JP2012500641A

JP2012500641A - ２−ヒドロキシイソブチレートの酵素による生産

Info

Publication number: JP2012500641A
Application number: JP2011524359A
Authority: JP
Inventors: フィリップ、スカイユ; セドリック、ボワサル
Original assignee: メタボリックエクスプローラー
Priority date: 2008-08-25
Filing date: 2009-08-25
Publication date: 2012-01-12
Also published as: US20110151530A1; WO2010023206A1; EP2331698A1; KR20110046560A; CN102203267A; WO2010022763A1

Abstract

本発明は、再生可能な資源から２−ＨＩＢＡの産生を促進するように修飾された微生物を用いる発酵法を包含する２−ヒドロキシ−イソブチレート（２−ＨＩＢＡ）の生物学的製造の新規方法に関する。本発明は、このような発酵法に用いられる修飾微生物にも関する。

Description

本発明は、再生可能な資源から２−ＨＩＢＡの産生を促進するように修飾した微生物を用いる発酵法などの２−ヒドロキシ−イソブチレート（２−ＨＩＢＡ）の生物学的調製のための新規な方法に関する。本発明は、このような発酵法に用いられる修飾微生物にも関する。

２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）は、２−ヒドロキシイソブチレート、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸および２−メチル乳酸とも呼ばれる。ＣＡＳ登録番号は、５９４−６１−６である。

２−ヒドロキシイソ酪酸は、３種類の化合物である２，３−ジヒドロキシ−メチルプロピオネート（methylproprionate）、２−プロパノールおよびメタクリレートの前駆体である。

メタクリル酸とも呼ばれるメタクリレートは、樹脂、プラスチック、ゴムおよび義歯材料に広く用いられる大量の化合物である（２００５年には、３．２百万トンが生産された）。これは、現在ではシアン化水素、ホルムアルデヒドまたはメタクロレインのような高毒性化学物質から生産されている。従って、メタクリル酸を生産するための環境に優しくかつ費用効果の高い方法を開発することは重要である。

（従来技術）
現在までのところ、２−ＨＩＢＡの酵素による生産は、下記に示される方法で行われていた：

参照のためには、次のものを参照されたい(Lopes Ferreira N, Labbe D, Monot F, Fayolle-Guichard F, Greer CW. Microbiology(2006) 152: 1361-74)。

「アルキル第三ブチルエーテル中間体である２−ヒドロキシイソブチレートは、新規なコバラミン依存性のムターゼ経路で分解される(The Alkyl tert-Butyl Ether Intermediate 2-Hydroxyiso butyrate is degraded via a novel cobalamin-dependant mutase pathway)」という標題のRohwerter et al.の論文には、メチルおよびエチル第三ブチルエーテルの分解経路が記載されている。著者らは、この経路の中間体である２−ＨＩＢＡに注目している。結果は、２−ＨＩＢＡがイソブチリル−ｃｏＡムターゼの小サブユニットによって分解されることを示している。

Rohwerter et al.のＷＯ２００７／１１０３９４号公報には、ムターゼ酵素活性を発現する微生物による３−ヒドロキシ酪酸から２−ヒドロキシイソ酪酸への酵素による転換方法が記載されている。酵素による転換は、微生物から得られる酵素抽出物を用いて(実施例２）または酵素による転換のために３−ヒドロキシ酪酸を基質として含んでなる培地上で微生物を培養することによって（実施例１）行われる。ＷＯ２００７／１１０３９４号公報には、２−ヒドロキシイソブチレートを微生物中でグルコースのような単一炭素源の転換によって得る発酵法は開示されていない。ＷＯ２００７／１１０３９４号公報に開示された方法では、出発材料は３−ヒドロキシ酪酸であり、これは任意の起源のものでよく、特に通常の化学合成によって得られたものでよい。

米国特許第７，２６２，０３７号公報は、組換え大腸菌（Escherichia coli）の発酵によるＤ−（３）−ヒドロキシ酪酸の産生方法を教示しており、図４は、グルコースから代謝物アセチル−ｃｏＡおよび３−ヒドロキシブチリル−ｃｏＡを介してＤ−（３）−ヒドロキシ酪酸を産生する代謝経路を示している。Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ由来の遺伝子ｐｈａＡおよびｐｈａＢを組換えＥ．ｃｏｌｉに導入し、コードされた酵素がアセチル−ｃｏＡの修飾の第一段階を行う。米国特許第７，２６２，０３７号公報には、グルコースのような炭素源から２−ＨＩＢＡを得る方法は開示されていない。

ＷＯ２００７／１１０３９４号公報および米国特許第７，２６２，０３７号公報の教示内容を組み合わせると、２種類の異なる微生物、グルコースを３−ヒドロキシ酪酸に転換するための第一の微生物と３−ヒドロキシ酪酸を２−ＨＩＢＡに酵素的に転換するための第二の微生物、を必要とする複雑な方法を生じる。

十分に存在しかつ廉価な再生可能な材料上で微生物を培養することによる２−ＨＩＢＡの発酵調製を用いる本発明の方法は、化学的方法の問題点並びに文献に開示されている酵素による転換の複雑さを解決することを提供する。

（発明の概略的説明）
本発明は、アセチル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソ酪酸に転換する連続段階を含んでなる２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）の製造方法であって、前記連続段階が、
ａ）アセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに転換し、
ｂ）上記段階（ａ）で得られた３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡに転換し、および
ｃ）２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソ酪酸に転換する
ことからなり、
段階ａ）、ｂ）およびｃ）における転換が酵素による転換である、方法に関する。

好ましい態様では、酵素による転換は単一微生物で行われ、この微生物は、連続段階ａ）、ｂ）およびｃ）に必要な酵素活性を発現するように修飾されている。

更に好ましくは、本発明の方法は、単一炭素源の２−ＨＩＢＡへの転換による２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）の発酵産生のための方法であって、
単一炭素源を含んでなる適当な培養培地中で連続段階ａ）、ｂ）およびｃ）に必要な酵素活性を発現するように修飾された微生物を培養し、
２−ＨＩＢＡを培養培地から回収する
段階を含んでなる、方法である。

段階ａ）は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼまたはアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性を有する、第一の酵素ａ１）、および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有する、第二の酵素ａ２）の２種類の酵素の組合せを用いて行うのが好都合である。

段階ｂ）は、ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ活性を有する酵素系を用いて行うのが好都合である。

段階ｃ）は、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性を有する酵素を用いて、またはホスホトランスアシラーゼ活性を有する、第一の酵素ｃ１）および酸−キナーゼ活性を有する、第二の酵素ｃ２）の２種類の酵素の組合せを用いて基質上のＣｏＡを転移することによって行うのが好都合である。

連続段階ａ）、ｂ）およびｃ）に必要な酵素活性は、外来遺伝子によってコードされるのが好都合である。

修飾微生物も、本発明の一部である。

発明の具体的説明

本発明は、アセチル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソ酪酸に転換する連続段階を含んでなる２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）の製造方法であって、前記連続段階が
ａ）アセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに転換し、
ｂ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡに転換し、および
ｃ）２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソ酪酸に転換する
ことからなる、方法に関する。

主要な基質であるアセチル−ＣｏＡは、代謝に重要な分子である。アセチル−ｃｏＡは、炭水化物代謝の産物である。その主要な用途は、アセチル基中の炭素原子をクエン酸回路に運び、酸化してエネルギー生産することである。アセチル−ＣｏＡは、好気性細胞呼吸の第二段階で産生される。

段階ａ）、ｂ）およびｃ）は、特定化合物の酵素による転換である。「酵素活性（enzyme activity）」および「酵素活性（enzymatic activity）」という用語は、互換的に用いられ、酵素または酵素の組合せが特定の化学反応を触媒する能力を表す。

本発明による２−ＨＩＢＡの製造は、基質アセチル−ｃｏＡを外部から添加した液体反応培地中で、または「ミニ・ファクトリーズ」として用いられる１種類以上の微生物、好ましくは１種類の微生物であって、任意の炭素源からアセチル−ｃｏＡを合成することができる前記微生物中で行うことができる。

本発明の明細書において、酵素活性は、このような活性を有する酵素をコードする遺伝子を参照することによっても命名される。遺伝子およびタンパク質は、一般的に大腸菌(Escherichia coli)、クロストリジウムアセトバティリカム(Clostridium acetobutylicum)、ラルストニアユートロファ(Ralstonia eutropha)、ＡｑｕｉｎｃｏｌａｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓおよびＭｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ由来の遺伝子の名称を用いて同定される。しかしながら、これらの名称の使用は、本発明によれば更に一般的な意味を有し、他の生物、特に微生物のあらゆる対応する遺伝子およびタンパク質、前記遺伝子およびタンパク質の機能的相同体、機能的変異体および機能的断片を包含する。

既知の酵素活性についてのＩＵＢＭＢの酵素命名法の文献を用いれば、当業者は、他の生物、細菌株、酵母、菌類などにおける同じ酵素活性を決定することができる。この所定の作業は、他の微生物由来のタンパク質を用いる配列アラインメントを行うことによって決定することができる共通配列を用いて行うのが好都合である。

２種類のタンパク質の間の相同性の割合を決定する方法は、当業者には知られている。例えば、それは、ウェブサイトhttp://www.ebi.ac.uk/clustalw/で入手可能なソフトウェアＣＬＵＳＴＡＬＷをこのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターと共に用いることによって、配列のアラインメントの後に行うことができる。アラインメントから、同一性の割合は、残基の総数と比較して同じ位置における同一残基の数を記録することによって容易に計算することができる。あるいは、例えば、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で入手可能なＢＬＡＳＴプログラムをこのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターと共に用いることによって、自動的に計算することもできる。

ＰＦＡＭ(アライメントおよび隠れマルコフモデルのタンパク質ファミリーデータベース；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)は、タンパク質配列アラインメントの大きなコレクションである。それぞれのＰＦＡＭにより多重アラインメントを可視化し、タンパク質ドメインを調べ、生物中の分布を評価し、他のデーターベースへのアクセスを獲得し、および既知のタンパク質構造を可視化することができる。

