KR20140096632A - 효소 반응법을 이용한 마이오-이노시톨로부터 d-카이로-이노시톨을 생산하는 방법 - Google Patents
효소 반응법을 이용한 마이오-이노시톨로부터 d-카이로-이노시톨을 생산하는 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20140096632A KR20140096632A KR1020130009431A KR20130009431A KR20140096632A KR 20140096632 A KR20140096632 A KR 20140096632A KR 1020130009431 A KR1020130009431 A KR 1020130009431A KR 20130009431 A KR20130009431 A KR 20130009431A KR 20140096632 A KR20140096632 A KR 20140096632A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- inositol
- myo
- chiro
- enzyme
- isomerase
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01018—Inositol 2-dehydrogenase (1.1.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
- C12Y503/99—Other intramolecular oxidoreductases (5.3.99)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 기질인 마이오-이노시톨을 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제, 또는 이들 효소가 융합된 형태의 단백질을 포함하는 효소 반응 완충액내에서 반응시켜 D-카이로-이노시톨을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면 세포외 효소 반응 완충액내에서의 D-카이로-이노시톨을 생산하므로 재조합 세포를 이용한 발효 방법과 비교하여 저비용 및 고수율로 D-카이로-이노시톨을 생산할 수 있다. 또한, 유기용매의 첨가, 상층액 분리 및 건조와 같은 간단한 공정을 통해 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합된 반응 완충액으로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 분리할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면 D-카이로-이노시톨로부터 분리된 마이오-이노시톨은 기질로서 재사용이 가능한 이점이 있다.
Description
본 발명은 효소를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 기질인 마이오-이노시톨을 2가지의 효소 이노시톨 디하이드로게나아제(inositol dehydrogenase) 및 이노소스 이소머라아제(inosose isomerase), 또는 이들의 융합 단백질 형태의 효소와 반응시켜 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법에 관한 것이다.
D-카이로-이노시톨(D-chiro-inositol, cis-1,2,4-trans-3,5,6-cyclohexol)은 마이오-이노시톨(myo-inositol, cis-1,2,3,5-trans-4,6-cyclohexanehexol)의 입체이성질체(stereoisomer)로서 3번 하이드록실 그룹이 에피머화 된 형태이다(도 1). D-카이로-이노시톨은 이노시톨 포스포글리칸(IPG)의 주요 구성성분으로 인슐린 신호전달의 중요한 매개체로 보고되어 있으며, 제2형 당뇨의 치료에 효과가 있다고 알려져 있다. D-카이로-이노시톨은 주로 진핵생물에서 발견되며, 마이오-이노시톨의 에피머화에 의해 생합성된다. D-카이로-이노시톨은 주로 피니톨(D-pinitol)이나 카스가마이신(kasugamycin)의 염산 가수분해에 의해 생산하고 있다(U.S. Pat No. 5827896, U.S. Pat No. 5091596, U.S. Pat No. 5463142, U.S. Pat No.5714643). 그러나, 원료인 피니톨이나 카스가마이신이 고가이며, 유기합성법(U.S. Pat No. 5406005, WO 96/25381)도 알려져 있으나, 부산물의 분리가 용이하지 않아 경제성이 낮다. D-카이로-이노시톨은 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제(myo-inositol dehydrogenase) 및 이노소스 이소머라아제(inosose isomerase)를 발현하는 형질전환된 세포를 이용한 발효 방법에 의해 마이오-이노시톨로부터 생산될 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기 형질전환된 세포를 이용한 발효 방법은 생산 수율이 낮으며 발효액으로부터 D-카이로-이노시톨을 정제하는 데 있어서 문제점이 있는 것으로 알려져 왔다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하고, 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 효율적으로 생산하는 방법을 개발하고자 연구 노력한 결과, 기질인 마이오-이노시톨을 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제의 2가지 효소, 또는 이들의 융합 단백질 형태의 효소와 세포외에서 반응시켜 D-카이로-이노시톨을 성공적으로 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 효소반응법을 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 효소반응법을 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법을 제공한다: (a) (i) 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제, 또는 이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제의 융합 단백질, (ⅱ) 조효소로서 NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide), 및 (ⅲ) 기질로서 마이오-이노시톨을 포함하는 효소 반응 완충액을 준비하는 단계; 및 (b) 상기 효소 반응 완충액을 반응시켜 D-카이로-이노시톨을 생성시키는 단계.
이하에서 본 발명을 각 단계에 따라 상세히 설명한다.
단계 (a): (i) 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제 , 또는 이 두 가지 효소의 융합 단백질, (ⅱ) 조효소로서 NAD( Nicotinamide Adenine Dinucleotide ), 및 (ⅲ) 기질로서 마이오-이노시톨을 포함하는 효소 반응 완충액을 준비하는 단계
본 명세서에서 용어 “이노시톨 디하이드로게나아제(inositol dehydrogenase)”또는 “마이오-이노시톨 디하이드로게나아제(myo-inositol dehydrogenase)”는 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이 마이오-이노시톨을 NAD+ 의존성 산화작용에 의해 2-케토-마이오-이노시톨(2-keto-myo-inositol)로 변환시키는 화학반응 또는 이의 역방향 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소이다. 본 명세서에서 “이노시톨 디하이드로게나아제”와 관련하여 이를 코딩하는 유전자 명칭은“iolG"으로 기재한다.
[반응식 1]
마이오-이노시톨 + NAD+ ↔ 2-케토-마이오-이노시톨 + NADH + H+
이노시톨 디하이드로게나아제는 에어로박터 에어로게네스(Aerobacter aerogenes) [Berman T, Magasanik B (1966). J. Biol. Chem. 241 (4): 800-806; LARNER J, JACKSON WT, GRAVES DJ, STAMER JR (1956). Arch. Biochem. Biophys. 60 (2): 352-363)과 효모 크립토코커스 멜리비오숨(Cryptococcus melibiosum)[Vidal-Leiria M, van Uden N (1973). Biochim. Biophys. Acta. 293 (2): 295-303]에서 분리되었다고 보고되어 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 이노시톨 디하이드로게나아제는 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로 부터 분리된 것이다. 보다 바람직하게는 본 발명에서 사용되는 이노시톨 디하이드로게나아제는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 이노시톨 디하이드로게나아제이다. 보다 더 바람직하게는 본 발명의 이노시톨 디하이드로게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.
본 명세서에서 용어 “이노소스 이소머라아제(inosose isomerase)”는 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 2-케토-마이오-이노시톨을 1-케토-D-카이로-이노시톨(1-keto-D-chiro-inositol)로 전환하는 이성질체화 반응 또는 이의 역방향 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소이다. 본 명세서에서 “이노소스 이소머라아제”와 관련하여 이를 코딩하는 유전자 명칭은 “iolI"로 기재한다.
[반응식 2]
2-케토-마이오-이노시톨 ↔ 1-케토-D-카이로-이노시톨
본 발명에서 사용할 수 있는 이노소스 이소머라아제는 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 클루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로 부터 분리된 것이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 이노소스 이소머라아제는 판토에아 아나나티스 유래 이노소스 이소머라아제이다. 보다 더 바람직하게는 본 발명의 이노소스 이소머라아제는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.
상기 반응식 2에 의해 생성된 1-케토-D-카이로-이노시톨은 하기 반응식 3에 의해 본 발명에서의 최종산물인 D-카이로-이노시톨을 생성한다. 하기 반응식 3의 반응은 앞서 설명된 효소인“이노시톨 디하이드로게나아제”가 촉매한다.
[반응식 3]
1-케토-D-카이로-이노시톨 + NADH + H+ ↔ D-카이로-이노시톨 + NAD+
본 발명에서는 상기 설명된 두 효소, 즉 이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제가 융합된 형태의 효소를 사용할 수 있다. 융합된 형태의 효소를 사용하는 경우 효소 반응의 효율과 열안정성을 증대시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 융합 효소에서 이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제는 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “펩타이드 링커”는 서로 다른 단백질을 연결하는데 사용하는 비교적 짧은 펩타이드를 의미한다. 펩타이드 링커에 관한 내용은 문헌 “Toon H. Evers et al., 2006, J. Christopher Anderson et al., 2010”에 상세히 개시되어 있으며, 이 문헌에 개시된 내용은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
일반적으로 도메인과 도메인, 또는 효소와 효소를 연결하는 다양한 링커가 알려져 있으며, 크게 유연성 있는 링커(flexible linker)와 견고한 링커(rigid linker)로 나눌 수 있다. 유연성 있는 링커로서는 주로 글리신(glycine), 알라닌(alanine) 등 회전이 자유로운 아미노산이 풍부한 비교적 짧은 펩타이드로 구성되어 있으며, 발현되었을 경우 두 도메인 또는 효소는 자유롭게 회전하여 각각의 단백질 입체구조에 영향을 덜 주게 된다. 한편, 견고한 링커로서는 입체구조 상에서 알파-헬릭스(alpha-helix)를 이루도록 하는 아미노산으로 구성되어 있으며, 실제 발현시 에는 알파-헬릭스를 이루어 견고한 구조를 갖게 된다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명에서의 링커는 유연성 있는 링커와 견고한 링커를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 유연성 있는 링커를 사용한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 펩타이드 링커는 2개 내지 24개의 아미노산으로 이루어지고, 보다 바람직하게는 4개 내지 12개의 아미노산으로 이루어진다.
본 발명의 하기 구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 긴 링커로서 “GGSGGGSGGGSG”펩타이드를, 중간 링커로서 “GGSGGGSG” 펩타이드를, 짧은 링커로서 “GGSG”펩타이드를 사용한다.
상기 펩타이드 링커의 N-말단과 C-말단에 각각 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제를 결합시킨다. 예를 들어, 링커의 N-말단에 이노시톨 디하이드로게나아제를 결합시키고 C-말단에 이노소스 이소머라아제를 결합시킬 수 있으며, 반대로 링커의 N-말단에 이노소스 이소머라아제를 결합시키고 링커의 C-말단에 이노시톨 디하이드로게나아제를 결합시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 융합 효소는 이노시톨 디하이드로게나아제의 C-말단과 이노소스 이소머라아제의 N-말단이 서로 연결된 형태이다.
본 발명의 상기 효소 반응 완충액내에서 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제, 또는 이들의 융합된 형태의 효소의 농도가 증가할수록 초기 반응속도가 증가된다. 따라서, 효소 반응 완충액내에서 효소의 농도를 증가시킴으로써 D-카이로-이노시톨의 생성 반응의 속도를 증가시킬 수 있다. 효소 반응 완충액내에서 상기 이노시톨 디하이드로게나아제, 이노소스 이소머라아제, 또는 이들의 융합 효소의 농도는 특별하게 한정되지 않고, 당업자가 생산 효율 및 제조 비용을 감안하여 적합한 농도를 선택할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 이노시톨 디하이드로게나아제, 이노소스 이소머라아제, 또는 이들의 융합 효소의 농도는 각각 100 - 500 ㎍/㎖의 범위 내에서 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 효소 반응 완충액내에서 NAD의 농도는 특별하게 한정되지 않으나, 바람직하게는 O.1 - 2.0 mM의 범위내에서 적합한 농도를 선택하여 정할 수 있다. 본 발명의 하기 구체적인 일 실시예에 의하면, 0.5 mM 까지는 NAD의 농도가 증가할수록 초기반응속도가 증가하나, 0.5 mM 이상의 농도에서는 NAD 농도 증가에 따라 반응속도가 크게 증가하지 않는다.
본 발명의 상기 효소 반응 완충액내의 마이오-이노시톨의 농도는 특별하게 제한되지 않으나, 바람직하게는 5 - 20 ％(w/v)의 범위내에서 적합한 값을 선택할 수 있다.
본 발명의 상기 효소 반응 완충액은 Tris-HCl, MgSO4, 및 MnSO4를 더 포함할 수 있다.
단계 (b): 상기 효소 반응 완충액을 반응시켜 D-카이로-이노시톨을 생성시키는 단계
본 발명에서 효소 반응의 반응온도는 특별하게 제한되지 않으나, 25 - 65℃의 범위내에서 적합한 온도를 선택할 수 있다. 보다 바람직하게는 30 - 60℃, 보다 더 바람직하게는 35 - 55℃이고, 가장 바람직하게는 37 - 55℃이다.
