に、バチルス ズブチリス ATCC 6633の染色体DNAのうちのイノシトール代謝オペロン中に存在する既知の12種類のＯＲＦのうちに存在するところの、12種類のタンパク質をそれぞれコードする12個のDNA配列に着目した。これらのDNA配列の中にある前記のiol E遺伝子、iol H遺伝子、iol I遺伝子によりコードされる３種の酵素は、その機能が今まで未知であったが、それら３種の酵素を収得して且つそれらの機能を調べる研究を行った。なお、この際に、既知のキシロ−スイソメラーゼのアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を有し且つタンパク質3Ｄ推定構造の点でも類似するタンパク質をコードできるDNA配列が前記のバチルス ズブチリス ATCC 6633の3種の遺伝子、iol E、iol H、iol IのそれぞれのDNA配列と多くの点で共通する事実があることを参考にした。
【００４１】
そこで初めに、バチルス ズブチリス ATCC 6633の染色体DNAのうちのiol E遺伝子、iol H遺伝子およびiol I遺伝子にそれぞれ相当する３種のDNA断片を遺伝子工学的手法により収得し、さらにこれら３種のDNA断片をそれぞれ包有する組換えプラスミドを構築し、これらプラスミドをそれぞれ別々に細菌宿主細胞中に導入し、宿主細胞形質転換体を培養し、３種のそれぞれのDNA断片でコードされる酵素を発現、生成させる遺伝子工学的手法を行う後記の実施例1の実験を実施した。
【００４２】
後記の実施例1の実験の方法は、概説すると、バチルス ズブチリス ATCC 6633の染色体DNAを抽出し、これを鋳型に用い且つ配列表の配列番号５および６のプライマーを用いるPCR法によって、iol E、iol H、iol Iの遺伝子に相当するDNAをそれぞれ作成し且つ単離し、それらDNAを発現ベクターに組み込み、得られた組換えベクターを宿主細胞に導入した後に、その形質転換宿主細胞を培養し、導入DNAから酵素を発現させることから成る方法である。得られた酵素の活性を測定したところ、iol I遺伝子に相当するDNAのみがシロ−イノソースイソメラーゼ活性をもつ酵素をコードすることが証明された。
【００４３】
さらに、前記の新菌株、バチルス リッチェニフォーミスOK3−2−2株（FERM P−19188）の染色体DNAを鋳型に用い且つ配列表の配列番号7および8のプライマーを用いるPCR法によって、前記iol I遺伝子のDNAときわめて高い類似性をもつ、すなわち高い相同性のあるDNA断片を作成し、このDNA断片を宿主細胞に導入し、その形質転換宿主細胞の培養により導入DNAから酵素を発現、生成させる遺伝子工学的手法を行う後記の実施例2の実験を実施した。実施例2で遺伝子工学的に得られたDNAも、シロ−イノソースイソメラーゼ活性をもつ酵素をコードすることを見出した。
【００４４】
後記の実施例１および実施例２でそれぞれ得られた酵素は、該酵素を含む粗酵素液100μl、10％シロ−イノソース溶液100μl、1Ｍトリス緩衝液（pH 7.5）100μl、100ｍＭ MnCl2溶液10μlおよび100ｍＭ ZnCl2溶液10μlを水と混ぜ、全容1mlの混合物を調製した後、この混合物液を27℃、16時間反応させ、反応後、1Ｍリン酸 pH 2.0 10μlを加えて、反応を停止させ、さらに、この反応溶液を70℃、10分加熱し、タンパク質を加熱変成により沈析させ、遠心分離し、得られた上清をHPLC分析する実験において、シロ−イノソースを基質にするとシロ−イノソースをＤ−キロ−1−イノソースに異性化させる反応を触媒すると共に、また、Ｄ−キロ−1−イノソースを基質にするとシロ−イノソースに異性化させる反応を触媒する酵素活性をもつ酵素である、すなわち換言すれば、シロ−イノソースイソメラーゼ活性をもつ酵素であることが判明した。
【００４５】
すなわち、後記の実施例１または実施例２で粗酵素液中に得られた目的の酵素は、下記のシロ−イノソース（I）と下記のＤ−キロ−1−イノソース（II）との平衡的変換反応
【００４６】
従って、第１の本発明においては、至適pHがpH 5〜pH 9の範囲にあり且つMn2+、Zn2+またはCo2+である活性化因子によって活性化される特性を有すると共に、下記の式（I）のシロ−イノソースを下記の式（II）のD−キロ−1−イノソースへ変換させ
【００４７】
実施例1において、バチルス ズブチリス ATCC 6633のiol I遺伝子に相当するDNAを包有するDNA断片として、PCR法で作成された約850bpのDNA断片は、配列表の配列番号３で示す塩基配列をもつ837 bpのDNAを包有するDNA断片であるから、実施例１で収得された目的の酵素シロ−イノソースイソメラーゼは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列をもつタンパク質であると推定できる。
【００４８】
また、実施例２において、バチルス リッチェニフォーミスOK3−2−2株（FERM P−19188）のiol I遺伝子ホモログに相当するDNAを包有するDNA断片として、PCR法で作成された約850bpのDNA断片は、配列表の配列番号4で示す塩基配列をもつ837 bpのDNAを包有するDNA断片であるから、実施例2で収得された目的の酵素、シロ−イノソースイソメラーゼは、配列表の配列番号2に示すアミノ酸配列をもつタンパク質であると推定できる。
【００４９】
従って、第２の本発明(請求項１の発明)においては、至適pHがpH 5〜pH 9の範囲にあり且つMn2+、Zn2+またはCo2+である活性化因子によって活性化される特性を有すると共に、下記の式（I）のシロ−イノソースを下記の式（II）のD−キロ−1−イノソースへ変換させ
【００５０】
第１の本発明の酵素、具体的には、実施例１または２で得た本発明酵素は、シロ−イノソースとＤ−キロ−1−イノソースの相互変換を触媒する作用を有するが、この作用は、イソメラーゼ作用またはエピメラーゼ作用のどちらかである。しかしながら、本酵素は次式（III）のＤ−(3−デオキシ)−2−ミオ−イノソースと次式（IV）のＤ−(3−デオキシ)−1−ミオ−イノソースの相互変換をも触媒することから、本発明酵素による変換反応は、ケトンの移動を伴うイソメラーゼ反応であることが判った。
また、バチルス ズブチリス ATCC 6633のiol I遺伝子の産物のＸ線構造解析（Proteine 2002年、48巻、423〜426頁）の結果に、本酵素を当てはめると、酵素の活性中心の金属イオン（Mnイオン）にケトンの酸素原子とOH基とが配位し、これによりケトンの移動を伴う遷移状態を安定化していると推定される。
【００５２】
さらに、配列表の配列番号1または2に示すアミノ酸配列と一部、僅かに異なるけれども、該アミノ酸配列に対して90〜100％相同性をもつタンパク質も、第1の本発明酵素と同じ酵素活性をもつと推定できる。
【００５４】
第1の本発明による酵素タンパク質、または第２の本発明によるシロ−イノソースイソメラーゼである酵素タンパク質は、バチルス ズブチリス ATCC 6633、または本発明者らによって単離された前記のバチルス属sp. OK3−2−2株（FERM P−19188）からiol I遺伝子またはiol I遺伝子ホモログをコードするDNAを遺伝子工学的に作成し、該DNAの導入により細菌形質転換体を作り、その細菌形質転換体を培養し、その培養された細胞菌体から、または培養液から、既知の酵素分離法により回収することによって製造できる。
【００５５】
本発明によるシロ−イノソースイソメラーゼを製造する方法においては、iol I遺伝子またはそのホモログのDNAの導入で形質転換された細菌、特に大腸菌属の細菌を、既知の細菌培養用液体培地中で30℃〜55℃の培養温度で培養する。得られた培養液から、培養された形質転換細菌の細胞の菌体を濾過または遠心分離法に分離できる。分離されたペレット状の菌体を水で洗浄後、遠心分離し、洗浄菌体を得ることができる。この洗浄菌体を1％トライトンＸ−100を含む100mMトリスバッファー（pH 7.5）に懸濁させ、超音波によって菌体を破砕する。菌体の破砕後、遠心分離し、上清にある酵素抽出液を得る。その後に、酵素抽出液に50％になるように硫酸アンモニウムを加えて、タンパク質を塩析させる。このようにして調製したタンパク質溶液を、さらに遠心分離し、タンパク質沈殿として目的の酵素を得る。これを100mMトリスバッファー（pH 7.5）に溶解して保存できる。
【００５６】
菌体からの前記した酵素抽出液に硫酸アンモニウムを加えてタンパク質を析出させる方法の他に、酵素抽出液から目的の酵素を回収する方法としては、酵素抽出液を、イオン交換樹脂に吸着後、塩濃度による直線濃度勾配を利用したカラムクロマトグラフィーにかけて分離して、精製することができる。
【００５７】
また、上記の形質転換細菌の培養液から目的の酵素を回収する場合には、培養液から培養細胞の菌体を分離した後に、得られ培養液上清を濃縮し、その濃縮液から硫安分画法によって目的の酵素を回収し、さらに精製することができる。
【００５８】
前記のバチルス属sp. OK3−2−2株は、以下の菌学的性質を以下に示した。 尚、本菌株の同定に当っては、新細菌培地学講座（第２版、近代出版）、医学細菌同定の手引き（第２版、近代出版）、細菌学実習提要（丸善）に準じて実験を行い、実験結果をBergey’s Manual of Systematic Bacteriology VOL. 1(1984)を参考にして本菌株を同定した。
【００５９】