ＣＯＧ(タンパク質の相同分子種群のクラスター；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)は、６６の完全に解読されたゲノムからのタンパク質配列を比較することによって得られ、３０の主要な系統学的系列を表している。それぞれのＣＯＧは、少なくとも３つの系列から定義され、これにより以前に保存されたドメインを同定することができる。

引用したタンパク質と相同性を共有しているタンパク質は、他の微生物から得てもよく、または天然タンパク質の変異体または機能的断片であってもよい。

「機能的変異体または機能的断片」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列が、天然に観察される配列に厳格に限定されないことがあり、追加のアミノ酸を含むことがあることを意味する。「機能的断片」という用語は、ポリペプチドの配列が元の配列より小さいアミノ酸であるが、参照の元の配列の酵素活性を付与するのに十分なアミノ酸を包含することがあることを意味する。ポリペプチドが、その酵素活性を保持したまま１以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失および/または付加によって修飾することができることは、当該技術分野で周知である。例えば、所定位置における１個のアミノ酸のタンパク質の機能特性に影響しない化学的に同等なアミノ酸による置換は、よく見られることである。本発明の目的では、置換は、下記の群：
小さな脂肪族の無極性または微極性残基：Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ
極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ
極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ
大きな脂肪族の無極性残基：Ｍｅｔ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｃｙｓ
大きな芳香族残基：Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ
の１つの中での交換として定義される。

他の１つの負に帯電した残基の代わりに１つの負に帯電した残基（例えば、アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸）または他の１つの正に帯電した残基の代わりに１つの正に帯電した残基（例えば、アルギニンの代わりにリシン）で置換を生じる変化は、機能的に同等な生成物を産生することを予想することができる。

アミノ酸が修飾される位置およびアミノ酸配列において修飾を受けるアミノ酸の数は、特に限定されない。当業者であれば、タンパク質の活性に影響を与えることなく導入することができる修飾を認識することができる。例えば、タンパク質のＮ−またはＣ−末端部における修飾は、ある種の環境下ではタンパク質の活性を変更させないと予想することができる。

「変異体」という用語は、元の酵素活性をさらに保持しながら、上記のような修飾を受けるポリペプチドを表す。

「コードする（encoding）」または「コードする（coding）」という用語は、ポリヌクレオチドが転写および翻訳の機構を介してアミノ酸配列を生成する過程を表す。この過程は、ＤＮＡにおける塩基の配列とタンパク質におけるアミノ酸の配列との関係である遺伝子コードによって可能となる。遺伝子コードの１つの主要な特徴は、縮重していることであり、１個のアミノ酸は１より多い塩基３つの組合せ（１個の「コドン」）によってコードすることができることを意味する。直接的な結果は、同じアミノ酸配列を異なるポリヌクレオチドによってコードすることができることである。コドンの使用は生物に準じて多様となりうることは、当業者には周知である。同じアミノ酸をコードするコドンの中では、幾つかは所定の微生物によって優先的に用いることができる。従って、興味深いことには、特定の微生物のコドン用法に適合したポリヌクレオチドを設計して、この生物における対応するタンパク質の発現を最適にすることができる。

詳細には、宿主微生物がＥ．ｃｏｌｉである場合には、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａのような他の微生物由来の遺伝子配列を好ましいコドンでコードし直してもよく、合成遺伝子を調製してＥ．ｃｏｌｉ中で正確に発現させるだろう（例参照）。

段階ａ
アセチル−ｃｏＡの３−ヒドロキシブチリル−ｃｏＡへの転換は、好都合には、２種類の酵素：
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性またはアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性を有する、第一の酵素ａ１）（ＥＣ２．３．１．）、および
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有する、第二の酵素ａ２）（ＥＣ１．１．１．１５７）
の組合せによって得られる。

本発明の好ましい態様では、第一の酵素ａ１）は、
Ｅ．ｃｏｌｉのａｔｏＢ、
Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｔｈｌＡ、および
Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａのｐｈａＡ
からなる群から選択される遺伝子によってコードされる遺伝子産物である。

Ｅ．ｃｏｌｉのａｔｏＢ、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｔｈｌＡおよびＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａのｐｈａＡの遺伝子によってコードされ、いずれも同じ酵素活性を示す３種類のタンパク質は、それらの配列において同一性の割合が少なくとも６１％であることを示している。

従って、本発明によれば、「アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性またはアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド」とは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のａｔｏＢの配列と少なくとも６０％の相同性を有し、好ましくは少なくとも７０％相同性を有し、更に好ましくは少なくとも８０％の相同性を有する、すべてのポリペプチドを表す。

本発明のもう一つの好ましい態様では、第二の酵素ａ２）は、
Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｈｂｄおよび
Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａのｐｈａＢ
からなる群から選択される遺伝子によってコードされる遺伝子産物である。

段階ｂ
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡへの転換は、好ましくはヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ活性を有する酵素系により得られる。

この活性は、培養培地に添加しなければならないビタミンＢ_１２のようなコバラミド補酵素の供給源を必要とする。

ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼは、Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ、Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ由来またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｐ由来のｉｃｍＡおよびｉｃｍＢである。

これらのヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ酵素は、それらのアミノ酸配列において少なくとも４０％の相同性を示す。従って、「ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ活性」の意味は、この活性を有しかつそれらのアミノ酸配列においてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｐ由来のＩｃｍＡおよびＩｃｍＢタンパク質と少なくとも４０％の同一性を共有するすべてのポリペプチドを表す。

コバラミド依存性ムターゼであるこのムターゼの活性は、ｆｌｄＡ−ｆｐｒ活性化系を過剰発現することによって増加させることができることが、本発明者らによって示された。このような系はＳＡＭ−ラジカル酵素についての文献（ＷＯ２００７／０４７６８０号公報）に開示されており、当業者であれば前記系の過剰発現の方法を知っている。

ムターゼの活性は、アッセイにおいて酸素の非存在下で向上することも本発明者らによって示された。本発明の一態様では、段階ｂ）は、嫌気性または微好気性条件下で行われる。

段階ｃ
本発明の特定態様では、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの２−ヒドロキシイソ酪酸への転換は、基質上のＣｏＡを、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する酵素（ＥＣ２．８．３）で転移することによって得られる。

優先的には、基質はアセテートおよび２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡであり、酵素はアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する（ＥＣ２．３．１．）。

本発明のもう一つの態様では、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの２−ヒドロキシイソ酪酸への転換は、基質上のＣｏＡを、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性を有する酵素（ＥＣ３．１．２）で転移することによって得られる。

優先的には、基質は２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡであり、酵素は２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性を有しており、
Ｅ．ｃｏｌｉのｔｅｓＢおよび
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｙｂｇＣ
からなる群から選択される遺伝子によってコードされる遺伝子産物である。

本発明のもう一つの態様では、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの２−ヒドロキシイソ酪酸への転換は、
ホスホトランスアシラーゼ活性を有する、第一の酵素ｃ１）および
酸−キナーゼ活性を有する、第二の酵素ｃ２）
の２種類の酵素の組合せを用いて得られる。

本発明の特定態様では、酵素ｃ１）は、ホスフェートヒドロキシイソブチリルトランスフェラーゼ活性を有しており、詳細にはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの遺伝子ｐｔｂによってコードされる遺伝子産物である。

本発明の特定態様では、酵素ｃ２）は、ヒドロキシイソブチレートキナーゼであり、詳細にはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの遺伝子ｂｕｋによってコードされる遺伝子産物である。

微生物
本発明の好ましい態様では、主要な基質アセチル−ＣｏＡは、微生物の任意の炭素源の生物転換によって得られる。この生物転換は、好気性細胞呼吸の第二段階中に起こり、炭素基質はエネルギーに転換される。

本発明による「炭素源」または「炭素基質」または「炭素の供給源」という用語は、六単糖(例えば、グルコース、ガラクトースまたはラクトース)、五単糖、単糖類、二糖類、オリゴ糖類(例えば、スクロース、セロビオースまたはマルトース)、糖蜜、澱粉またはその誘導体、ヘミセルロース、グリセロールおよびそれらの組合せを包含する、微生物の正常な増殖を支持する目的で当業者が用いることができる任意の炭素供給源を表す。特に好ましい単一炭素源は、グルコースである。もう一つの好ましい炭素源は、スクロースである。

本発明の好ましい態様では、段階ａ）、ｂ）およびｃ）は、前記段階ａ）、ｂ）およびｃ）の転換のために必要な酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子を発現する微生物によって行われる。

優先的には、段階ａ）、ｂ）およびｃ）は、上記のように酵素反応の実現に必要なすべての遺伝子産物を発現する同一の微生物によって行われる。

更に優先的には、それは同一の微生物であり、酵素反応ａ）、ｂ）およびｃ）を行う前にグルコースのアセチル−ＣｏＡへの生物転換を提供する。従って、グルコースの２−ＨＩＢＡへの転換は、単一微生物内で行われる。

本発明は、２−ヒドロキシイソ酪酸を調製するための微生物であって、前記微生物が、上記で定義した前記段階ａ）、ｂ）およびｃ）の転換に必要な酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子を発現する微生物にも関する。

従って、本発明は、２−ＨＩＢＡの産生を向上させるために修飾された微生物であって、前記微生物が、
ａ）アセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに転換し、
ｂ）上記で得られた３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡに転換し、および
ｃ）２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソ酪酸に転換する
ことからなる連続段階ａ）、ｂ）およびｃ）によってアセチル−ＣｏＡから２−ヒドロキシイソ酪酸へ転換することができる酵素をコードする遺伝子を発現するように修飾されているものである、微生物を提供する。

このような酵素活性を可能にする酵素およびこのような酵素活性をコードする遺伝子は、上記および以下に開示されている。

本発明の微生物は、「２−ＨＩＢＡの産生を向上させるために修飾した微生物」であって、単一炭素源の転換によって２−ＨＩＢＡの産生を促進する経路が修飾されているものである。前記産生を向上させるために修飾された微生物は、本来の未修飾微生物より多くの所望な生化学物質を産生する。

本発明によれば、「微生物」という用語は、細菌、酵母または菌類を表す。優先的には、微生物は、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトマイセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリア科(Corynebacteriaceae)の一種である。更に優先的には、微生物は、エシェリヒア属(Escherichia)、クロストリジウム属(Clostridium)、バチルス属(Bacillus)、クレブシエラ属(Klebsiella)、パントエア属(Pantoea)、サルモネラ属(Salmonella)またはコリネバクテリウム属(Corynebacterium)の一種である。更により優先的には、微生物は、大腸菌(Escherichia coli)またはコリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)またはクロストリジウムアセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)またはバチルスサブティリス(Bacillus subtilis)の種である。