본 발명의 방법은 효소 반응이 완료된 효소 반응 완충액에 유기용매를 첨가하여 D-카이로-이노시톨을 고순도로 정제하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 단계 (b) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다: (c) 상기 반응이 완료된 효소 반응 완충액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계; (d) 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (e) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
단계 (c): 상기 반응이 완료된 효소 반응 완충액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계
상기 효소 반응에서 생성물인 D-카이로-이노시톨의 최종 평형 농도는 약 14％이므로, 반응이 완료된 효소 반응 완충액내에서 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨은 약 86:14의 비율로 존재한다. 물을 용매로 한 수용액내에서 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도 차이는 도 17에 나타나 있다. 본 발명의 방법은 반응물인 마이오-이노시톨과 생성물인 D-카이로-이노시톨이 포함된 반응 완료된 완충액내에서 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도 차이에 의해 D-카이로-이노시톨의 순도를 높여 정제한다. 이를 위해, 본 발명의 방법에서, 먼저 반응이 완료된 효소 반응 완충액에 유기용매를 첨가한다. 상기 유기용매의 첨가에 의해 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 침전이 유도된다. 한편, 유기용매 첨가에 의해 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 침전율이 모두 증가되지만, D-카이로-이노시톨에 비해 마이오-이노시톨의 침전율이 훨씬 크게 증가한다(도 18 참조). 따라서, 반응이 완료된 효소 반응 완충액에 유기용매를 첨가하여 D-카이로-이노시톨 보다 마이오-이노시톨을 더 많은 양으로 침전시켜 용액중의 D-카이로-이노시톨의 농도를 증대시킬 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 유기용매는 D-카이로-이노시톨의 침전 보다 마이오-이노시톨의 침전을 더욱 크게 유도할 수 있는 특성을 갖는 것이면 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들어, 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1, 3-부틸렌글리콜 또는 에테르가 바람직하다. 상기 알코올은 탄소수 2-6개의 알코올이 바람직하다. 상기 유기용매는 더욱 바람직하게는 에탄올, 이소프로판올, 아세톤을 사용할 수 있다.
상기 반응이 완료된 효소 반응 완충액에 첨가하는 유기용매의 양은 특별히 한정되지 않고, 효소 반응 완충액 대비 0.1 - 9배(v/v)의 범위 내에서 적합한 양을 선택하여 첨가할 수 있다. 바람직하게는 상기 유기용매는 효소 반응 완충액 대비 0.1 - 6배(v/v)의 양, 보다 바람직하게는 0.1 - 4배(v/v)의 양, 보다 더 바람직하게는 0.1 - 2배(v/v)양이고, 가장 바람직하게는 0.1 - 1.5배(v/v)양으로 첨가한다.
본 발명에서 유기용매의 첨가에 의해 유도되는 이노시톨 침전물에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 모두 포함되어 있으나, 마이오-이노시톨의 침전율이 더 높으므로, 마이오-이노시톨이 더 많이 포함되어 있다.
단계 (d): 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계
상기 단계 (c)를 통해 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리한다. 상기 이노시톨 침전물은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전물이지만, 마이오-이노시톨이 더 큰 침전율을 나타내므로, D-카이로-이노시톨 보다는 마이오-이노시톨이 더욱 많은 양으로 포함되어 있다. 마이오-이노시톨의 다량 침전으로 인해 상층액 중에는 마이오-이노시톨의 농도가 낮아지게 되며, D-카이로-이노시톨의 농도(순도)는 상대적으로 증가하게 된다. 이노시톨 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 또는 원심분리 방법을 사용하며, 바람직하게는 여과 방법을 사용하여 행한다.
단계 (e): 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계
상기 단계 (d)에서 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는다. 상층액의 건조는 상층액을 가열하면서 행할 수 있으며, 또는 진공상태에서 행할 수 있다. 상층액을 건조시켜 얻은 이노시톨 건조물에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합되어 있으나, 상기 단계 (b)의 반응이 완료된 효소 반응 완충액에서와 비교하여 D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 단계 (e) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다: (f) 상기 단계 (e)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하는 단계; (g) 상기 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계; (h) 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (i) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
단계 (f): 상기 단계 (e)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하는 단계
상기 단계 (e)에서 얻은 이노시톨의 분말을 물에 용해시켜 이노시톨이 용해된 수용액을 제조한다. 상기 물은 바람직하게는 증류수이다. 바람직하게는, 상기 이노시톨 분말은 물에 20％(w/v) 이하의 저농도로 용해시키고, 보다 바람직하게는 18％(w/v) 이하의 농도, 보다 더 바람직하게는 15％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다.
단계 (g): 상기 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계
상기 단계 (f)에서 얻은 이노시톨이 용해된 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨의 침전물을 생성시킨다. 상기 유기용매는 상기 단계 (c)에서 설명된 내용과 동일하다. 유기용매는 D-카이로-이노시톨의 침전 보다 마이오-이노시톨의 침전을 더욱 크게 유도할 수 있는 특성을 갖는 것이면 특별하게 한정되지 않으며, 예컨대 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1, 3-부틸렌글리콜 또는 에테르가 바람직하다. 상기 알코올은 탄소수 2 - 6개의 알코올이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 에탄올, 이소프로판올, 아세톤을 사용할 수 있다. 상기 수용액에 첨가되는 유기용매의 양은 수용액 대비 0.1 - 10배(v/v)의 범위 내에서 적합한 양을 선택하여 첨가할 수 있다. 바람직하게는 유기용매는 수용액 대비 1.5 - 9배(v/v)의 양으로 첨가하며, 가장 바람직하게는 9배(v/v)의 양으로 첨가한다. 상기 이노시톨 침전물은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전물이지만, 마이오-이노시톨이 더 큰 침전율을 나타내므로, D-카이로-이노시톨 보다는 마이오-이노시톨이 더욱 많은 양으로 포함되어 있다.
단계 (h): 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계
상기 단계 (g)를 통해 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리한다. 이노시톨 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 또는 원심분리 방법을 사용하며, 바람직하게는 여과방법을 사용하여 행한다. 이노시톨 침전물에는 마이오-이노시톨이 다량 포함되어 있으므로 상층액에는 D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다.
단계 (i): 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계
상기 단계 (h)에서 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는다. 상기 상층액의 건조는 상층액을 가열하면서 행할 수 있으며, 또는 진공상태에서 행할 수 있다. 상층액을 건조시켜 얻은 이노시톨 건조물에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합되어 있으나, D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 단계 (e) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다: (f)′상기 단계 (c)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하고 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계; (g)′상기 수용액에서 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (h)′상기 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
단계 (f)′: 상기 단계 (e)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하고 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계
상기 단계 (e)에서 얻은 이노시톨의 분말을 물에 용해시켜 이노시톨이 용해된 수용액을 제조한다. 상기 물은 바람직하게는 증류수이다. 바람직하게는 상기 이노시톨 분말은 물에 20％(w/v) 초과의 고농도로 용해시키고, 보다 바람직하게는 20％(w/v) 초과 80％(w/v) 이하의 농도로 용해시키며, 보다 더 바람직하게는 30％(w/v) 이상 70％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 물에 대한 마이오-이노시톨의 용해도는 최대 약 15％이며, D-카이로-이노시톨의 용해도는 최대 약 55％이므로, 상기 단계 (e)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 70％의 고농도로 용해시키는 경우 마이오-이노시톨은 최대 15％ 농도로 용해될 것이며, 나머지 용해되지 않은 마이오-이노시톨은 침전물로 생성된다. D-카이로-이노시톨은 최대 55％의 용해도이므로 분말에 존재하는 모든 D-카이로-이노시톨이 물에 용해된다.
단계 (g)′: 상기 수용액에서 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계
상기 단계 (f)′에서 생성된 이노시톨의 침전물로부터 상층액을 분리한다. 이노시톨 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 또는 원심분리 방법을 사용하며, 바람직하게는 여과방법을 사용하여 행한다. 이노시톨 침전물에는 대부분이 마이오-이노시톨이 포함되어 있을 것이며, 상층액에는 D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다.
단계 (h)′: 상기 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
상기 단계 (g)′에서 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는다. 상기 상층액의 건조는 상층액을 가열하면서 행할 수 있으며, 또는 진공상태에서 행할 수 있다. 상층액을 건조시켜 얻은 이노시톨 건조물에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합되어 있으나, D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다. 하기 구체적인 일 실시예에 의하면, 상기 단계 (g)′에서 이노시톨 분말을 물에 약 70％(w/v)의 고농도로 용해시킨 경우 건조된 분말에서의 D-카이로-이노시톨의 순도는 약 73％가 될 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제, 또는 이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제와의 융합 단백질; 및 (b) 조효소로서 NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide)를 유효성분으로 포함하는 마이오-이노시 톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하기 위한 용도의 효소 반응 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 조성물은 (c) 기질로서 마이오-이노시톨을 더 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 조성물은 Tris-HCl, MgSO4, 및 MnSO4를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 조성물에서 상기 이노시톨 디하이드로게나아제는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 유래 효소이다. 보다 바람직하게는 상기 이노시톨 디하이드로게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 조성물에서 상기 이노소스 이소머라아제는 판토에아 아나나티스(P. ananatis) 유래 효소이다. 보다 바람직하게는 이노소스 이소머라아제는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 융합 단백질은 이노시톨 디하이드로게나아제의 C-말단과 이노소스 이소머라아제의 N-말단을 연결한 형태이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
(ⅰ) 본 발명의 방법은 기질인 마이오-이노시톨을 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제, 이들의 융합 단백질 형태의 효소의 존재하에 반응 완충액내에서 반응시켜 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법에 관한 것이다.
(ⅱ) 본 발명은 반응이 완료된 효소 반응 완충액에 유기용매를 첨가하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 분리하여 고순도로 정제하는 단계를 포함한다.
(ⅲ) 본 발명의 방법은 효소 반응 완충액내에서 반응에 의해 D-카이로-이노시톨을 생산하므로 재조합 세포를 이용한 발효 방법과 비교하여 저비용이며 고수율로 D-카이로-이노시톨을 생산할 수 있다.
(ⅳ) 본 발명의 방법은 유기용매의 첨가, 상층액 분리 및 건조와 같은 간단한 공정을 통해 저비용으로 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합된 반응 완충액으로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 분리할 수 있다.
(ⅴ) 본 발명의 방법에 의하면 D-카이로-이노시톨로부터 분리된 마이오-이노시톨은 기질로서 재사용이 가능하다.
본 발명의 방법에 의하면 세포외 효소 반응 완충액내에서의 D-카이로-이노시톨을 생산하므로 재조합 세포를 이용한 발효 방법과 비교하여 저비용 및 고수율로 D-카이로-이노시톨을 생산할 수 있다. 또한, 유기용매의 첨가, 상층액 분리 및 건조와 같은 간단한 공정을 통해 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합된 반응 완충액으로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 분리할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면 D-카이로-이노시톨로부터 분리된 마이오-이노시톨은 기질로서 재사용이 가능한 이점이 있다.
도 1은 입체이성질체인 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 구조를 보여준다.
도 2는 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제 또는 이노소스 이소머라아제 유전자를 함유한 재조합 플라스미드인 pET15b-CP (N-말단 His-Tag), pET15b-PI (N-말단 His-Tag), pET21b-CP (C-말단 His-Tag), pET21b-PI (C-말단 His-Tag)가 도입된 대장균주의 단백질 발현 양상을 확인한 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨 및 그 입체 이성질체 또는 유도체에 관한 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 4는 N-말단과 C-말단에 His-Tag을 적용한 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제를 이용한 효소반응의 결과이다. 흰색막대는 마이오-이노시톨을 나타내며, 검은색 막대는 D-카이로-이노시톨을 나타낸다.
도 5는 C-말단에 His-Tag을 적용한 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제(Cgiep)와 이노소스 이소머라아제(PaiolI)를 SDS-PAGE로 정제한 결과이다.
도 6은 정제된 효소 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산한 결과를 보여준다. 기질로서 5％(w/v) 마이오-이노시톨을 첨가하였으며, 마이오-이노시톨과 생산된 D-카이로-이노시톨의 비율(전환율)을 나타내었다. 50 g/L (5％(w/v)) 마이오-이노시톨에 대한 D-카이로-이노시톨의 반응평형 농도는 존재하는 마이오-이노시톨의 약 14％ 수준, 즉, 7 g/L 이다.
도 7은 마이오-이노시톨 농도에 따른 D-카이로-이노시톨 생산 결과이다. 패널 A는 시간에 따른 마이오-이노시톨의 농도별 D-카이로-이노시톨의 생산량이며, 패널 B는 시간에 따른 마이오-이노시톨의 농도별 D-카이로-이노시톨의 전환율이다. 첨가한 마이오-이노시톨의 농도는 ■: 0％, ○: 5％, ▲: 10％, ▽: 15％, ◆: 20％ 이다.