OK3−2−2株の菌学的性質は次の通りである。
(a)形態的特徴
(1)細胞形態：桿菌、胞子を形成する
(2)運動性： +（懸滴法）
(3)普通寒天培地上での生育：５５℃での生育は速く、コロニー形態は薄く広がり不定形、色調は白色である。
【００６０】
(b)生理生化学的性状
(1)グラム染色： ＋
(2)OFテスト： O (Oxidative)
(3)好気条件での生育： ＋
(4)嫌気条件での生育： ＋
(5)生育温度：
20℃ −
30℃ ＋
40℃ ＋
45℃ ＋
55℃ ＋
65℃ −
(6)食塩耐性：
0％ ＋
5％ ＋
7％ ＋
10％ −
(7)生育ｐH：
ｐH 5.0 ＋
ｐH 6.0 ＋
ｐH 7.0 ＋
ｐH 8.0 ＋
(8)チトクロームオキシダーゼ： ＋
(9)カタラーゼ： ＋
【００６１】
(10)硝酸塩還元性： ＋
(11)硫化水素産生： −
(12)ゼラチンの液化： ＋
(13)カゼインの加水分解： ＋
(14)スターチの加水分解： ＋
(15)インドールの産生： −
(16)マロン酸の利用性： ＋
(17)ONPG分解性： −
(18)エスクリンの分解性： ＋
(19)クエン酸の利用性： ＋
(20)プロピオン酸の利用性： ＋
(21)デカルボキシラーゼ活性：
L-リジン −
(20)尿素の分解性： −
(21)各種糖から酸の生成：
D−グルコース ＋
D−キシロース ＋
D−マンニトール ＋
L−アラビノース ＋
(22)Ｖ−Ｐテスト ＋
(23)フェニルアラニンデアミナーゼ −
【００６２】
以上のとおり、OK3−2−2株の主性状は、グラム陽性の桿菌であり、生育適温は45℃〜55℃の中度好熱性微生物であって、本菌株の16SリボゾームRNAの塩基配列の相同性は、16Sリボゾーム塩基配列決定用プライマーとして、以下の配列：
5’-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3’
を有するプライマーを用いて、629塩基対までの範囲でシークエンスしたところ、バチルス ズブチリス （Bacillus subtilis）およびバチルス リッチェニフォーミス（Bacillus licheniformis）の２種類の菌株の16SリボゾームRNA塩基配列と100％一致した。
【００６３】
これらの菌学的性質と16SリボゾームRNAの塩基配列の相同性を総合して、OK3−2−2株はバチルス(Bacillus)属に属し、中度好熱性菌であるバチルス リッチェニフォーミス（Bacillus licheniformis）であると判断した。しかる後、本菌株をバチルス リッチェニフォーミスOK3−2−2株と命名し、産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−19188として寄託した（寄託日は平成15年１月17日）。
【００６４】
前述したところから明らかなように、第１の本発明のシロ−イノソースイソメラーゼ、あるいは第２の本発明のシロ−イノソースイソメラーゼは、これをシロ−イノソースに作用させると、シロ−イノソースをD−キロ−1−イノソースに変換できるから、シロ−イノソースからD−キロ−1−イノソースを製造できる。
【００６５】
従って、第３の本発明(請求項２の発明)においては、シロ−イノソースを含有する水溶液に、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質、あるいは配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質を、シロ−イノソースイソメラーゼとして使用し作用させて、シロ−イノソースをD−キロ−1−イノソースへ異性化させる酵素反応を行う工程と、その酵素反応溶液から酵素を回収する工程と、酵素の回収後に得た残液からD−キロ−1−イノソースを回収する工程と、回収したD−キロ−1−イノソースを精製する工程からなる、D−キロ−1−イノソースの製造方法が提供される。
【００６６】
第３の本発明方法に使用するシロ−イノソースの水溶液は、ミオ−イノシトールから微生物的変換により生成したシロ−イノソースの水溶液、あるいは、ミオ−イノシトールを酸化白金により酸化したシロ−イノソースの水溶液であることができる。シロ−イノソース水溶液は、反応開始時のシロ−イノソース濃度が１％〜15％、好ましくは10％であるのが望ましい。
【００６７】
このシロ−イノソース水溶液に作用させるシロ−イノソースイソメラーゼは、第1の本発明による単離されたシロ−イノソースイソメラーゼであることもでき、またはこれを含む粗酵素液であることもできる。
【００６８】
さらに、使用されるシロ−イノソースイソメラーゼは固定化酵素としても使用可能である。酵素固定化法としては、ゲル抱埋法、イオン交換樹脂吸着法など、一般の酵素固定化方法が適用できる。
【００６９】
使用されるシロ−イノソースの水溶液のpHは、シロ−イノソースイソメラーゼの至適pHであるpH５〜９、好ましくはpH５〜９、さらに好ましくはpH7.5に調整されてあるのが望ましい。また、活性化因子として、Mn2+とZn2+イオンを最終濃度0.01mM〜10mM、好ましくは0.5mMになるようにMn塩、Zn塩を添加、含有する方が望ましい。使用されるMn塩、Zn塩は水溶性の塩であれば使用することができる。また、反応温度は、バチルス由来シロ−イノソースイソメラーゼを使用する場合、20℃〜50℃、好ましくは40℃が望ましい。
【００７０】
シロ−イノソース水溶液に反応させるために抽出酵素液を使用する場合は、反応混合物が均一溶液のために攪拌する必要は無いが、温度を均一化するため攪拌した方が好ましい。反応はシロ−イノソースとＤ−キロ−１−イノソースが70：30の平衡値に達するまで進行させるのが好ましい。
【００７１】
反応終了後に、酵素回収は、酵素溶液を使用した場合、イオン交換樹脂カラムに反応溶液を通過させることにより酵素を回収することができる。固定化された酵素を使用した場合は、反応溶液を遠心分離、あるいはろ過操作することによって、固定化酵素を回収することができる。
【００７２】
このようにして、酵素を除いた後の残液である反応溶液は、未反応のシロ−イノソースと生成されたＤ−キロ−１−イノソースを含んでいる。次に、この溶液を、最初に加えたシロ−イノソースの重量の1.3倍〜2.5培、好ましくは1.7倍の重量までに濃縮し、その濃縮液を室温で静置する。この操作によりシロ−イノソースは、選択的に結晶化し、これを分別して、最初に加えたシロ−イノソースの25％に相当する水で結晶を洗浄し、この操作により、最初に加えたシロ−イノソースの約70％が回収される。結晶分別後の母液には、反応で生成したＤ−キロ−１−イノソースが溶解して居り、その生成量の内、約90％が含まれる。該母液を濃縮乾固すると、D−キロ−1−イノソースの無色粉末を回収できる。
なお、回収したシロ−イノソース結晶は再利用できる。
【００７３】
第３の本発明方法で収得できたD−キロ−1−イノソースは、これを化学的還元剤、例えばNaBH4で還元すると、D−キロ−イノシトールに転化できることが本発明者らによって見出された。
【００７４】
従って、第４の本発明(請求項３の発明)においては、シロ−イノソースを含有する水溶液に、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質、あるいは配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質を、シロ−イノソースイソメラーゼとして使用し作用させてシロ−イノソースをD−キロ−1−イノソースへ異性化させる酵素反応を行う第１の工程と、その酵素反応溶液から、シロ−イノソースイソメラーゼとして使用した酵素を回収する第２の工程と、その酵素回収後に、未反応のシロ−イノソースとD−キロ−1−イノソースを含む残液を濃縮する第３の工程と、その得られた濃縮液からシロ−イノソースを結晶化させてその結晶を分別する第４の工程と、その母液として得たD−キロ−1−イノソース含有溶液に還元剤を加え、D−キロ−1−イノソースを還元し、D−キロ−イノシトールを生成する第５の工程と、還元で生成したD−キロ−イノシトールを含む還元反応溶液からD−キロ−イノシトールを分離して精製する第６の工程とからなる、D−キロ−イノシトールの製造方法が提供される。
【００７５】
第４の本発明方法において、水溶液中のシロ−イノソースにシロ−イノソースイソメラーゼを作用させてD−キロ−1−イノソースに異性化させる第１工程と、その第１工程で得られた反応溶液から酵素を分離して回収する第２工程とは、第３の本発明によるシロ−イノソース製造方法におけるそれぞれ対応の工程と同様な要領で実施できる。
【００７６】
第４の本発明方法におけるD−キロ−1−イノソース含有の残液の濃縮の第３工程と、その濃縮液からのシロ−イノソースの結晶化およびその結晶の分離の第４の工程は、既知の手法で実施できる。第４の本発明方法におけるD−キロ−1−イノソース含有の水溶液に還元剤を加えて還元反応によりD−キロ−イノシトール（DCI）を生成する第５工程は、次の要領で実施できる。
すなわち、先行の第４工程で得られたD−キロ−1−イノソースを含有する母液は、そのまま第５工程の還元反応に使用することができる。しかし、該母液をpH調節して、pH6〜7、好ましくはpH6.5に調節するのが望ましい。この溶液に対して、還元剤、例えばNaBH4の粉末を直接にあるいは水溶液の形で添加する。還元剤はD−キロ−1−イノソースの0.25〜0.5モル、好ましくは0.3モル当量の量で添加する。その際、pHはpH6〜7の範囲で調整して還元反応を行うのが望ましい。