外来遺伝子が宿主微生物でこれらを発現させることができるすべての要素と共に微生物に導入されるときには、微生物は外来遺伝子を発現することができる。外来ＤＮＡによる微生物の形質転換は、当業者にとって所定の作業である。

外来遺伝子は、宿主ゲノムに組込みまたは染色体外でプラスミドまたはベクターによって発現させることができる。様々な種類のプラスミドが当業者に知られており、これらは細胞中における複製の起源およびそれらのコピー数が異なっている。

本発明によれば、特に断らない限り、遺伝子の「過剰発現（overexpressing）」または「過剰発現（overexpression）」は、
１種類以上の遺伝子を発現することによって生成した酵素活性が形質転換していない微生物には存在しないときには、少なくとも１種類以上の外来遺伝子を微生物に導入するか、または
前記酵素活性を有する微生物に含まれている１種類以上の遺伝子の発現を増加する
ことを意味する。

当業者であれば、微生物で遺伝子を過剰発現する方法、特に、修飾プロモーターの制御下で遺伝子の発現水準を修飾することによって微生物に遺伝子の１種類以上のコピーを導入することによる微生物で遺伝子を過剰発現する方法、を知っている。

遺伝子の発現の制御に重要な要素は、プロモーターである。本発明の好ましい態様では、遺伝子は様々な強度の誘導性であってもよいプロモーターを用いて発現してもよい。これらのプロモーターは、相同性または非相同性であってもよい。当業者であれば、最も好都合なプロモーターを選定する方法を知っており、例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、ＰｌａｃまたはλプロモーターｃＩが広く用いられている。

微生物を形質転換するためのすべての手法、および本発明のタンパク質の産生を高めるために用いられる調節要素は当該技術分野で周知であり、ＷＯ２００８／０５２９７３号公報、ＷＯ２００８／０５２５９５号公報、ＷＯ２００８／０４０３８７号公報、ＷＯ２００７／１４４３４６号公報、ＷＯ２００７／１４１３１６号公報、ＷＯ２００７／０７７０４１号公報、ＷＯ２００７／０１７７１０号公報、ＷＯ２００６／０８２２５４号公報、ＷＯ２００６／０８２２５２号公報、ＷＯ２００５／１１１２０２号公報、ＷＯ２００５／０７３３６４号公報、ＷＯ２００５／０４７４９８号公報、ＷＯ２００４／０７６６５９号公報など様々な微生物における生合成経路の修飾に関する本出願人自身の特許出願などの文献で入手可能であり、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。

最も好ましい態様では、本発明の微生物は、下記の遺伝子：
ｐｈａＡ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ｐｈａＢ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ｉｃｍＡ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｉｃｍＢ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｔｅｓＢ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、または
ｐｈａＡ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ｐｈａＢ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ｉｃｍＡ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｉｃｍＢ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｙｂｇＣ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、または
ｐｈａＡ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ｐｈａＢ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ｉｃｍＡ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｉｃｍＢ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｐｔｂ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ｂｕｋ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、または
ｔｈｌＡ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｌｙｌｉｃｕｍ）、ｈｂｄ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｌｙｌｉｃｕｍ）、ｉｃｍＡ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｉｃｍＢ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｔｅｓＢ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、または
ｔｈｌＡ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｌｙｌｉｃｕｍ）、ｈｂｄ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｌｙｌｉｃｕｍ）、ｉｃｍＡ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｉｃｍＢ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｙｂｇＣ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、または
ｔｈｌＡ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｌｙｌｉｃｕｍ）、ｈｂｄ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｌｙｌｉｃｕｍ）、ｉｃｍＡ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｉｃｍＢ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｐｔｂ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ｂｕｋ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、または
ａｔｏＢ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｈｂｄ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｌｙｌｉｃｕｍ）またはｐｈａＢ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ｉｃｍＡ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｉｃｍＢ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｔｅｓＢ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、または
ａｔｏＢ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｈｂｄ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｌｙｌｉｃｕｍ）またはｐｈａＢ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ｉｃｍＡ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｉｃｍＢ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｙｂｇＣ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、または
ａｔｏＢ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｈｂｄ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｌｙｌｉｃｕｍ）またはｐｈａＢ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ｉｃｍＡ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｉｃｍＢ（Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ，Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ｐｔｂ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ｂｕｋ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）
を発現する修飾微生物である。

特定の態様では、上記および以下に定義されている本発明の微生物も、高濃度のアセチル−ＣｏＡを産生するように修飾される。

アセチル−ＣｏＡへの流れは、様々な手段、特に
ｉ）遺伝子ｌｄｈＡの減衰によって、酵素ラクテートデヒドロゲナーゼの活性を減少させ、
ｉｉ）下記の酵素：
ｐｔａ遺伝子によってコードされるホスホ−トランスアセチラーゼ、
ａｃｋＡ遺伝子によってコードされるアセテートキナーゼ、
ｐｏｘＢ遺伝子によってコードされるピルベートオキシダーゼ
の少なくとも１種類の活性を遺伝子の減衰によって減少させ、
ｉｉｉ）ａｃｅＡ遺伝子によってコードされる酵素イソシトレートリアーゼの活性を減少させる
ことによって増加させてもよい。

本発明の一態様は、ＮＡＤＰＨの利用可能性を増加させることによって２−ＨＩＢＡ産生のより良好な収率も提供する。微生物におけるこの利用可能性の増加は、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼをコードするｐｇｉまたは可溶性のトランスヒドロゲナーゼをコードするｕｄｈＡから選択される遺伝子の少なくとも１種類の減衰によって得ることができる。このような遺伝子修飾により、グルコース−６−ホスフェートはペントースホスフェート経路を介して糖分解にはいる必要があり、代謝されるグルコース−６−ホスフェート当たり最大２ＮＡＤＰＨが生成されるであろう。

ＮＡＤＰＨ利用可能性の増加により２−ＨＩＢＡの産生を向上させるために修飾された微生物も、本発明の一部である。

段階ａ）、ｂ）およびｃ）を含むグルコースから２−ＨＩＢＡへの生合成経路は、図１に示されている。

発酵による産生
本発明は、
上記および以下に定義される本発明による微生物を、単一炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養し、
培養培地から２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）を回収する
段階を含んでなる、単一炭素源の２−ＨＩＢＡへの転換による２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）の発酵による産生方法も開示する。

更に詳細には、本発明は、
単一炭素源を含んでなる適当な培養培地で２−ＨＩＢＡの産生を向上させるために修飾した微生物を培養し、
培養培地から２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）を回収する
段階を含んでなる、単一炭素源の２−ＨＩＢＡへの転換による２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）の発酵による産生方法であって、
前記微生物を
ａ）アセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに転換し、
ｂ）上記で得られた３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡに転換し、
ｃ）２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソ酪酸に転換する
ことからなる連続段階ａ）、ｂ）およびｃ）によって、アセチル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソ酪酸に転換する酵素をコードする遺伝子を発現するように修飾する、方法を提供する。

好ましい態様では、微生物は、一層高濃度のアセチル−ＣｏＡを産生するように修飾される。微生物は、ＮＡＤＰＨ利用可能性を増加させるように修飾されることもある。

微生物のすべての修飾は、上記および以下に開示される。

発酵は、一般的には少なくとも１種類の単一炭素源と必要ならば補助基質とを含む、用いられる微生物に適合した適当な培養培地を有する発酵槽で行われる。

発酵は好気性、微好気性または嫌気性条件下で行うことができる。幾つかの態様では、微好気性条件下での培養では収率が増加することがあることが見出された。

本発明の産生方法では、微生物は、適当な培養培地で培養される。

「適当な培地」とは、微生物の増殖に適合した既知の分子組成の培地を意味する。詳細には、前記培地は、少なくともリンの供給源と窒素の供給源とを含んでいる。前記適当な培地は、例えば、少なくとも１種類の炭素源を含む、用いる細菌に適合した既知の組成セットの無機培養培地である。前記適当な培地は、窒素供給源および／またはリン供給源を含んでなる任意の液体であって、前記液体はスクロースの供給源に添加しおよび／または混合されるものを示すこともある。従って、詳細には、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)用の無機増殖培地は、Ｍ９培地(Anderson, 1946)、Ｍ６３培地(Miller, 1992)またはSchaefer et al.(1999)によって定義されたような培地と同一または同様な組成のものであることができる。

Ｅ．ｃｏｌｉ用の既知培養培地の一例としては、培養培地は、Ｍ９培地（Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128）、Ｍ６３培地（Miller, 1992；「速成細菌遺伝学：大腸菌および関連細菌の実験室便覧および手引(A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria)」， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，ニューヨーク）またはSchaefer et al.によって定義されたような培地（1999, Anal. Biochem. 270: 88-96）と同一または同様な組成のものであることができる。

Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用の培養培地のもう一つの例としては、ＢＭＣＧ培地(Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210)またはRiedel et al.(2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583)によって報告されたような培地と同一または同様な組成のものであることができる。

当業者であれば、本発明による微生物のための培養条件を規定することができる。詳細には、細菌は、２０°Ｃと５５°Ｃとの間、優先的には２５°Ｃと４０°Ｃとの間、更に具体的にはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍについては約３０°ＣおよびＥ．ｃｏｌｉについては約３７°Ｃの温度で発酵される。

炭素源「グルコース」は、この培地では任意の他の炭素源、詳細には、スクロースまたはサトウキビ液またはサトウダイコン液のような任意のスクロースを含む炭素源によって、換えることができる。