도 8은 조효소인 NAD 농도에 따른 D-카이로-이노시톨의 생산 결과이다. 패널 A는 시간에 따른 NAD 농도별 D-카이로-이노시톨의 전환율 측정 결과이다. NAD의 농도는 ■: 0 mM, ○: 0.1 mM, ▲: 0.2 mM, ▽: 0.5 mM, ◆: 0.7 mM, ◁: 1 mM, ▶: 1.5 mM, : 2 mM 이다. 패널 B는 NAD 농도에 따른 초기반응속도의 측정 결과이다.
도 9는 효소 농도에 따른 D-카이로-이노시톨 생산 결과이다. 패널 A는 시간에 따른 효소 농도별 D-카이로-이노시톨의 전환율을 측정한 결과이다. 효소의 농도, ■: 0 mg/L, ○: 0.1 mg/L, ▲: 0.2 mg/L, ▽: 0.3 mg/L, ◆: 0.4 mg/L, ◁: 0.5 mg/L. 패널 B는 효소 농도에 따른 초기 반응속도의 측정 결과이다.
도 10은 반응온도에 따른 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨로의 전환 반응양상을 측정한 결과이다. 패널 A는 시간에 따른 반응온도별 D-카이로-이노시톨의 전환율을 측정한 결과이다. ■: 25℃, ○: 30℃, ▲: 37℃, ▽: 42℃, ◆: 47℃, ◁: 50℃ ▶: 55℃, ☆: 65℃. 패널 B는 온도에 따른 초기 반응속도를 측정한 결과이다.
도 11은 효소의 열안정성을 시험한 결과이다. 패널 A는 특정 온도에 노출한 후의 효소 반응 결과이다. ■: 4℃, : ○ 37℃, ▲: 42℃, ▽: 47℃, ◆: 50℃, ◁: 55℃. 패널 B는 노출시간에 따른 효소의 실활율을 측정한 결과이다. ■: 4℃, ○: 37℃, ▲: 42℃, ▽: 47℃, ◆: 50℃, ◁: 55℃.
도 12는 이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제의 각각 N-말단과 C-말단 또는 C-말단과 N-말단에 연결시킨 융합 단백질이 클로닝된 pCOLAD-1CPFLLPI, pCOLAD-1CPFMLPI, pCOLAD-1CPFSLPI, pCOLAD-2PIFLLCP, pCOLAD-2PIFMLCP, pCOLAD-2PIFSLCP를 이미 구축한 살모넬라 티피무리엄(S. typhimurium) 유래 마이오-이노시톨 트랜스포터를 함유하는 재조합 플라스미드 pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)(한국특허출원 제10-2012-0107278호 참조)와 함께 대장균(E. coli) BL21(DE3)에 형질전환 하여 재조합 균주를 제작하고, 이 균주를 마이오-이노시톨의 존재하에서 배양한 결과이다. 배양 시간에 균체농도와 D-카이로-이노시톨의 생산량을 측정하였다.
도 13은 각각의 N-말단과 C-말단에 His-tag을 적용한 3종의 융합 단백질 효소에 대한 발현(좌측) 및 정제결과(우측)를 보여준다.
도 14는 각각의 N-말단과 C-말단에 His-tag을 적용한 3 종의 융합효소 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터를 마이오-이노시톨 트랜스포터를 포함하는 벡터 pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)와 함께 대장균 BL21(DE3)도입하여 D-카이로-이노시톨의 생산성을 측정한 결과이다. ■: pET21b-CPFLLPI, ○: pET21b-CPFMLPI, ▲: pET21b-CPFSLPI, ▽: pET15b-CPFLLPI, ◆: pET15b-CPFMLPI, ◁: pET15b-CPFSLPI.
도 15는 융합 단백질 효소 CPFMLPI의 반응온도에 따른 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨로의 전환 반응양상을 측정한 결과이다. 패널 A는 시간에 따른 반응온도별 D-카이로-이노시톨의 전환율을 측정한 결과이다. ■: 25℃, ○: 30℃, ▲: 37℃, ▽: 42℃, ◆: 47℃, ◁: 50℃, ▶: 55℃, ☆: 65℃. 패널 B는 온도에 따른 초기 반응속도를 측정한 결과이다.
도 16은 융합효소 CPFMLPI의 열안정성을 시험한 결과이다. 패널 A는 특정 온도에 노출한 후의 효소 반응 결과이다. ■: 4℃, ○: 37℃, ▲: 42℃, ▽: 47℃, ◆: 50℃, ◁: 55℃, ▶: 65℃. 패널 B는 노출시간에 따른 효소의 실활율을 측정한 결과이다. ■: 4℃, ○: 37℃, ▲: 42℃, ▽: 47℃, ◆: 50℃, ◁: 55℃, ▶: 65℃.
도 17은 25℃ 증류수에서 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도를 보여준다. ■: 마이오-이노시톨의 용해도, ○: D-카이로-이노시톨의 용해도.
도 18은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 용해되어 있는 효소반응 완충액에 에탄올을 첨가하여 이노시톨을 침전시킨 후 상층액내 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 농도를 측정한 결과이다. ■: 마이오-이노시톨의 농도, ○:카이로-이노시톨의 농도.
도 19는 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 용해되어 있는 효소 반응 완충액에 에탄올을 첨가한 경우 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전율을 나타낸다. ■: 마이오-이노시톨의 침전율, ○: 카이로-이노시톨의 침전율.
도 20은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 용해되어 있는 효소반응완충액에 에탄올을 첨가하여 이노시톨을 침전시킨 후 얻은 상층액을 건조하여 얻은 이노시톨 분말 중의 D-카이로-이노시톨의 순도를 측정한 결과를 보여준다.
도 21은 1차 에탄올을 첨가하여 얻은 상층액의 건조 분말(마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말)을 물에 다시 용해한 경우의 각 이노시톨의 용해 특성을 보여준다. 패널 A는 수용액의 상층액중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 농도를 보여준다. 패널 B는 수용액의 상층액중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 용해도를 보여준다. 패널 C는 수용액의 상층액중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전율을 보여준다. 패널 D는 수용액의 상층액 중의 D-카이로-이노시톨의 순도를 보여준다. ■: 마이오-이노시톨, ○: D-카이로-이노시톨.
도 22는 1차 에탄올을 첨가하여 얻은 상층액의 건조 분말(마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말)을 약 12％ 함유하는 수용액에 다양한 양의 에탄올을 첨가한 경우의 침전 및 정제 특성을 측정한 결과이다. 패널 A는 상층액 중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 농도를 측정한 결과이다. 패널 B는 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전율을 측정한 결과이다. 패널 C는 상층액내의 D-카이로-이노시톨의 순도를 나타낸 결과이다. ■: 마이오-이노시톨, ○: D-카이로-이노시톨.
도 23은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 약 13:2의 중량비율로 용해된 효소반응 완충용액에 다양한 유기용매를 첨가한 경우에 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전 특성을 측정한 결과이다. 패널 A는 에탄올, 이소프로판올 및 아세톤을 첨가한 경우의 침전특성이다. 여기에서 흰색 막대는 마이오-이노시톨의 농도를, 회색 막대는 D-카이로-이노시톨의 농도를 나타낸다. 패널 B는 에탄올에 대한 이소프로판올 및 아세톤의 상대적인 침전 특성을 보여준다. 여기에서 흰색 막대는 D-카이로-이노시톨이고, 회색 막대는 마이오-이노시톨을 나타낸다.
도 2는 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제 또는 이노소스 이소머라아제 유전자를 함유한 재조합 플라스미드인 pET15b-CP (N-말단 His-Tag), pET15b-PI (N-말단 His-Tag), pET21b-CP (C-말단 His-Tag), pET21b-PI (C-말단 His-Tag)가 도입된 대장균주의 단백질 발현 양상을 확인한 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨 및 그 입체 이성질체 또는 유도체에 관한 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 4는 N-말단과 C-말단에 His-Tag을 적용한 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제를 이용한 효소반응의 결과이다. 흰색막대는 마이오-이노시톨을 나타내며, 검은색 막대는 D-카이로-이노시톨을 나타낸다.
도 5는 C-말단에 His-Tag을 적용한 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제(Cgiep)와 이노소스 이소머라아제(PaiolI)를 SDS-PAGE로 정제한 결과이다.
도 6은 정제된 효소 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산한 결과를 보여준다. 기질로서 5％(w/v) 마이오-이노시톨을 첨가하였으며, 마이오-이노시톨과 생산된 D-카이로-이노시톨의 비율(전환율)을 나타내었다. 50 g/L (5％(w/v)) 마이오-이노시톨에 대한 D-카이로-이노시톨의 반응평형 농도는 존재하는 마이오-이노시톨의 약 14％ 수준, 즉, 7 g/L 이다.
도 7은 마이오-이노시톨 농도에 따른 D-카이로-이노시톨 생산 결과이다. 패널 A는 시간에 따른 마이오-이노시톨의 농도별 D-카이로-이노시톨의 생산량이며, 패널 B는 시간에 따른 마이오-이노시톨의 농도별 D-카이로-이노시톨의 전환율이다. 첨가한 마이오-이노시톨의 농도는 ■: 0％, ○: 5％, ▲: 10％, ▽: 15％, ◆: 20％ 이다.
도 8은 조효소인 NAD 농도에 따른 D-카이로-이노시톨의 생산 결과이다. 패널 A는 시간에 따른 NAD 농도별 D-카이로-이노시톨의 전환율 측정 결과이다. NAD의 농도는 ■: 0 mM, ○: 0.1 mM, ▲: 0.2 mM, ▽: 0.5 mM, ◆: 0.7 mM, ◁: 1 mM, ▶: 1.5 mM, : 2 mM 이다. 패널 B는 NAD 농도에 따른 초기반응속도의 측정 결과이다.
도 9는 효소 농도에 따른 D-카이로-이노시톨 생산 결과이다. 패널 A는 시간에 따른 효소 농도별 D-카이로-이노시톨의 전환율을 측정한 결과이다. 효소의 농도, ■: 0 mg/L, ○: 0.1 mg/L, ▲: 0.2 mg/L, ▽: 0.3 mg/L, ◆: 0.4 mg/L, ◁: 0.5 mg/L. 패널 B는 효소 농도에 따른 초기 반응속도의 측정 결과이다.
도 10은 반응온도에 따른 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨로의 전환 반응양상을 측정한 결과이다. 패널 A는 시간에 따른 반응온도별 D-카이로-이노시톨의 전환율을 측정한 결과이다. ■: 25℃, ○: 30℃, ▲: 37℃, ▽: 42℃, ◆: 47℃, ◁: 50℃ ▶: 55℃, ☆: 65℃. 패널 B는 온도에 따른 초기 반응속도를 측정한 결과이다.
도 11은 효소의 열안정성을 시험한 결과이다. 패널 A는 특정 온도에 노출한 후의 효소 반응 결과이다. ■: 4℃, : ○ 37℃, ▲: 42℃, ▽: 47℃, ◆: 50℃, ◁: 55℃. 패널 B는 노출시간에 따른 효소의 실활율을 측정한 결과이다. ■: 4℃, ○: 37℃, ▲: 42℃, ▽: 47℃, ◆: 50℃, ◁: 55℃.
도 12는 이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제의 각각 N-말단과 C-말단 또는 C-말단과 N-말단에 연결시킨 융합 단백질이 클로닝된 pCOLAD-1CPFLLPI, pCOLAD-1CPFMLPI, pCOLAD-1CPFSLPI, pCOLAD-2PIFLLCP, pCOLAD-2PIFMLCP, pCOLAD-2PIFSLCP를 이미 구축한 살모넬라 티피무리엄(S. typhimurium) 유래 마이오-이노시톨 트랜스포터를 함유하는 재조합 플라스미드 pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)(한국특허출원 제10-2012-0107278호 참조)와 함께 대장균(E. coli) BL21(DE3)에 형질전환 하여 재조합 균주를 제작하고, 이 균주를 마이오-이노시톨의 존재하에서 배양한 결과이다. 배양 시간에 균체농도와 D-카이로-이노시톨의 생산량을 측정하였다.
도 13은 각각의 N-말단과 C-말단에 His-tag을 적용한 3종의 융합 단백질 효소에 대한 발현(좌측) 및 정제결과(우측)를 보여준다.
도 14는 각각의 N-말단과 C-말단에 His-tag을 적용한 3 종의 융합효소 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터를 마이오-이노시톨 트랜스포터를 포함하는 벡터 pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)와 함께 대장균 BL21(DE3)도입하여 D-카이로-이노시톨의 생산성을 측정한 결과이다. ■: pET21b-CPFLLPI, ○: pET21b-CPFMLPI, ▲: pET21b-CPFSLPI, ▽: pET15b-CPFLLPI, ◆: pET15b-CPFMLPI, ◁: pET15b-CPFSLPI.