【００７７】
この還元反応によって、還元反応液中ではD−キロ−1−イノソースのうちの約50％が変換されてD−キロ−イノシトールが生成し、また残りはミオ−イノシトールに変換される。また、該母液中に共雑する残留のシロ−イノソースも還元され、シロ−イノソースの残留量のうちの60％がミオ−イノシトールに変換され且つ残りはシロ−イノシトールに変換される。従って、還元反応液は主生成物のD−キロ−イノシトールの他に、ミオ−イノシトールとシロ−イノシトールとを含む混合物溶液として得られる。
【００７８】
第４の本発明方法の第６工程は、第５工程で得た還元反応液からD−キロ−イノシトールの単離精製をする工程である。D−キロ−イノシトールを、共存するミオ−イノシトールおよびシロ−イノシトールとの混合物から単離する方法としては、該混合物をカラムクロマトグラフィーにかける分離方法が利用でき、また分別結晶化による分離方法も使用できる。また、これらの方法を組み合わせることができる。
【００７９】
前述したように、第１の本発明は、シロ−イノソースイソメラーゼとして使用できるところの、配列番号１のアミノ酸配列をもつ酵素タンパク質に関するものであり、またその第２の本発明は配列番号２のアミノ酸配列をもつ酵素タンパク質であって、シロ−イノソースイソメラーゼである酵素タンパク質に関するものである。これらの第１および第２の本発明による酵素タンパク質は、シロ−イノソースイソメラーゼとして作用することができ、しかも、それぞれに配列番号３の塩基配列をもつDNA、および配列番号４の塩基配列をもつDNAによってコードされる（後記の実施例１および２、参照）。
【００８０】
従って、第５の本発明においては、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであって且つ配列表の配列番号３で表される塩基配列を有するDNAである、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子が提供される。
【００８１】
また、第６の本発明(請求項４の発明)においては、至適pHがpH 5〜pH 9の範囲にあり且つMn2+、Zn2+またはCo2+である活性化因子によって活性化される特性を有すると共に、下記の式（I）のシロ−イノソースを下記の式（II）のD−キロ−1−イノソースへ変換させ
【００８２】
次に、第５の本発明による配列番号３の塩基配列をもつDNAよりなるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を見出して単離することに成功した本発明者の研究の経緯を説明する。
【００８３】
(a) シロ−イノソースイソメラーゼをコードする遺伝子の探索
(i) バチルス ズブチリス染色体上にあるイノシトールオペロンを構成するDNA配列には、12種類のオープンリーディングフレーム（ORF）を有することが知られる。またこの内に在るiol G遺伝子はミオ−イノシトール ２−デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.18）をコードするDNAから成ることが知られていることに本発明者は先づ着目した。
【００８４】
次に、上記のORFの中に在ってミオ−イノシトール 2−デヒドロゲナーゼ以外の他の酵素をコードする残り11個の遺伝子の中から、イソメラーゼをコードする遺伝子またはDNAを見出すために、それら11個の遺伝子DNAを、代表的な糖のイソメラーゼであって、3D構造が良く知られているキシロースイソメラーゼ（EC5.3.1.5）をコードする遺伝子のDNAとそれらの相同性について比較した。しかしながら、塩基配列や、アミノ酸配列における相同性の点で比較を行ったところ、これらの点で高い相同性を有する遺伝子は認められなかった。
【００８５】
一方、インターネット3D-PSSMサイト（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~3dpssm /）において、コードされるアミノ酸配列から推定される推定3D構造の点でキシロースイソメラーゼに対して形の類似性がある遺伝子が、上記のORF中の残り11個の遺伝子のうちに３つ存在することを見出した。
【００８６】
これら３つの遺伝子はiol E(Entry No. BG11121)、iol H(Entry No. BG11123)、iol I(Entry No. BG11124)の３種類である。これらの３つの遺伝子の中に、目的のシロ−イノソースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードするものが存在すると本発明者らは推定した。
【００８７】
(ii) iol E、iol Hおよびiol I遺伝子の単離
iol E、iol H、iol Iの各遺伝子のそれぞれの単離のためには、バチルス ズブチリス染色体から抽出したゲノムDNAを鋳型にして用い且つ適当なプライマーを用いるポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）法により、iol E、iol H、 iol Iの各遺伝子にそれぞれ相当するDNAを包有していると推定できる３種類の、約850bpのDNA断片を単離した。この際には、制限酵素反応でPCR法のDNA断片を切断し且つ適当な方法、例えばアガロース電気泳動法で望みのDNA断片を選別する方法を利用した。
PCR法により、iol I遺伝子に相当するDNA断片を収得して、さらに単離する方法の詳細は、後記の実施例１に記載される。
【００８８】
(iii) iol E、iol Hおよびiol Iの各遺伝子に相当するDNAをそれぞれ連結された３つの組換えベクターの構築と、組換えプラスミドの構築
上記の(ii)で得た３つの遺伝子にそれぞれ相当する３種のDNA断片（約850bpのサイズ）は、各々別々に発現プラスミドベクターに組み込むため、あらかじめそれぞれのDNA断片の末端に、適切な制限酵素サイトを設定してある。これらDNA断片をそれぞれプラスミドベクターの同じ制限酵素サイトへ挿入して連結後、得られた組換えベクターをライゲートさせることによって、組換えプラスミドを構築できる。
【００８９】
この際に使用するプラスミドベクターとしては、好ましくは、マルチクローニングサイトを有する発現プラスミドベクターが使用される。酵素を発現させることが可能であり、かつ、適当な制限酵素サイトを有する他のプラスミドベクターも使用できる。
【００９０】
また、組換えプラスミドに組み込まれた遺伝子を発現させるために使用されて該プラスミド中に挿入されるプロモーターは、該プラスミドで形質転換した宿主微生物中で該遺伝子が発現することを可能にするプロモーターであれば、特に制限はない。例えばlacプロモーター、tacプロモーターなどが使用できる。
【００９１】
(iv) 上記３つの遺伝子に相当する各DNAを組み込まれた３種の組換えプラスミドによりそれぞれ形質転換された宿主細細胞の作製
(iii)のように調製された組換えプラスミドを、宿主細菌に導入するのは常法で行う。この際用いられる宿主細菌としては、組換えプラスミドが安定でかつ自律的に増殖可能である細菌であれば特に制限されず、通常の遺伝子組換えに用いられているもの、例えばエッシェリヒア属細菌またはバチルス属細菌などが好ましく使用される。
【００９２】
宿主細菌に(iii)で得た組換えプラスミドを導入する方法としては、例えば宿主細菌がエシェリヒア属に属するの場合には、カルシウムイオンの存在下に組換えプラスミドの導入を行ってもよい。コンピテントセル法を用いてもよく、またバチルス属に属する微生物の場合には、コンピテントセル法またはプロトプラスト法などを用いることができるし、エレクトロポレーション法あるいはマイクロインジェクション法を用いてもよい。宿主細菌への所望の組換えプラスミド導入の有無の検定については、組換えプラスミドを構成するベクターの薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で、プラスミド導入反応後の宿主微生物を培養し、選択培地上で生育できた宿主微生物を選択すればよい。
【００９３】
(b) 形質転換された宿主細菌中の導入遺伝子のDNAの発現による酵素の産生の検定
(i) 上記の(a)(iv)で得た形質転換細菌を培地上で培養すると、該細菌の形質転換のため導入された遺伝子（DNA）は発現して、その遺伝子（DNA）でコードされる酵素を産生する。酵素を発現誘導するために使用される培地は、形質転換細菌が安定して増殖する培地であれば、特に限定されない。例えば、Nutrient Broth、L-Broth、などを使用することができる。また、プラスミドベクターの種類によっては、培地中に遺伝子を発現させるためにイソプロピルチオガラクトピラノシド（IPTG）のようなインデューサーを加えてもよいし、培養の途中にインデューサーを加えても良い。
【００９４】
(ii) 上記の形質転換細菌の培養により、導入した遺伝子からの酵素の発現は次のようにして確認できる。iol E、iol H、iol Iの各遺伝子に相当するDNAをそれぞれもつ組換えプラスミドを導入した３種の形質転換株の細胞を別々に培養する。これにより、３つの酵素がそれぞれ発現される。発現した酵素を含有する細菌菌体は、遠心分離され、培地を除去し、さらに、ペレット状の菌体を水で洗浄後、遠心分離し、洗浄菌体を得ることができる。この洗浄菌体を１％トライトンX-100を含む100mMトリスバッファー（pH7.5）に懸濁させる。超音波によって菌を破砕する。破砕後、遠心分離し、上清液として粗酵素溶液を得る。その後に、50％になるように硫酸アンモニウムを加えて、タンパク質を塩析させる。このようにして調製したタンパク質溶液を、さらに遠心分離し、タンパク質沈殿を得る。これを100mMトリスバッファー（pH7.5）に溶解すると、iol E、iol H、iol Iの各遺伝子からそれぞれ発現誘導されたリコンビナート酵素を含む３種の粗酵素溶液を得ることができる。