「炭素源」または「炭素基質」とは、微生物が代謝することができる任意の炭素原であって、少なくとも１個の炭素原子を含む基質を意味する。

好ましくは、炭素源は、グルコース、スクロース、単糖類またはオリゴ糖類、澱粉またはその誘導体、またはグリセロール、およびそれらの混合物からなる群から選択される。

実際に、本発明の方法で用いられる微生物は、非修飾微生物が同じ炭素源上で増殖することができないか、または低率でしか増殖できないときに、特定の炭素源上で増殖できるように修飾することもできる。これらの修飾は、炭素源がサトウキビの副生成物のようなバイオマス分解の副生成物、例えば未処理液および様々な種類の糖蜜の清澄化から得られるフィルターケーキであるときに、必要となってもよい。

培養培地からの２−ヒドロキシイソ酪酸の回収は、当業者にとっては所定の作業である。

本発明の一態様では、回収された２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）は、更に精製される。

１例１：２−ヒドロキシイソ酪酸を産生する菌株：ＭＧ１６５５ｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２の構築
２−ヒドロキシイソ酪酸を産生するＥ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５株を構築するため、ムターゼ活性をコードするＭｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍの遺伝子ｉｃｍＡおよびｉｃｍＢを、それぞれアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼおよび３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性をコードするＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈａＡおよびｐｈａＢ遺伝子と組み合わせてプラスミド上で過剰発現させる。それぞれの個々のおよび組合せた構築物を、下記に詳細に説明する。

１．１Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍのヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼｉｃｍＡおよびｉｃｍＢの過剰発現のためのプラスミド：ｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７プラスミドの構築

この目的のため、Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍｉｃｍＡおよびｉｃｍＢヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ遺伝子を、Ｇｅｎｅａｒｔ社で調製した。遺伝子のコドン使用頻度および遺伝子のＧＣ含量を、サプライヤーマトリックスに準じてＥ．ｃｏｌｉに適合させた。オペロンで組織化した合成遺伝子の発現を、構成的Ｐｔｒｃプロモーターによって行った。転写ターミネーターを、遺伝子の下流に付加した。構築物をサプライヤーのｐＭベクターにクローニングして、シークエンスによって検証した。従って、Ｅ．ｃｏｌｉ株の形質転換前に必要ならば、この構築物をｐＭＥ１０１ベクターにクローニングしてもよい（このプラスミドは、プラスミドｐＣＬ１９２０に由来する(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)）。

Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７は、
配列番号１：制限部位（ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＥｃｏＲＶ）：ｇｇａｔｃｃａｔｇｃａａｇｃｔｔａｔｇｃｇａｔａｔｃ
配列番号２：Ｐｔｒｃ０１プロモーター：ｇａｇｃｔｇｔｔｇａｃａａｔｔａａｔｃａｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔａａｔｇｔｇｔｇｇａａｔａａｇｇａｇｇｔａｔａｔｃ
配列番号３：Ｅ．ｃｏｌｉについて最適化したｉｃｍＡｍｐ遺伝子配列（ＹＰ＿００１０２３５４６．）：
配列番号４：遺伝子間配列：ｇａａｔａａｇｇａｇｇｔａｔａｔｔ
配列番号５：Ｅ．ｃｏｌｉについて最適化したｉｃｍＢｍｐ遺伝子配列（ＹＰ＿００１０２３５４３．）
配列番号６：終了配列Ｔ７Ｔｅ（文献：Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.）：ｃｔｇｇｃｔｃａｃｃｔｔｃｇｇｇｔｇｇｇｃｃｔｔｔｃｔｇ
配列番号７：制限部位（ＳｍａＩ，ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ）：ｃｃｃｃｇｇｇａｔｇｃｇｇａｔｃｃａｔｇｃｇａａｔｔｃ
から構成されている。

低コピーベクターの発現には、プラスミドｐＭＥ１０１を下記のようにして構築することができる。プラスミドｐＣＬ１９２０を、オリゴヌクレオチドＰＭＥ１０１ＦおよびＰＭＥ１０１Ｒと、ｌａｃＩ遺伝子を含むベクターｐＴＲＣ９９Ａ由来のＢｓｔＺ１７Ｉ−ＸｍｎＩ断片とを用いてＰＣＲ増幅し、Ｐｔｒｃプロモーターを増幅したベクターに挿入する。得られるベクターおよびｉｃｍＡｍｐおよびｉｃｍＢｍｐ遺伝子を含むベクターは、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩによって制限することができ、ｉｃｍＡｍｐおよびｉｃｍＢｍｐを含む断片をベクターｐＭＥ１０１にクローニングすることができ、得られるプラスミドをｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７と命名する。
ＰＭＥ１０１Ｆ（配列番号８）：ｃｃｇａｃａｇｔａａｇａｃｇｇｇｔａａｇｃｃｔｇ
ＰＭＥ１０１Ｒ（配列番号９）：ａｇｃｔｔａｇｔａａａｇｃｃｃｔｃｇｃｔａｇ

１．２Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼｐｈａＡおよび３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼｐｈａＢの過剰発現のためのプラスミド：ｐＭＥ１０１−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２プラスミドの構築
上記のように、この目的のために、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａの合成遺伝子であるｐｈａＡアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼおよびｐｈａＢ３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を、Ｇｅｎｅａｒｔ社で調製した。オペロンで組織化された合成遺伝子の発現を、構成的Ｐｌａｃプロモーターにより行った。転写ターミネーターを、遺伝子の下流に付加した。この構成物をサプライヤーのｐＭベクターにクローニングして、シークエンスによって検証した。従って、この構成物は、必要ならば、Ｅ．ｃｏｌｉ株を形質転換する前にｐＭＥ１０１ベクターにクローニングすることができる。

Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２は、
配列番号１０：制限部位（ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳｍａＩ）：ｇｇａｔｃｃａｔｇｃａａｇｃｔｔａｔｇｃｃｃｃｇｇｇ
配列番号１１：Ｐｌａｃプロモーター：ａａｇｃｔｃａｃｔｃａｔｔａｇｇｃａｃｃｃｃａｇｇｃｔｔｔａｃａｃｔｔｔａｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔｇｔｔｇｔｇｔｇｇａａｔｔｇｔｇａｇｃｇｇａｔａａｃａａｔｔｔｃａｃａｃａｇｇａｃｔａｃａｃａ
配列番号１２：Ｅ．ｃｏｌｉについて最適化したｐｈａＡｒｅ遺伝子配列（ＹＰ＿７２５９４１．）
配列番号１３：遺伝子間配列：
ｇｇａａｇｇｇｇｔｔｔｔｃｃｇｇｇｇｃｃｇｃｇｃｇｃｇｇｔｔｇｇｃｇｃｇｇａｃｃｃｇｇｃｇａｃｇａｔａａｃｇａａｇｃｃａａｔｃａａｇｇａｇｔｇｇａｃ
配列番号１４：Ｅ．ｃｏｌｉについて最適化したｐｈａＢｒｅ遺伝子配列（ＹＰ＿７２５８４２．）
配列番号１５：ターミネーター配列ｒｒｎＢｔ１（文献：Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.）：ｃａｔｃａａａｔａａａａｃｇａａａｇｇｃｔｃａｇｔｃｇａａａｇａｃｔｇｇｇｃｃｔｔｔｃｇｔｔｔｔａｔｃｔｇｔｔ
配列番号１６：制限部位（ＢｓｔＺ１７Ｉ，ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ）：ｇｔａｔａｃｔｇｃａｇｇａｔｃｃａｔｇｃｇａａｔｔｃ
から構成されている。

ｐＭＥ１０１ベクターおよびｐｈａＡｒｅおよびｐｈａＢｒｅ遺伝子を含むベクターは、ＢｓｒＢＩおよびＢａｍＨＩによって制限することができ、ｐｈａＡｒｅおよびｐｈａＢｒｅを含む断片をベクターｐＭＥ１０１にクローニングすることができ、得られるプラスミドを、ｐＭＥ１０１−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２と命名する。

１．３Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍのヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼｉｃｍＡおよびｉｃｍＢ、およびＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼｐｈａＡおよび３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼｐｈａＢの過剰発現のためのプラスミド：ｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２プラスミドの構築
１種類のＥ．ｃｏｌｉ株でｉｃｍＡ、ｉｃｍＢ、ｐｈａＡおよびｐｈａＢ遺伝子を共発現させるため、ｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７ベクターおよびｐＭＥ１０１−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２遺伝子を含むベクターをＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩによって制限することができ、断片を含むｐｈａＡｒｅおよびｐｈａＢｒｅをベクターｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７にクローニングすることができ、得られるプラスミドを、ｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２と命名する。

１．４菌株ＭＧ１６５５ｐＭＥ１０１−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２およびＭＧ１６５５ｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２の構築
上記のプラスミドｐＭＥ１０１−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２およびｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２を、菌株ＭＧ１６５５に導入する。得られた第一の菌株ＭＧ１６５５ｐＭＥ１０１−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２をＨＩ０００８と命名し、得られた第二の菌株ＭＧ１６５５ｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２をＨＩ００１２と命名する。

２例２：２−ヒドロキシイソ酪酸を産生する菌株：ＭＧ１６５５ｐＵＣ１８−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２の構築
ムターゼ活性をコードするＭｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍのｉｃｍＡおよびｉｃｍＢ遺伝子、およびＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ由来のアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼおよび３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性をそれぞれコードするｐｈａＡおよびｐｈａＢ遺伝子の発現を一層高くするため、これらの遺伝子を高コピー数ｐＵＣ１８プラスミドに導入する。

２．１Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍのヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼｉｃｍＡおよびｉｃｍＢを過剰発現するためのプラスミド：ｐＵＣ１８−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７プラスミドの構築
ｉｃｍＡｍｐおよびｉｃｍＢｍｐ遺伝子を含むベクター（ｐＭ−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７ＧｅｎｅａｒｔのｐＭベクター）をＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって制限し、断片を含むｉｃｍＡｍｐおよびｉｃｍＢｍｐを同じ制限酵素によって制限したベクターｐＵＣ１８にクローニングし、得られるプラスミドをｐＵＣ１８−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７と命名する。

２．２Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍのヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼｉｃｍＡおよびｉｃｍＢを過剰発現し、かつＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼｐｈａＡおよび３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼｐｈａＢを過剰発現するためのプラスミド：ｐＵＣ１８−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２プラスミドの構築