도 15는 융합 단백질 효소 CPFMLPI의 반응온도에 따른 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨로의 전환 반응양상을 측정한 결과이다. 패널 A는 시간에 따른 반응온도별 D-카이로-이노시톨의 전환율을 측정한 결과이다. ■: 25℃, ○: 30℃, ▲: 37℃, ▽: 42℃, ◆: 47℃, ◁: 50℃, ▶: 55℃, ☆: 65℃. 패널 B는 온도에 따른 초기 반응속도를 측정한 결과이다.
도 16은 융합효소 CPFMLPI의 열안정성을 시험한 결과이다. 패널 A는 특정 온도에 노출한 후의 효소 반응 결과이다. ■: 4℃, ○: 37℃, ▲: 42℃, ▽: 47℃, ◆: 50℃, ◁: 55℃, ▶: 65℃. 패널 B는 노출시간에 따른 효소의 실활율을 측정한 결과이다. ■: 4℃, ○: 37℃, ▲: 42℃, ▽: 47℃, ◆: 50℃, ◁: 55℃, ▶: 65℃.
도 17은 25℃ 증류수에서 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도를 보여준다. ■: 마이오-이노시톨의 용해도, ○: D-카이로-이노시톨의 용해도.
도 18은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 용해되어 있는 효소반응 완충액에 에탄올을 첨가하여 이노시톨을 침전시킨 후 상층액내 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 농도를 측정한 결과이다. ■: 마이오-이노시톨의 농도, ○:카이로-이노시톨의 농도.
도 19는 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 용해되어 있는 효소 반응 완충액에 에탄올을 첨가한 경우 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전율을 나타낸다. ■: 마이오-이노시톨의 침전율, ○: 카이로-이노시톨의 침전율.
도 20은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 용해되어 있는 효소반응완충액에 에탄올을 첨가하여 이노시톨을 침전시킨 후 얻은 상층액을 건조하여 얻은 이노시톨 분말 중의 D-카이로-이노시톨의 순도를 측정한 결과를 보여준다.
도 21은 1차 에탄올을 첨가하여 얻은 상층액의 건조 분말(마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말)을 물에 다시 용해한 경우의 각 이노시톨의 용해 특성을 보여준다. 패널 A는 수용액의 상층액중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 농도를 보여준다. 패널 B는 수용액의 상층액중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 용해도를 보여준다. 패널 C는 수용액의 상층액중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전율을 보여준다. 패널 D는 수용액의 상층액 중의 D-카이로-이노시톨의 순도를 보여준다. ■: 마이오-이노시톨, ○: D-카이로-이노시톨.
도 22는 1차 에탄올을 첨가하여 얻은 상층액의 건조 분말(마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말)을 약 12％ 함유하는 수용액에 다양한 양의 에탄올을 첨가한 경우의 침전 및 정제 특성을 측정한 결과이다. 패널 A는 상층액 중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 농도를 측정한 결과이다. 패널 B는 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전율을 측정한 결과이다. 패널 C는 상층액내의 D-카이로-이노시톨의 순도를 나타낸 결과이다. ■: 마이오-이노시톨, ○: D-카이로-이노시톨.
도 23은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 약 13:2의 중량비율로 용해된 효소반응 완충용액에 다양한 유기용매를 첨가한 경우에 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전 특성을 측정한 결과이다. 패널 A는 에탄올, 이소프로판올 및 아세톤을 첨가한 경우의 침전특성이다. 여기에서 흰색 막대는 마이오-이노시톨의 농도를, 회색 막대는 D-카이로-이노시톨의 농도를 나타낸다. 패널 B는 에탄올에 대한 이소프로판올 및 아세톤의 상대적인 침전 특성을 보여준다. 여기에서 흰색 막대는 D-카이로-이노시톨이고, 회색 막대는 마이오-이노시톨을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제 유전자의 클로닝 하기 반응식 1 내지 반응식 3의 연속적 반응을 통해 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하기 위해, 반응식 1 및 반응식 3의 반응을 촉매하는 이노시톨 디하이드로게나아제(inositol dehydrogenase) 유전자 iolG를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터, 반응식 2를 촉매하는 이노소스 이소머라아제(inosose isomerase) 유전자 iolI를 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로부터 증폭하였다.
[반응식 1]
마이오-이노시톨 + NAD+ ↔ 2-케토-마이오-이노시톨 + NADH + H+
[반응식 2]
2-케토-마이오-이노시톨 ↔ 1-케토-D-카이로-이노시톨
[반응식 3]
1-케토-D-카이로-이노시톨 + NADH + H+ ↔ D-카이로-이노시톨 + NAD+
증폭된 유전자를 T7 프로모터와 His-Tag을 갖는 플라스미드 벡터인 pET-15b(Novogen)와 pET-21b(Novogen)에 삽입하여 해당 단백질 발현을 위한 재조합 플라스미드를 제작하였다. pET-15b는 N-말단에 His-tag이 융합된 단백질로 발현시키기 위한 벡터이며, pET-21b는 C-말단에 His-tag이 융합된 단백질을 발현시키기 위한 플라스미드 벡터이다. 이노시톨 디하이드로게나아제는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)의 iolG 상동유전자인 Cgiep (NCgl2957 또는 GI:19554252)를 이용하였으며, 이노소스 이소머라아제는 판토에아 아나나티스(P. ananatis)의 iolI인 PaiolI (PANA_3268, GI:291618821)를 클로닝하였다. 보다 상세히 설명하면, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032 (taxid:196627; GenBank NID:NC_003450)의 지놈 DNA로부터 ETCP-F와 ETCP-R 프라이머를 이용하여 Cgiep를 증폭한 후 NdeI과 BamHI으로 절단하여 pET-15b의 동일부위로 삽입하여 pET15b-CP를 제작하였다. 상기 증폭한 Cgiep 유전자는 또한 NdeI과 HindIII로 절단하여 pET-21b의 동일부위로 삽입하여 pET21b-CP를 제작하였다.
이노소스 이소머라아제의 경우 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) LMG 20103 (taxid:706191, GenBank NID:CP001875)의 지놈 DNA로부터 ETPI-F와 ETPI-R 프라이머를 이용하여 PaiolI를 증폭한 후 NdeI과 BamHI으로 절단하여 동일 효소로 절단한 pET-15b에 삽입하여 pET15b-PI를 제작하였고, 또한 증폭한 PaiolI를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단하여 pET-21b의 동일 부위에 삽입하여 pET21b-PI를 제작하였다. 이상의 유전자, 프라이머, 재조합 플라스미드의 서열은 표 1에 나타내었다.
실시예
2: 이노시톨
디하이드로게나아제와
이노소스
이소머라아제
효소의 발현 확인 및 정제
실시예 1에서 구축한 재조합 플라스미드 pET15b-CP, pET21b-CP, pET15b-PI, pET21b-PI는 대장균 BL21(DE3)star (Invitrogen)에 도입하여 재조합 균주를 제조하였다. 각각의 재조합 균주는 100 mg/L 농도의 암피실린을 함유한 LB 배지에 접종하고 37℃에서 OD 3 까지 종배양하였다. 이를 100 mg/L 농도의 암피실린을 함유한 LB 배지 50 mL이 들어있는 300 mL의 홈이 파인(baffled) 삼각플라스크에 초기 OD 0.1로 접종하고 37℃에서 OD 0.6까지 배양한 후 1 mM IPTG를 첨가하여 37℃에서 약 6시간 동안 배양하였다. 배양한 재조합 균주의 단백질 발현을 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다. 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제에 각각 N-말단 His-Tag과 C-말단 His-Tag을 적용한 pET15b-CP, pET21b-CP, pET15b-PI, pET21b-PI 플라스미드에 대하여 모두 발현이 정상적으로 이루어지는 것을 확인하였다.
단백질 정제는 니켈이 충진된 레진을 사용하여 당업계에게 공지된 방법을 통해 행하였다. 보다 상세히 설명하면, 배양액 50 mL을 원심분리하여 균체를 얻은 후 8 mL의 바인딩 버퍼 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 8.0)에 재현탁하였다. 재현탁액에 10 mg의 리소자임을 첨가하고 얼음에서 30분 방치한 후 초음파 파쇄기 (10초 파쇄, 10초 냉각으로 3회) 파쇄하였다. 파쇄한 현탁액은 즉시 액체 질소에 넣어 급속 냉각 시킨 후 37℃ 항온 수조에서 즉시 해동하였다. 이상의 파쇄-냉각-해동을 3회 반복하여 점도가 높은 균체 파쇄액을 얻었으며, 이를 18게이지 주사기에 약 5-10회 통과시켜 점도를 낮추었다. 균체 파쇄액을 원심분리한 후 상층액을 니켈 충진 칼럼에 적용하였다. 바인딩 버퍼로 평형시킨 니켈 충진 칼럼에 상기에서 얻은 균체 파쇄 상층액을 넣고 약 1 시간 동안 냉장 상태에서 천천히 진탕하였다. 진탕후 가볍게 원심분리하여 상층액을 제거 후 세척버퍼 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0)로 4회 세척하였고, 최종 4 mL의 용출버퍼 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)를 이용하여 2회 용출하였다. 효소 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제인 Cgiep는 분자량 36,222.73이며, 1 ㎍ 당 27.607 pM이며, 이노소스 이소머라아제인 PaiolI는 분자량 30,417.05이며, 1 ㎍ 당 32.876 pM이다.
실시예
3: 정제된 효소의 반응 측정 및 재조합 플라스미드의 선별
N-말단 His-Tag과 C-말단 His-Tag을 각각 적용한 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제의 활성을 확인하기 위하여 효소 반응을 실시하였다. 효소반응 조건은 다음과 같다. 반응은 총 200 ㎕ 부피로 수행하였으며, 반응액은 50 mM Tris-HCl (pH8.0), 1 mM MgSO4, 0.1 mM MnSO4, 0.5 mM NAD, 5%(w/v) (278 mM) 마이오-이노시톨, 0.25 mg/mL (6.5 nM) 이노시톨 디하이드로게나아제(Cgiep), 0.25 mg/mL (7.7 nM) 이노소스 이소머라아제(PaiolI)가 되도록 제조하였다. 따라서 효소 혼합물의 농도는 약 0.5 mg/mL이며 이는 약 14.2 nM 이었다. 반응액을 37℃에서 약 15 시간 반응시켰으며, 반응 종료 후 10분간 끓여서 반응을 정지시켰다. 반응 정지된 반응액을 원심분리하여 물로 5배 희석한 뒤 HPLC로 분석하였다. 전처리한 반응액을 HPLC(Shimadzu LC10Avp)에 적용하여 분석하였으며, 분석조건은 Kromasil 5NH2 칼럼(4.6 mm X 250 mm), 이동상 75％ 아세토니트릴, 칼럼 온도 40℃, RI 검출기를 이용하였다. 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨을 포함하여 이들의 각각의 이성질체에 대한 HPLC 크로마토그램은 도 3에 나타내었다. 반응 결과 반응액내에서 측정된 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 양은 도 4에 나타내었다. N-말단 His-Tag을 적용한 경우 약 5％의 D-카이로-이노시톨이 생산되었고, C-말단 His-Tag을 적용한 경우 약 9％의 D-카이로-이노시톨이 생산되어 C-말단에 His-Tag을 적용한 경우가 효소 전환율이 우수하였다. 따라서, C-말단에 His-Tag을 적용한 pET21b-CP 및 pET21b-PI를 이용하여 이후 효소반응을 진행하였다.
상기에서 확인한 pET21b-CP 및 pET21b-PI를 도입한 대장균으로부터 정제된 효소인 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 SDS-PAGE 행하여 분석한 결과는 도 5에 나타내었다. 각각의 단백질 농도는 Cgiep의 경우 0.86 mg/mL (약 22.8 nM) 이었으며, PaiolI의 경우 0.64 mg/mL(약 20.32 nM) 이었다.
상기 방법으로 정제한 두 효소를 이용하여 약 24 시간 동안 반응하면서 시간별로 반응 결과를 확인하였다. 반응 조건은 상기와 같으며, 반응시킨 결과는 도 6에 나타내었다. 기질인 마이오-이노시톨은 반응 시작 후 급격히 D-카이로-이노시톨로 전환되었으며, 약 5 시간 후 점차 반응속도가 낮아지기 시작하면서 약 10 시간에 반응평형농도인 약 14％에 도달하였다. 이후에도 반응 산물인 D-카이로-이노시톨의 농도는 크게 증가하지 않았다.