【００９５】
これらの酵素液の各々と10％シロ−イノソース溶液または10％D−キロ−1−イノソース溶液をそれぞれ混合し、27℃、16時間反応させる。得られた酵素反応液を前述したHPLC条件で分析したところ、iol Eとiol Hとの各遺伝子に由来するリコンビナート酵素は、シロ−イノソースをD−キロ−1−イノソースに変換される活性をもたないことが確認された。iol I遺伝子に由来するリコンビナート酵素は、シロ−イノソースからD−キロ−1−イノソースへ変換させ且つD−キロ−1−イノソースからシロ−イノソースへ変換させる活性を有することが確認された。従って、バチルス ズブチリスのiol I遺伝子に相当するDNAの発現に由来するリコンビナート酵素は、シロ−イノソースとD−キロ−1−イノソースとを相互変換する酵素、すなわち本発明のシロ−イノソースイソメラーゼであることが判明した。
【００９６】
更に、第６の本発明（請求項４の発明）による配列番号4の塩基配列をもつDNAを、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子として見出して単離することに成功した本発明者の研究の経緯を説明する。
【００９７】
前記に説明するように、バチルス ズブチリスのiol I遺伝子（配列番号3のDNA）にコードされる酵素がシロ−イノソースイソメラーゼと証明された。このことから、他のバチルス属細菌もiol I遺伝子に似る遺伝子を有し、これによってシロ−イノソースイソメラーゼを産生することが推定できる。
【００９８】
上記の知見に基づいて、本発明者が分離したバチルス属sp. OK3−2−2株からのiol I遺伝子ホモログを得るために実験を行った。すなわち、該OK3−2−2株のゲノムDNAを単離し精製し、そのゲノムDNAを鋳型として用い且つ配列表の配列番号5のプライマーおよび配列番号６のプライマーと同様な塩基配列をもつ配列番号7のプライマーおよび配列番号8のプライマーを用いるPCR法を行うことによって、全く同様の操作によって、該OK3−2−2株上にあるiol I遺伝子ホモログに相当するDNA断片を得ることができた。
【００９９】
このようにPCR法によって、OK3−2−2株のiol I遺伝子ホモログに相当するDNAを包有するDNA断片を収得して単離する方法の詳細は、後記の実施例2に記載される。
【０１００】
このOK 3-2-2株のiol I遺伝子ホモログに相当するDNAの塩基配列は、配列表の配列番号4に記載される塩基配列を有していることが認められた。
【０１０１】
配列表の配列番号3の塩基配列をもつDNA（バチルス ズブチリス由来）と、配列番号4の塩基配列をもつDNA（バチルス リッチェニフォーミスOK3−2−2株由来）との違いは、塩基の位置番号78、102、105、192、234、295、426、480、510、696、711、729および810の13個所で塩基の種類が異なることである。その相違点を下記の表１に示す。
【０１０２】
【表１】
配列番号3のDNAの塩基配列と配列番号4のDNAとの塩基配列の相同性は98％である。配列番号3のDNAでコードされるアミノ酸配列（配列番号1）の18番目はロイシンで99番目はリジンであるが、配列番号4のDNAでコードされるアミノ酸配列（配列番号2）の18番目はグルタミンで99番目がグルタミンである点で2個所で異なって居り、アミノ酸配列の相同性は99％であった。
【０１０４】
配列番号4のDNA（OK3−2−2株由来）の導入により形質形換された細菌による酵素の発現も、前記と同様の操作によって行うことができた。酵素活性の測定から、このリコンビナント酵素もまた、シロ−イノソースイソメラーゼであることが証明された（実施例2、参照）。
【０１０５】
また、本酵素の至適pHはpH7〜8にあり、Mn2+、Zn2+、Co2+イオンの存在下に活性化されることが判った。本酵素の熱安定性は45℃10minの熱処理で活性は100％であり、10分間の熱処理で活性が50％になる温度は54℃であった。
【０１０６】
さらにまた、第７の本発明においては、配列表の配列番号3または4に示す塩基配列をもつDNAであるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を導入された組換えベクターが提供される。
【０１０７】
配列番号3または4に記載のDNAは、その末端に適切な制限酵素、例えばHindIIIおよびBamHIによる切断サイトが設定されてある。ここで使用されるベクターは、既知の発現用ベクター、例えばプラスミドベクターpUC119であることができ、これに対して、配列番号３または４のDNAを遺伝子工学的手法の常法で結合して導入できる。
【０１０８】
プラスミドベクターに組み込むためには、あらかじめDNA断片の末端を適切な制限酵素で切断しておき、これをプラスミドベクター上にある同じ制限酵素サイトへ挿入し連結して組換えベクターを作成できる。また、適当なプロモーター等もライゲートさせることによって、組換えプラスミドを構築できる。この際に使用するプラスミドは、好ましくは、マルチクローニングサイトを有する発現プラスミドベクターが使用される。
【０１０９】
さらに、第８の本発明においては、配列表の配列番号3または4に示す塩基配列をもつDNAであるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を包有する第７の本発明の組換えベクターを、導入することにより形質転換された細菌宿主細胞が提供される。
【０１１０】
使用される宿主細菌は、大腸菌、例えばコンピーテントセルである大腸菌JM109株であることができ、組換えベクターの導入は既知の遺伝子工学的手法で行いうる。
【０１１１】
また、第９の本発明（請求項５の発明）においては、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質であるシロ−イノソースイソメラーゼをコードし且つ配列表の配列番号４の塩基配列をもつDNA配列を包有する組換えベクターの導入により形質転換された細菌宿主細胞を培養し、その培養された細胞菌体の破砕物からまたは培養液から、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質としてのシロ−イノソースイソメラーゼを回収することを特徴とする、前記シロ−イノソースイソメラーゼの製造方法が提供される。
【０１１２】
さらにまた、第10の本発明（請求項６の発明）においては、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであって且つ配列番号４で表される塩基配列を有するDNAを、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子として、染色体中に持つ中度好熱性のバチルス・リッチェニフォーミスOK3-2-2株（FERM P-19188として寄託）が新規微生物として提供される。
【０１１３】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を実施例について具体的に説明する。
【０１１４】
【実施例１】
バチルス ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラー
ゼの発現
（a）バチルス ズブチリスのゲノムDNAの調製
LBフラスコ培地100ml（1％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0）中に、LBスラント培地（1％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0、1.5％寒天）で培養したバチルス ズブチリスATCC 6633を一白金耳接種し、4時間、36℃で好気的に培養し、培養液から集菌した。得られた菌体ペレットに、15mlのSaline−EDTA溶液（0.15M NaCl、0.1M EDTA、pH8.0）とリゾチーム50mgを加えて菌体を懸濁し、菌体にリゾチームを37℃、2時間作用させた。処理後、得られた菌体溶解液に25％SDS溶液0．5mlを加えて完全に溶菌させた。次に、フェノールを3ml加えて、タンパク質を変成させた後に、遠心分離した。上清を取り出し、この上清液に20mlの2−プロパノールを加えて、粗ゲノムDNAを析出させた。析出した粗ゲノムDNAを遠心分離により沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。
【０１１５】
乾燥した粗ゲノムDNAは、さらに3mlTE液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0）に溶解後、その溶液に0.01mgのRNAaseを加え、36℃、2時間反応させてRNAを分解させた。さらに、0.01mgのプロテイナーゼKを加えて、36℃、2時間反応させてタンパク質を分解させた。次に、そのタンパク質分解反応液に1mlのフェノール−クロロホルム（1：1）混液を加えて、得られた混合物をゆっくりと攪拌し、RNAaseと、プロテイナーゼKを変成させた。次いで、混合物を遠心分離した。2相に分離したうちの、水性の上層を取り出した。これに3M酢酸Na溶液を0.3ml加えて、pH5.2に調整した。これに3mlの2−プロパノールを加えて、ゲノムDNAを析出させた。