ｐｈａＡｒｅおよびｐｈａＢｒｅ遺伝子を含むベクター（ｐＭ−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２ＧｅｎｅａｒｔのｐＭベクター）をＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩによって制限し、断片を含むｐｈａＡｒｅおよびｐｈａＢｒｅを同じ制限酵素によって制限されたベクターｐＵＣ１８−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７にクローニングし、得られるプラスミドをｐＵＣ１８−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２と命名する。

２．３菌株ＭＧ１６５５ｐＵＣ１８−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２の構築
上記のｐＵＣ１８−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２プラスミドを、菌株ＭＧ１６５５に導入する。得られた菌株ＭＧ１６５５ｐＵＣ１８−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２を、ＨＩ００６０と命名する。

３例３：ＮＡＤＰＨ利用可能性の増加した菌株：ＭＧ１６５５ Δｐｇｉ ΔｕｄｈＡｐＵＣ１８−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２の構築
ＮＡＤＰＨ利用可能性を増加させて２−ヒドロキシイソ酪酸産生を最適にするために、上記のプラスミドをｐｇｉ（グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼをコードする）およびｕｄｈＡ（可溶性のトランスヒドロゲナーゼをコードする）遺伝子が欠失している株Ｅ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５に導入する。

３．１菌株ＭＧ１６５５ Δｐｇｉ：：Ｃｍの構築
ｐｇｉ遺伝子を欠失させるために、Ｄａｔｓｅｎｋｏ＆Ｗａｎｎｅｒ(2000)によって報告されている相同組換え法を用いる。この方法により、関係した遺伝子のほとんどを欠失させながら、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することができる。この目的には、下記のオリゴヌクレオチド：
遺伝子ｐｇｉの配列（４２３１３５２−４２３１４３１）に相同する領域（小文字）(ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/上の配列参照)、
クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645における配列参照)
を有するＤｐｇｉＦ（配列番号１７）：ｃｃａａｃｇｃａｇａｃｃｇｃｔｇｃｃｔｇｇｃａｇｇｃａｃｔａｃａｇａａａｃａｃｔｔｃｇａｔ
ｇａａａｔｇａａａｇａｃｇｔｔａｃｇａｔｃｇｃｃｇａｔｃｔｔｔｔｔｇｃＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ、
遺伝子ｐｇｉの配列（４２３２９８０−４２３２９０１）に相同する領域（小文字）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/上の配列参照）、
クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:６６４０−６６４５における参照配列)
を有するＤｐｇｉＲ（配列番号１８）：ｇｃｇｃｃａｃｇｃｔｔｔａｔａｇｃｇｇｔｔａａｔｃａｇａｃｃａｔｔｇｇｔｃｇａｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｃｔｇａｔｔｔｃｔｔｔａｔｃａｔｃｔｔｔｃａｇｃｔｃｔｇＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ
を用いる。

オリゴヌクレオチドＤｐｇｉＦおよびＤｐｇｉＲを用いて、プラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅する。次いで、得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションによって菌株ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）に導入する。次いで、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択して、耐性カセットの挿入を、下記に定義されるオリゴヌクレオチドｐｇｉＦおよびｐｇｉＲを用いるＰＣＲ分析によって検証する。保持される菌株を、ＭＧ１６５５ Δｐｇｉ：：Ｃｍと命名する。
ｐｇｉＦ（配列番号１９）：ｇｃｇｇｇｇｃｇｇｔｔｇｔｃａａｃｇａｔｇｇｇｇｔｃａｔｇｃ（配列４２３１１３８から４２３１１６７に相同）。
ｐｇｉＲ（配列番号２０）：ｃｇｇｔａｔｇａｔｔｔｃｃｇｔｔａａａｔｔａｃａｇａｃａａｇ（配列４２３３２２０から４２３３１９１に相同）。

３．２菌株ＭＧ１６５５ Δｐｇｉ ΔｕｄｈＡの構築
ｕｄｈＡ遺伝子を、形質導入によってＭＧ１６５５ Δｐｇｉ：：Ｃｍ株で欠失させる。

ＭＧ１６５５ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ株を、最初に上記と同じ方法を用いて下記のオリゴヌクレオチド：
遺伝子ｕｄｈＡの配列（４１５７５８８−４１５７６６７）に相同する領域（ボールド文字）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/上の配列参照）、
カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（下線付文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:６６４０−６６４５における配列参照）
を有するＤｕｄｈＡＦ（配列番号２１）：ＣＣＣＡＧＡＡＴＣＴＣＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＣＧＡＴＧＧＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＣＣＡＣＧＴＴＣＡＴＧＣＣＧＡＣＧＡＴＴＴＧＴＧＣＧＣＧＴＧＣＣＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ、
遺伝子ｕｄｈＡの配列（４１５８７２９−４１５８６５０）に相同する領域（ボールド文字）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/上の配列参照）、
カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（下線付文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:６６４０−６６４５における配列参照）
を有するＤｕｄｈＡＲ（配列番号２２）：ＧＧＴＧＣＧＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＴＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＴＡＴＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＧＧＧＧＣＡＣＣＡＴＣＣＣＧＴＣＧＡＡＡＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ
を用いて構築する。

オリゴヌクレオチドＤｕｄｈＡＦおよびＤｕｄｈＡＲを用いて、プラスミドｐＫＤ４由来のカナマイシン耐性カセットを増幅する。次いで、得られたＰＣＲ産物を、エレクトロポレーションによって菌株ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）に導入する。次いで、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を下記に定義したオリゴヌクレオチドｕｄｈＡＦおよびｕｄｈＡＲを用いるＰＣＲ分析によって検証する。保持された菌株を、ＭＧ１６５５ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍと命名する。
ｕｄｈＡＦ（配列番号２３）：（４１５７０８８から４１５７１０８の配列に相同）：
ＧＡＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＣＡＣＴ
ｕｄｈＡＲ（配列番号２４）：（４１５９０７０から４１５９０５２の配列に相同）：
ｇｔｇａａｔｇａａｃｇｇｔａａｃｇｃ

欠失ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍを転移するため、ファージＰ１の形質導入の方法を用いる。下記のプロトコルを、菌株ＭＧ１６５５ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍのファージ溶解産物の調製に継ぐ、菌株ＭＧ１６５５ Δｐｇｉ：：Ｃｍへの形質導入の２段階で実行する。菌株の構築は、上記した通りである。

ファージ溶解産物Ｐ１の調製：
ＬＢ＋Ｋｍ５０μｇ／ｍｌ＋０．２％グルコース＋５ｍＭＣａＣｌ_２１０ｍｌに菌株ＭＧ１６５５ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍの一晩培養したもの１００μｌを接種、
３７℃で３０分間振盪培養、
菌株ＭＧ１６５５上で調製したファージ溶解産物Ｐ１１００μｌを添加（約１．１０^９個のファージ／ｍｌ）、
すべての細胞が溶解するまで３７℃で３時間振盪、
クロロホルム２００μｌを添加し、渦流攪拌、
４５００ｇで１０分間遠心分離して、細胞破片を除去、
上清を滅菌試験管に移し、クロロホルム２００μｌを添加、
溶解産物を４℃で保管。

形質導入
ＬＢ培地で菌株ＭＧ１６５５ Δｐｇｉ：：Ｃｍを一晩培養したもの５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離、
細胞ペレットを１０ｍＭＭｇＳＯ_４＋５ｍＭＣａＣｌ_２２．５ｍｌに懸濁、
対照試験管：細胞１００μｌ
菌株ＭＧ１６５５ ΔｕｄｈＡ：：ＫｍのファージＰ１１００μｌ、
検定試験管：細胞１００μｌ＋菌株ＭＧ１６５５ ΔｕｄｈＡ：：ＫｍのファージＰ１１００μｌ、
３０℃で振盪せずに３０分間インキュベーション、
それぞれの試験管に１Ｍクエン酸ナトリウム１００μｌを添加し、渦流攪拌、
ＬＢ１ｍｌを添加、
３７℃で振盪しながら１時間インキュベーション、
試験管を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、シャーレＬＢ＋Ｋｍ５０μｇ／ｍｌ上に塗布、
３７℃で一晩インキュベーション。

菌株の検証
次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、遺伝子ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍの欠失を上記のオリゴヌクレオチドｕｄｈＡＦおよびｕｄｈＡＲを用いるＰＣＲ分析によって検証する。保持されている菌株を、ＭＧ１６５５ Δｐｇｉ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍと命名する。

カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットを、次に除去することができる。カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを持つプラスミドｐＣＰ２０を、次にエレクトロポレーションによって組換え部位に導入する。一連の培養を４２℃で行った後、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットの喪失を、上記で用いたのと同じオリゴヌクレオチド（ｐｇｉＦ／ｐｇｉＲおよびｕｄｈＡＦ／ｕｄｈＡＲ）を用いるＰＣＲ分析によって検証する。保持されている菌株を、ＭＧ１６５５ Δｐｇｉ ΔｕｄｈＡと命名する。

３．３菌株ＭＧ１６５５ Δｐｇｉ ΔｕｄｈＡｐＵＣ１８−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２の構築
上記のｐＵＣ１８−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２プラスミドを、菌株ＭＧ１６５５ Δｐｇｉ ΔｕｄｈＡに導入する。得られた菌株ＭＧ１６５５ Δｐｇｉ ΔｕｄｈＡｐＵＣ１８−Ｐｔｒｃ０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２を、ＨＩ００６２と命名する。

４例４：ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ活性の増加した菌株：ＭＧ１６５５（ｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２）（ｐＪＢ１３７−ｆｌｄＡ−ＴＴ０７−ｆｐｒ）の構築
ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ活性を増加させるため、フラボドキシンおよびフラボドキシンレダクターゼをコードする遺伝子を過剰発現させる。

４．１フラボドキシンｆｌｄＡの過剰発現およびフラボドキシンレダクターゼｆｐｒの過剰発現のためのプラスミド：ｐＪＢ１３７−ｆｌｄＡ−ＴＴ０７−ｆｐｒの構築
プラスミドｐＪＢ１３７−ｆｌｄＡ−ＴＴ０７−ｆｐｒは、プラスミドｐＪＢ１３７由来である(Blatny et al., 1997; ApplEnviron Microbiol. 1997 Feb; 63(2):370-9.)。