실시예
4 : 기질인 마이오-이노시톨의 농도에 따른 D-카이로-이노시톨의 생산성
실시예 3에서 설명되었듯이, 본 발명에서 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨로의 반응은 물리 화학적 반응평형이 관여하는 반응이므로, D-카이로-이노시톨의 생산량은 전적으로 기질인 마이오-이노시톨의 양에 의존하게 된다. 따라서 기질인 마이오-이노시톨의 농도에 따른 반응 속도를 시험하였다. 이를 위하여 표준 반응조건에서 마이오-이노시톨의 최대 용해도를 조사하였으며, 37℃에서 최대 약 20％(w/v)인 것으로 나타났다. 이를 토대로 5％에서 20％까지 마이오-이노시톨의 농도를 달리하여 효소반응을 수행하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다. 기질인 마이오-이노시톨의 농도가 증가하여도 반응속도는 감소하지 않는 것을 확인하였으나(도 7의 패널 A), 기질 농도가 높으면 반응 평형에 도달하는 시간이 그만큼 지연되는 것으로 나타났다. 마이오-이노시톨의 농도가 5％일 경우 약 10 시간에 반응 평형에 도달한 반면, 20％ 마이오-이노시톨을 첨가하였을 경우 약 반응 평형 도달에는 24 시간이 소요되는 것으로 나타났다.
실시예
5: 조효소
NAD
의 농도에 따른 D-카이로-이노시톨 생산성
마이오-이노시톨 디하이드로게나아제의 반응에 필요한 조효소인 NAD의 농도에 따른 D-카이로-이노시톨의 생산성을 조사하였다. 기질인 마이오-이노시톨은 10％로 첨가하였고, 효소는 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제를 각각 250 ㎍/mL 농도(혼합효소로서 14.2 nM)로 첨가하였다. 조효소인 NAD의 농도는 0.1 mM에서 2 mM 까지 다양한 농도로 첨가하여 D-카이로-이노시톨의 생산속도를 확인하였다. 반응결과는 도 8에 나타내었다. 일정 수준까지는 NAD 농도가 증가할수록 초기반응속도가 급격히 증가하다가, 약 0.5 mM의 농도 이상에서는 크게 증가하지 않았다. 도 8의 패널 B에 의해 당 효소 혼합체는 전형적인 NAD 의존형 효소의 상태를 보여주는 것이며, NAD의 최적 농도는 기질 농도인 10％ (555 mM) 당 0.5 mM 일 것으로 사료된다.
실시예
6: 첨가한 효소의 농도에 따른 D-카이로-이노시톨 생산성
마이오-이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제의 첨가 농도에 따른 D-카이로-이노시톨의 생산성을 조사하였다. 기질인 마이오-이노시톨은 10％로 하였고, NAD는 1 mM로 첨가하였다. 혼합 효소 농도는 100 ㎍/mL (약 5.7 nM)에서 500 ㎍/mL(약 28.4 nM)까지 100 ㎍/mL 단위로 첨가하여 효소 농도에 따른 D-카이로-이노시톨 생산속도를 확인하였다. 반응결과는 도 9에 나타내었다. 효소의 농도가 높을수록 반응 속도가 증가하는 것으로 나타났으며(도 9의 패널 A), 이는 일반적으로 기질의 농도가 충분할 경우 반응 속도는 효소의 농도에 비례한다는 반응 속도론에 준하는 결과이다(도 9의 패널 B).
실시예
7: 반응온도에 따른 D-카이로-이노시톨 생산성 조사
효소 반응온도에 따른 D-카이로-이노시톨 생산성을 조사하였다. 효소는 각각 250 ㎍/mL, 조효소는 1 mM로 투여하였으며, 기질인 마이오-이노시톨은 10％로 하였다. 반응온도 25℃, 30℃, 37℃, 42℃, 47℃, 50℃, 55℃, 65℃에서 반응하면서 D-카이로-이노시톨의 생산성을 확인하였다. 결과는 도 10에 나타내었다. 55℃까지는 반응 온도가 높아질수록 반응 속도가 증가하였으며, 65℃에서는 반응 속도가 대폭 감소함을 알 수 있었다. 이는 전형적인 효소와 반응온도간의 상태방정식인 아레니우스 방정식을 따르면서 최적 반응 온도가 약 50℃임을 나타낸다. 일반적인 효소의 최적 반응 온도가 약 37℃임을 감안한다면 비교적 열에 안정한 효소 혼합체임을 알 수 있었다.
실시예
8: 마이오-이노시톨
디하이드로게나아제
및
이노소스
이소머라아제의
열안정성
마이오-이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제의 열에 대한 안정성을 확인하였다. 효소를 특정 온도에서 일정시간 방치한 후 이를 이용하여 일정시간 반응하고 D-카이로-이노시톨의 생산성 및 반응 속도를 측정하였다. 열에 노출하지 않은 효소를 이용한 반응군을 대조구로 하고, 각각 4℃, 37℃, 42℃, 47℃, 50℃, 55℃에서 2, 6, 12, 24 시간 동안 노출한 효소를 이용하여 약 7시간 반응하였으며, 결과는 도 11에 나타내었다. 약 42℃까지는 24시간 노출하여도 안정한 반응을 하는 것으로 나타났으며, 47℃에서는 12시간 이상 노출할 경우 실활율이 증가하는 것으로 나타났다. 또한 그 이상의 온도에서는 단시간 열에 노출한 경우에도 그 실활율이 급격히 증가하는 것으로 나타났다. 실시예 7에서 보았듯이 본 발명의 효소 혼합체는 일반적인 효소에 비해 열에 대해 비교적 안정한 것으로 보인다.
실시예
9: 이노시톨
디하이드로게나아제와
이노소스
이소머라아제의
융합 단백질의 발현을 위한 재조합 벡터의 제조
본 실시예에서는 글리신과 세린으로 구성되어 있는 유연성 있는 링커를 사용하여 두 효소 이노시톨-디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제를 연결하였다. 각 효소 서로 간에 가장 영향을 덜 주는 조건을 찾기 위하여 링커의 길이를 달리하였으며, 역시 같은 이유로 두 효소 각각의 N-말단과 C-말단을 연결하는 링커를 제작하였다. 링커의 경우 바이오부품등록센터(Registry of Standard Biological Parts; http://partsregistry.org)로 부터 글리신과 세린으로 이루어진 각각 다른길이의 유연성있는 링커 3종의 서열을 참고 하였다(표 2 참조).
우선, Cgiep의 C-말단과 PaiolI의 N-말단을 각각 다른 길이의 링커로 연결한 융합 단백질 발현용 재조합 플라스미드 3종을 제작하였다.
상세히 설명하면, 긴 길이의 링커로 연결한 융합 단백질 발현을 위하여 프라이머 CPFLL-F와 CPFLL-R를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC 13032 (taxid:196627; GenBank NID:NC_003450)의 지놈 DNA로부터 Cgiep 유전자를 증폭하였고, 이 Cgiep를 포함하는 PCR 산물과 CPFLLPI-R 프라이머를 이용하여 판토에아 아나나티스(P. ananatis) LMG 20103 (taxid:706191, GenBank NID:CP001875)의 지놈 DNA로부터 PaiolI를 증폭하여 Cgiep와 PaiolI가 긴 링커로 융합된 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 제한효소 BspHI과 SalI으로 절단하고 NcoI과 SalI으로 절단한 pCOLADuet-1(Novogen)으로 삽입하여 pCOLAD-1CPFLLPI를 제작 하였다.
중간 길이의 링커를 가진 융합단백질 발현을 위하여 프라이머 CPFLL-F와 CPFML-R을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC 13032 (taxid:196627; GenBank NID:NC_003450)의 지놈 DNA로부터 Cgiep 유전자를 증폭하였고, 이 Cgiep를 포함하는 PCR 산물과 CPFLLPI-R 프라이머를 이용하여 판토에아 아나나티스(P. ananatis) LMG 20103 (taxid:706191, GenBank NID:CP001875)의 지놈 DNA로부터 PaiolI를 증폭하여 Cgiep와 PaiolI가 중간길이의 링커로 융합된 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 제한효소 BspHI과 SalI으로 절단하고 NcoI과 SalI으로 절단한 pCOLADuet-1로 삽입하여 pCOLAD-1CPFMLPI를 제작하였다.
짧은 길이의 링커를 가진 융합단백질 발현을 위하여 프라이머 CPFLL-F와 CPFSL-R을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC 13032 (taxid:196627; GenBank NID:NC_003450)의 지놈 DNA로부터 Cgiep 유전자를 증폭하였고, 이 Cgiep를 포함하는 PCR 산물과 CPFLLPI-R 프라이머를 이용하여 판토에아 아나나티스(P. ananatis) LMG 20103 (taxid:706191, GenBank NID:CP001875)의 지놈 DNA로부터 PaiolI를 증폭하여 Cgiep와 PaiolI가 짧은 링커로 융합된 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 제한효소 BspHI과 SalI으로 절단하고 NcoI과 SalI으로 절단한 pCOLADuet-1로 삽입하여 pCOLAD-1CPFSLPI를 제작하였다.
또한, PaiolI의 C-말단과 Cgiep의 N-말단을 각각 다른 길이의 링커로 연결한 융합 단백질 발현용 재조합 플라스미드 3종을 제작하였다.
상세히 설명하면, 긴 길이의 링커로 연결한 융합 단백질 발현을 위하여 프라이머 PIFLL-F와 PIFLL-R을 이용하여 판토에아 아나나티스(P. ananatis) LMG 20103 (taxid:706191, GenBank NID:CP001875)의 지놈 DNA 로부터 PaiolI 유전자를 증폭하였고, 이 PaiolI를 포함하는 PCR 산물과 PIFLLCP-R 프라이머를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC 13032 (taxid:196627; GenBank NID:NC_003450)의 지놈 DNA로부터 Cgiep를 증폭하여 PaiolI와 Cgiep가 긴 링커로 연결된 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 제한효소 NdeI과 BglII로 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pCOLADuet-1로 삽입하여 pCOLAD-2PIFLLCP를 제작하였다. 중간 길이의 링커로 연결한 융합 단백질 발현을 위하여 프라이머 PIFLL-F와 PIFML-R을 이용하여 판토에아 아나나티스(P. ananatis) LMG 20103 (taxid:706191, GenBank NID:CP001875)의 지놈 DNA 로부터 PaiolI 유전자를 증폭하였고, 이 PaiolI를 포함하는 PCR 산물과 PIFLLCP-R 프라이머를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC 13032 (taxid:196627; GenBank NID:NC_003450)의 지놈 DNA로부터 Cgiep를 증폭하여 PaiolI와 Cgiep가 중간길이의 링커로 연결된 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 제한효소 NdeI과 BglII로 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pCOLADuet-1로 삽입하여 pCOLAD-2PIFMLCP를 제작하였다.
짧은 길이의 링커로 연결한 융합 단백질 발현을 위하여 프라이머 PIFLL-F와 PIFSL-R을 이용하여 판토에아 아나나티스(P. ananatis) LMG 20103 (taxid:706191, GenBank NID:CP001875)의 지놈 DNA로부터 PaiolI 유전자를 증폭하였고, 이 PaiolI를 포함하는 PCR 산물과 PIFLLCP-R 프라이머를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC 13032 (taxid:196627; GenBank NID:NC_003450)의 지놈 DNA 로부터 Cgiep를 증폭하여 PaiolI와 Cgiep가 짧은 링커로 연결된 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 제한효소 NdeI과 BglII로 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pCOLADuet-1로 삽입하여 pCOLAD-2PIFSLCP를 제작하였다. 상기 유전자들의 정보는 표 2에 나타내었고, 사용된 프라이머는 표 3에 나타내었다.
실시예
10: 이노시톨
디하이드로게나아제와
이노소스
이소머라아제의
융합 단백질의 발현을 통한 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨의 생산
상기 실시예 9에서 제작한 재조합 플라스미드를 대장균에 도입하여 D-카이로-이노시톨의 생산성을 확인하였다. 상세히 설명하면, pCOLAD-1CPFLLPI, pCOLAD-1CPFMLPI, pCOLAD-1CPFSLPI, pCOLAD-2PIFLLCP, pCOLAD-2PIFMLCP, pCOLAD-2PIFSLCP를 이미 구축한 살모넬라 티피무리엄(S. typhimurium) 유래 마이오-이노시톨 트랜스포터를 함유하는 재조합 플라스미드 pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)(한국특허출원 제10-2012-0107278호 참조)와 함께 대장균(E. coli) BL21(DE3)에 형질전환 하여 재조합 균주를 제작하였다. 제작한 재조합 균주는 직경 25 mm, 높이 150 mm의 유리시험관에서 5 mL 배양하였다. 배양조건은 15％(w/v) 마이오-이노시톨, 50 mg/L 클로람페니콜, 50 mg/L 카나마이신, 0.5％ 락토오스를 함유한 TB(terrific broth)배지를 이용하여, 37℃, 250 rpm의 조건에서 24 시간 동안 배양하였다. 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨 분석을 위하여 배양액을 원심분리하여 배양 상층액 1 mL을 취하고 10분간 끓인 후 다시 원심분리 하여 상층액 100 μL를 취하여 물 900 μL와 섞었다. 전처리한 배양 상층액은 HPLC(Shimadzu LC10Avp)로 분석하였으며, 분석조건은 실시예 3에서와 같다. 각 융합 단백질의 D-카이로-이노시톨 생산성을 조사한 결과는 도 12에 나타내었다. 도 12의 결과에 의하면, Cgiep의 C-말단과 PaiolI의 N-말단을 연결하였을 경우가 PiolI의 C-말단과 Cgiep의 N-말단을 연결하였을 경우보다 D-카이로-이노시톨의 생산성이 우수한 것을 알 수 있었다.