【０１１６】
析出したゲノムDNAを遠心分離により沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥したゲノムDNAは、3mlTE液に溶解させ、さらにその溶液に1mlのフェノール−クロロホルム（1：1）混液を加える操作から、3mlTE液に溶解させる過程までを、再度繰り返した後に、遠心分離を行い、同様にpH5.2にて、上清に等量の2−プロパノールを加えて、バチルス ズブチリスのゲノムDNAの溶液を調製した。このようにして得られたゲノムDNAを、PCR反応のための鋳型として用いるDNAの溶液とした。
【０１１７】
（b）バチルス ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼに相当するDNA配列のクローニング
バチルス ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼに相当するDNA配列のクローニングを行うために、配列番号5と6との塩基配列を有する下記の2つのプライマーを用いて、PCR反応を行った。
iolIB.sub.-Fプライマー： 5'-ccccaagcttgatgaaactttgttttaatgaag-3'（配列No.5）
iolIB.sub.-Rプライマー： 5'-cgggatccttacatgctgaagtattttg-3''（配列No.6）
【０１１８】
PCR反応は次のように行った。すなわち宝酒造社のEx taq反応用溶液を使用し、該溶液の組成はTakara ExTaq Buffer×10倍液 5μl、dNTP mixture 4μl、鋳型DNA 30ng、10μM プライマー溶液 各1μl、Takara ExTaq 0．5μlを全体が50μlになるように水を加えて混合し、さらに30μlのミネラルオイルを重層することにより調製した。反応条件は、PCR増幅装置（ASTEC社 PC-700）を用い、変成を94℃，30秒、アニ―リングを40℃，1分、伸長を72℃，1分、の3段階の反応を35回繰返し行った。上記のPCR反応によって、約0.85kbpの大きさのDNA断片が増幅した。
【０１１９】
増幅反応後、重層したミネラルオイルを0.3mlのヘキサンで抽出し且つヘキサン層を除去する操作を3回繰返し、1分間減圧することにより、ミネラルオイルを除去した。この様にして得られた増幅反応液50μlから、ジーンクリーンキット（Bio101社製）を用いてPCR法で得たDNA断片を分離し精製した。すなわち、ジーンクリーンキット添付のNaI溶液の300μlを増幅反応液に加えて混合し、10μlガラスビーズ溶液を加えて混合し、得られた混合物を4℃、15分静置した後に、遠心分離した。こうして、増幅されたDNA断片の吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μlを該ガラスビーズに加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液によるガラスビーズ洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μlの滅菌水を加えて、混合することにより懸濁した。得られたガラスビーズ懸濁液を55℃で、15分加温した後、遠心分離を行い、増幅された約0.85 kbpのDNA断片を含む上清12μlを得た。
【０１２０】
（c）バチルス ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼをコードするDNAを含有する組換えベクターの調製と、それによる大腸菌の形質転換
（i）上記（b）で増幅され且つ精製されたDNA断片を、発現ベクターに組み込む操作は以下のように行った。すなわち、上記のDNA断片溶液10μlに対して、発現用プラスミドベクターとしてのベクターpUC119の0.5μgと、宝酒造社製の制限酵素Hind IIIおよびBam HIの各1μlと、宝酒造社製の制限酵素用緩衝液K buffer×10倍液 2μlとを加え、全体が20μlになるように滅菌水を加え、混合した。得られた混合液を36℃、16時間保って制限酵素を反応させた。
【０１２１】
（ii）上記の制限酵素反応を行った後、ジーンクリーン・キットを用いて、DNA断片と発現ベクターとを単離させた。すなわち、得られた制限酵素反応液20μlにキット添付のNaI溶液を300μl加えて混合し、次いで10μlガラスビーズ溶液を加えて混合し、さらに4℃、15分静置した後に、遠心分離し、DNA断片と発現ベクターの吸着したガラスビーズが沈殿させられた。上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μlを加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液によるガラスビーズ洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μlの滅菌水を加えて、懸濁し、55℃で、15分加温した後、遠心分離を行うと、DNA断片と発現ベクターとを含む上清12μlを得た。この操作により、制限酵素によって生じた約50bp以下の不要な小さなDNA断片は取り除かれ、目的とするDNA断片と、発現ベクターとが得られた。
【０１２２】
（iii）このようにして得たDNA断片と発現ベクターとを連結（ライゲーション）させるために、上記で調製したDNA断片とベクターとの溶液10μlにTakara Ligation kit−I溶液（宝酒造社）を10μl加えた。次いで、16℃、1時間反応させた。生成された組換えベクターを含むライゲーション反応溶液を用いて、コンピテントセルとして大腸菌JM109の形質転換を行った。すなわち、4℃で解凍したコンピテントセル溶液60μlに前記のライゲーション反応溶液を5μl加え、混合した。その混合物を、0℃，30分後、42℃，45秒、0℃，2分の処理にかけ、次いで、これに500μlのSOC溶液（2％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース、10mM MgSO4、10mM MgCl2）を加えて、36℃で1時間回復培養させた。この培養液100μlを、50μg/mlアンピシリン、40μg/ml X-gal（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside）、1mM IPTG（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を含むLB寒天培地（1％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0、1.5％寒天）に塗布した。さらに37℃、16時間培養した。この培養により、白色に発色したコロニーとして、前記の組換えプラスミドベクターの導入で形質転換された大腸菌が得られたので、これを選択した。
【０１２３】
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーを、アンピシリン（50μg/ml）を含むLB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体から、プラスミド精製キット（QIA filter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）によりプラスミドDNAの分離および精製を行った。こうして得られたプラスミドDNAは、目的とするシロ−イノソースイソメラーゼをコードする配列番号3の塩基配列をもつDNAを包有する約0.8kbpのDNA断片を含有することが確認された。
【０１２４】
（d）バチルス ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼの発現
（i）上記の（c）で白色発色したコロニーとして単離した大腸菌形質転換菌株を50μg/mlアンピシリンを含む100mlLB培地（1％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0）に移植し、36℃7時間培養した。この培養液に200mMイソプロピルチオガラクトピラノシド溶液を0.3ml加え、さらに36℃3時間培養した。培養終了後、遠心分離により、菌体を集めた。菌体を生理食塩水で1回洗浄した。さらに、洗浄菌体を0.6％トライトンX100溶液3mlに懸濁し、4℃で超音波により菌体を破砕した。この溶液を遠心分離し、上清としての酵素溶液2.8mlを取り出した。上清に1.2g硫安を加え、4℃でタンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、上清を除去した。この沈殿したタンパク質を2.5mlの20mMトリス緩衝液（pH7.0）に溶解させ、再度、遠心分離を行い、上清を20mMトリス緩衝液（pH7.0）で平衡化したShephadex G-25カラム（14ml）にアプライし、20mMトリス緩衝液（pH7.0）で溶出させ、脱塩を行なった。この操作により、シロ−イノソースイソメラーゼの粗酵素液3.5mlを得た。
【０１２５】