プラスミドｐＪＢ１３７−ｆｌｄＡ−ＴＴ０７−ｆｐｒを構築するため、最初にｆｌｄＡ−ＴＴ０７領域を、以下のオリゴヌクレオチド、ＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ−ｆｌｄＡ−Ｆ−１およびｆｌｄＡ−ｆｐｒ−Ｒ−２(ウェブサイトhttp://ecogen.org/上の配列参照)を用いてＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡからのＰＣＲによって増幅した。次いで、ＴＴ０７−ｆｐｒ領域を、以下のオリゴヌクレオチド、ｆｌｄＡ−ｆｐｒ−Ｆ−３およびｆｐｒ−ＢａｍＨＩ−Ｒ−４(ウェブサイトhttp://ecogen.org/上の配列参照)を用いてＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡからのＰＣＲによって増幅した。三番目の段階で、ｆｌｄＡ−ＴＴ０７−ｆｐｒ領域を、ｆｌｄＡ−ＴＴ０７およびＴＴ０７−ｆｐｒＰＣＲ産物を混合し、かつＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ−ｆｌｄＡ−Ｆ−１およびｆｐｒ−ＢａｍＨＩ−Ｒ−４オリゴヌクレオチドを用いることによってＰＣＲ増幅した。ｆｌｄＡ−ｆｐｒ−Ｒ−２およびｆｌｄＡ−ｆｐｒ−Ｆ−３オリゴヌクレオチドは、両方ともそれらの全配列をオーバーラップし、融合ＰＣＲによって２つの断片を連結できるように設計した。得られるＰＣＲ産物を、ｐＳＣＢベクター(Stratagene)にクローニングし、シークエンシングによって検証し、ベクターをｐＳＣＢ−ｆｌｄＡ−ＴＴ０７−ｆｐｒと命名した。

ＢａｍＨＩ部位を含む領域（下線付き大文字）、
追加塩基(extra-bases)を有する領域（小文字）、
ＮｃｏＩ部位を有する領域（斜体大文字）、
ｆｌｄＡ領域（７１０８０４から７１０７８４まで）と相同する領域（ボールド大文字）
を有するＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ−ｆｌｄＡ−Ｆ−１（配列番号２５）：
ＧＧＡＴＣＣａｔｇｃＣＣＡＴＧＧＴＧＴＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＧＴＴＴＧＣ。

ｆｌｄＡ領域（７１０１７９から７１０１５６まで）に相同する領域（ボールド大文字）、
Ｔ７ｔｅ転写終了配列に対する領域（下線付き大文字）(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):５０１９−２４)、
ＳｍａＩ部位を含む領域（斜体大文字）、
ｆｐｒ領域（４１１２５８３から４１１２５６３まで）に相同する領域（小文字）
を有するｆｌｄＡ−ｆｐｒ−Ｒ−２（配列番号２６）：ｇｇａｃｔｇｇａａｇｇｃｔｃａａｔｃｇａｔＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＡＴＣＡＴＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＴＴＴＣＧＴＣＧ。

ｆｌｄＡ領域（７１０１７９から７１０１５６まで）に相同する領域（ボールド大文字）、
Ｔ７ｔｅ転写終了配列に対する領域（下線付き大文字）(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):５０１９−２４)、
ＳｍａＩ部位を含む領域（斜体大文字）、
ｆｐｒ領域（４１１２５８３から４１１２５６３まで）に相同する領域（小文字）
を有するｆｌｄＡ−ｆｐｒ−Ｆ−３（配列番号２７）：ＣＧＡＣＧＡＡＡＴＴＣＴＣＡＡＴＧＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＧＴＧＧＧＣＣＴＴＴＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧａｔｃｇａｔｔｇａｇｃｃｔｔｃｃａｇｔｃｃ。

ｆｐｒ領域（４１１１７７０から４１１１７４９まで）に相同する領域（小文字）、
ＢａｍＨＩ部位を含む領域（斜体大文字）
を有するｆｐｒ−ＢａｍＨＩ−Ｒ−４（配列番号２８）：ＧＧＡＴＣＣｔｔａｃｃａｇｔａａｔｇｃｔｃｃｇｃｔｇｔｃ。

遺伝子ｆｌｄＡおよびｆｐｒを低コピーベクターに転移するため、ベクターｐＳＣＢ−ｆｌｄＡ−ＴＴ０７−ｆｐｒを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｆｌｄＡ−ＴＴ０７−ｆｐｒ断片をｐＪＢ１３７ベクターのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ベクターｐＪＢ１３７−ｆｌｄＡ−ＴＴ０７−ｆｐｒを得た。

４．２菌株ＭＧ１６５５（ｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２）（ｐＪＢ１３７−ｆｌｄＡ−ＴＴ０７−ｆｐｒ）の構築
上記のｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２およびｐＪＢ１３７−ｆｌｄＡ−ＴＴ０７−ｆｐｒプラスミドを、菌株ＭＧ１６５５に導入する。得られた菌株ＭＧ１６５５（ｐＭＥ１０１−ｉｃｍＡｍｐ−ｉｃｍＢｍｐ−ＴＴ０７−Ｐｌａｃ−ｐｈａＡｒｅ−ｐｈａＢｒｅ−ＴＴ０２）（ｐＪＢ１３７−ｆｌｄＡ−ＴＴ０７−ｆｐｒ）を、ＨＩ００４８と命名する。

５例５：ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼをコードするＭ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍのｉｃｍＡおよびｉｃｍＢ遺伝子産物の精製、および遺伝子産物が反応３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ＜−＞２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを触媒することの証明
ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ活性が３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡへの転換を触媒することを証明するため、２つのサブユニットｉｃｍＡおよびｉｃｍＢを別々に精製し、活性多量体タンパク質をインビトロで再構築した。

５．１ｉｃｍＡｍｐおよびｉｃｍＢｍｐに対する過剰発現プラスミドの構築

５．１．１プラスミドｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｉｃｍＡｍｐの構築
Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ由来の遺伝子ｉｃｍＡを増幅するため、鋳型としてのＧｅｎｅＡｒｔ社製のサプライヤーのｐＭベクター（例１参照）と、ｐＰＡＬ７−ｉｃｍＡｍｐＦおよびｐＰＡＬ７−ｉｃｍＡｍｐＲとを用いてＰＣＲを行う。
ｐＰＡＬ７−ｉｃｍＡｍｐＦ（配列番号２９）
ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＣＴＴＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣＡＧ
ｐＰＡＬ７−ｉｃｍＡｍｐＲ（配列番号３０）
ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＡＡＣＡＣＣＧＧＧＧＴＴＴＣＡＣＧＡＴＡＧＧ

ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、同じ制限酵素によって切断されたベクターｐＰＡＬ７（ＰｒｏｆｉｎｉｔｙｅＸａｃｔｐＰＡＬ７ベクターＢｉｏｒａｄ）にクローニングする。得られるプラスミドを、ｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｉｃｍＡｍｐと命名する。過剰発現したタンパク質は、２種類の付加アミノ酸（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）をもたらし、これは精製の成功を確実にするために用いたタグとタンパク質との間のスペーサーに相当する。

ベクターｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｉｃｍＡｍｐをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）のケミカルコンピテントセルに導入し、菌株ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）（ｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｉｃｍＡｍｐ）を得る。

５．１．２プラスミドｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｉｃｍＢｍｐの構築
Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ由来の遺伝子ｉｃｍＢを増幅するため、鋳型としてのＧｅｎｅＡｒｔ社製のサプライヤーのｐＭベクター（例１参照）と、ｐＰＡＬ７−ｉｃｍＢｍｐＦおよびｐＰＡＬ７−ｉｃｍＢｍｐＲとを用いてＰＣＲを行う。
ｐＰＡＬ７−ｉｃｍＢｍｐＦ（配列番号３１）
ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＣＴＴＣＴＡＴＧＧＡＴＣＡＧＡＴＴＣＣＧＡＴＴＣＧＴＧ
ｐＰＡＬ７−ｉｃｍＢｍｐＲ（配列番号３２）
ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＧＣＧＣＡＣＣＡＣＧＣＧＣＣＧＣＡＡＣＣ

ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、同じ制限酵素によって切断されたベクターｐＰＡＬ７（ＰｒｏｆｉｎｉｔｙｅＸａｃｔｐＰＡＬ７ベクターＢｉｏｒａｄ）にクローニングする。得られるプラスミドを、ｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｉｃｍＢｍｐと命名する。過剰発現したタンパク質は２種類の付加アミノ酸（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）をもたらし、これは精製の成功を確実にするために用いたタグとタンパク質との間のスペーサーに相当する。

ベクターｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｉｃｍＢｍｐをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）のケミカルコンピテントセルに導入し、菌株ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）（ｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｉｃｍＢｍｐ）を得る。

５．２ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼの２つのサブユニットＩｃｍＡｍｐおよびＩｃｍＢｍｐの過剰産生
タンパク質ＩｃｍＡｍｐおよびＩｃｍＢｍｐの過剰産生を、２リットル三角フラスコ中で２．５ｇ／ｌグルコースおよび１００ｐｐｍアンピシリンを補足したＬＢ培地(Bertani, 1951, J. Bacteriol. 62:293-300)を用いて行った。一晩の前培養を用いて、５００ｍｌ培養物をＯＤ_{６００ｎｍ}が約０．１となるように接種した。この前培養を、２．５ｇ／ｌグルコースおよび１００ｐｐｍアンピシリンを補足したＬＢ培地５０ｍｌを満たした５００ｍｌ三角フラスコで行った。培養物を、最初にＯＤ_{６００ｎｍ}が約０．５となるまで３７℃および２００ｒｐｍで振盪器上に保持した後、培養物を、ＯＤ_{６００ｎｍ}が０．６〜０．８（約１時間）となるまで２５℃および２００ｒｐｍで第二の振盪器上に約１時間移動した後、５００μＭＩＰＴＧで誘導した。培養物を、ＯＤ_{６００ｎｍ}が約４となるまで２５℃および２００ｒｐｍに保持した後、停止した。細胞を４℃、７０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、−２０℃で保管した。