실시예
11: 이노시톨
디하이드로게나아제와
이노소스
이소머라아제의
융합효소의 His-tag 정제를 위한 재조합 플라스미드의 구축
상기의 실시예 10에서 확인된 이노시톨 디하이드로게나아제의 C-말단과 이노소스 이소머라아제의 N-말단이 결합되고 링커의 길이가 다른 3종의 유전자인 CPFLLPI, CPFMLPI, CPFSLPI의 N-말단과 C-말단에 각각 His-tag을 적용하기 위하여 플라스미드 벡터 pET15b와 pET21b에 융합효소를 코딩하는 유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드를 구축하였다. pET-15b는 N-말단에 His-tag을 적용할 수 있으며, pET-21b는 C-말단에 His-tag을 적용할 수 있는 플라스미드 벡터이다. 상세히 설명하면, 프라이머 ETCP-F1과 ETPI-R1를 이용하여 pCOLAD-1CPFLLPI 플라스미드를 주형으로 하여 CPFLLPI를 증폭한 후, NdeI과 BamHI으로 절단하여 pET-15b의 동일부위로 삽입하여 pET15b-CPFLLPI를 제작하였다. 이상에 증폭한 CPFLLPI는 또한 NdeI과 SalI으로 절단하여 pET-21b의 동일부위로 삽입하여 pET21b-CPFLLPI를 제작하였다. 또한, 유전자 CPFMLPI를 위하여 pCOLAD-CPFMLPI 플라스미드로부터 프라이머 ETCP-F1과 ETPI-R1을 이용하여 CPFMLPI를 증폭한 후 NdeI과 BamHI으로 절단하여 pET-15b의 동일부위로 삽입하여 pET15b-CPFMLPI를 제작하였다. 증폭한 CPFMLPI는 또한 NdeI과 SalI으로 절단하여 pET-21b의 동일부위로 삽입하여 pET21b-CPFMLPI를 제작하였다. 또한, 유전자 CPFSLPI를 위하여, pCOLAD-CPFSLPI 플라스미드를로부터 프라이머 ETCP-F1과 ETPI-R1을 이용하여 CPFSLPI를 증폭한 후 NdeI과 BamHI으로 절단하여 pET-15b의 동일부위로 삽입하여 pET15b-CPFSLPI를 제작하였다. 증폭한 CPFSLPI는 또한 NdeI과 SalI으로 절단하여 pET-21b의 동일부위로 삽입하여 pET21b-CPFSLPI를 제작하였다. 상기 6종의 재조합 플라스미드를 제작하는 데 사용된 프라이머와 유전자 정보는 아래 표 4에 나타내었다.
실시예
12:
His
-
tag
을 적용한 융합효소의 발현, 정제 및 활성측정
융합효소의 발현을 위하여 실시예 11에서 구축한 6종의 재조합 플라스미드인 pET15b-CPFLLPI, pET-15b-CPFMLPI, pET15b-CPFSLPI, pET21b-CPFLLPI, pET21b-CPFMLPI, pET21b-CPFSLPI를 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 재조합 대장균을 구축하였으며, 이에 대한 융합효소의 발현 및 정제는 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다. 발현 및 정제의 결과는 도 13에 나타내었다. 융합효소의 활성측정을 위한 반응은 총 200 ㎕ 부피로 수행하였으며, 반응액은 50 mM Tris-HCl (pH8.0), 1 mM MgSO4, 0.1 mM MnSO4, 0.5 mM NAD, 5%(w/v) (278 mM) 마이오-이노시톨, 0.5 mg/mL (약 7.2 nM)의 융합효소가 되도록 제조하였다. 반응액을 37℃에서 약 15 시간 반응시켰으며, 반응 종료 후 10분간 끓여서 반응을 정지시켰다. 반응 정지된 반응액을 원심분리하여 물로 5배 희석한 뒤 HPLC로 분석하였으며, HPLC 분석방법은 실시예 3에서 설명한 바와 같다. 정제된 융합 단백질 효소를 이용하여 반응시킨 결과 마이오-이노시톨이 D-카이로-이노시톨로 거의 전환되지 않았다.
실시예
13:
His
-
tag
을 적용한 융합효소의 인 비보(
in
vivo
) 활성측정
상기 실시예 10에서 활성을 나타내었던 융합효소에 His-tag을 적용한 경우 N-말단, C-말단 모두 D-카이로-이노시톨로의 전환 활성이 없었으므로, 그 이유를 확인하기 위하여 인 비보(in vivo) 실험을 수행하였다. 즉, 제조한 6 종의 재조합 플라스미드 pET15b-CPFLLPI, pET15b-CPFMLPI, pET15b-CPFSLPI, pET21b-CPFLLPI, pET21b-CPFMLPI, pET21b-CPFSLPI를 마이오-이노시톨 트랜스포터를 갖는 재조합 플라스미드 pCOLAD-StiolT1-StiolT2(F2)(한국특허출원 제10-2012-0107278호 참조)와 함께 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 재조합 균주를 구축하고 실시예 10에서와 동일한 방법으로 배양 및 분석하여 그 결과를 도 14에 나타내었다. 융합 효소를 정제하여 반응시켰을 때와는 달리 6종의 재조합 플라스미드를 균체에 도입하여 시험한 결과 모든 실험구에서 D-카이로-이노시톨이 정상적으로 생산되는 것을 확인 할 수 있었으며, 특히 pET15b-CPFMLPI이 경우 가장 빠르게 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 실시예 12에서 정제한 His-tag 융합효소를 인 비트로 반응에 사용하였을 시 D-카이로-이노시톨이 생산되지 않은 것은 His-tag을 적용한 것으로 인한 결과가 아니며, 정제과정 중에 발생한 원인에 의한 것으로 판단하였다.
실시예
14: 투석에 의해
이미다졸을
제거한
CPFMLPI
융합 효소의 반응온도에 따른 반응 양상 측정
본 발명에서 정제 과정 중에 이미다졸이 과량으로 들어가게 되어, 이미다졸이 효소의 활성에 영향을 미치는 것으로 예상하고 정제된 효소로부터 이미다졸을 제거하기 위하여 투석을 실시하였다. 투석은 실시예 13의 결과에서 가장 빠르게 D-카이로-이노시톨을 생산한 pET15b-CPFMLPI에 대하여만 실시하였다(도 14 참조). 투석은 스펙트럼사의 투석막(Spectra/Por 1 dialysis tubing, 6-8K MWCO)에 최종 용출한 효소 용액을 넣은 후 기질과 NAD를 제외한 효소반응 완충액(50 mM Tris-HCl, pH = 8.0, 1 mM MgSO4, 0.1 mM MnSO4)에 침지하여 교반하고, 효소반응 완충액을 6-8시간마다 교체하면서 약 24-48동안 실시하였다. 투석을 통해 이미다졸을 제거한 효소를 효소 반응에 이용하였으며, 반응온도에 따른 반응 속도를 측정하였다. 융합 효소는 0.5 mg/mL, 조효소는 1 mM로 투여하였으며, 기질인 마이오-이노시톨은 10％로 하였다. 반응온도 25℃, 30℃, 37℃, 42℃, 47℃, 50℃, 55℃, 65℃에서 반응하면서 D-카이로-이노시톨의 생산성을 확인하였다. 결과는 도 15에 나타내었다. 융합하지 않은 단일 효소 Cgipe와 PaiolI를 함께 사용했을 경우와 마찬가지로 55℃까지는 반응 온도가 높아질수록 반응 속도가 증가하였으며, 65℃에서는 반응 속도가 대폭 감소함을 알 수 있었다(도 15의 패널 A). 이는 전형적인 효소와 반응온도간의 상태방정식인 아레니우스 방정식을 따르면서 최적 반응 온도가 약 50℃ - 55℃임을 나타낸다(도 15의 패널 B). 단일 효소 Cgipe 및 PaiolI를 함께 사용했을 경우와 비슷한 반응속도를 보였으며, 동일 온도에서 약간 더 열에 안정한 것으로 나타났으나 큰 차이는 보이지 않았다. 결과적으로 링커를 이용하여 융합할 경우 각각의 효소를 사용하는 것과 유사한 반응 속도를 보였으므로, 효소반응법에서는 융합 효소를 이용하는 것이 효율적일 것으로 판단하였다.
실시예
15: 융합효소
CPFMLPI
의
열안정성
조사
융합효소 CPFMLPI의 열에 대한 안정성을 확인하였다. 효소를 특정 온도에서 일정시간 방치한 후 이를 이용하여 일정시간 반응하고 D-카이로-이노시톨의 생산성 및 반응 속도를 측정하였다. 열에 노출하지 않은 효소를 이용한 반응군(0시간 반응군)을 대조구로 하고, 각각 4℃, 37℃, 42℃, 47℃, 50℃, 55℃, 65℃에서 2, 6, 12, 24 시간 동안 노출한 효소를 이용하여 약 7시간 반응하였으며, 결과는 도 16에 나타내었다. 약 55℃까지는 24 시간 노출하여도 비교적 안정한 반응을 하며 실활율이 20％ 이하로 유지되는 것으로 나타났으며, 65℃에서는 노출 후 급격히 실활되는 것으로 나타났다. 이로서 융합효소 CPFMLPI는 기존 효소 Cgiep와 PaiolI를 함께 사용하는 것보다 10℃ 이상의 열에 장시간 노출해도 안정한 것으로 보인다. 즉, 이는 효소를 각각 사용할 때 보다 융합했을 경우 효소 안정성이 증가되었다는 의미이며, 이를 실제 생산시에 적용할 경우 정제된 효소의 이용효율을 높일 수 있을 것으로 예상된다. 또한 융합효소 CPFMLPI는 발현 및 정제 과정에서 기존 두 가지 효소를 따로 사용할 때 보다 시간과 비용을 절반으로 줄일 수 있으므로, 매우 효율적일 것으로 기대된다.
상기 실시예 들에서 정제된 효소의 반응 속도는 37℃, 1 mM NAD의 조건에서 첨가한 효소의 중량(500 ㎍)을 기준으로 하였을 경우 단독 효소는 54.6 mM/시간, 융합 효소는 71.2 mM/시간의 속도를 나타냈으며, 효소의 몰 농도를 기준으로 할 경우, 단독 효소는 3.7 mM/nM Enzymes/시간 이며, 융합효소를 사용하였을 경우 9.9 mM/nM Enzymes/시간으로 나타나, 단위 시간당 반응속도는 융합효소가 높은 것으로 나타났다.
실시예
16: 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도 측정
마이오-이노시톨(myo-inositol)과 D-카이로-이노시톨(D-chiro-inositol)의 용해도를 측정하였다. 먼저 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨을 상온(약 25℃)에서 1차 증류수에 각각 5％(w/v) 내지 80％(w/v)의 농도가 되도록 용해시켰다. 각 용액에서 용해되지 않고 침전된 부분을 원심분리를 통하여 분리하고 이노시톨이 완전히 용해된 상층액 부분을 취하여 각각의 농도를 HPLC로 분석하였다. 분석조건은 HPLC(Shimadzu LC10Avp)를 이용하여, Kromasil 5NH2 칼럼(4.6 mm X 250 mm), 이동상 75％ 아세토니트릴, 칼럼 온도 40℃, RI 검출기를 이용하였다. 그 결과는 도 17에 나타내었다. 마이오-이노시톨의 용해도는 25℃에서 약 15％(w/v)로 나타났으며, D-카이로-이노시톨의 경우 약 55％(w/v) 전후로 나타나, 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도 차이가 매우 큰 것으로 확인하였다.