（ii）シロ−イノソースイソメラーゼ活性の測定は、次のように行った。すなわち、上記の粗酵素液100μl、10％シロ−イノソース溶液100μlまたは10％D−キロ−1−イノソース100μl、1Mトリス緩衝液（pH7.5）100μl、100mM MnCl2溶液 10μl、100mM ZnCl2溶液 10μlを全体が1mlになるように水を加えて混合した後、このように得た基本反応液を27℃、16時間反応させ、反応後、1Mリン酸（pH2.0）10μlの添加により反応を停止させた。さらに、この反応後の溶液は70℃10分加熱し、タンパク質を加熱変成させ、次いで遠心分離によりタンパク質沈殿を除き、上清をHPLC分析した。HPLC条件としては、WakosilNH2カラム（内径4.6mm×25cm）を用い、移動相は80％アセトニトリル水溶液、カラム温度20℃、流速2ml／min、検出器はUV検出器、OR検出器を用いた。
【０１２６】
その結果として、バチルス ズブチリスのiolI遺伝子から遺伝子工学的手法で得た配列番号3のDNAでコードされたリコンビナント酵素は、シロ−イノソースを基質にすると、D−キロ−1−イノソースに異性化させる反応を触媒することが判明した。また、反応は可逆的で、D−キロ−1−イノソースを基質にするとシロ−イノソースに異性化させることが判明した。平衡状態では1％のシロ−イノソースを基質にすると、シロ−イノソース：D−キロ−1−イノソース＝70：30の平衡に達することが判った。
【０１２７】
（e）バチルス ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼの諸性質
上記の（d）(ii)に示した基本反応液組成の内、1Mトリス緩衝液（pH7.5）100μlに代えて、pH4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5の1Mリン酸緩衝液100μl、あるいは、pH7.0、8.5、9.0の1Mトリス緩衝液100μlを用いて、変換活性を測定したところ、pH7.0〜8.0に最大活性を有していたことから、上記（d）のシロ−イノソースイソメラーゼの至適pHはpH7.0〜8.0であることが判った。
【０１２８】
さらに、上記の基本反応液組成の内、100mM MnCl2溶液 10μl、100mM ZnCl2溶液 10μlの合計20μlの重金属塩溶液の添加に代えて、重金属塩無添加、あるいは50mM MnCl2溶液 20μl、50mM ZnCl2溶液 20μl、50mM CoCl2溶液 20μl、50mM PbCl2溶液 20μl、50mM CuSO4溶液 20μl、50mM FeSO4溶液 20μl、50mM CaCl2溶液 20μl、50mM SnCl2溶液 20μl、50mM CdCl2溶液 20μl、50mM NiCl2溶液 20μl、もしくは、50mM MgCl2溶液 20μlを用いて変換活性を測定したところ、Mn2+、Zn2+、Co2+を含有する試験区で、それぞれ対象となる重金属塩無添加区よりも、120〜150％酵素活性が増加することから、本酵素はMn2+、Zn2+、Co2+を要求する金属酵素であることが判明した。
【０１２９】
【実施例２】
バチルス リッチェニフォーミスOK3−2−2株由来シロ−イノソースイソメラーゼの発現
（a）バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株のゲノムDNAの調製
LBフラスコ培地100ml（1％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0）中に、LBスラント培地（1％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0、1.5％寒天）で培養したバチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株を一白金耳接種し、4時間、55℃で好気的に培養し、培養液から集菌した。この菌体ペレットに、15mlのSaline−EDTA溶液（0.15M NaCl、0.1M EDTA、pH8.0）とリゾチーム50mgを加えて菌体を懸濁し、菌体にリゾチームを37℃、2時間作用させた。処理後、得られた菌体溶解液に25％SDS溶液を0.5ml加えて完全に溶菌させた。次にフェノールを3ml加えて、タンパク質を変成させた後に、遠心分離した。上清を取り出し、この上清に20mlの2−プロパノールを加えて、粗ゲノムDNAを析出させた。析出した粗ゲノムDNAを遠心分離により沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。
【０１３０】
乾燥した粗ゲノムDNAは、さらに3mlTE液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0）に溶解後、その溶液に0.01mgのRNAaseを加え、36℃、2時間反応させ、RNAを分解させた。さらに、0.01mgのプロテイナーゼKを加えて、36℃、2時間反応させ、タンパク質を分解させた。次に、そのタンパク質分解反応液に1mlのフェノール−クロロホルム（1：1）混液を加えて、得られた混合物をゆっくりと攪拌し、RNAaseと、プロテイナーゼKを変成させた。その変成混合物を遠心分離し、2相に分離した内の水相である上層を取り出した。、これに3M酢酸Na溶液を0.3ml加えて、pH5.2に調整した。これに3mlの2−プロパノールを加えて、ゲノムDNAを析出させた。
【０１３１】
析出したゲノムDNAを遠心分離により沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥したゲノムDNAは、3mlTE液に溶解させ、さらにその溶液に1mlのフェノール−クロロホルム（1：1）混液を加える操作から、3mlTE液に溶解させる過程までを、再度繰り返した後に、遠心分離を行い、同様にpH5.2にて、上清に等量の2−プロパノールを加えて、バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株のゲノムDNAの溶液を調製した。このようにして得られたゲノムDNAを、PCR反応のための鋳型として用いるDNAの溶液とした。
【０１３２】
（b）バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株由来シロ−イノソースイソメラーゼに相当するDNA配列のクローニング
バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株由来シロ−イノソースイソメラーゼ配列のクローニングを行うために、配列番号7と8の塩基配列を有する下記の2つのプライマーを用いて、PCR反応を行った。
iolIOK3 − 2 − 2-Fプライマー： 5’- ccccaagcttgatgaaactttgttttaatgaag -3’（配列No.7）
iolI OK3 − 2 − 2-Rプライマー： 5’- cgggatccttacatgctgaagtattttg -3’（配列No.8）
【０１３３】
PCR反応は次のように行った。すなわち宝酒造社のEx taq反応用溶液を使用し、該溶液の組成はTakara ExTaq Buffer×10倍液 5μl、dNTP mixture 4μl、鋳型DNA 30ng、10μM プライマー溶液 各1μl、Takara ExTaq 0．5μlを全体が50μlになるように水を加えて混合し、さらに30μlのミネラルオイルを重層することにより調製した。反応条件は、PCR増幅装置（ASTEC社 PC-700）を用い、変成を94℃，30秒、アニーリングを40℃，1分、伸長を72℃，1分、の3段階の反応を35回繰返し行った。上記のPCR反応によって、約0.85 kbpの大きさのDNA断片が増幅した。
【０１３４】
増幅反応後、重層したミネラルオイルを0.3mlのヘキサンで抽出し且つヘキサン層を除去する操作を3回繰返し、1分間減圧することにより、ミネラルオイルを除去した。この様にして得られた増幅反応液50μlから、ジーンクリーンキット（Bio101社製）を用いてPCR断片を分離して精製した。すなわち、キット添付のNaI溶液を増幅反応液に300μl加えて混合し、10μlガラスビーズ溶液を加えて混合し、得られた混合物を4℃、15分静置した後に、遠心分離した。こうして増幅したDNA断片の吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μlを該ガラスビーズに加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液によるガラスビーズ洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μlの滅菌水を加えて、懸濁し混合することにより55℃で、15分ガラスビーズ懸濁液を加温した後、遠心分離を行い、増幅された約0.85 kbpのDNA断片を含む上清12μlを得た。
【０１３５】
（c）バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株由来シロ−イノソースイソメラーゼをコードするDNAを含有する組換えベクターの調製と大腸菌の形質転換
（i）上記（b）で得た精製されたDNA断片を、発現ベクターに組み込む操作は以下のように行った。すなわち、上記のDNA断片溶液10μlに対して、発現用プラスミドベクターとしてベクターpUC119の0.5μgと、宝酒造社製の制限酵素Hind IIIとBam HIの各1μlと、宝酒造社製の制限酵素用緩衝液K buffer×10倍液 2μlとを加え、全体が20μlになるように滅菌水を加え、混合した。得られた混合液を36℃、16時間保って制限酵素反応を行った。
【０１３６】
（ii）上記の制限酵素反応の後、ジーンクリーン・キットを用いて、DNA断片と発現ベクターとを単離した。すなわち、得られた制限酵素反応液20μlにキット添付のNaI溶液を300μl加えて混合し、次いで10μlガラスビーズ溶液を加えて混合し、4℃、15分静置した後に、遠心分離すると、DNA断片と発現ベクターの吸着したガラスビーズが沈殿させられた。上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μlをガラスビーズに加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液によるガラスビーズ洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μlの滅菌水を加えて、懸濁し、55℃で、15分加温した後、遠心分離を行うと、DNA断片と発現ベクターを含む上清12μlを得た。この操作により、制限酵素によって生じた約50bp以下の小さなDNA断片は取り除かれ、目的とするDNA断片と、発現ベクターとが得られた。
【０１３７】
（iii）上記で得たDNA断片と発現ベクターとをライゲートするために、上記で調製したDNA断片とベクターとの溶液10μlにTakara Ligation kit−I溶液（宝酒造社）を10μl加え、16℃、1時間反応させた。生成された組換えベクターを含むライゲーション反応溶液を用いて、コンピテントセルとしての大腸菌JM109の形質転換を行った。すなわち、4℃で解凍したコンピテントセル溶液60μlに前記のライゲーション反応溶液を5μl加え、混合し、0℃，30分、42℃，45秒、0℃，2分の処理にかけ、次いで、これに500μlのSOC溶液（2％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース、10mM MgSO4、10mM MgCl2）を加えて、36℃で1時間回復培養させた。
【０１３８】
この培養液100μlを、50μg/mlアンピシリン、40μg/ml X-gal（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside）、1mM IPTG（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を含むLB寒天培地（1％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0、1.5％寒天）に塗布した。さらに37℃、16時間培養した。この培養により、白色に発色したコロニーとして前記の組換えベクターの導入で形質転換された大腸菌が得られたため、これを選択した。
【０１３９】
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーを、アンピシリン（50μg/ml）を含むLB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（QIA filter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）によりプラスミドDNAの分離および精製を行った。こうして得られたプラスミドDNAは、目的とするシロ−イノソースイソメラーゼをコードする配列番号4のDNAを包有する約0.8kbpのDNA断片を有することが確認された。
【０１４０】
（d）バチルス リッチェニフォーミス（OK3-2-2）由来シロ−イノソースイソメラーゼの発現
（i）上記で白色発色したコロニーとして単離した大腸菌形質転換菌株を、50μg/mlアンピシリンを含む100mlLB培地（1％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、pH7.0）に移植し、36℃7時間培養した。この培養液に200mMイソプロピルチオガラクトピラノシド溶液を0.3ml加え、さらに36℃3時間培養した。培養終了後、遠心分離により、菌体を集めた。これを生理食塩水で1回洗浄した。さらに、洗浄菌体を0.6％トライトンX100溶液3mlに懸濁し4℃で超音波により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、上清としての酵素溶液2.8mlを取り出した。上清に1.2g硫安を加え、4℃でタンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、上清を除去した。この沈殿したタンパク質を2.5mlの20mMトリス緩衝液（pH7.0）に溶解させ、再度、遠心分離を行い、上清を20mMトリス緩衝液（pH7.0）で平衡化したShephadex G-25カラム（14ml）にアプライし、20mMトリス緩衝液（pH7.0）で溶出させ、脱塩を行なった。この操作により、シロ−イノソースイソメラーゼの粗酵素液3.5mlを得た。
【０１４１】
（ii）シロ−イノソースイソメラーゼ活性の測定は、次のように行った。すなわち上記の粗酵素液100μl、10％シロ−イノソース溶液100μlまたは10％D−キロ−1−イノソース100μl、1Mトリス緩衝液（pH7.5）100μl、100mM MnCl2溶液 10μl、100mM ZnCl2溶液 10μlを全体が1mlになるように水を加えて混合した後、このように得た基本反応液を27℃、16時間反応させ、反応後、1Mリン酸（pH2.0）10μlを加えて、反応を停止させた。さらに、この反応溶液は70℃10分加熱し、タンパク質を加熱変成させ、遠心分離によりタンパク質を除いた。上清をHPLC分析した。HPLC条件としては、WakosilNH2カラム（内径4.6mm×25cm）を用い、移動相は80％アセトニトリル水溶液、カラム温度20℃、流速2ml／min、検出器はUV検出器、OR検出器を用いた。
【０１４２】
その結果として、バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株のiolI遺伝子ホモログから得た配列番号4のDNAでコードされたリコンビナント酵素は、シロ−イノソースを基質にすると、D−キロ−1−イノソースに異性化させる反応を触媒することが判明した。また、反応は可逆的で、D−キロ−1−イノソースを基質にすると、シロ−イノソースに異性化させることが判明した。平衡状態では1％のシロ−イノソースを基質にすると、シロ−イノソース：D−キロ−1−イノソース＝70：30の平衡に達することが判った。
【０１４３】
（e）バチルス リッチェニフォーミスOK3-2-2株由来シロ−イノソースイソメラーゼの諸性質
上記の基本反応液組成の内、1Mトリス緩衝液（pH7.5）100μlに代えて、pH4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5の1Mリン酸緩衝液100μl、あるいはpH7.0、8.5、9.0の1Mトリス緩衝液100μlを用いて変換活性を測定したところ、pH7.0〜8.0に最大活性を有していたことから、本酵素の至適pHはpH7.0〜8.0であることが判った。
【０１４４】
さらに、上記基本反応液組成の内、100mM MnCl2溶液 10μl、100mM ZnCl2溶液 10μlの合計20μlの重金属塩溶液の添加に代えて、重金属塩無添加、あるいは50mM MnCl2溶液 20μl、50mM ZnCl2溶液 20μl、50mM CoCl2溶液 20μl、50mM PbCl2溶液 20μl、50mM CuSO4溶液 20μl、50mM FeSO4溶液 20μl、50mM CaCl2溶液 20μl、50mM SnCl2溶液 20μl、50mM CdCl2溶液 20μl、50mM NiCl2溶液 20μl、もしくは50mM MgCl2溶液 20μlを用いて変換活性を測定したところ、Mn2+、Zn2+、Co2+を含有する試験区で、それぞれ対象となる重金属塩無添加区よりも、120〜150％酵素活性が増加することから、本酵素はMn2+、Zn2+、Co2+を要求する金属酵素であることが判明した。
【０１４５】
【実施例３】
シロ−イノソースイソメラーゼの調製
実施例２で調製した組換えプラスミドを有する大腸菌形質転換菌株をLB培地１Ｌに移植し、好気条件で36℃，７時間培養した。得られた培養液に200mMイソプロピルチオガラクトピラノシド３mlを加え、同様に好気条件で36℃，３時間培養した。その培養後、得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め、この菌体を0.6％トライトンX100溶液50mlに懸濁し、その菌体懸濁液を４℃で超音波処理して菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を分離し、得られた上清のpHをpH7.5に調整し、上清を粗酵素液として得た。この粗酵素液は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列をもつタンパク質からなるシロ−イノソースイソメラーゼを含有するものである。
【０１４６】
前記の粗酵素液に対して、硫安濃度が80％になるように硫安を加え、タンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、集めたタンパク質を20mMトリス緩衝液pH7.0に溶解させると、シロ−イノソースイソメラーゼを含む粗酵素液が調製された。
【０１４７】
【実施例４】
シロ−イノソースからD−キロ−1−イノソースの製造
シロ−イノソース100ｇを熱水900mlに溶解して得られた水溶液を36℃まで冷却した。得られたシロ−イノソース水溶液をNaOH溶液で、pH7.5に調整した後、100mM MnCl2の水溶液50mlを加えた。さらに、このシロ−イノソース水溶液に、実施例３で調製したトリス緩衝液中の粗酵素液を加え、最終的に１Ｌになるように水を加えて、混合した。得られた混合液を36℃で24時間反応させた。
反応中に、経時的に反応溶液をサンプリングし、採取したサンプル液のHPLC分析を行ったところ、反応溶液中のシロ−イノソースの当初の量のうちの22％がD−キロ−1−イノソースになった時点で平衡に達した。
【０１４８】
反応終了後、6N硫酸５mlを加え、反応溶液をpH2.0に調整し、80℃まで加熱し、タンパク質を変成させた。この変成溶液を遠心分離してタンパク質を除いた。D−キロ−1−イノソースを含有する上清を、強酸性陽イオン交換樹脂50ml（Duolite-C20（H+タイプ））カラムと弱塩基性陰イオン交換樹脂100ml（Duolite-A368S（OH-タイプ））カラムとを通して連続的に通過させた。その後にこれらカラムに蒸留水250mlを通過させて交換樹脂カラム内に残留するイノソース異性体を溶出させて各画分を分離し、精製した。
【０１４９】
陰イオン交換樹脂カラムから溶出液として得られた透明な画分の溶液1.25Ｌを、エバポレーターを用いて溶液重量が180ｇになるまで減圧下に濃縮した。この段階で濃縮液からシロ−イノソースが析出し、濃縮液はスラリー状になった。このスラリーを16時間放置した後、ろ過操作を行い、固体とろ液に分別した。固体とろ液中に含まれるイノソース異性体は、HPLC分析によって、それらの組成分析および定量を行ったところ、ろ液中にD−キロ−1−イノソース19.2ｇ、シロ−イノソース17.6ｇが含まれていた。また、固体（58.2ｇ）中にはD−キロ−1−イノソース1.7ｇ、シロ−イノソース56.5ｇが含まれていた。
【０１５０】
【実施例５】
実施例４で得られたところの、D−キロ−1−イノソースおよびシロ−イノソース含有のろ液のpHを6.5に調整し、攪拌しながら該ろ液にNaBH4粉末2.45ｇを10回に分けて、添加した。添加する際には、5N HClの滴下によりpHを6.5〜7.0に保ち、また、温度は50℃以下に保って還元反応をさせた。反応溶液は室温まで冷却後、沈殿してくるシロ−イノシトール固体をろ過により除去した。
【０１５１】
得られたろ液を強酸性陽イオン交換樹脂50ml（Duolite-C20（H+タイプ））カラムと強塩基性陰イオン交換樹脂50ml（Duolite-A116（OH-タイプ）カラムとに連続的に通過させた後に、さらにイオン交換樹脂カラムに蒸留水100mlを通過させた。樹脂カラム内に残留するイノシトール異性体が溶出した。得られた溶出液中に含まれるイノシトール異性体は、HPLC分析によって、それらの組成分析を行ったところ、溶出液中にD−キロ−イノシトール12.5ｇ、ミオ−イノシトール17.3ｇ、シロ−イノシトール1.7ｇが含まれていた。
【０１５２】
上記の還元反応により、使用したシロ−イノソースの100ｇ当りにD−キロ−イノシトール12.5ｇが得られた。従って、反応収率は12.5％と見積もられた。
【０１５３】
前記の溶出液は、エバポレーターを用いて、減圧濃縮すると結晶化し始め、最終的にD−キロ−イノシトールとミオ−イノシトールとシロ−イノシトールとの混合結晶（31.5ｇ）が得られた。
【０１５４】
【実施例６】
Ｄ−キロ−イノシトールの単離と精製
実施例５で得られた混合結晶からのＤ−キロ−イノシトールの単離は、次のようにして行った。すなわち、混合結晶31.5ｇに30mlの水を加え、80℃に加熱溶解させ、この溶液を４℃に16時間放置し、結晶を析出させた。次に、この結晶を含む溶液をろ過して母液を得た。母液中にはＤ−キロ−イノシトール12.1ｇ、ミオ−イノシトール4.3ｇ、シロ−イノシトール0.7ｇが含まれていた。
次に、この母液45mlを、強塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）CG-400（OH―型）3000mlを充填したカラム（内径5.5cm、長さ85cm）に流し、さらにカラムを蒸留水で溶出し、溶出液を分画して集めた。Ｄ−キロ−イノシトールを含む画分を集め、これらを減圧下で濃縮した。その濃縮液20mlに室温でエタノール40mlを加え、その混合液を、徐々に冷却するとともに、結晶を析出させた。結晶を乾燥し、Ｄ−キロ−イノシトールの結晶11.2gを得た。このようにして得られたＤ−キロ−イノシトールの物理的性質は、比旋光度［α]D 25が＋65°（c＝1.0、H2O）であり、光学純度99％以上および融点238℃であり、Ｄ−キロ−イノシトール純品であると確認できた。
【０１５５】
【配列表】
Claims (6)
- 至適 pH が pH 5 〜 pH 9 の範囲にあり且つ Mn 2+ 、 Zn 2+ または Co 2+ である活性化因子によって活性化される特性を有すると共に、下記の式（ I ）のシロ−イノソースを下記の式（ II ）の D −キロ− 1 −イノソースへ変換させ
且つ後者を前者に変換させる相互変換の平衡的反応を触媒する酵素作用をもつ特性を有するシロ−イノソースイソメラーゼであることを特徴とする、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する酵素タンパク質。 - シロ−イノソースを含有する水溶液に、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質、あるいは配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質を、シロ−イノソースイソメラーゼとして使用し作用させて、シロ−イノソースを D −キロ− 1 −イノソースへ異性化させる酵素反応を行う工程と、その酵素反応溶液から酵素を回収する工程と、酵素の回収後に得た残液から D −キロ− 1 −イノソースを回収する工程と、回収した D −キロ− 1 −イノソースを精製する工程からなる、 D −キロ− 1 −イノソースの製造方法。
- シロ−イノソースを含有する水溶液に、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質、あるいは配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質を、シロ−イノソースイソメラーゼとして使用し作用させてシロ−イノソースを D −キロ− 1 −イノソースへ異性化させる酵素反応を行う工程と、その酵素反応溶液から、シロ−イノソースイソメラーゼとして使用した酵素を回収する工程と、その酵素回収後に、未反応のシロ−イノソースと D −キロ− 1 −イノソースを含む残液を濃縮する工程と、その得られた濃縮液からシロ−イノソースを結晶化させてその結晶を分別する工程と、その母液として得た D −キロ− 1 −イノソース含有溶液に還元剤を加え、 D −キロ− 1 −イノソースを還元し、 D −キロ−イノシトールを生成する工程と、還元で生成した D −キロ−イノシトールを含む還元反応溶液から D −キロ−イノシトールを分離して精製する工程とからなる、 D −キロ−イノシトールの製造方法。
- 至適 pH が pH 5 〜 pH 9 の範囲にあり且つ Mn 2+ 、 Zn 2+ または Co 2+ である活性化因子によって活性化される特性を有すると共に、下記の式（ I ）のシロ−イノソースを下記の式（ II ）の D −キロ− 1 −イノソースへ変換させ
且つ後者を前者に変換させる相互変換の平衡的反応を触媒する酵素作用をもつ特性を有するシロ−イノソースイソメラーゼとして作用できて、しかも配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質をコードし且つ配列表の配列番号４の塩基配列を有する DNA 。 - 配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素タンパク質であるシロ−イノソースイソメラーゼをコードし且つ配列表の配列番号４の塩基配列をもつ DNA 配列を包有する組換えベクターの導入により形質転換された細菌宿主細胞を培養し、その培養された細胞菌体の破砕物からまたは培養液から、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を 有する酵素タンパク質としての請求項１に記載のシロ−イノソースイソメラーゼを回収することを特徴とする、前記シロ−イノソースイソメラーゼの製造方法。
- 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNA であって且つ配列番号４で表される塩基配列を有する DNA を、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子として、染色体中に持つ中度好熱性のバチルス・リッチェニフォーミス OK3-2-2 株（ FERM P-19188 として寄託）。
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