５．３タンパク質ＩｃｍＡｍｐおよびＩｃｍＢｍｐの精製

５．３．１段階１：無細胞抽出物の調製
Ｅ．ｃｏｌｉバイオマス約１００ｍｇを１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６およびプロテアーゼ阻害剤カクテル１５ｍｌに再懸濁した。細胞懸濁液を、５０ｍｌコニカル試験管中で氷上で３０秒間ずつ３０秒間の間隔を置きながら８サイクル音波処理を行った（ＢａｎｄｅｌｉｎＳｏｎｏｐｌｕｓ，７０Ｗ）。音波処理の後、細胞を５ｍＭＭｇＣｌ_２および１ＵＩ／ｍｌＤＮａｓｅＩと共に室温で３０分間インキュベーションした。細胞破片を、１２０００ｇ、４℃で、３０分間遠心分離によって除去した。

５．３．２段階２：アフィニティー精製
タンパク質を、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙカラム（ＢＩＯＲＡＤ，Ｂｉｏ−ＳｃａｌｅＭｉｎｉＰｒｏｆｉｎｉｔｙｅＸａｃｔカートリッジ１ｍｌ）上で製造業者の推奨するプロトコルに準じて親和力によって粗製細胞抽出物から精製した。粗製抽出物を、１ｍｌＰｒｏｆｉｎｉｔｙｅＸａｃｔカートリッジ上に１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で平衡にした１ｍｌを加えた。カラムを、同じ緩衝液の１０カラム容量で洗浄し、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６、１００ｍＭフルオリドと共に４℃で一晩インキュベーションした。タンパク質を、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６の２カラム容量でカラムから溶出した。タグは樹脂にしっかり結合して保持され、精製タンパク質が放出された。タンパク質を含む画分をプールし、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌおよび１０％グリセロールｐＨ８に対して透析した。

タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質分析法を用いて測定した。

５．４ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ分析
ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ分析を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４、５ｍＭＥＤＴＡ、コエンザイムＢ１２２０μＭ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ１ｍＭまたは１０ｍＭ、１０％グリセロール、および等モル濃度で混合した精製ＩｃｍＡｍｐおよびＩｃｍＢｍｐ約１７μｇを用いて総容積５００μｌで行った。反応は、暗所で３０℃にて１２０分間インキュベーションし、１５％（ｖ／ｖ）Ｈ_２ＳＯ_４２５０μｌで酸性にした後、２ＭＫＯＨ２５０μｌを加えて停止した。酵素分析は、好気性および嫌気性条件の両方で行った。形成した酸（２−ヒドロキシイソ酪酸）を、ＬＣ−ＭＳによって測定した。

５．５精製酵素の活性

インビトロで測定したこの活性は、ＩｃｍＡｍｐ、ＩｃｍＢｍｐおよびコエンザイムＢ１２の混合物から得た多量体活性タンパク質が３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡへの転換（酸加水分解による本発明者らの酵素分析では２−ヒドロキシイソ酪酸への転換）を触媒することを示している。本発明者らは、ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼが、嫌気性条件下では２０倍を上回る活性を有することも示している。

６例６：アシル−ＣｏＡチオエステラーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉのｔｅｓＢ遺伝子産物、およびホスホトランスブチリラーゼおよびブチレートキナーゼ活性をコードするＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｐｔｂｃａおよびｂｕｋｃａ遺伝子産物の精製、および遺伝子産物が２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの２−ヒドロキシイソ酪酸への転換を触媒することの証明
アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性、またはホスホトランスブチリラーゼとブチレートキナーゼ活性との組合せが、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの２−ヒドロキシイソ酪酸への転換を触媒することを証明するため、３種類のｔｅｓＢ、ｐｔｂｃａおよびｂｕｋｃａ遺伝子産物を別々に精製し、酵素分析を実現した。

６．１ｔｅｓＢ、ｐｔｂｃａおよびｂｕｋｃａに対する過剰発現プラスミドの構築

６．１．１プラスミドｐＰＡＬ７−ｔｅｓＢの構築
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来の遺伝子ｔｅｓＢを増幅するため、鋳型としてのＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡと、ｐＰＡＬ７−ｔｅｓＢＦおよびｐＰＡＬ７−ｔｅｓＢＲと命名されたプライマーとを用いてＰＣＲを行う。
ｐＰＡＬ７−ｔｅｓＢＦ（配列番号３３）
ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＧＣＧＣＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＣＴＧＡＣ
ｐＰＡＬ７−ｔｅｓＢＲ（配列番号３４）
ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＴＧＴＧＡＴＴＡＣＧＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＴＣＣ

ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、同じ制限酵素によって切断されたベクターｐＰＡＬ７（ＰｒｏｆｉｎｉｔｙｅＸａｃｔｐＰＡＬ７ベクターＢｉｏｒａｄ）にクローニングする。得られるプラスミドを、ｐＰＡＬ７−ｔｅｓＢと命名する。

ベクターｐＰＡＬ７−ｔｅｓＢを、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）のケミカルコンピテントセルに導入し、菌株ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）（ｐＰＡＬ７−ｔｅｓＢ）を得る。

６．１．２プラスミドｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｐｔｂｃａの構築
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来の遺伝子ｐｔｂを増幅するため、鋳型としてのＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍゲノムＤＮＡと、ｐＰＡＬ７−ｐｔｂｃａＦおよびｐＰＡＬ７−ｐｔｂｃａＲと命名されたプライマーとを用いて、ＰＣＲを行う。
ｐＰＡＬ７−ｐｔｂｃａＦ（配列番号３５）
ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＣＴＴＣＴＡＴＧＡＴＴＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＡＴＧ
ｐＰＡＬ７−ｐｔｂｃａＲ（配列番号３６）
ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡＡＧＣＴＧＣ。

ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、同じ制限酵素によって切断されたベクターｐＰＡＬ７（ＰｒｏｆｉｎｉｔｙｅＸａｃｔｐＰＡＬ７ベクターＢｉｏｒａｄ）にクローニングする。得られるプラスミドを、ｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｐｔｂｃａと命名する。過剰発現したタンパク質は２種類の付加アミノ酸（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）をもたらし、これは精製の成功を確実にするために用いたタグとタンパク質との間のスペーサーに相当する。

ベクターｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｐｔｂｃａをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）のケミカルコンピテントセルに導入し、菌株ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）（ｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｐｔｂｃａ）を得る。

６．１．３プラスミドｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｂｕｋｃａの構築
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来の遺伝子ｂｕｋを増幅するため、鋳型としてのＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍゲノムＤＮＡと、ｐＰＡＬ７−ｂｕｋｃａＦおよびｐＰＡＬ７−ｂｕｋｃａＲと命名されたプライマーとを用いてＰＣＲを行う。
ｐＰＡＬ−ｂｕｋｃａＦ（配列番号３７）
ＣＣＣＧＣＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＣＴＴＣＴＡＴＧＴＡＴＡＧＡＴＴＡＣＴＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＣＣｐＰＡＬ−ｂｕｋｃａＲ（配列番号３８）
ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣ

ＰＣＲ産物をＳａｐＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、同じ制限酵素で切断されたベクターｐＰＡＬ７（ＰｒｏｆｉｎｉｔｙｅＸａｃｔｐＰＡＬ７ＶｅｃｔｏｒＢｉｏｒａｄ）にクローニングする。得られるプラスミドを、ｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｂｕｋｃａと命名する。過剰発現したタンパク質は、２種類の付加アミノ酸（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）をもたらし、これは精製の成功を確実にするために用いたタグとタンパク質との間のスペーサーに相当する。

ベクターｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｂｕｋｃａをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）のケミカルコンピテントセルに導入し、菌株ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）（ｐＰＡＬ７ＶＢ０１−ｂｕｋｃａ）を得る。

６．２アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、ホスファターゼおよびキナーゼ、ＴｅｓＢ、ＰｔｂｃａおよびＢｕｋｃａの過剰産生
タンパク質ＴｅｓＢ、ＰｔｂｃａおよびＢｕｋｃａを、例５．２と同じプロトコルを適用して過剰産生した。

６．３タンパク質ＴｅｓＢ、ＰｔｂｃａおよびＢｕｋｃａの精製

６．３．１段階１：無細胞抽出物の調製
Ｅ．ｃｏｌｉバイオマス約１００ｍｇ（ＴｅｓＢのためには１２０ｍｇ）を１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６およびプロテアーゼ阻害剤カクテル１５ｍｌに再懸濁した。細胞懸濁液を、５０ｍｌコニカル試験管中で氷上で３０秒間ずつ３０秒間の間隔を置きながら８サイクル音波処理を行った（ＢａｎｄｅｌｉｎＳｏｎｏｐｌｕｓ，７０Ｗ）。音波処理の後、細胞を５ｍＭＭｇＣｌ_２および１ＵＩ／ｍｌＤＮａｓｅＩと共に室温で３０分間インキュベーションした。細胞破片を、１２０００ｇ、４℃にて３０分間遠心分離によって除去した。

６．３．２段階２：アフィニティー精製
タンパク質ＴｅｓＢ、ＰｔｂｃａおよびＢｕｋｃａの精製を、上記の例５．３．２と同じプロトコルを適用して行った。

６．４酵素分析

６．４．１アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ分析
アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ分析を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８、０．１ｍＭ５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、２００μＭ２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡおよび精製タンパク質１１μｇを用いて総容積１ｍｌで行った。４０５ｎｍにおける吸光度の増加率を、分光光度計で３０℃にて測定した。酵素を欠いている対照分析を、この分析値に対して差し引いた。アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性の単位は、毎分基質１μｍｏｌを加水分解するのに必要とする酵素量である。（υ４０５ｎｍ＝１３６００Ｍ^−１ｃｍ^−１）

６．４．２酸−キナーゼ分析
反応を、過剰のヒドロキシルアミンの存在下にて２−ヒドロキシイソ酪酸（または３−ヒドロキシ酪酸）およびＡＴＰを反応物として用いて行う。この分析法は、リン酸アシルが中性で直ちにヒドロキサム酸を形成した後、酸溶液で着色した第二鉄−ヒドロキサメート錯体を形成することができることを用いている。酵素を、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４緩衝液、ＫＯＨで中和した４００ｍＭヒドロキシルアミンｐＨ７．４、５０ｍＭ２−ヒドロキシイソ酪酸、ＫＯＨで中和した１０ｍＭＡＴＰｐＨ７．４、２０ｍＭＭｇＣｌ_２、１５０ｍＭＣｌ、１２０ｍＭＫＯＨおよび精製酵素約５μｇで、総容積１ｍｌで分析した。反応は、精製酵素を用いて３７℃で開始し、反応を３０分後に３７０ｍＭＦｅＣｌ_３、２０％トリクロロ酢酸および７２０ｍＭＨＣｌを含む溶液５００μｌを添加することによって停止した。試験管を、１００００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を氷上で保管し、５４０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定した。酵素を欠いている対照分析を、この分析に対して差し引いた（υ５４０ｎｍ＝１６９Ｍ^−１ｃｍ^−１）。

６．４．３ホスホトランスアシラーゼ分析
ホスホトランスアシラーゼ分析を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４、０．０８ｍＭ５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、２００μＭ２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡおよび精製タンパク質約２μｇを用いて、総容積１ｍｌで行った。４０５ｎｍにおける吸光度の増加率を、分光光度計で３０℃にて測定した。酵素を欠いている対照分析を、この分析に対して差し引いた。ホスホトランスアシラーゼ活性の単位は、毎分基質１μｍｏｌを加水分解するのに必要とする酵素量である（υ４０５ｎｍ＝１３６００Ｍ^−１ｃｍ^−１）。

６．５精製酵素の活性

精製酵素についてインビトロで測定したこれらの活性は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性、およびホスホトランスアシラーゼと酸キナーゼ活性との組合せが、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの２−ヒドロキシイソ酪酸への転換を触媒することを証明している。

６．６標準株Ｅ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５の粗製抽出物についての活性

ｔｅｓＢの染色体バージョンによる標準菌株ＭＧ１６５５で測定したアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ比活性は、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソ酪酸へ転換するのに十分であることを証明する。

７例７：三角フラスコでの２−ヒドロキシイソ酪酸産生株の発酵

７．１バッフル付き三角フラスコにおける２−ＨＩＢＡ産生株の発酵（好気性条件）
菌株の挙動を、最初に１０ｇ／ｌＭＯＰＳ、１０ｇ／ｌグルコース、１０ｍｇ／ｌビタミンＢ１２および１００μＭＩＰＴＧを補足し、ｐＨ６．８に調整した修飾Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)を用いて、５００ｍｌバッフル付き三角フラスコ中で評価した。必要ならば、スペクチノマイシンおよびカルベニシリンを、それぞれ５０ｍｇ／ｌおよび１００ｍｇ／ｌの濃度で加えた。２４時間前培養を用いて、５０ｍｌ培養物をＯＤ_{６００ｎｍ}が約０．３から０．６になるように接種した。（前培養時間を短くすると、菌株ＨＩ００４８ｃ０１の２−ＨＩＢＡ産生が増加した）。培養物を振盪器上に、培養培地中のグルコースが枯渇するまで３７℃および２００ｒｐｍに保持した。グルコース消費を、分離用ＢｉｏｒａｄＨＰＸ９７Ｈカラムおよび検出用屈折計を用いるＨＰＬＣによって追跡した。２−ＨＩＢＡ産生を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析法カップリング）によって追跡した。

様々な菌株の挙動の比較を、下表に示す。

７．２バッフルなし三角フラスコにおける２−ＨＩＢＡ産生株の発酵（微好気性条件）
ＩｃｍＡｍｐ／ＩｃｍＢｍｐ酵素複合体は、酸素の非存在下で一層効率的であることが示されているので（インビトロ酵素分析で得られた結果、例５．５参照）、最初のプロトコルを改良して、培養の微好気性段階に適用した。次に、菌株の挙動を、５００ｍｌのバッフルなし三角フラスコで２０ｇ／ｌＭＯＰＳ、１０ｇ／ｌグルコースおよび１００μＭＩＰＴＧを補足して、ｐＨ６．８に調整した修飾Ｍ９培地を用いて評価した。必要ならば、スペクチノマイシンおよびカルベニシリンを、それぞれ５０ｍｇ／ｌおよび１００ｍｇ／ｌの濃度で加えた。２４時間前培養を用いて、５０ｍｌ培養物をＯＤ_{６００ｎｍ}が約０．３から０．６になるように接種した。培養物を振盪器上に、ＯＤ_{６００ｎｍ}が４より高くなるまで３７℃および２００ｒｐｍに保持した。次に、１０ｍｇ／ｌビタミンＢ１２を培養培地に加え、振盪器の攪拌速度を培養培地中のグルコースが枯渇するまで１００ｒｐｍに低下させた。グルコース消費は、分離用ＢｉｏｒａｄＨＰＸ９７Ｈカラムおよび検出用屈折計を用いるＨＰＬＣによって追跡した。２−ＨＩＢＡ産生を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析法カップリング）によって追跡した。

様々な菌株の挙動の比較を、下表に示す。

７．３バッフル付き三角フラスコ中での菌株ＨＩ００４８の２−ＨＩＢＡ酸性に対するビタミンＢ１２の影響（好気性条件）
ＩｃｍＡｍｐ／ＩｃｍＢｍｐ酵素複合体はビタミンＢ１２依存性であることが知られているので、菌株ＨＩ００４８ｃ０１の２つの培養を、例７．１に記載の培養条件で、２４時間の前培養の代わりに７時間の前培養で、ビタミンＢ１２の供給有りまたは無しで行った。グルコース消費を、分離用ＢｉｏｒａｄＨＰＸ９７Ｈカラムおよび検出用屈折計を用いるＨＰＬＣによって追跡した。２−ＨＩＢＡ産生を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析法カップリング）によって追跡した。２−ＨＩＢＡ産生を、図１に示す。

挙動を、下表に示す。

Claims

アセチル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソ酪酸に転換する連続段階を含んでなる２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）の製造方法であって、前記連続段階が
ａ）アセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに転換し、
ｂ）上記で得られた３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡに転換し、および
ｃ）２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソ酪酸に転換する
ことからなり、
段階ａ）、ｂ）およびｃ）が酵素による転換である、方法。
段階ａ）における酵素活性が、
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼまたはアセチル−ＣｏＡアセチル−トランスフェラーゼ活性を有する、第一の酵素ａ１）、および
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有する、第二の酵素ａ２）
の２種類の酵素の組合せを用いて得られる、請求項１に記載の方法。
酵素ａ１）が、Ｅ．ｃｏｌｉのａｔｏＢ、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｔｈｌＡおよびＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａのｐｈａＡからなる群から選択される遺伝子によってコードされる遺伝子産物である、請求項２に記載の方法。
酵素ａ２）が、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｈｂｄおよびＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａのｐｈａＢからなる群から選択される遺伝子によってコードされる遺伝子産物である、請求項２または３に記載の方法。
段階ｂ）が、ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ活性を有する酵素系を用いて得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼが、Ａ．ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ由来、Ｍ．ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ由来またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｐ由来の遺伝子ｉｃｍＡおよびｉｃｍＢによってコードされる遺伝子産物から生じる酵素によって活性化される、請求項５に記載の方法。
ｆｌｄＡ−ｆｐｒ活性化系を過剰発現することによって、ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼの活性を増加させる、請求項６に記載の方法。
段階ｃ）が、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する酵素を用いて基質上のＣｏＡを転移することによって得られる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
酵素がアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有し、かつ基質がアセテートおよび２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡである、請求項８に記載の方法。
段階ｃ）が、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性を有する酵素を用いて基質上のＣｏＡを転移することによって得られる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
アシル−ＣｏＡチオエステラーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｅｓＢおよびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｙｂｇＣからなる群から選択される遺伝子によってコードされる遺伝子産物から生じる酵素によって活性化される、請求項１０に記載の方法。
段階ｃ）が、
ホスホトランスアシラーゼ活性を有する、第一の酵素ｃ１）、および
酸−キナーゼ活性を有する、第二の酵素ｃ２）
の２種類の酵素の組合せを用いて得られる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
酵素ｃ１）が、ホスフェートヒドロキシイソブチリルトランスフェラーゼ活性、特にＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの遺伝子ｐｔｂによってコードされる遺伝子産物を有する、請求項１２に記載の方法。
酵素ｃ２）が、ヒドロキシイソブチレートキナーゼであり、特にＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの遺伝子ｂｕｋによってコードされる遺伝子産物である、請求項１２または１３に記載の方法。
アセチル−ＣｏＡが、微生物における炭素源の生物転換によって得られる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
段階ａ）、ｂ）およびｃ）が、前記段階ａ）、ｂ）およびｃ）の転換のために必要な酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子を発現する微生物によって行われる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
段階ａ）、ｂ）およびｃ）を同一の微生物で行う、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
同一の微生物が、グルコースのアセチル−ＣｏＡへの生物転換を提供する、請求項１７に記載の方法。
２−ヒドロキシイソ酪酸の産生を向上させるために修飾された微生物であって、前記微生物が請求項２〜１５のいずれか一項に記載の前記段階ａ）、ｂ）およびｃ）の転換のために必要な酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子を発現する、微生物。
更に高濃度のアセチル−ＣｏＡを産生するように修飾された、請求項１７に記載の微生物。
下記の遺伝子
ホスホ−トランスアセチラーゼをコードするｐｔａ、
アセテートキナーゼをコードするａｃｋＡ、
ピルベートオキシダーゼをコードするｐｏｘＢ、
ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈＡ、
イソシトレートリアーゼをコードするａｃｅＡ
の少なくとも１種類の発現を減衰させる、請求項１８に記載の微生物。
ＮＡＤＰＨの利用可能性を増加させる、請求項１９または２０に記載の微生物。
下記の遺伝子
グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼをコードするｐｇｉ、
可溶性トランスヒドロゲナーゼをコードするｕｄｈＡ
の少なくとも１種類の発現を減衰させる、請求項２２に記載の微生物。
細菌、優先的には腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、クロストリジウム科（Clostridiaceae）、バチルス科（Bacillaceae）、ストレプトマイセス科（Streptomycetaceae）およびコリネバクテリウム科（Corynebacteriaceae）からなる群から選択される、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の微生物。
単一炭素源の２−ＨＩＢＡへの転換による２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）の発酵産生の方法であって、
請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の微生物を、単一炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養し、
培養培地から２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）を回収する
段階を含んでなる、方法。
２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）を更に精製する、請求項２５に記載の方法。