실시예
17: 마이오-이노시톨의 분리를 위한 1차 에탄올 처리
효소 반응이 완료된 효소 반응 완충액에는 50 mM Tris-HCl (pH8.0), 1 mM MgSO4, 0.1 mM MnSO4, 0.5 mM NAD 12.9％(w/v) 마이오-이노시톨, 2.1％(w/v) D-카이로-이노시톨이 포함되어 있다. 상기 효소 반응 완충액에 에탄올을 가하여, 반응 완충액 : 에탄올의 비율이 각각 10:0, 9:1(0.11배), 8:2(0.25배), 7:3(0.43배), 6:4(0.67배), 5:5(1배), 4:6(1.5배), 3:7(2.33배), 2:8(4배), 1:9(9배)로 되도록 하여 완전히 혼합한 후 실온(약 25℃)에서 1시간 동안 진탕하였다. 이를 3,500 rpm에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 HPLC로 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 농도를 분석하였다.
농도 분석 결과는 도 18, 도 19, 및 도 20에 나타내었다. 도 18은 반응이 완료된 효소 반응 완충액에 에탄올 첨가한 후 생성된 침전물을 제거하여 얻은 상층액내에 남아있는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 농도를 나타낸 것이다. 마이오-이노시톨의 경우, 에탄올 첨가량에 따라 농도가 빠르게 감소하여, 약 1 배수의 에탄올을 첨가한 경우 마이오-이노시톨은 초기 126 g/L 농도로부터 약 99 g/L이 침전되어 약 27 g/L의 마이오-이노시톨이 남아 있는 것으로 나타났다. 이에 비해, D-카이로-이노시톨의 감소량은 매우 낮아서 약 1 배수의 에탄올을 첨가하면 초기 17 g/L의 농도에서 15 g/L으로 감소되어 약 2 g/L만이 침전되는 것으로 나타났다.
상기 도 18에 나타난 결과를 침전율로 환산하여 도 19에 나타내었다. 마이오-이노시톨의 침전율은 에탄올 첨가량에 따라 급격히 증가하였으며, 1 배수의 에탄올을 첨가하였을 때 모든 반응액 조건에서 비교적 유사하게 70-80％의 침전율을 보였고, 약 2.5 배 이상의 에탄올 첨가 조건에서는 대부분의 마이오-이노시톨이 침전되는 것을 확인하였다. 이에 반하여 D-카이로-이노시톨의 침전율은 약 1 배의 에탄올을 첨가할 때까지는 약 15％ 이하의 침전율을 보였으며, 2배 이상의 에탄올을 첨가한 경우 침전율이 비교적 크게 증가하였다.
상기 도 18 및 도 19에 나타난 실험 결과를 토대로 D-카이로-이노시톨의 순도를 계산하여 도 20에 나타내었다. D-카이로-이노시톨의 순도는 1 배수의 에탄올을 첨가하였을 경우 약 35 - 40％ 정도로 나타났으며, 그 이상의 양의 에탄올을 첨가하면 순도가 증가하지만, D-카이로-이노시톨의 손실율이 커지는 것으로 나타났다.
이상의 결과를 종합하면, 약 1 배수의 에탄올을 첨가할 경우 약 80％의 마이오-이노시톨이 침전되고, 이때 D-카이로-이노시톨의 침전율, 즉 손실율은 15％ 이하로 나타났으며, 초기 14％ 정도이었던 D-카이로-이노시톨의 순도를 약 30-40％로 증가시킬 수 있었다. 한편, 에탄올 첨가량이 1 배수를 초과할 경우 D-카이로-이노시톨의 침전율(손실율)이 급격히 증가므로, 약 1 배수의 에탄올을 첨가하는 경우 D-카이로-이노시톨의 손실율을 최소로 하면서 마이오-이노시톨을 침전시켜 분리 및 제거할 수 있는 것으로 확인되었다.
실시예
18 : 1차 에탄올 처리 후
상층액의
농축 건조 및 재용해
상기 실시예 17에서 설명된 방법과 같이, 효소 반응이 완료된 반응 완충액에 동량(1:1)의 에탄올을 혼합한 후 침전물을 제거하여 얻은 상층액을 80℃로 가열하고 진공 상태에서 농축 및 건조하였다. 건조 후 얻은 이노시톨의 건조 분말(마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말)을 15％ - 70％의 다양한 농도로 증류수에 용해시켜 각 농도에서의 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해 특성을 관찰하였다.
마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해특성을 분석한 결과는 도 21에 나타내었다. 도 21의 패널 A는 상층액에서 각 이노시톨의 농도, 즉 용해도를 나타낸 것으로 마이오-이노시톨 용해도는 상기 실시예 16에서 나타난 바와 같이 약 15％ 이상으로는 더 증가하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 한편, D-카이로-이노시톨의 경우 용해도가 약 55％ 이므로 건조분말을 70％ 농도로 용해시킨 경우에서도 모든 D-카이로-이노시톨이 용해된 것을 확인할 수 있었다. 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해특성을 용해도와 침전율로 표시한 결과는 각각 도 21의 패널 B와 패널 C에 나타내었다. 마이오-이노시톨은 약 20％ 용액부터 용해도가 감소하기 시작하여 용액의 농도가 증가할수록 계속적으로 감소하였고, 침전율은 용액의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. D-카이로-이노시톨의 경우 용해도는 용액의 농도가 70％인 경우에 이르기까지 100％을 유지하였으며, 이에 따라 침전율도 0％로서 전혀 침전되지 않는 것으로 나타났다. 결론적으로 최대 70％ 용액을 제조하는 경우 마이오-이노시톨은 15％만이 용해되었고, D-카이로-이노시톨은 모두 용해되었으므로, D-카이로-이노시톨의 경우 순도는 약 73％ 정도인 것으로 나타났다(도 21의 패널 D).
실시예
19 : 저농도의 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 건조물 용액에 2차 에탄올을 처리한 경우의 정제 특성
상기 실시예 17에서 설명된 방법과 같이, 반응이 완료된 효소 반응 완충액에 동량(1:1)의 에탄올을 혼합한 후 침전물을 제거하여 얻은 상층액을 80℃로 가열하고 진공 상태에서 농축 및 건조하였다. 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 혼합 건조물을 저농도인 15％ 이하 농도의 용액으로 제조하여 여기에 에탄올을 첨가하는 실험을 수행하였다. 1차 에탄올 처리 후 상층액의 건조분말이 완전히 녹는 양의 물을 첨가하여 용해시켰으며, 이때 총 이노시톨 함량으로 약 11.5％가 되었고, 각각의 농도는 마이오-이노시톨 75 g/L 및 D-카이로-이노시톨 40 g/L 이었다. 이 혼합용액에 에탄올을 최대 19배 까지 첨가하면서 침전 및 분리 양상을 확인하였다. 그 결과는 도 22에 나타내었다. 도 22의 패널 A는 에탄올 첨가 후 상층액의 농도를 나타낸 것이며, 마이오-이노시톨의 경우 약 1 배수의 에탄올을 첨가할 때까지 큰 변화가 없었으나, 1.5 배의 에탄올이 첨가되면 절반 이상의 마이오-이노시톨이 침전되는 것으로 나타났다. 이에 반하여 D-카이로-이노시톨은 1.5 배수의 에탄올에서 약간 침전되는 것으로 나타났으며, 이후에도 침전량이 크게 증가되지는 않았다. 도 22의 패널 B는 침전율을 나타낸 것이며, 마이오-이노시톨의 경우 약 9배의 에탄올을 첨가할 경우 90％ 이상 침전되었으며, 이때 D-카이로-이노시톨의 침전율은 약 20％인 것으로 나타났다. 따라서 약 9 배 양의 에탄올을 첨가하면 대부분의 마이오-이노시톨을 제거하면서 D-카이로-이노시톨 손실율을 20％ 이하로 줄일 수 있고, D-카이로-이노시톨의 순도를 90％ 이상으로 정제 가능하였다(도 22 패널 C 참조).
실시예
20: 에탄올 이외의 유기용매에 의한 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 선택적 침전
상기 실시예 16 내지 실시예 19의 실험결과로부터 효소 반응 완충액에 함유된 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨은 이들의 큰 용해도 차이에 의해 에탄올을 이용한 분리가 가능함을 확인하였다. 2개의 탄소를 갖는 에탄올 이외의 다른 유기용매에 의해서도 이러한 분리가 가능한지 확인하기 위해 탄소수 3개의 알코올인 이소프로판올과 케톤인 아세톤을 이용하여 분리를 시도하였다. 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합용액 제조 시, 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 비율은 일반적인 반응평형 도달 농도인 약 13:2로 하였으며, M9 최소배지 조건 (효소 반응 완충액 조건)으로 전체 농도가 약 15％가 되도록 제조하였다. 제조한 이노시톨이 첨가된 효소반응 완충액에 동일부피의 에탄올, 이소프로판올, 아세톤을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 진탕한 후 원심분리하고, 그 상층액을 HPLC로 분석하였다. 결과는 도 23에 나타내었다. 도 23의 패널 A는 실제 상층액에 존재하는 이노시톨의 농도를 나타낸 것이다. 마이오-이노시톨의 경우 에탄올과 이소프로판올에서는 큰 차이가 없었으나, 아세톤에서는 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났다. D-카이로-이노시톨의 경우 역시 에탄올과 이소프로판올이 비슷한 반면 아세톤의 경우에는 유기용매를 처리하지 않았던 농도와 같게 나타나 전혀 침전되지 않은 것으로 나타났다. 즉, 이소프로판올은 에탄올과 비교할 때 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 침전율은 큰 차이가 없었고, 아세톤은 마이오-이노시톨에 대한 침전율이 약간 더 높고, D-카이로-이노시톨의 손실율이 적은 것으로 보인다. 이는 에탄올의 침전율에 대한 상대값을 나타낸 도 23의 패널 B에서 쉽게 볼 수 있다. 즉, 이소프로판올은 에탄올에 대하여 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 각각 1.0과 0.9 값으로 큰 차이가 없으며, 아세톤은 마이오-이노시톨의 침전율이 약 1.1로 높으며, D-카이로-이노시톨에 대해서는 약 0.1로 수준이 낮은 것으로 나타났다. 따라서 에탄올 이외의 유기용매가 에탄올과 같이 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 분리에 사용할 수 있는 것을 확인하였으며, 아세톤의 경우 에탄올에 비해 그 분리 특성이 유리하다는 사실을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Solgent Co. Ltd.
<120> Method for Producing D-Chiro-Inositol From Myo-Inositol Using In
Vitro Enzyme Reaction
<160> 21
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 335
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
Met Thr Leu Arg Ile Ala Leu Phe Gly Ala Gly Arg Ile Gly His Val
1 5 10 15
His Ala Ala Asn Ile Ala Ala Asn Pro Asp Leu Glu Leu Val Val Ile
20 25 30
Ala Asp Pro Phe Ile Glu Gly Ala Gln Arg Leu Ala Glu Ala Asn Gly
35 40 45
Ala Glu Ala Val Ala Ser Pro Asp Glu Val Phe Ala Arg Asp Asp Ile
50 55 60
Asp Gly Ile Val Ile Gly Ser Pro Thr Ser Thr His Val Asp Leu Ile
65 70 75 80
Thr Arg Ala Val Glu Arg Gly Ile Pro Ala Leu Cys Glu Lys Pro Ile
85 90 95
Asp Leu Asp Ile Glu Met Val Arg Ala Cys Lys Glu Lys Ile Gly Asp
100 105 110
Gly Ala Ser Lys Val Met Leu Gly Phe Asn Arg Arg Phe Asp Pro Ser
115 120 125
Phe Ala Ala Ile Asn Ala Arg Val Ala Asn Gln Glu Ile Gly Asn Leu
130 135 140
Glu Gln Leu Val Ile Ile Ser Arg Asp Pro Ala Pro Ala Pro Lys Asp
145 150 155 160
Tyr Ile Ala Gly Ser Gly Gly Ile Phe Arg Asp Met Thr Ile His Asp
165 170 175
Leu Asp Met Ala Arg Phe Phe Val Pro Asn Ile Val Glu Val Thr Ala
180 185 190
Thr Gly Ala Asn Val Phe Ser Gln Glu Ile Ala Glu Phe Asn Asp Tyr
195 200 205
Asp Gln Val Ile Val Thr Leu Arg Gly Ser Lys Gly Glu Leu Ile Asn
210 215 220
Ile Val Asn Ser Arg His Cys Ser Tyr Gly Tyr Asp Gln Arg Leu Glu
225 230 235 240
Ala Phe Gly Ser Lys Gly Met Leu Ala Ala Asp Asn Ile Arg Pro Thr
245 250 255
Thr Val Arg Lys His Asn Ala Glu Ser Thr Glu Gln Ala Asp Pro Ile
260 265 270
Phe Asn Phe Phe Leu Glu Arg Tyr Asp Ala Ala Tyr Lys Ala Glu Leu
275 280 285
Ala Thr Phe Ala Gln Gly Ile Arg Asp Gly Gln Gly Phe Ser Pro Asn
290 295 300
Phe Glu Asp Gly Val Ile Ala Leu Glu Leu Ala Asn Ala Cys Leu Glu
305 310 315 320
Ser Ala Gln Thr Gly Arg Thr Val Thr Leu Asn Pro Ala Asn Val
325 330 335
<210> 2
<211> 273
<212> PRT
<213> Pantoea ananatis
<400> 2
Met Thr Ile Ala Ala Glu Arg Phe Cys Ile Asn Arg Lys Ile Ala Pro
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Glu Ala Phe Phe Arg Leu Val Asn Gly Leu Gly Leu
20 25 30
Asn Lys Val Glu Leu Arg Asn Asp Leu Pro Ser Gly Asn Val Met Asp
35 40 45
Asn Leu Ser Ala Ala Gln Val Cys Ala Leu Ala Glu Arg Tyr Gly Ile
50 55 60
Asp Ile Ile Thr Ile Asn Ala Val Tyr Pro Phe Asn Gln Arg Thr Glu
65 70 75 80
Gln Val Arg Gln Leu Thr Glu Ser Leu Leu Ala Asp Ala Lys Ala Val
85 90 95
Gly Ala Arg Ser Leu Val Leu Cys Pro Leu Asn Asp Gly Ser Ser Val
100 105 110
Ala Pro Glu Val Thr Leu Asn Ala Leu Arg Asp Leu Ala Pro Leu Phe
115 120 125
Ala Thr Tyr Gly Ile Thr Gly Leu Val Glu Pro Leu Gly Phe Pro Gln
130 135 140
Ser Ser Leu Arg Ser Ala Ala Gln Ala Gln Lys Leu Ile Arg Asp Ala
145 150 155 160
His Val Pro Phe Lys Leu Leu Ile Asp Thr Phe His His His Leu Tyr
165 170 175
Pro Asp Ala Asp Ala Glu Phe Ser Gln Val Asp Ile Ala Gln Ile Gly
180 185 190
Leu Val His Leu Ser Gly Val Glu Asp Lys Arg Pro Arg Glu Ser Leu
195 200 205
Thr Asp Ala Glu Arg Ile Met Leu Thr Pro Glu Asp Arg Leu Phe Thr
210 215 220
Cys Arg Gln Val Lys Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Lys Gly Ile Tyr
225 230 235 240
Ala Phe Glu Pro Phe Ala Pro Glu Leu Ala Asp Trp Asp Glu Asn Lys
245 250 255
Ile Gln His Glu Ile Lys Asn Ser Ile Gln Leu Ile Gln His Ser Leu
260 265 270
Lys
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 3
cgacatatga ctcttcgtat cgcccttttc g 31
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 4
cgaggatcct taaagcttaa cgttggcagg gttgagggtg 40
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 5
cgacatatga ccatcgccgc agaacg 26
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 6
cgaggatcct tactcgagct tcaaggaatg ttgaatcagt tggatgc 47
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide Linker
<400> 7
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide Linker
<400> 8
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide Linker
<400> 9
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 10
cgatcatgac tcttcgtatc gcccttttcg 30
<210> 11
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 11
cgttctgcgg cgatggtcat accagaacca ccaccagaac caccaccaga accaccaacg 60
ttggcagggt tgagggtg 78
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 12
gcagtcgact tacttcaagg aatgttgaat tagttggatg c 41
<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 13
cgttctgcgg cgatggtcat accagaacca ccaccagaac caccaacgtt ggcagggttg 60
agggtg 66
<210> 14
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 14
cgttctgcgg cgatggtcat accagaacca ccaacgttgg cagggttgag ggtg 54
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 15
cgtcatatga ccatcgccgc agaacg 26
<210> 16
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 16
cgaaaagggc gatacgaaga gtcataccag aaccaccacc agaaccacca ccagaaccac 60
ccttcaagga atgttgaatc agttggatg 89
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 17
gctagatctt aaacgttggc agggttgagg gtg 33
<210> 18
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 18
cgaaaagggc gatacgaaga gtcataccag aaccaccacc agaaccaccc ttcaaggaat 60
gttgaatcag ttggatg 77
<210> 19
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 19
cgaaaagggc gatacgaaga gtcataccag aaccaccctt caaggaatgt tgaatcagtt 60
ggatg 65
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 20
cgacatatga ctcttcgtat cgcccttttc g 31
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 21
gcaggatcct tagtcgacct tcaaggaatg ttgaattag 39
Claims (23)
- 다음의 단계를 포함하는 효소반응법을 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법:
(a) (i) 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제, 또는 이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제의 융합 단백질, (ⅱ) 조효소로서 NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide), 및 (ⅲ) 기질로서 마이오-이노시톨을 포함하는 효소 반응 완충액을 준비하는 단계; 및
(b) 상기 효소 반응 완충액을 반응시켜 D-카이로-이노시톨을 생성시키는 단계.
- 제 1 항에 있어서, 상기 효소 반응 완충액내의 이노시톨 디하이드로게나아제, 이노소스 이소머라아제, 또는 이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제의 융합 단백질의 농도는 100 - 500 ㎍/㎖ 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 효소 반응 완충액내의 NAD의 농도는 0.1 - 2 mM 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 효소 반응 완충액내의 마이오-이노시톨의 농도는 5 - 20 ％(w/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 효소 반응 온도는 25 - 65℃인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 효소반응 완충액은 Tris-HCl, MgSO4, 및 MnSO4를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 이노시톨 디하이드로게나아제는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 유래 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 이노소스 이소머라아제는 판토에아 아나나티스(P. ananatis) 유래 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 이노시톨 디하이드로게나아제의 C-말단과 이노소스 이소머라아제의 N-말단이 연결된 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(c) 상기 반응이 완료된 효소반응 완충액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계;
(d) 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및
(e) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
- 제 10 항에 있어서, 상기 단계 (e) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(f) 상기 단계 (e)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하는 단계;
(g) 상기 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계;
(h) 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및
(i) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
- 제 10 항에 있어서, 상기 단계 (f)에서, 이노시톨 분말을 20％(w/v) 이하의 농도로 물에 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 단계 (c) 또는 (g)에서의 유기용매는 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1, 3-부틸렌글리콜 또는 에테르인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 유기용매의 첨가량은 효소 반응 완충액 대비 0.1 - 9배 (v/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 단계 (g)에서 유기용매의 첨가량은 수용액 대비 1 - 10배(v/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 단계 (e) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(f)′ 상기 단계 (e)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하고 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계;
(g)′ 상기 수용액에서 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및
(h)′ 상기 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
- 제 16 항에 있어서, 상기 단계 (f)′에서, 이노시톨을 20％(w/v) 초과 - 70％(w/v) 이하의 농도로 물에 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제, 또는 이노시톨 디하이드로게나아제와 이노소스 이소머라아제의 융합 단백질; 및 (b) 조효소로서 NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide)를 유효성분으로 포함하는 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하기 위한 용도의 효소 반응 조성물.
- 제 18 항에 있어서, 상기 조성물은 (c) 기질로서 마이오-이노시톨을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 18 항에 있어서, 상기 조성물은 Tris-HCl, MgSO4, 및 MnSO4를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 18 항에 있어서, 상기 이노시톨 디하이드로게나아제는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 유래 효소인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 18 항에 있어서, 상기 이노소스 이소머라아제는 판토에아 아나나티스(P. ananatis) 유래 효소인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 18 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 이노시톨 디하이드로게나아제의 C-말단과 이노소스 이소머라아제의 N-말단을 연결한 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130009431A KR101971931B1 (ko) | 2013-01-28 | 2013-01-28 | 효소 반응법을 이용한 마이오-이노시톨로부터 d-카이로-이노시톨을 생산하는 방법 |
| PCT/KR2014/000758 WO2014116072A1 (ko) | 2013-01-28 | 2014-01-27 | 효소 반응법을 이용한 마이오-이노시톨로부터 d-카이로-이노시톨을 생산하는 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130009431A KR101971931B1 (ko) | 2013-01-28 | 2013-01-28 | 효소 반응법을 이용한 마이오-이노시톨로부터 d-카이로-이노시톨을 생산하는 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140096632A true KR20140096632A (ko) | 2014-08-06 |
| KR101971931B1 KR101971931B1 (ko) | 2019-04-25 |
Family
ID=51227807
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130009431A KR101971931B1 (ko) | 2013-01-28 | 2013-01-28 | 효소 반응법을 이용한 마이오-이노시톨로부터 d-카이로-이노시톨을 생산하는 방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101971931B1 (ko) |
| WO (1) | WO2014116072A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113957101B (zh) * | 2020-07-21 | 2023-02-28 | 山东福洋生物科技股份有限公司 | 一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005087149A (ja) * | 2003-09-19 | 2005-04-07 | Hokko Chem Ind Co Ltd | Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法 |
| JP2006141216A (ja) * | 2004-11-16 | 2006-06-08 | Kobe Univ | Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法 |
| JP3887600B2 (ja) * | 2001-01-15 | 2007-02-28 | 北興化学工業株式会社 | Ｄ−ミオ−イノシトール１−エピメラーゼをコードするｄｎａ |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5091596A (en) * | 1990-12-20 | 1992-02-25 | Univ. Of Va. Alumni Patents Foundation | Method for producing chiro-inositol |
-
2013
- 2013-01-28 KR KR1020130009431A patent/KR101971931B1/ko active IP Right Grant
-
2014
- 2014-01-27 WO PCT/KR2014/000758 patent/WO2014116072A1/ko active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3887600B2 (ja) * | 2001-01-15 | 2007-02-28 | 北興化学工業株式会社 | Ｄ−ミオ−イノシトール１−エピメラーゼをコードするｄｎａ |
| JP2005087149A (ja) * | 2003-09-19 | 2005-04-07 | Hokko Chem Ind Co Ltd | Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法 |
| JP2006141216A (ja) * | 2004-11-16 | 2006-06-08 | Kobe Univ | Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Applied and Environmental Microbiology, Vol. 72, pp. 1310-1315 (2006.)* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101971931B1 (ko) | 2019-04-25 |
| WO2014116072A1 (ko) | 2014-07-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3103874B1 (en) | Construction of new variants of dextransucrase dsr-s by genetic engineering | |
| KR20150058478A (ko) | 글루칸 중합체의 생성을 위한 글루코실트랜스퍼라제 효소 | |
| JP5224572B2 (ja) | デキストラン生成酵素遺伝子、デキストラン生成酵素およびその製造方法、デキストランの製造方法 | |
| WO1997027303A1 (fr) | Alpha-1-6 fucosyltransferases | |
| JP2012500641A (ja) | ２−ヒドロキシイソブチレートの酵素による生産 | |
| CN111849951B (zh) | L-苏氨酸醛缩酶突变体r318m及其应用 | |
| JP2012531198A (ja) | Ｃｒｍ１９７及びその誘導体の産生のための人工遺伝子の細菌発現 | |
| Baumgart et al. | Biochemical characterisation of aconitase from Corynebacterium glutamicum | |
| JP7387194B2 (ja) | イソオイゲノールからのバニリンの生合成 | |
| CN109468304B (zh) | 乙内酰脲酶的突变体 | |
| KR101971931B1 (ko) | 효소 반응법을 이용한 마이오-이노시톨로부터 d-카이로-이노시톨을 생산하는 방법 | |
| US8691960B2 (en) | Oxidoreductases for enantioselective reactions | |
| AU734397B2 (en) | Method for cleaving chimeric protein using processing enzyme | |
| US6825018B1 (en) | Sorbitol dehydrogenase, gene encoding the same and use thereof | |
| EP2559758A1 (en) | Modified glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from corynebacterium glutamicum and uses thereof | |
| CN109971803B (zh) | 一种l-赤藓酮糖和赤藓糖醇生产方法 | |
| KR102017776B1 (ko) | 휴면 세포 전환법을 이용한 ｄ-카이로 이노시톨의 생산 방법 | |
| US7241611B2 (en) | Methods for synthesis of holo-photoactive yellow protein | |
| CN114990097B (zh) | L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用 | |
| JP5499350B2 (ja) | キヌクリジノン還元酵素及びそれを用いた光学活性３−キヌクリジノールの製造方法 | |
| Krüger et al. | Cloning and functional expression of the D-β-hydroxybutyrate dehydrogenase gene of Rhodobacter sp. DSMZ 12077 | |
| CA2384625A1 (en) | Novel carbonyl reductase, gene thereof and method of using the same | |
| KR101715882B1 (ko) | 신규 ε-카프로락탐 전환 효소 및 이를 이용한 ε-카프로락탐 생산 방법 | |
| EP2574667A1 (en) | Enzyme variants | |
| KR20230108128A (ko) | 신규 타이로시네이즈 효소 및 이를 이용한 에리오딕티올의 생산 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |