KR102621632B1 - Ｎａｄｐｈ 의존성 아세톨 리덕타제 및 개선된 ｎａｄｐｈ 공급에 기반한 １,２-프로판디올의 생산을 위한 신규한 미생물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 1,2-프로판디올의 생산 및 1,2-프로판디올의 제조 방법에 유용한 재조합 미생물에 관한 것이다. 본 발명의 미생물은 1,2-프로판디올 생산이 NADPH 의존성 HAR 활성을 향상시킴으로써 개선되는 방식으로 변형된다.
Description
본 발명은 1,2-프로판디올의 생산에 유용한 재조합 미생물 및 1,2-프로판디올의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 미생물은 1,2-프로판디올 생산이 NADPH 의존성 아세톨 리덕타제 활성을 향상시킴으로써 개선되는 방식으로 변형된다.
1,2-프로판디올 또는 프로필렌 글리콜, 즉, 화학식 C3H8O2 또는 HO-CH2-CHOH-CH3을 갖는 C3 디-알콜은 폭넓게 사용되는 화학물질이다. 그의 CAS 번호는 57-55-6이다. 이는 약하게 단맛을 갖는 무색이며 거의 무취의 투명한 점성 액체이고, 흡습성이며, 물, 아세톤, 및 클로로포름과 혼화성이다. 이는 불포화 폴리에스테르 수지, 액체 세정제, 냉각수, 항공기용 부동액 및 해동액의 성분이다. 프로필렌 글리콜은 프로필렌 유도체보다 더 독성인 것으로 인식되는 에틸렌 유도체에 대한 대체물로서 1993년 내지 1994년 이래로 사용이 증가되었다.
1,2-프로판디올은 현재 다량의 물을 소비하고, 매우 독성인 물질을 사용하며, tert-부탄올 및 1-페닐 에탄올과 같은 부산물을 생성하는 프로필렌 옥시드 수화 공정을 사용하여 화학적 수단에 의해 생산된다.
1,2-프로판디올의 생산을 위한 화학적 공정의 단점은 생물학적 합성을 매력적인 대안으로 만든다. 미생물에 의한 당으로부터의 1,2-프로판디올의 발효적 생산에 대해 2가지 경로가 특징화되었다.
첫 번째 경로에서, 6-데옥시 당 (예를 들어 L-람노스 또는 L-푸코스)을 디히드록시아세톤 포스페이트 및 (S)-락트알데히드로 절단하고, 이를 추가로 (S)-1,2-프로판디올로 환원시킬 수 있다 (Badia et al., 1985). 이 경로는 이. 콜라이 (E. coli)에서 기능적이지만, 데옥시헥소스의 상승된 비용으로 인해 경제적으로 실행가능한 공정을 산출할 수 없다.
두번째 경로는 해당 경로 후의 메틸글리옥살 경로를 통한 공통 당 (예를 들어 글루코스 또는 크실로스)의 대사이다. 디히드록시아세톤 포스페이트를 메틸글리옥살로 전환시키고, 이를 락트알데히드 또는 히드록시아세톤 (아세톨)으로 환원시킬 수 있다. 그 후, 이들 2가지 화합물을 1,2-프로판디올로 변환한다. 이 경로는 (R)-1,2-프로판디올의 천연 생산자, 예컨대 클로스트리디움 스페노이데스 (Clostridium sphenoides) 및 써모안아에로박터 써모사카롤리티쿰 (Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)에 의해 사용된다. 그러나, 이들 유기체로 얻어지는 성능의 개선은 이용가능한 유전적 도구의 결여로 인해 제한될 가능성이 있다.
종래 기술
메틸글리옥살 경로는 이. 콜라이 또는 다른 장내세균과 (Enterobacteriaceae)에서 기능적이며, 단순한 탄소 공급원을 사용하여 1,2-프로판디올 생산자를 얻기 위한 이. 콜라이의 유전자 변형에 대한 몇몇 조사가 이루어졌다 (WO 98/37204; Cameron et al., 1998; Altaras and Cameron, 1999; Huang et al., 1999; Altaras and Cameron, 2000; Berrios-Rivera et al., 2003; Jarboe, 2011). 합리적 설계 및 진화의 조합에 의해 얻어진 개선된 1,2-프로판디올 생산 이. 콜라이 균주는 특허 출원 WO 2005/073364, WO 2008/116848, WO 2008/116852, WO 2008/116853, WO 2010/051849, WO 2011/012693, WO 2011/012697 및 WO 2011/012702에 기재되어 있으며, 이들은 본원에 참조로 포함된다.
이. 콜라이 1,2-프로판디올 생산 균주에서, 히드록시아세톤의 1,2-프로판디올로의 환원은 조인자로서 NADH를 사용하는 글리세롤 데히드로게나제 GlyDH에 의해 수행되며, 호기성 조건 하에서 세포의 내부 산화환원 상태로 인해 전체적이지 않다. 호기적으로, NADH의 주요한 역할은 산화적 인산화를 통한 호흡성 ATP 생성이며, 이의 결과로서, NADH-대-NAD+ 비율은 강하게 NAD+의 선호이다. 화학적으로 매우 유사한 NADPH는 대조적으로 동화적 환원을 유도하며, NADPH-대-NADP+ 비율은 보다 높다 (Fuhrer and Sauer, 2009).
따라서, 본 발명의 목적은 NADPH 의존성 아세톨 리덕타제 활성을 증가시킴으로써 및 NADPH 공급을 개선시킴으로써 1,2-프로판디올의 생산을 개선시키는 것이다.
호열성 박테리아 바실루스 스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus)로부터의 GlyDH의 3-차원 구조가 확립되었으며, NAD+ 결합 부위는 완전히 특징화되었다 (Ruzheinikov et al., 2001). NADPH를 생산할 수 있는 비. 스테아로써모필루스 돌연변이 글리세르알데히드-3-포스페이트가 구축 및 특징화되었다 (Clermont et al., 1993).
클로스트리디움 베이제린크키이 (Clostridium beijerinckii)로부터의 NADPH 의존성 2차 알콜 데히드로게나제 (Sadh)는 아세톤의 이소프로판올로의 환원을 자연적으로 촉매한다 (Ismaiel et al., 1993). 미쯔이 케미컬즈 인코포레이티드 (Mitsui Chemicals Inc.)로부터의 특허 출원 EP2546331에서, 이소프로필 알콜은 클로스트리디움 베이제린크키이로부터의 sadh 유전자를 발현하는 이. 콜라이 균주에서 생산된다.
이 효소 뿐만 아니라 써모안아에로박터 브로키이 (Thermoanaerobacter brockii)로부터의 그의 상동체는 히드록시아세톤의 1,2-프로판디올로의 환원을 촉매하는 것으로 나타났으며, 절대 광독립영양 시아노박테리아 시네코코쿠스 엘롱가투스 (Synechococcus elongatus)에서 과발현되어 탄소 공급원으로서 비-탄수화물 CO2로부터 1,2-프로판디올을 생산하였다 (Li and Liao, 2013).
예상외로, 본 발명자들은 sadh 유전자의 과발현이 단독으로 또는 NADPH 공급을 개선시키는 다른 수단과 조합하여 탄소 공급원으로서의 탄수화물로부터 1,2-프로판디올 생산을 유의하게 개선시킴을 밝혀내었다.
발명의 요약
본 발명은 1,2-프로판디올의 생산을 최적화하기 위한 재조합 미생물 및 상기 미생물을 사용하는 방법에 관한 것이며, 상기 미생물에서, NADPH 의존성 아세톨 리덕타제 (HAR) 활성은 향상된다. 보다 특히, 상기 재조합 미생물에서, NADPH 의존성 아세톨 리덕타제 활성을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 또는 NADPH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 유전자 gldA *가 과발현되며, 상기 NADPH 의존성 아세톨 리덕타제는 클로스트리디움 베이제린크키이로부터의 adh 유전자 또는 써모안아에로박터 브로키이로부터의 adh 유전자 또는 엔트아메바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica)로부터의 adh1 유전자 또는 글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter oxydans)로부터의 GOX1615 유전자 또는 히포크레아 제코리나 (Hypocrea jecorina)로부터의 gld2 유전자 또는 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)로부터의 yhdN 유전자에 의해 코딩되는 단백질과 적어도 60％ 아미노산 동일성을 갖는다.
이 발명에 사용되는 재조합 미생물은 또한 다른 유전자 변형, 예컨대
- NADH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 gldA 유전자의 약화된 발현,
- 알데히드 리덕타제를 코딩하는 yqhD 유전자의 약화된 발현,
- 니코틴아미드 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제를 코딩하는 pntAB 유전자 오페론의 증가된 발현,
- 포스포글루코스 이소머라제를 코딩하는 pgi 유전자의 약화된 발현,
- 포스포프룩토키나제를 코딩하는 pfkA 유전자의 약화된 발현,
- 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 zwf 유전자의 증가된 발현,
- ADP-의존성 데히드라타제를 코딩하는 yjeF 유전자의 증가된 발현,
- NADP-의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 gapN 유전자의 증가된 발현,
- NADP-의존성 리포아미드 데히드로게나제를 코딩하는 lpd * 돌연변이 유전자의 증가된 발현
을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 미생물은 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클레브시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 써모안아에로박테리움 써모사카롤리티쿰 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum), 클로스트리디움 스페노이데스 또는 사카로미세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)이다.
본 발명을 상세하게 기재하기 전에, 이 발명은 특히 예시된 방법에 제한되지 않으며, 물론 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정 실시양태를 기재하기 위한 목적이고, 제한적인 것으로 의도되지 않으며, 이는 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임이 이해되어야 한다.
상기 또는 하기의 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
더욱이, 본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는다면 관련 기술분야의 기술 내의 통상적인 미생물학적 및 분자 생물학적 기술을 채용한다. 이러한 기술은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 문헌에 충분히 설명되어 있다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태 관사 ("a", "an", 및 "the")는 내용이 명백히 달리 나타내지 않는다면 복수 언급대상을 포함함을 유념해야 한다. 따라서, 예를 들어, "미생물"에 대한 언급은 복수의 이러한 미생물을 포함하며, "내인성 유전자"에 대한 언급은 하나 이상의 내인성 유전자에 대한 언급인 것 등이다. 달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 물질 및 방법이 본 발명을 실시 또는 시험하는 데 사용될 수 있지만, 이하 바람직한 물질 및 방법이 기재된다.
이어지는 청구범위에서 및 연속하는 발명의 설명에서, 표현 언어 또는 필요한 암시로 인해 내용이 달리 요구하는 경우를 제외하고, 단어 "포함하다 (comprise)", "함유하다", "관여하다 (involve)" 또는 "포함하다 (include)" 또는 변형, 예컨대 "포함하다 (comprises)", "포함하는 (comprising)", "함유하는", "관여하는 (involved)", "포함하다 (includes)", "포함하는 (including)"은 포함적 의미로, 즉, 언급된 특징의 존재를 구체화하기 위해, 그러나 본 발명의 다양한 실시양태에서 추가의 특징의 존재 또는 첨가를 불가능하게 하지 않기 위해 사용된다.
본 발명은 탄소의 공급원으로서 탄수화물을 포함하는 적절한 배양 배지에서 1,2-프로판디올의 생산을 위해 유전자 변형된 미생물을 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 1,2-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 유전자 변형된 미생물에서 NADPH 의존성 HAR 활성이 향상되는 것인 발효적 공정에서의 1,2-프로판디올의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태는 하기에 추가로 기재된다.
용어 "아세톨 리덕타제" 및 "히드록시아세톤 리덕타제" 또는 "HAR"은 호환적으로 사용되며, 아세톨 (또는 히드록시아세톤)의 1,2-프로판디올로의 환원의 효소적 활성을 나타낸다. 이 활성은 NADPH 의존성 또는 NADH 의존성일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "미생물"은 인공적으로 변형되지 않은 박테리아, 효모 또는 진균을 지칭한다. 바람직하게는, 미생물은 장내세균과, 바실루스과 (Bacillaceae), 클로스트리디움과 (Clostridiaceae), 스트렙토미세스과 (Streptomycetaceae) 및 효모 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 미생물은 에스케리키아 (Escherichia), 클레브시엘라 (Klebsiella), 써모안아에로박테리움 (Thermoanaerobacterium), 클로스트리디움 (Clostridium) 또는 사카로미세스 (Saccharomyces)의 종이다. 보다 더욱 바람직하게는 미생물은 에스케리키아 콜라이, 클레브시엘라 뉴모니아에, 써모안아에로박테리움 써모사카롤리티쿰, 클로스트리디움 스페노이데스 또는 사카로미세스 세레비지아에 중에서 선택된다. 바람직하게는, 미생물은 종속영양 미생물이며, 즉, 대기 탄소를 고정할 수 없고, 대신 그의 성장을 위해 유기 탄소 공급원을 사용한다. 보다 더욱 바람직하게는, 본 발명의 종속영양 미생물은 에스케리키아 콜라이이다.
본원에 사용된 용어 "재조합 미생물" 또는 "유전자 변형된 미생물"은 자연에서 발견되지 않으며, 자연에서 발견되는 그의 등가물과 유전적으로 상이한 박테리아, 효모 또는 진균을 지칭한다. 이는, 이것이 유전적 요소의 도입에 의해 또는 결실에 의해 또는 변형에 의해 변형되는 것을 의미한다. 이는 또한 특이적 선택 압력 하에서의 지정 돌연변이유발 및 진화를 조합함으로써 새로운 대사 경로의 발달 및 진화를 강제함으로써 형질전환될 수 있다 (예를 들어, WO2005/073364 또는 WO2008/116852 참조).
미생물은 이들 유전자가 숙주 미생물에서 그의 발현을 허용하는 모든 요소를 갖는 미생물 내로 도입되는 경우, 외인성 유전자를 발현하도록 변형될 수 있다. 외인성 DNA를 갖는 미생물의 변형 또는 "형질전환"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적인 과업이다.
미생물은 내인성 유전자의 발현 수준을 조정하도록 변형될 수 있다.
용어 "내인성 유전자"는 임의의 유전자 변형 전에 미생물에 존재하는 유전자를 의미한다. 내인성 유전자는 내인성 조절 요소에 추가로, 또는 이를 대체하기 위해 이종성 서열을 도입함으로써, 또는 염색체 또는 플라스미드 내로 유전자의 하나 이상의 보충적 카피를 도입함으로써 과발현될 수 있다. 내인성 유전자는 또한 그의 발현 및/또는 활성을 조정하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 유전자 생성물을 조정하기 위해 코딩 서열 내로 도입될 수 있거나, 이종성 서열은 내인성 조절 요소에 추가로 또는 이를 대체하기 위해 도입될 수 있다. 내인성 유전자의 조정은 유전자 생성물의 활성의 상향-조절 및/또는 향상을 초래하거나, 대안적으로 내인성 유전자 생성물의 활성을 하향 조절하고/거나 저하시킬 수 있다.
그의 발현을 조정하는 또다른 방식은 유전자의 내인성 프로모터 (예를 들어, 야생형 프로모터)를 보다 강한 또는 보다 약한 프로모터로 교환하여 내인성 유전자의 발현을 상향 또는 하향 조절하는 것이다. 이들 프로모터는 상동성 또는 이종성일 수 있다. 적절한 프로모터를 선택하는 것은 충분히 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 내이다.
대조적으로, "외인성 유전자"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 널리 공지된 수단에 의해 미생물 내로 도입된 유전자를 의미하지만, 이 유전자는 미생물에서 자연적으로 발생하지 않는다. 외인성 유전자는 숙주 염색체 내로 통합되거나, 플라스미드 또는 벡터에 의해 염색체-외적으로 발현될 수 있다. 그의 복제 원점 및 세포 중의 그의 카피 수에 관해 상이한 다양한 플라스미드는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들 유전자는 상동성일 수 있다. "과발현" 또는 "과발현하는"은 미생물에서의 외인성 유전자의 발현을 지칭하기 위해 사용된다.
본 발명의 내용에서, 용어 "상동성 유전자"는 이론적으로 공통적인 유전적 조상을 갖는 유전자를 지칭하는 것으로 제한되지 않지만, 그럼에도 불구하고, 유사한 기능을 수행하고/거나 유사한 구조를 갖는 단백질을 코딩하도록 진화된 유전적으로 비관련될 수 있는 유전자를 포함한다. 따라서, 본 발명의 목적상 용어 "기능적 상동체"는 특정 효소적 활성이 한정된 아미노산 서열의 특이적 단백질에 의해서 뿐만 아니라 다른 (비)관련된 미생물로부터의 유사한 서열의 단백질에 의해 제공될 수 있다는 사실에 관한 것이다.
공지된 단백질에 대한 유니프로트 (Uniprot)에 또는 공지된 유전자에 대한 진뱅크 (Genbank)에 주어진 참조번호를 사용하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단백질 및/또는 유전자 서열을 얻고, 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등에서 동등한 유전자를 결정할 수 있다. 이 통상적인 작업은 유리하게는 다른 미생물로부터 유래된 유전자와의 서열 정렬을 수행하고, 축중성 프로브를 설계하여 또다른 유기체에서 상응하는 유전자를 클로닝함으로써 결정될 수 있는 컨센서스 서열을 사용하여 수행된다. 이들 통상적인 분자 생물학의 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "발효적 공정", "발효" 또는 "배양"은 미생물의 성장을 나타내기 위해 호환적으로 사용된다. 이 성장은 일반적으로 사용되는 미생물에 적합화된 적절한 성장 배지를 갖는 발효조에서 수행된다.
"적절한 배양 배지"는 세포의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 유익한 영양분, 예컨대 탄소 공급원 또는 탄소 기질, 질소 공급원, 예를 들어, 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 우레아, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 및 인산암모늄; 인 공급원, 예를 들어, 인산일칼슘 또는 인산이칼슘; 추적량 요소 (예를 들어, 금속 염), 예를 들어 마그네슘 염, 코발트 염 및/또는 망간 염; 뿐만 아니라 성장 인자, 예컨대 아미노산 및 비타민을 포함하는 배지 (예를 들어, 멸균, 액체 배지)를 지칭한다.
본 발명에 따른 용어 "탄소의 공급원", "탄소 공급원" 또는 "탄소 기질"은 미생물에 의해 대사될 수 있는 임의의 탄소 공급원을 지칭하며, 여기서, 기질은 적어도 하나의 탄소 원자를 함유한다.
용어 "탄수화물"은 미생물에 의해 대사될 수 있으며, 적어도 하나의 탄소 원자, 2개의 수소 원자 및 하나의 산소 원자를 함유하는 임의의 탄소 공급원을 지칭한다. CO2는 수소를 함유하지 않기 때문에 탄수화물이 아니다.
탄수화물은 단당류, 예컨대 글루코스, 프룩토스, 만노스, 크실로스, 아라비노스, 갈락토스 등, 이당류, 예컨대 수크로스, 셀로비오스, 말토스, 락토스 등, 올리고당류, 예컨대 라피노스, 스타키오스, 말토덱스트린 등, 다당류, 예컨대 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 전분 등, 메탄올, 포름알데히드 및 글리세롤로 이루어진 군 중에서 선택된다. 특히 바람직한 탄소 공급원은 아라비노스, 프룩토스, 갈락토스, 글루코스, 락토스, 말토스, 수크로스, 크실로스 또는 이들의 혼합물이다. 보다 바람직하게는, 탄소 공급원은 수크로스이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 탄소 공급원은 재생가능한 공급-원료로부터 유래된다. 재생가능한 공급-원료는 짧은 지연 내에 및 바람직한 생성물로의 그의 변환을 허용하기에 충분한 양으로 재생될 수 있는 특정 공업적 공정에 필요한 원료 물질로 정의된다. 처리되거나 그렇지 않은 식물성 바이오매스는 흥미로운 재생가능한 탄소 공급원이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 따른 미생물에 대한 배양 조건을 정의할 수 있다. 특히, 박테리아는 20℃ 내지 55℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 보다 구체적으로 이. 콜라이에 대해 약 30℃ 내지 37℃의 온도에서 발효된다.
이 공정은 배치 공정으로, 유가식 공정으로 또는 연속식 공정으로 수행될 수 있다. 이는 호기성, 미량-호기성 또는 혐기성 조건 하에서 수행될 수 있다.
'호기성 조건 하에서'는 산소가 기체를 액체 상 내로 용해시킴으로써 배양에 제공되는 것을 의미한다. 이는 (1) 산소 함유 기체 (예를 들어 공기)를 액체 상 내로 분무하거나, (2) 헤드 공간에 함유된 산소를 액체 상 내로 옮기기 위해 배양 배지를 함유하는 용기를 진탕함으로서 얻어질 수 있다. 호기성 조건 하에서의 발효의 주요한 이점은 전자 수용체로서의 산소의 존재가 세포 공정을 위한 ATP의 형태 하에서 보다 많은 에너지를 생산하는 균주의 능력을 개선시키는 것이다. 따라서, 균주는 그의 일반적 대사가 개선된다.
미량-호기성 조건은 산소의 낮은 퍼센트 (예를 들어 0.1 내지 10％의 산소를 함유하고, 질소로 100％까지 채워진 기체의 혼합물을 사용함)가 액체 상 내로 용해되는 배양 조건으로 정의된다.
혐기성 조건은 산소가 배양 배지에 제공되지 않는 배양 조건으로 정의된다. 엄격한 혐기성 조건은 질소와 같은 불활성 기체를 배양 배지 내로 분무하여 추적량의 다른 기체를 제거함으로써 얻어진다. 니트레이트는 균주에 의한 ATP 생산을 개선시시키고, 그의 대사를 개선시키기 위한 전자 수용체로서 사용될 수 있다.
어구 "배양 배지로부터 1,2-프로판디올을 회수하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여, 생산된 1,2-프로판디올을 정제하는 공정을 지칭한다. 이러한 방법은 특히 특허 출원 WO2011/076690 및 WO2012/130316에 개시되어 있다.
용어 "1,2-프로판디올의 생산을 위해 유전자 변형된 미생물"은 유전적 요소의 도입 또는 결실 중 하나를 통해, 또는 특허 출원 WO 2005/073364에 기재된 바와 같은 진화의 단계를 통해 변형된 미생물을 지칭한다. 특히, 이는 유전자 변형이 없는 상응하는 야생형 미생물의 내인성 생산과 비교하여 개선된 1,2-프로판디올 생산을 나타내는 유전자 변형된 미생물을 지칭한다. 이러한 미생물은 예를 들어 참조로 포함되는 특허 출원 WO 2008/116848, WO 2008/116853, WO 2011/012693, WO 2011/012697, WO 2011/012702 또는 EP2532751에 기재되어 있다. 바람직한 유전자 변형은 하기이다:
- 메틸글리옥살 신타제를 코딩하는 mgsA 유전자, 메틸글리옥살 리덕타제를 코딩하는 yqhD, yafB, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG 또는 ydbC 유전자, 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 gldA 유전자 및 락트알데히드 리덕타제를 코딩하는 fucO 유전자 중에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 증가된 발현;
- 포스포글루코네이트 데히드라타제를 코딩하는 edd 유전자 또는 2-케토-3-데옥시글루코네이트 6-포스페이트 알돌라제를 코딩하는 eda 유전자 중 하나 또는 둘 다의 결실;
- 메틸글리옥살로부터 락테이트 (예컨대 글리옥살라제 I을 코딩하는 gloA 유전자, 알데히드 데히드로게나제 A를 코딩하는 aldA 유전자, 아세트알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 aldB 유전자), 피루베이트로부터 락테이트 (락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 ldhA 유전자), 포르메이트 (피루베이트 포르메이트 리아제를 코딩하는 pflA 유전자, 피루베이트 포르메이트 리아제를 코딩하는 pflB 유전자), 에탄올 (알데히드-알콜 데히드로게나제를 코딩하는 adhE 유전자) 및 아세테이트 (아세테이트 키나제를 코딩하는 ackA 유전자, 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 pta 유전자, 피루베이트 옥시다제를 코딩하는 poxB 유전자)의 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 결실에 의한 원하지 않는 부산물의 합성의 약화;
- PEP 유사 피루베이트 키나제 (pykA 및 pykF 유전자에 의해 코딩됨)를 소비하는 경로의 제거 및/또는 PEP의 합성을 촉진시킴으로써, 예를 들어 PEP 신타제를 코딩하는 ppsA 유전자를 과발현시킴으로써;
- 리포아미드 데히드로게나제를 코딩하는 lpd 유전자에서의 특이적 돌연변이;
- ArcA 전사 이중 조절자를 코딩하는 arcA 유전자 및 NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 II를 코딩하는 ndh 유전자가 결실될 수 있음,
- 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 gapA 유전자가 온도 유도성 프로모터의 제어 하에 있음,
- 수크로스의 이입 및 대사에 관여하는 유전자 (수크로스 퍼미아제를 코딩하는 cscB 유전자, 수크로스 히드롤라제를 코딩하는 cscA 유전자, 프룩토키나제를 코딩하는 cscK 유전자, 포스포에놀피루베이트-의존성 포스포트랜스퍼라제 시스템의 효소 II를 코딩하는 scrA 유전자, ATP-의존성 프룩토키나제를 코딩하는 scrK 유전자, 수크로스 6-포스페이트 히드롤라제 (인베르타제)를 코딩하는 scrB 유전자, 수크로스 포린을 코딩하는 scrY 유전자)가 부가되거나, 그의 발현이 증가됨.
바람직한 유전자 변형은 유전자 yqhD *(Gl49E)의 증가된 발현에 의해 얻어지는 메틸글리옥살 리덕타제 활성의 개선이다.
또다른 바람직한 유전자 변형은 유전자 mgsA *(H21Q)의 증가된 발현에 의해 얻어지는 메틸글리옥살 신타제 활성의 개선이다.
또다른 바람직한 유전자 변형은 유전자 gldA *(A160T)의 증가된 발현에 의해 얻어지는 히드록시아세톤 리덕타제 활성의 개선이다. 이 HAR 돌연변이체는 이하에 개시되는 HAR 돌연변이체 NADPH 의존성과는 다른 NADH 의존성이다.
히드록시아세톤 리덕타제 (HAR)는 1,2-프로판디올의 생산에 관여하는 마지막 효소이다. HAR은 하기 반응을 촉매한다:
히드록시아세톤 + NAD(P)H → 1,2-프로판디올 + NAD(P)+
gldA 유전자가 결실된 1,2-프로판디올 생산 균주는 1,2-프로판디올을 더 이상 생산할 수 없으며, 히드록시아세톤을 축적한다 (WO2008/116851). GldA 단백질은 정제 균질화되었으며, 조인자로서 NADH를 사용한다 (Kelley and Dekker, 1984). 호기성 조건에서, 히드록시아세톤의 1,2-프로판디올로의 전환은 세포의 내부 산화환원 상태로 인해 전체적이지 않고: 이러한 조건 하에서, NADH의 주요한 역할은 산화적 인산화를 통한 호흡성 ATP 생성이며, 이의 결과로서, NADH-대-NAD+ 비율은 강하게 NAD+의 선호이다. 화학적으로 매우 유사한 NADPH는 대조적으로 동화적 환원을 유도하며, NADPH-대-NADP+ 비율은 보다 높다 (Fuhrer and Sauer, 2009).
이 관찰에 따라, 이 발명의 목적은 NADPH 의존성 히드록시아세톤 리덕타제 활성을 증가시킴으로써 1,2-프로판디올의 생산을 개선시키는 것이다.
활성을 증가시키는 것은 단백질 촉매 효율을 개선시키거나, 단백질 교체율을 감소시키거나, 전령 RNA (mRNA) 교체율을 감소시키거나, 유전자의 전사를 증가시키거나, mRNA의 번역을 증가시킴으로써 얻어질 수 있다.
단백질 촉매 효율을 개선시키는 것은 주어진 기질 및/또는 주어진 조인자에 대한 kcat를 증가시키고/거나 Km을 감소시키는 것, 및/또는 주어진 억제제에 대한 Ki를 증가시키는 것을 의미한다. kcat, Km 및 Ki는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 결정할 수 있는 미카엘리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 상수이다 (Segel, 1993). 단백질 교체율을 감소시키는 것은 단백질을 안정화하는 것을 의미한다. 단백질 촉매 효율을 개선시키고/거나 단백질 교체율을 감소시키는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자로부터 널리 공지되어 있다. 이는 서열로의 합리적 조작 및/또는 구조적 분석 및 지정 돌연변이유발, 뿐만 아니라 무작위 돌연변이유발 및 스크리닝을 포함한다. 돌연변이는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)과 같은 통상적인 방법에 의한 부위-지정 돌연변이유발에 의해, 또는 무작위 돌연변이유발 기술, 예컨대 돌연변이유발제 (자외선 또는 니트로소구아니딘 (NTG) 또는 에틸메탄술포네이트 (EMS)와 같은 화학 제제)의 사용 또는 PCR 기술 (DNA 셔플링 또는 오류-유발 PCR)의 사용에 의해 도입될 수 있다. 단백질을 안정화하는 것은 또한 단백질의 N-말단 또는 C-말단 중 하나에서 "태그"로 지칭되는 펩티드 서열을 부가함으로써 달성될 수 있다. 태그는 관련 기술분야의 통상의 기술자로부터 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)는 단백질을 안정화기 위해 사용될 수 있다.
mRNA 교체율을 감소시키는 것은 5'-비번역된 영역 (5'-UTR) 및/또는 코딩 영역, 및/또는 3'-UTR의 유전자 서열을 변형함으로써 달성될 수 있다 (Carrier and Keasling, 1999).
유전자의 전사를 증가시키는 것은 유전자의 카피의 수를 증가시키고/거나 보다 높은 수준의 유전자의 발현을 초래하는 프로모터를 사용함으로써 달성될 수 있다. "과발현" 또는 "과발현하는"은 또한 미생물에서 유전자의 전사를 증가시키는 것을 지칭하기 위해 사용된다.
미생물에서 유전자의 카피의 수를 증가시키기 위해, 유전자를 염색체적으로 또는 염색체외적으로 코딩한다. 유전자가 염색체 상에 위치하는 경우, 유전자의 몇몇 카피를 관련 기술분야의 숙련가에 의해 공지된 재조합의 방법 (유전자 대체를 포함함)에 의해 염색체 상에 도입할 수 있다. 유전자가 염색체-외적으로 위치하는 경우, 이는 그의 복제 원점 및 따라서 세포 중의 그의 카피 수에 관해 상이한 상이한 유형의 플라스미드에 의해 운반될 수 있다. 이들 플라스미드는 플라스미드의 성질에 따라 미생물에 1 내지 5 카피, 또는 약 20 카피, 또는 500 카피 이하로 존재한다: 밀집한 복제를 갖는 낮은 카피 수 (예를 들어 이. 콜라이 pSC101, RK2에 대해), 낮은 카피 수 플라스미드 (예를 들어 이. 콜라이 pACYC, pRSF1010에 대해) 또는 높은 카피 수 플라스미드 (예를 들어 이. 콜라이 pSK 블루스크립트 II에 대해).
높은 수준의 유전자의 발현을 초래하는 프로모터를 사용하기 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 어느 프로모터가 가장 편리한 지를 알고 있으며, 예를 들어 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac, 또는 람다 프로모터 cI가 폭넓게 사용된다. 이들 프로모터는 특정 화합물에 의해 또는 온도 또는 광과 같은 특정 외부 조건에 의해 "유도성"일 수 있다. 이들 프로모터는 상동성 또는 이종성일 수 있다.
mRNA의 번역을 증가시키는 것은 리보솜 결합 부위 (Ribosome Binding Site) (RBS)를 변형함으로써 달성될 수 있다. RBS는 단백질 번역을 개시할 경우 리보솜에 의해 결합되는 mRNA 상의 서열이다. 이는 진핵생물에서 mRNA의 5' 캡, 원핵생물에서 개시 코돈 AUG의 상류의 영역 6 내지 7 뉴클레오티드 (샤인-달가르노 (Shine-Dalgarno) 서열로 지칭됨), 또는 바이러스에서 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) 중 하나일 수 있다. 이 서열을 변형함으로써, 단백질 번역 개시 속도를 변화시키고, 비례적으로 그의 생산 속도를 변경하고, 세포 내부에서 그의 활성을 제어할 수 있다. 동일한 RBS 서열은 mRNA의 성질에 따라 동일한 영향을 갖지 않을 것이다. 소프트웨어 RBS 캘큘레이터 (CALCULATOR)를 사용함으로써 RBS 서열의 강도를 최적화하여 표적화된 번역 개시 속도를 달성할 수 있다 (Salis, 2011).
본 발명의 제1 측면에서, 1,2-프로판디올의 생산은 변형된 미생물에서 NADPH 의존성 아세톨 리덕타제 (NADPH HAR) 활성을 향상시킴으로써 개선된다.
본 발명의 제1 실시양태에서, NADPH HAR 활성은 변형된 미생물에서 NADPH HAR을 코딩하는 유전자 (NADPH HAR 유전자)를 과발현시킴으로써 향상된다.
클로스트리디움 베이제린크키이로부터의 Adh는 아세톤의 이소프로판올로의 환원을 자연적으로 촉매한다 (Ismaiel et al., 1993). 이 효소 뿐만 아니라 써모안아에로박터 브로키이로부터의 그의 상동체는 히드록시아세톤의 1,2-프로판디올로의 환원을 촉매하는 것으로 나타났으며, 절대 광독립영양 시아노박테리아 시네코코쿠스 엘롱가투스에서 과발현되어 탄소 공급원으로서 CO2로부터 1,2-프로판디올을 생산한다 (Li and Liao, 2013).
데이터 마이닝 및 서열 분석은 일부 후보 상동성 효소 및 이러한 효소를 코딩하는 유전자를 결정하는 데 사용되었다. 이들 후보는 하기 표 1에 개시되어 있다.
상동성 서열 및 그의 퍼센트 상동성을 확인하는 수단은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 특히 BLAST 프로그램을 들 수 있다. 그 후, 얻어진 서열을 예를 들어, 프로그램 CLUSTALW 또는 MULTALIN을 사용하여 활용할 (예를 들어, 정렬할) 수 있다. 단백질 상동체를 확인하는 또다른 방식은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 널리 공지된 생물정보학 프로그램을 사용한 계통수의 구축을 통해서이다.
<표 1>
NADPH
의존성
HAR
효소에 대한 가능한 후보
본 발명의 이 실시양태에서, 재조합 미생물에서 과발현된 NADPH HAR을 코딩하는 유전자는 상기 열거된 단백질 중에서 선택되는 NADPH 의존성 아세톨 리덕타제를 코딩한다. 유니프로트 번호로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상응하는 유전자의 수 및 서열을 얻을 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 유전자, 클로스트리디움 베이제린크키이로부터의 adh 또는 써모안아에로박터 브로키이로부터의 adh 또는 엔트아메바 히스톨리티카로부터의 adh1 또는 글루코노박터 옥시단스로부터의 GOX1615 또는 히포크레아 제코리나로부터의 gld2 또는 바실루스 서브틸리스로부터의 yhdN에 의해 코딩되는 완전 단백질과 적어도 60％, 바람직하게는 적어도 70％, 보다 바람직하게는 적어도 85％, 및 보다 더욱 바람직하게는 적어도 90％ 아미노산 동일성을 갖는 NADPH 의존성 아세톨 리덕타제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 (NADPH HAR 유전자)를 발현한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 클로스트리디움 베이제린크키이로부터의 adh 또는 써모안아에로박터 브로키이로부터의 adh 또는 엔트아메바 히스톨리티카로부터의 adh1 또는 글루코노박터 옥시단스로부터의 GOX1615 또는 히포크레아 제코리나로부터의 gld2 또는 바실루스 서브틸리스로부터의 yhdN (즉, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질 서열과 100％ 아미노산 서열 동일성) 중에서 선택되는 유전자를 발현한다. 보다 더욱 바람직하게는, NADPH 의존성 아세톨 리덕타제는 클로스트리디움 베이제린크키이로부터의 adh 유전자에 의해 코딩된다.
아미노산 서열 사이의 서열 동일성은 비교의 목적으로 정렬될 수 있는 각각의 서열에서의 위치를 비교함으로써 측정될 수 있다. 비교되는 서열에서의 위치가 동일한 아미노산에 의해 점유되는 경우, 서열은 그 위치에서 동일하다. 단백질 사이의 서열 동일성의 정도는 상기 단백질의 서열에 의해 공유되는 위치에서의 동일한 아미노산 잔기의 수의 함수이다.
2개의 아미노산 서열 사이의 동일성의 퍼센트를 측정하기 위해, 서열을 최적 비교를 위해 정렬한다. 예를 들어, 제2 아미노산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 서열의 서열에 갭을 도입할 수 있다. 그 후, 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 잔기를 비교한다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다.
2개의 서열 사이의 동일성의 퍼센트는 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 따라서, ％ 동일성 = 동일한 위치의 수 / 중첩하는 위치의 총 수 X 100.
서열의 최적 정렬은 문헌 [Needleman and Wunsch (1970)]의 전반적 상동성 정렬 알고리듬에 의해, 이 알고리듬의 컴퓨터화 실행에 의해 또는 육안 검사에 의해 수행될 수 있다. 다양한 방법에 의해 생성되는 가장 양호한 정렬 (즉, 비교되는 서열 사이의 동일성의 최고 퍼센트를 초래함)이 선택된다.
즉, 서열 동일성의 퍼센트는 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 아미노산이 둘 다의 서열에서 발생하는 위치의 수를 측정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 위치의 총 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 산출함으로써 계산된다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, NADPH HAR 활성은 상기 기재된 바와 같은 NADPH 의존성 HAR 활성을 증가시킴으로써 및/또는 NADH 의존성 HAR 활성을 감소시킴으로써 향상된다.
효소의 활성을 감소시키는 것은 아미노산 서열을 변화시키도록 유전자를 돌연변이시킴으로써 그의 특이적 촉매 활성을 감소시키는 것 및/또는 뉴클레오티드 서열을 돌연변이시킴으로서 또는 유전자의 코딩 영역을 결실시킴으로써 세포 중의 단백질의 농도를 감소시키는 것 중 하나를 의미한다.
본 발명에서, NADH 의존성 HAR 활성의 감소는 gldA 유전자를 결실시킴으로써, 또는 GldA 효소 상에서 조인자 조작을 수행함으로써 수행되었으며, 이는 NADH 의존성 HAR 활성의 감소 및 NADPH 의존성 HAR 활성의 증가 둘 다를 초래하였다.
따라서, 본 발명의 미생물은 바람직하게는 NADPH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 gldA * 유전자를 과발현하고/거나 내인성 gldA 유전자에서 결실된다.
조인자 조작은 GldA 단백질에서 일부 특이적 아미노산 잔기를 대체함으로써 효소의 조인자 특이성을 변화시키는 것을 의미한다. 이들 초래된 돌연변이체 (GldA* NADPH)는 NADPH 의존성이며, NADH 의존성인 상기 개시된 GldA* 돌연변이체 (GldA* A160T)와 상이하다. '로스맨 폴드 (Rossman fold)'로 공지된 조인자-결합 포켓에서의 조인자 특이성을 지배하는 잔기는 완전히 연구되었으며 (Scrutton et al., 1990; Clermont et al., 1993; Corbier et al., 1990; Wu et al., 2012), 관련 기술분야의 통상의 기술자는 조인자 특이성을 변화시키기 위해 어느 아미노산 잔기를 변형하는 지를 정의할 수 있다. 조인자 조작은 최근 NADPH 대신 조인자로서 NADH를 선호하는 효소를 변경하는 데 있어서 성공적이었다. 예는 효소 Gre2p, 즉, 사카로미세스 세레비지아에에서 발견된 NADPH-선호 데히드로게나제이며, 이는 직접 돌연변이유발에 의해 NADPH에 대한 감소된 의존성, 및 NADH에 대한 증가된 친화도를 갖도록 변형되었다 (Katzberg et al., 2010).
본 발명에서, 이. 콜라이로부터의 GldA의 3-차원 구조 모델은 바실루스 스테아로써모필루스로부터의 효소의 3-차원 구조로부터 수립되었다 (Ruzheinikov et al., 2001). 관련 기술분야의 통상의 기술자는 예를 들어 소프트웨어, 예컨대 디스커버리 스튜디오 (Discovery Studio) (악셀리스 (Accelrys))를 사용하여 3-차원 상동성 모델을 수립하는 방법을 알고 있다. 이러한 모델은 조인자 특이성의 바람직한 변화를 달성하기 위해 어느 아미노산 잔기를 돌연변이시킬 지를 결정하는 데 유용하다. 이. 콜라이로부터의 GldA의 3-차원 구조로부터, 본 발명자들은 동일한 위치에서의 상이한 아미노산 잔기에 의해 대체되어야 하는 아미노산 잔기를 확인하였다:
- D37
- F39
- V40
- F43
- T116
- P161
- L164
본 발명에 따르면, GldA 조인자 특이성의 변화는 위치 D37의 적어도 하나의 돌연변이에 의해 매개된다. 바람직한 실시양태에서, 위치 D37의 아미노산 잔기는 글리신 (D37G), 알라닌 (D37A) 또는 발린 (D37V)에 의해 대체된다. 가장 바람직한 실시양태에서, 위치 D37의 아미노산 잔기는 글리신 (D37G)에 의해 대체된다.
바람직한 실시양태에서, GldA 조인자 특이성의 변화는 위치 D37의 돌연변이를 위치 P161의 적어도 하나의 돌연변이와 조합함으로써 개선된다. 바람직하게는, 위치 P161의 아미노산 잔기는 세린 (P161S) 또는 트레오닌 (P161T)에 의해 대체된다. 보다 바람직하게는, 위치 P161의 아미노산 잔기는 세린 (P161S)에 의해 대체된다.
가장 바람직한 실시양태에서, GldA 조인자 특이성의 변화는 위치 D37 및 P161의 돌연변이를 위치 L164의 적어도 하나의 돌연변이와 조합함으로써 개선된다. 바람직하게는, 위치 L164의 아미노산 잔기는 알라닌 (L164A), 글리신 (L164G) 또는 발린 (L164V)에 의해 대체된다. 보다 바람직하게는, 위치 L164의 아미노산 잔기는 알라닌 (L164A)에 의해 대체된다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 적어도 하기 돌연변이: D37G, P161S 및 L164A를 함유하는 돌연변이 gldA * 코딩 GldA* 돌연변이체를 과발현한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 이들 돌연변이는 이전에 구축되고 돌연변이 A160T를 함유하는 GldA* 돌연변이체에서 도입될 수 있다.
이. 콜라이 (균주 K12)에 의해 발현되는 글리세롤 데히드로게나제의 아미노산 서열은 유니프로트KB 데이터베이스 상에서 참조번호 P0A9S5 하에 공개적으로 이용가능하다.
따라서, NADPH HAR 의존성 활성을 향상시키기 위해, 본 발명의 미생물은 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 NADPH 의존성 아세톨 리덕타제 (NADPH HAR)를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 또는 상기 기재된 바와 같은 NADPH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 gldA * 유전자를 과발현한다.
본 발명의 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 변형된 미생물은
- 적어도 하나의 NADPH HAR 유전자를 과발현할 수 있고, gldA 유전자에서 결실될 수 있거나,
- 적어도 하나의 NADPH HAR 유전자 및 gldA * NADPH 돌연변이체를 과발현할 수 있거나,
- 적어도 하나의 NADPH HAR 유전자 및 gldA * NADPH 돌연변이체를 과발현할 수 있고, gldA 유전자에서 결실될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에서, 1,2-프로판디올의 생산은 추가로 상기 기재된 바와 같은 NADPH 의존성 HAR 활성의 증가를 세포에서의 NADPH 이용률의 증가와 조합함으로써 개선된다.
세포에서의 NADPH 이용률을 증가시키기 위한 전략은 관련 기술분야의 통상의 기술자로부터 널리 공지되어 있다 (문헌 [Lee et al., 2013]에서 검토됨). 본 발명에서, 세포에서의 NADPH 이용률은
- 막-결합된 트랜스히드로게나제를 코딩하는 pntAB 오페론을 과발현시킴 (WO2012/055798A1), 및/또는
- 포스포글루코스 이소머라제를 코딩하는 pgi 유전자를 약화시킴, 및/또는
- pfkA 유전자에 의해 코딩되는 포스포프룩토키나제의 활성을 감소시키고 (WO2005/047498), 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 zwf 유전자를 과발현시킴 (Shin et al., 2002)으로써 펜토스 포스페이트 경로를 통한 유동을 증가시킴, 및/또는
- NADPH 생성 글리세르알데히드-3-포스페이트를 코딩하는 스트렙토코쿠스 무탄스 (Streptococcus mutans)로부터의 gapN 유전자를 과발현시킴 (Centeno-Leija et al., 2013),
- 및/또는 NADPH를 생성할 수 있는 리포아미드 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 lpd * 유전자를 과발현시킴 (Bocanegra et al., 1993),
- 및/또는 효소적 또는 열-의존성 수화에 의해 생산되는 NADH(X) 및 NADPH(X)를 재활성화하는 ADP-의존성 데히드라타제를 코딩하는 yjeF 유전자를 과발현시킴 (Marbaix et al., 2011)
으로써 증가된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명의 미생물이 NADPH HAR 유전자를 과발현하는 경우, 메틸글리옥살 리덕타제 (MGR)를 코딩하는 yqhD 유전자는 결실되었다. 이러한 조건 하에서, HAR 단백질은 NADPH 의존성 HAR 효소로서 뿐만 아니라, 메틸글리옥살의 1,2-프로판디올로의 2-단계 NADPH 의존성 환원을 수행하는 NADPH 의존성 MGR 효소로서 작용한다. 이러한 활성은 상기 열거된 NADPH 의존성 HAR 효소에 대한 임의의 후보에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 보다 바람직한 실시양태에서, NADPH 의존성 아세톨 리덕타제 활성이 상기 기재된 임의의 변형에 따라 향상되는, 탄소 공급원으로서 탄수화물로부터의 재조합 미생물에 의한 발효적 공정에서의 1,2-프로판디올의 생산은 상기 미생물에서 상기 논의된 변형의 조합, 예를 들어:
- 적어도 하나의 NADPH HAR 유전자 및 pntAB 유전자의 발현이 향상됨,
- 적어도 하나의 NADPH HAR 유전자의 발현이 향상되고, gldA 유전자가 결실됨,
- 적어도 하나의 NADPH HAR 유전자 및 pntAB의 발현이 향상되는 반면, gldA 유전자는 결실됨,
- 적어도 하나의 NADPH HAR 유전자 및 yjeF의 발현이 향상되는 반면, gldA 유전자는 결실됨,
- 적어도 하나의 NADPH HAR 유전자의 발현이 향상되고, pgi가 약화되는 반면, gldA 유전자는 결실됨,
- 적어도 하나의 NADPH HAR 유전자 및 zwf의 발현이 향상되는 반면, gldA 유전자 및 pfkA 유전자는 약화됨,
- 적어도 하나의 NADPH HAR 유전자 및 gapN의 발현이 향상되는 반면, gldA 유전자는 결실됨,
- 적어도 하나의 NADPH HAR 유전자 및 lpd * 돌연변이체의 발현이 향상되는 반면, gldA 유전자는 결실됨,
- 돌연변이 GldA* NADPH 코딩 유전자의 발현이 향상되고, gldA 유전자가 결실됨,
- 돌연변이 GldA* NADPH 코딩 유전자 및 pntAB 유전자의 발현이 향상됨,
- 돌연변이 GldA* NADPH 코딩 유전자 및 pntAB 유전자의 발현이 향상되는 반면, gldA 유전자는 결실됨,
- 적어도 하나의 NADPH HAR 유전자의 발현이 향상되고, yqhD 유전자가 약화되는 반면, gldA 유전자는 결실됨,
- 적어도 하나의 NADPH HAR 유전자 및 pntAB 유전자의 발현이 향상되는 반면, yqhD 유전자 및 gldA 유전자는 결실됨
을 통해 달성될 수 있다.
실시예
실시예
1 : 방법
하기 주어진 실시예에서, 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 에스케리키아 콜라이에 대해 문헌 [Datsenko & Wanner, (2000)]에 의해 잘 기재된 상동성 재조합을 사용하여 복제용 벡터 및/또는 다양한 염색체 결실, 및 치환을 함유하는 이. 콜라이 균주를 구축하였다. 동일한 방식으로, 재조합 미생물에서 하나 또는 몇몇 유전자를 발현하거나 과발현하는 플라스미드 또는 벡터의 사용은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 널리 공지되어 있다. 적합한 이. 콜라이 발현 벡터의 예로는 pTrc, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236 등을 들 수 있다.
몇몇 프로토콜을 하기 실시예에서 사용하였다. 이 발명에 사용된 프로토콜 1 (상동성 재조합, 재조합의 선택에 의한 염색체 변형), 프로토콜 2 (파지 P1의 형질도입) 및 프로토콜 3 (항생제 카세트 절제, 저항성 유전자는 필요할 경우 제거하였음)은 특허 출원 EP 2532751에 충분히 기재되었다. 염색체 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 설계할 수 있는 적절한 올리고뉴클레오티드로의 PCR 분석에 의해 확인하였다.
프로토콜 4: 재조합 플라스미드의 구축
재조합 DNA 기술은 관련 기술분야에 잘 기재되어 있다. DNA 단편 및 선택된 플라스미드를 혼화성 제한 효소 (관련 기술분야의 통상의 기술자가 정의할 수 있을 것임)로 소화시킨 후, 라이게이션하고, 수용 세포 내로 형질전환시켰다. 형질전환체를 분석하고, 관심의 재조합 플라스미드를 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.
<표 2>
하기
실시예에
인용된 서열
프로토콜
5: 1
,2-
프로판디올
생산 균주의 평가
1,2-프로판디올 생산 균주를 20 g/L 글루코스 또는 수크로스 및 40 g/L MOPS를 사용한 것을 제외하고는 특허 출원 EP 2532751에 기재된 바와 같이 플라스크 배양으로 배양하였다. 필요한 100 μΜ IPTG를 배지에 첨가하였다. 1,2-프로판디올 (PG) 및 히드록시아세톤 (HA)을 HPLC에 의해 정량하였다. PG의 생산 (gPG/L) 및 HA의 PG로의 전환 (gPG/L/(gHA/L+gPG/L))은 1,2-프로판디올의 생산에 대한 균주 성능의 추정치를 제공한다.
프로토콜 6: 재조합 단백질의 생산을 위한 플라스크 배양
재조합 단백질의 생산을 위한 플라스크 배양을 LB 브로쓰를 5.0 g/L 글루코스로 보충한 것을 제외하고는 특허 출원 WO 2010/076324에 기재된 바와 같이 수행하였다.
실시예
2 : 균주 1, 2, 3 및 4의 구축
균주 1의 구축
frdABCD 오페론에 의해 코딩되는 푸마레이트 리덕타제 플라보단백질 복합체 및 ptsG 유전자에 의해 코딩되는 글루코스 포스포트랜스퍼라제 효소 IIBC(Glc)를 불활성화하기 위해, 상동성 재조합 전략을 사용하였다 (프로토콜 1 및 3에 따름). DfrdABCD: 서열식별번호: (SEQ ID N°): 1 및 2 (표 2에 열거됨), 및 DptsG: 서열식별번호: 3 및 4 (표 2에 열거됨)에 대한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 저항성 카세트를 PCR 증폭시켰다. 보유된 균주를 MG1655 DfrdABCD ::Cm 및 MG1655 DptsG :: Km으로 지정하였다. 마지막으로, DfrdABCD :: Cm 및 DptsGr :: Km 결실을 특허 출원 WO2008/116852에 기재된 진화된 균주 MG1655 lpd * DtpiA DpflAB DadhE DldhA DgloA DaldA DaldB Dedd DarcA Dndh 내로의 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 전달하여 균주 1을 생성하였다.
균주 2의 구축
gldA * ( A160T ) 유전자를 특허 출원 EP 2532751에 기재된 바와 같은 pME101VB06 플라스미드 내로 클로닝하였다. pPG0078로 명명된 이 플라스미드를 균주 1 내로 형질전환시켜 균주 2를 생성하였다.
균주 3의 구축
tpiA 유전자에 의해 코딩되는 트리오스 포스페이트 이소머라제를 발현시키고, gapA 유전자에 의해 코딩되는 글리세르알데히드 포스페이트 데히드로게나제의 발현을 조절하기 위해, 상동성 재조합 전략을 사용하였다 (프로토콜 1 및 3에 따름). tpiA 유전자를 특허 WO2008/116852에 기재된 바와 같이 진화된 균주 MG1655 lpd * DtpiA DpflAB DadhE DldhA DgloA DaldA DaldB Dedd DarcA Dndh DfrdABCD 내로 도입하였다. 그 후, gapA 발현을 조절하기 위한 게놈 변형 "CI857-PR01/ RBS11 -gapA"를 특허 EP 2532751에 기재된 바와 같이 이전의 균주 내로 도입하여 균주 3을 생성하였다.
균주 4의 구축
수크로스 상에서 에스케리키아 콜라이를 성장시키기 위해, 플라스미드 pUR400으로부터의 유전자 scrK, scrYAB 및 scrR (Schmid et al., 1982)을 플라스미드 pBBR1MCS3 상의 그의 천연 프로모터 하에서 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pPG0231로 명명하였다. 플라스미드 pPG0078 및 pPG0231을 균주 3 내로 형질전환시켜 균주 4를 생성하였다.
실시예
3 : 1
,2-
프로판디올의
생산은
클로스트리디움
베이제린크키이
로부터의
2차
알콜
데히드로게나제
adh
를
과발현하는 균주에서
개선된다
균주 5의 구축
클로스트리디움 베이제린크키이로부터의 adh 유전자 (Hanai et al., 2007)를 특허 출원 WO 2008/116853에 기재된 pME101VB01 플라스미드 내로 클로닝하였다. pPG0468로 명명된 이 플라스미드를 균주 1 내로 형질전환시켜 균주 5를 생성하였다.
균주 6의 구축
gldA 유전자를 불활성화하기 위해, 상동성 재조합 전략을 사용하였다 (프로토콜 1 및 3에 따름). DgldA에 대한 올리고뉴클레오티드: 서열식별번호: 5 및 6 (표 2에 열거됨)를 사용하여 저항성 카세트를 PCR 증폭시켰다. 보유된 균주를 MG1655 DgldA :: Cm으로 지정하였다. DgldA :: Cm 결실을 균주 5 내로의 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 전달하여 균주 6을 생성하였다.
균주 7의 구축
플라스미드 pPG0468 및 pPG0231을 균주 3 내로 형질전환시켜 균주 7을 생성하였다.
균주 8의 구축
gldA 유전자를 불활성화하기 위해, 이전에 기재된 DgldA :: Cm 결실을 균주 7 내로의 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 전달하여 균주 8을 생성하였다.
프로토콜 5에 기재된 바와 같이 평가된 클로스트리디움 베이제린크키이로부터의 adh를 발현하는 균주 5, 6, 7 및 8은 그의 각각의 대조군 균주 2 및 4에 비해 보다 많은 1,2-프로판디올 (PG)을 생산하였으며, 보다 양호한 전환율 및 수율을 가졌다 (표 3).
<표 3>
클로스트리디움 베이제린크키이 로부터의 adh 를 발현하는 균주 5, 6, 7 및 8에 의한 1,2- 프로판디올 생산. (기호 ∼는 균주 사이에 유의한 차이가 없음을 지시하고, 기호 +는 대조군 균주에 비해 성능의 10 내지 100％의 증가를 지시하고, 기호 ++는 대조군 균주에 비해 100 내지 200％의 증가를 지시하고, 기호 +++는 대조군 균주에 비해 200 내지 300％의 증가를 지시하고, 기호 ++++는 대조군 균주에 비해 300％ 초과의 증가를 지시함):
실시예
4 : 1
,2-
프로판디올의
생산은
클로스트리디움
베이제린크키이
로부터의
2차
알콜
데히드로게나제
adh
를
과발현하는 균주에서 피리딘 뉴클레오티드
트랜스
히드로게나제
pntAB
를 과발현시킴으로써
개선된다
균주 9의 구축
pntAB의 천연 프로모터 영역을 상동성 재조합 전략 (프로토콜 1 및 3에 따름)을 사용하여 유도성 trc 프로모터 (플라스미드 pTRC99A로부터, 아머샴 파마시아 (Amersham Pharmacia)) 및 한정된 리보솜 결합 부위 RBS120 (RBS 캘큘레이터 소프트웨어로부터) (표 2에 열거된 서열식별번호: 7)에 의해 대체하였다. 염색체 통합을 위해, 둘 다 표적화된 통합 좌위 pntAB에 대한 상동성 DNA 서열에 의해 플랭킹된 인공 프로모터 영역 및 저항성 마커를 운반하는 단편을 중첩 PCR 기술 (중첩 올리고뉴클레오티드)에 의해 PCR 증폭시켰다. pntAB 내로의 재조합을 위한 서열은 서열식별번호: 8 및 9 (표 2에 열거됨)로 지칭된다. 그 후, 얻어진 PCR 생성물을 전기천공에 의해 균주 MG1655 (pKD46) 내로 도입하였다. 보유된 균주를 MG1655 Ptrc01 /OP01/ RBS120 - pntAB :: Cm으로 지정하였다. 그 후, Ptrc01/OP01/RBS120-pntAB::Cm 변형을 균주 6 내로의 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 전달하여 균주 9를 생성하였다.
균주 10의 구축
이전에 기재된 Ptrc01 /OP01/ RBS120 - pntAB :: Cm 변형을 균주 8 내로의 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 전달하여 균주 10을 생성하였다.
프로토콜 5에 기재된 바와 같이 평가된 pntAB를 과발현하는 균주 9 및 10은 각각 균주 6 및 8에 비해 보다 많은 1,2-프로판디올 (PG)을 생산하였으며, 보다 양호한 전환율 및 수율을 가졌다 (표 4).
<표 4>
pntAB 를 과발현하는 균주 9 및 10에 의한 1,2- 프로판디올 생산. (기호 ∼는 균주 사이에 유의한 차이가 없음을 지시하고, 기호 +는 대조군 균주에 비해 성능의 10 내지 100％의 증가를 지시하고, 기호 ++는 대조군 균주에 비해 100 내지 200％의 증가를 지시하고, 기호 +++는 대조군 균주에 비해 200 내지 300％의 증가를 지시하고, 기호 ++++는 대조군 균주에 비해 300％ 초과의 증가를 지시함):
실시예
5 :
클로스트리디움
베이제린크키이
로부터의
2차
알콜
데히드로게나제
adh
를 과발현하는 균주에서의 1,2-
프로판디올
생산을
개선시키기
위한
pntAB
의
과발현에 대한 대안
균주 11의 구축
에스케리키아 콜라이로부터의 yjeF 유전자를 adh를 갖는 오페론에서 한정된 리보솜 결합 부위 RBS121 (RBS 캘큘레이터 소프트웨어로부터) (표 2에 열거된 서열식별번호: 10) 하에서 실시예 3에 기재된 pPG0468 플라스미드 내로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pPG0518로 명명하였다. 마지막으로, 플라스미드 pPG0518 및 pPG0231을 중간체 균주 8 (플라스미드 없음) 내로 형질전환시켜 균주 11을 생성하였다.
균주 12의 구축
pgi 유전자를 불활성화하기 위해, 상동성 재조합 전략을 사용하였다 (프로토콜 1 및 3에 따름). Dpgi에 대한 올리고뉴클레오티드: 서열식별번호: 11 및 12 (표 2에 열거됨)를 사용하여 저항성 카세트를 PCR 증폭시켰다. 보유된 균주를 MG1655 Dpgi::Cm으로 지정하였다. Dpgi::Cm 결실을 균주 8 내로의 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 전달하여 균주 12를 생성하였다.
균주 13의 구축
천연 pfkA 유전자를 상동성 재조합 전략 (프로토콜 1 및 3에 따름)을 사용하여 돌연변이된 pfkA * (L98Q) 유전자에 의해 대체하였다. 먼저, pfkA 유전자를 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 13 및 14 (표 2에 열거됨)를 사용하여 결실시켜 저항성 카세트를 PCR 증폭시켰다. 보유된 균주를 MG1655 DpfkA::Km으로 지정하였다. 그 후, 염색체 통합을 위해, 둘 다 표적화된 통합 좌위 pfkA에 대한 상동성 DNA 서열에 의해 플랭킹된 돌연변이된 pfkA * (L98Q) 영역 및 저항성 마커를 운반하는 단편을 중첩 PCR 기술 (중첩 올리고뉴클레오티드)에 의해 PCR 증폭시켰다. pfkA 내로의 재조합을 위한 서열을 서열식별번호: 15 및 16 (표 2에 열거됨)으로 지칭한다. 그 후, 얻어진 PCR 생성물을 전기천공에 의해 균주 MG1655 DpfkA::Km (pKD46) 내로 도입하였다. 보유된 균주를 MG1655 pfkA * (L98Q)::Cm으로 지정하였다. pfkA * (L98Q)::Cm 변형을 중간체 균주 8 (플라스미드가 없는 균주) 내로의 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 전달하였다. 에스케리키아 콜라이로부터의 zwf 유전자를 adh를 갖는 오페론에서 한정된 리보솜 결합 부위 RBS 113 (RBS 캘큘레이터 소프트웨어로부터) (표 2에 열거된 서열식별번호: 17) 하에서 실시예 3에 기재된 pPG0468 플라스미드 내로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pPG0532로 명명하였다. 마지막으로, 플라스미드 pPG0532 및 pPG0231을 이전의 균주 내로 형질전환시켜 균주 13을 생성하였다.
균주 14의 구축
gldA 유전자를 불활성화하기 위해, 이전에 기재된 DgldA::Cm 결실을 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 중간체 진화된 균주 3 (gapA 조절이 없음) 내로 전달하였다. gapN 유전자에 의해 코딩되는 스트렙토코쿠스 무탄스로부터의 NADP+-의존성 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제를 발현시키기 위해, 상동성 재조합 전략을 사용하였다 (프로토콜 1 및 3에 따름). 에스케리키아 콜라이로부터의 gapA 유전자를 문헌 [Centeno-Leija et al. (2013)]에 의해 기재된 바와 같이 스트렙토코쿠스 무탄스로부터의 gapN 유전자에 의해 대체하였다. 얻어진 PCR 생성물을 전기천공에 의해 균주 MG1655 (pKD46) 내로 도입하였다. 보유된 균주를 MG1655 gapN::Cm으로 지정하였다. gapN::Cm 변형을 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 이전의 균주 내로 전달하였다. 유전자 scrK, scrYAB 및 scrR을 염색체적으로 발현시키기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner, 2000]에 의해 기재된 상동성 재조합 전략 (프로토콜 1 및 3에 따름)을 사용하였다. 염색체 통합을 위해, 둘 다 표적화된 통합 좌위 ykiA에 대한 상동성 DNA 서열에 의해 플랭킹된 저항성 마커에 연결된 그의 천연 프로모터 하에서 발현된 유전자 scrK, scrYAB 및 scrR을 운반하는 단편을 중첩 PCR 기술 (중첩 올리고뉴클레오티드)에 의해 PCR 증폭시켰다. ykiA 내로의 재조합을 위한 서열을 서열식별번호: 18 및 19 (표 2에 열거됨)로 지칭하였다. 그 후, 얻어진 PCR 생성물 "DykiA::scrKYABR"을 전기천공에 의해 균주 MG1655 (pKD46) 내로 도입하였다. 보유된 균주를 MG1655 DykiA::scrKYABR::Cm으로 지정하였다. DykiA::scrKYABR::Cm 변형을 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 이전의 균주 내로 전달하였다. 스트렙토코쿠스 무탄스로부터의 NADP+-의존성 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제의 과생산을 허용하기 위해, gapN 유전자를 문헌 [Centeno-Leija et al. (2013)]에 기재된 바와 같이 pACYC184 플라스미드 상에서 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pPG0548로 명명하였다. 마지막으로, 플라스미드 pPG0468 및 pPG0548을 이전의 균주 내로 형질전환시켜 균주 14를 생성하였다.
균주 15의 구축
lpd 유전자에 의해 코딩되는 NAD+-의존성 리포아미드 데히드로게나제를 불활성화하기 위해, 상동성 재조합 전략을 사용하였다 (프로토콜 1 및 3에 따름). 따라서, Dlpd에 대한 올리고뉴클레오티드: 서열식별번호: 20 및 21 (표 2에 열거됨)을 사용하여 저항성 카세트를 PCR 증폭시켰다. 보유된 균주를 MG1655 Dlpd::Cm으로 지정하였다. 마지막으로, Dlpd::Cm 결실을 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 중간체 균주 8 (플라스미드가 없는 균주) 내로 전달하였다. 에스케리키아 콜라이로부터의 돌연변이된 lpd * (A55V/G185A/G189A/E203V/M204R/F205K/D206H/P210R) 유전자를 중첩 PCR 기술 (중첩 올리고뉴클레오티드)에 의해 PCR 증폭시키고, adh를 갖는 오페론에서 한정된 리보솜 결합 부위 RBS131 (RBS 캘큘레이터 소프트웨어로부터) (표 2에 열거된 서열식별번호: 22) 하에서 실시예 3에 기재된 pPG0468 플라스미드 내로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pPG0523으로 명명하였다. 마지막으로, 플라스미드 pPG0231 및 pPG0523을 이전의 균주 내로 형질전환시켜 균주 15를 생성하였다.
프로토콜 5에 기재된 바와 같이 평가된 균주 11, 12, 13, 14 및 15는 균주 8에 비해 보다 많은 1,2-프로판디올 (PG)을 생산하였으며, 보다 양호한 전환율을 가졌다 (표 5).
<표 5>
균주 11, 12, 13, 14 및 15에 의한 1,2- 프로판디올 생산. (기호 ∼는 균주 사이에 유의한 차이가 없음을 지시하고, 기호 +는 대조군 균주에 비해 성능의 10 내지 100％의 증가를 지시하고, 기호 ++는 대조군 균주에 비해 100 내지 200％의 증가를 지시하고, 기호 +++는 대조군 균주에 비해 200 내지 300％의 증가를 지시하고, 기호 ++++는 대조군 균주에 비해 300％ 초과의 증가를 지시함):
실시예
6 :
클로스트리디움
베이제린크키이
로부터의
adh
에
대한 대안
상동성
서열의 확인 및 계통수의 구축
서열의 세트로부터의 계통수의 구축을 웹사이트 http://www.phylogeny.fr/ 상에서 이용가능한 생물정보학 프로그램을 사용하여 수행하였으며, 소프트웨어는 문헌 [Dereeper et al. (2008)] 및 [Dereeper et al. (2010)]에 기재되어 있다.
단계 1 :
상동성
서열의 확인
유사한 서열의 확인을 2차 알콜 데히드로게나제 패밀리 및 알데히드/케톤 리덕타제 패밀리로부터 BLAST 소프트웨어를 사용하여 하기 파라미터 : 데이터베이스 (스위스프로트 (Swissprot)/유니프로트), e-값 = 0.01 및 저-복잡성 서열에 대한 필터를 설정함으로써 수행하였다.
단계 2 : 계통수의 구축
서열을 MUSCLE 소프트웨어로 정렬하고, 모호한 영역을 지블록스 (Gblocks) 프로그램으로 제거하였다. 그 후, 계통수를 PhyML 프로그램에서 실행된 최대 가능도 방법을 사용하여 재구축하였다. 계통수의 그래프 제시 및 편집을 트리딘 (TreeDyn)으로 수행하였다.
<표 6>
NADPH
의존성
HAR
효소에 대한 후보:
클로스트리디움 베이제린크키이로부터의 Adh는 써모안아에로박테리움 브로키이, 엔트아메바 히스톨리티카 및 미코플라스마 뉴모니아에 효소와 가장 가깝게 관련되었다. 다음으로 가장 양호한 매치는 진핵생물에서 발견된 알콜 데히드로게나제와의 것이었다. 글루코노박터 옥시단스, 히포크레아 제코리나, 엔트아메바 히스톨리티카 및 바실루스 서브틸리스로부터의 효소를 클로닝하고, 정제하고, NADPH 의존성 히드록시아세톤 리덕타제 활성에 대해 검정하였다.
균주 16의 구축
gldA 유전자를 불활성화하기 위해, 상동성 재조합 전략을 사용하였다 (프로토콜 1 및 3에 따름). DgldA에 대한 올리고뉴클레오티드: 서열식별번호: 5 및 6 (표 2에 열거됨)을 사용하여 저항성 카세트를 PCR 증폭시켰다. 보유된 균주를 MG1655 DgldA :: Km으로 지정하였다. 마지막으로, DgldA :: Km 결실을 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 균주 BL21(DE3)스타 내로 전달하였다. 글루코노박터 옥시단스로부터의 글리세롤 데히드로게나제를 특징화하기 위해, 에스케리키아 콜라이에 대해 최적화된 합성 유전자 gld (표 2에 열거된 서열식별번호: 23)를 발현 플라스미드 pPAL7 (바이오래드 (Biorad)®) 내로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pPG0381로 명명하고, 균주 BL21(DE3)스타 DgldA :: Km 내로 형질전환시켜 균주 16을 생성하였다.
균주 17의 구축
히포크레아 제코리나로부터의 글리세롤 데히드로게나제를 특징화하기 위해, 에스케리키아 콜라이에 대해 최적화된 합성 유전자 gld2 (표 2에 열거된 서열식별번호: 24)를 발현 플라스미드 pPAL7 (바이오래드®) 내로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pPG0418로 명명하고, 이전에 기재된 균주 BL21(DE3)스타 DgldA :: Km 내로 형질전환시켜 균주 17을 생성하였다.
균주 18의 구축
엔트아메바 히스톨리티카로부터의 알콜 데히드로게나제를 특징화하기 위해, 에스케리키아 콜라이에 대해 최적화된 합성 유전자 adh1 (표 2에 열거된 서열식별번호: 25)을 발현 플라스미드 pPAL7 (바이오래드®) 내로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pPG0539로 명명하고, 균주 BL21(DE3)코돈플러스 내로 형질전환시켜 균주 18을 생성하였다.
균주 19의 구축
바실루스 서브틸리스로부터의 알도 케토 리덕타제를 특징화하기 위해, 바실루스 서브틸리스로부터의 유전자 yhdN을 발현 플라스미드 pPAL7 (바이오래드®) 내로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pPG0357로 명명하고, 균주 BL21(DE3) 내로 형질전환시켜 균주 19를 생성하였다.
재조합 단백질 정제
균주 16, 17, 18 및 19를 프로토콜 6에 기재된 바와 같이 배양하였다. 세포 (350 내지 500 mg 건조 중량)를 프로테아제 억제제 칵테일을 갖는 추출 완충제 (60 내지 90 ml)에 재현탁시켰다. 현탁된 세포를 얼음 상의 30초의 6회 초음파처리 사이클 (브란슨 (Branson) 초음파기, 70W)에 의해 파괴한 후, 1 mM MgCl2 및 2 UI/ml의 DNaseI과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 데브리스를 4℃에서 30분 동안 12000 g에서의 원심분리에 의해 제거하였다. 상청액을 조 세포-추출물로서 보관하였다. 재조합 단백질을 서브틸리신 친화도 크로마토그래피 (PROfinity EXact 카트리지 (Cartridge) 5 ml, 바이오래드 (BIORAD))를 제조자의 지시서에 따라 사용함으로써 조 추출물로부터 정제하였다. 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 농축시키고, 겔 여과 컬럼 (수퍼덱스 (Superdex) 200 10/300 GL 컬럼, 지이 헬스케어 (GE Healthcare)) 상으로 로딩하였다. 단백질 농도를 브래드포드 (Bradford) 검정을 사용하여 측정하였다.
정제된 효소의
NADPH
의존성 히드록시아세톤
리덕타제
(
HAR
NADPH
)
HAR NADPH 활성을 30℃에서의 및 분광광도계 상의 340 nm에서의 NADPH의 소비 (ε340nm = 6290 M-1cm-1)를 측정함으로써 측정하였다. 검정 완충제, 0.2 mM NADPH 및 정제된 단백질을 함유하는 반응 혼합물 (1 mL)을 30℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 30 mM 히드록시아세톤을 첨가하여 반응을 개시하였다. 효소 활성의 1 단위는 분 당 1 μmol의 NADPH의 감소를 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다. 특이적 효소 활성을 단백질의 mg 당 효소 활성의 단위로서 표현하였다. 히드록시아세톤 없이 측정된 활성 값은 제하였다.
<표 7>
특정 후보에 대한
HAR
NADPH
의존성 활성:
균주 20의 구축
엔트아메바 히스톨리티카로부터의 최적화된 adh1 유전자를 특허 출원 WO 2008/116853에 기재된 pME101VB01 플라스미드 내로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pPG0544로 명명하였다. 플라스미드 pPG0544 및 pPG0231을 실시예 2에 기재된 균주 3 내로 형질전환시킨 후, gldA 유전자를 실시예 3에 기재된 바와 같이 불활성화하고, pntAB 오페론을 실시예 4에 기재된 바와 같이 과발현시켜 균주 19를 생성하였다.
프로토콜 5에 기재된 바와 같이 평가된 균주 20은 균주 4에 비해 보다 많은 1,2-프로판디올 (PG)을 생산하였으며, 보다 양호한 전환율을 가졌다 (표 8).
<표 8>
엔트아메바 히스톨리티카로부터의 adh1 유전자를 발현하는 균주 20에 의한 1,2-프로판디올 생산. (기호 ∼는 균주 사이에 유의한 차이가 없음을 지시하고, 기호 +는 대조군 균주에 비해 성능의 10 내지 100％의 증가를 지시하고, 기호 ++는 대조군 균주에 비해 100 내지 200％의 증가를 지시하고, 기호 +++는 대조군 균주에 비해 200 내지 300％의 증가를 지시하고, 기호 ++++는 대조군 균주에 비해 300％ 초과의 증가를 지시함):
실시예
7 :
GldA
*
(
A160T
)의 조-인자
리팩터링
효소 설계 및 구조적 분석
GldA*(A160T)의 상동성 모델을 바실루스 스테아로써모필루스의 글리세롤 데히드로게나제의 X-선 구조로부터 수립하였다. 모델을 디스커버리 스튜디오 소프트웨어 (악셀리스)를 사용함으로써 계산하였다. 이들 모델을 적어도 30％ 동일성을 가지며 그의 구조가 공지된 NAD 및 NADP 의존성 효소의 구조와 비교하였다.
조인자 특이성에 관여하는 아미노산을 GldA*(A160T) 및 몇몇 NAD 및 NADP 의존성 데히드로게나제의 서열 사이의 서열 정렬, GldA*(A160T) 및 RCSB 단백질 데이터 뱅크 (Protein Data Bank)에 존재하는 글리세롤 데히드로게나제의 상동성 모델 사이의 중복, 및 문헌 [Clermont et al. (1993)], [Ruzheinikov et al. (2001)], [Corbier et al. (1990)] 및 [Wu et al. (2012)]에서 발견되는 데이터와의 비교를 통해 확인하였다.
2가지 돌연변이체를 서열적 및 구조적 분석으로부터 한정하였다: D37G 및 D37G/P161S/L164A.
균주 21의 구축
에스케리키아 콜라이로부터의 돌연변이된 1,2-프로판디올:NAD+ 옥시도리덕타제를 특징화하기 위해, 먼저 유전자 gldA를 발현 플라스미드 pET101/D-TOPO (라이프테크놀로지즈 (Lifetechnologies)®) 내로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pPG0029로 명명하였다. 돌연변이된 gldA * ( A160T ) 유전자를 과발현시키기 위해, pPG0029 상의 부위-지정 돌연변이유발을 사용하였다. 이 플라스미드를 pPG0394로 명명하고, 균주 BL21(DE3)스타 DgldA :: Km 내로 형질전환시켜 균주 21을 생성하였다.
균주 22의 구축
돌연변이된 gldA * ( A160T / D37G ) 유전자를 과발현시키기 위해, pETTOPO-gldA * (A160T) 상의 부위-지정 돌연변이유발을 사용하였다. 이 플라스미드를 pPG0425로 명명하고, 균주 BL21(DE3)스타 DgldA :: Km 내로 형절전환시켜 균주 22를 생성하였다.
균주 23의 구축
돌연변이된 gldA * ( A160T / D37G / P161S / L164A ) 유전자를 과발현시키기 위해, pPG0425 상의 부위-지정 돌연변이유발을 사용하였다. 이 플라스미드를 pPG0438로 명명하고, 균주 BL21(DE3)스타 DgldA :: Km 내로 형질전환시켜 균주 23을 생성하였다.
GldA
*
(
A160T
),
GldA
*
(
A160T
/
D37G
및
GldA
*
(
A160T
/
D37G
/
P161S
/
L164A
)의 정제
균주 21, 22 및 23을 프로토콜 6에 기재된 바와 같이 배양하였다. 세포 (500 mg 건조 중량)를 90 mL의 추출 완충제 (100 mM 인산칼륨 pH 7.6, 20 mM 이미다졸 및 프로테아제 억제제 칵테일)에 재현탁시켰다. 현탁된 세포를 얼음 상의 30초의 8회의 초음파처리 사이클 (브란슨 초음파기, 70W)에 의해 파괴한 후, 5 mM MgCl2 및 2 UI/ml의 DNaseI과 함께 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 세포 데브리스를 4℃에서 30분 동안 12000 g에서의 원심분리에 의해 제거하였다. 상청액을 조 추출물로서 보관하였다. 효소를 니켈 (Nickel) 친화도 크로마토그래피 (HisTrapFF 1 mL, 지이 헬스케어)를 제조자의 지시서에 따라 사용함으로써 조 추출물로부터 정제하였다. 효소를 100 mM 인산칼륨 (pH 7.6) 중 이미다졸의 선형 구배 (20에서 500 mM)를 사용하여 용리하였다. 100 mM MES-KOH (pH 6.5)로 평형화된 겔 여과 (수퍼덱스200 10/300 GL 컬럼, 지이 헬스케어)에 의한 탈염 단계 후, 단백질 농도를 브래드포드 검정을 사용하여 측정하였다.
GldA
*
(
A160T
),
GldA
*
(
A160T
/
D37G
) 및
GldA
*
(
A160T
/
D37G
/
P161S
/
L164A
)의
특징화
NADPH 의존성 히드록시아세톤 리덕타제 활성 (HAR NADPH)을 30℃에서의 및 분광광도계 상의 340 nm에서의 NADPH의 소비 (ε340 = 6290 M-1cm-1)를 측정함으로써 측정하였다. 100 mM MES-KOH (pH 6.5), 0.1 mM FeSO4, 30 mM 황산암모늄, 0.05 내지 0.4 mM NADPH 및 정제된 효소를 함유하는 반응 혼합물 (1 mL)을 30℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 0.1 내지 10 mM 히드록시아세톤을 첨가하여 반응을 개시하였다. NADH 의존성 히드록시아세톤 리덕타제 (HAR NADH) 검정은 NADPH가 반응 혼합물에서 NADH에 의해 대체되고, 활성이 340 nm에서의 NADH의 소비를 측정함으로써 측정된 것을 제외하고는 HAR NADPH와 동일한 조건 하에서 수행된다. 동역학 파라미터를 시그마플로트 (Sigmaplot)로 미카엘리스-멘텐 방정식에 대해 피팅함으로써 측정하였다.
GldA*(A160T/D37G) 및 GldA*(A160T/D37G/P161S/L164A) 효소는 GldA*(A160T)에 비해 NADPH로는 증가된 촉매 효율 및 NADH로는 감소된 촉매 효율을 나타내었다 (표 9).
<표 9>
GldA
*
NADPH
돌연변이체의 촉매 효율:
균주 24의 구축
돌연변이된 gldA * ( A160T / D37G / P161S / L164A ) 유전자를 특허 출원 EP 2532751에서 pME101VB06-gldA*(A160T)의 구축에 대해 기재된 바와 같이 pME101 유래된 플라스미드 내로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pPG0467로 명명하였다. 마지막으로, 플라스미드 pPG0467 및 pPG0231을 실시예 2에 기재된 중간체 균주 8 (플라스미드가 없는 균주) 내로 형질전환시켜 균주 24를 생성하였다.
프로토콜 5에 기재된 바와 같이 평가된 균주 24는 균주 4에 비해 보다 많은 1,2-프로판디올 (PG)을 생산하였으며, 보다 양호한 전환율을 가졌다 (표 10).
<표 10>
균주 24에 의한 1,2- 프로판디올 생산. (기호 ∼는 균주 사이에 유의한 차이가 없음을 지시하고, 기호 +는 대조군 균주에 비해 성능의 10 내지 100％의 증가를 지시하고, 기호 ++는 대조군 균주에 비해 100 내지 200％의 증가를 지시하고, 기호 +++는 대조군 균주에 비해 200 내지 300％의 증가를 지시하고, 기호 ++++는 대조군 균주에 비해 300％ 초과의 증가를 지시함):
실시예
8:
클로스트리디움
베이제린크키이
로부터의
Adh에
의한
MG
=>
PG
활성
균주 25의 구축
클로스트리디움 베이제린크키이로부터의 최적화된 adh 유전자 (Hanai, Atsumi and Liao, 2007)를 발현 플라스미드 pET28a 내로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pPG0445로 명명하고, 균주 BL21(DE3) 내로 형질전환시켜 균주 25를 생성하였다.
클로스트리디움
베이제린크키이
로부터의
Adh의
정제
균주 25를 프로토콜 6에 기재된 바와 같이 배양하였다. 세포 (315 mg 건조 중량)을 50 mL의 추출 완충제 (20 mM 트리스-HCl pH 7.3, 0.1 mM DTT, 0.1 mM 벤즈아미딘, 10％ 글리세롤, 0.02％ 아지드화나트륨 및 프로테아제 억제제 칵테일)에 재현탁시켰다. 현탁된 세포를 얼음 상의 30초의 8회의 초음파처리 사이클 (브란슨 초음파기, 70W)에 의해 파괴하였다. 세포 데브리스를 4℃에서 30분 동안 12000 g에서의 원심분리에 의해 제거하였다. 상청액을 열에 노출시킨 후 (65℃에서 5분 동안), 4℃에서 30분 동안 12000 g에서 재원심분리하였다. 단백질을 니켈 친화도 크로마토그래피 (HisTrapFF 1 mL, 지이 헬스케어)를 제조자의 지시서에 따라 사용함으로써 상청액으로부터 정제하였다. 단백질을 50 mM 트리스-HCl (pH 7.4) 중 이미다졸의 선형 구배 (20에서 500 mM)를 사용함으로써 용리하였다. 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 농축시키고, 50 mM 트리스-HCl (pH 7)에 대해 투석하였다. 단백질 농도를 브래드포드 검정을 사용하여 측정하였다.
메틸글리옥살로부터 생산된 1,2-
프로판디올의
정량화
5 내지 10 μg의 정제된 효소를 50 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 10 mM 메틸글리옥살 및 5 mM NADPH 중에서 30℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 메틸글리옥살로부터의 Adh에 의해 생산된 1,2-프로판디올의 양을 GC-MS (아질런트 테크놀로지즈 (Agilent Technologies))에 의해 직접 측정하였다.
이러한 조건 하에서, 4.6 mM의 1,2-프로판디올이 생산된 반면, 메틸글리옥살 또는 효소 중 하나가 생략된 경우 1,2-프로판디올은 생산되지 않았다.
균주 26, 27 및 28의 구축
gldA 유전자를 불활성화하기 위해, 이전에 기재된 DgldA::Km 결실 및 tpiA 유전자를 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 특허 출원 WO2008/116852에 기재된 균주 MG1655 lpd * DtpiA DpflAB DadhE DldhA DgloA DaldA DaldB Dedd 내로 공동-전달하였다. gapA 발현을 조절하기 위한 게놈 변형 "CI857-PR01/ RBS11 -gapA"를 특허 EP 2532751에 기재된 바와 같이 이전의 균주 내로 도입하였다. yqhD 유전자에 의해 코딩되는 알데히드 리덕타제 및 yqhE 유전자에 의해 코딩되는 글리옥살 리덕타제를 불활성화하기 위해, 상동성 재조합 전략을 사용하였다 (프로토콜 1 및 3에 따름). DyqhDE에 대한 올리고뉴클레오티드: 서열식별번호: 26 및 27 (표 2에 열거됨)을 사용하여 저항성 카세트를 PCR 증폭시켰다. 보유된 균주를 MG1655 DyqhDE::Bs로 지정하였다. DyqhDE :: Bs 결실을 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 이전의 균주 내로 전달하여 균주 26을 생성하였다. 그 후, 플라스미드 pPG0468을 이 균주 내로 형질전환시켜 균주 27을 생성하였다. 마지막으로, 이전에 기재된 Ptrc01 /OP01/ RBS120 - pntAB ::Cm 변형을 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2에 따름)에 의해 균주 27 내로 전달하여 균주 28을 생성하였다.
프로토콜 5에 기재된 바와 같이 평가된 경우, 균주 27 및 28은 균주 26보다 더 많은 1,2-프로판디올 (PG)을 생산하였다.
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cgtgcaaacc tttcaagccg atcttgccat tgtaggcgcc ggtggcgcgg gattacgtgc 60
tgcaattgct gccgcgcagg ccatatgaat atcctcctta g 101
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cgttagattg taacgacacc aatcagcgtg acaactgtca ggatagcagc cagaccgtag 60
aaaacccatt tgcccgcagg tgtaggctgg agctgcttcg 100
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atgtttaaga atgcatttgc taacctgcaa aaggtcggta aatcgctgat gctgccggta 60
tccgtactgc ctatcgcagg tgtaggctgg agctgcttcg 100
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ttagtggtta cggatgtact catccatctc ggttttcagg ttatcggatt tagtaccgaa 60
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gaccgtcgaa gacaattatc agtctttatc cggcgttcta aggtgtttat cccactatca 60
cggctgaatc gttaatattt tgcgagttca cgccgaaata ctgatttttg gcgctagatc 120
acaggcataa ttttcagtac gttatagggc gtttgttact aatttatttt aacggagtaa 180
catttagctc gtacatgagc agcttgtgtg gctcctgaca caggcaaacc atcatcaata 240
aaaccgatgg aagggaatat c 261
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aaaacagtgg aacagctgct gaaactgggt tttaccgtcg cggtagagag cggcgcgggt 120
caactggcaa gttttgacga taaagcgttt gtgcaagcgg gcgctgaaat tgtagaaggg 180
aatagcgtct ggcagtcaga gatcattctg aaggtcaatg cgccgttaga tgatgaaatt 240
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<223> oligonucleotides for recombination into Pfka
<400> 16
ggcctgataa gcgaagcgca tcaggcattt ttgcttctgt catcggtttc agggtaaagg 60
aatctgcctt tttccgaaat ca 82
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Ribosome binding site RBS113
<400> 17
aactcatttc gtttttaggg aggaataa 28
<210> 18
<211> 202
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sequence for recombination into ykiA
<400> 18
cttccccttg aacgggaggg catttttctg aaatatcctt tctttagccc ataataatat 60
ttcctttgct gcgatttttt caatttccga tatattcata atttatcaag gttgatataa 120
atatcagtga agatctccag atattgttgc ggaactggct acgataaaag ataaatcaga 180
tgatgaatgg tggcgtgcat tg 202
<210> 19
<211> 254
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sequence for recombination into ykiA
<400> 19
catcctgatg actggtgaac tggcagcgtt aattcaaaac ctgattgaag gattaggtgg 60
cgaagcacaa cgttaattgc tgattttcct ttaatgccgg atgcgacgcc tgccgcgtct 120
tatccggcgt acgaagccac accaggcata taattattcg ctacggcgag caataatttt 180
tagcgcagca atattatgcg ttttacgctg taacttgctc catggacgtt gtgtcattgt 240
ttttcctcaa gccg 254
<210> 20
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide for lpd
<400> 20
atgagtactg aaatcaaaac tcaggtcgtg gtacttgggg caggccccgc aggttactcc 60
gctgccttcc gttgcgctga catatgaata tcctccttag 100
<210> 21
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide for lpd
<400> 21
ttacttcttc ttcgctttcg ggttcggcag gtcggtaatg ctaccttcga acacttctgc 60
cgccaggccc acagactcgt tgtaggctgg agctgcttcg 100
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Ribosome binding site RBS131
<400> 22
tggcaaggta agcaaactat aaggaggtca aat 33
<210> 23
<211> 1013
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic gene gld
<400> 23
aagctttgat ggcaagcgat accattcgta ttccgggtat tgatacaccg ctgagccgtg 60
ttgcactggg cacctgggca attggtggtt ggatgtgggg tggtccggat gatgataatg 120
gtgttcgtac cattcatgca gcactggatg aaggtattaa tctgattgat accgctccgg 180
tttatggttt tggtcatagc gaagaaattg ttggtcgtgc actggcagaa aaaccgaata 240
aagcacatgt tgcaaccaaa ctgggtctgc attgggttgg tgaagatgag aaaaacatga 300
aagtgtttcg tgatagccgt ccggcacgta ttcgtaaaga agttgaagat agcctgcgtc 360
gtctgcgtgt tgaaaccatt gatctggaac aaattcattg gcctgatgat aaaaccccga 420
ttgatgaaag cgcacgtgaa ctgcagaaac tgcatcagga tggtaaaatt cgtgccctgg 480
gtgttagcaa ttttagtccg gaacaaatgg atatctttcg tgaagttgca ccgctggcaa 540
ccattcagcc tccgctgaac ctgtttgaac gtaccattga aaaagatatt ctgccgtatg 600
ccgaaaaaca taatgcagtt gttctggcat atggtgcact gtgtcgtggt ctgctgaccg 660
gcaaaatgaa tcgtgatacc acctttccga aagatgatct gcgtagcaat gatccgaaat 720
ttcagaaacc gaacttcgag aaatatctgg ctgcaatgga tgagtttgaa aaactggccg 780
agaaacgtgg taaaagcgtt atggcatttg cagttcgttg ggttctggat cagggtccgg 840
ttattgcact gtggggtgca cgtaaaccgg gtcaggttag cggtgttaaa gatgtttttg 900
gttggagcct gaccgacgaa gaaaaaaaag cagttgatga tattctggca cgtcatgttc 960
cgaatccgat tgatccgacc tttatggcac cgcctgcacg tgattaagaa ttc 1013
<210> 24
<211> 971
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic gene gld2
<400> 24
aagctttgat ggcctccaag acgtacactc tgaacaccgg tgccaagata cccgcggtcg 60
ggttcggcac attcgccaat gagggtgcca agggcgagac atacgcagct gttacaaagg 120
cactggacgt tggataccgc caccttgatt gcgcgtggtt ttaccacaac gaagatgagg 180
ttggtgacgc ggtacgcgat tttctcgccc gccgacccga cgtgaaacgc gaggatctct 240
tcatttgcac caaagtttgg aaccacctgc atgagccaga ggacgtcaag tggagcgcca 300
agaactcgtg cgaaaacctc aaggtcgatt acattgacct gttcctcgtc cactggccaa 360
tcgcggccga gaagaacagc gacaggagcg tcaagctggg ccccgatggc aagtatgtca 420
tcaaccaagc cctgacggaa aacccagagc caacatggcg agccatggaa gagcttgttg 480
aaagcggcct cgtcaaggca attggagtat ccaactggac gattccgggg ttgaagaagc 540
tccttcagat cgccaagatc aagccggcag tgaaccagat tgagattcac ccattcctac 600
caaacgaaga gcttgtggcg ttctgctttg agaacgggat cctgcccgaa gcctactcgc 660
cgctgggctc gcagaaccag gtcccaagca ccggcgagcg agtgcgcgac aacccgacac 720
tcaaagcggt tgccgagcga agcggctaca gccttgccca gatcctattg gcatggggcc 780
tgaagcgagg atatgtggtc ctcccaaaga gctcaactcc aagccgtatt gaaagcaact 840
tcaacattcc ggagctgagt gatgaagact ttgaggcgat tcaacaggtt gctaagggga 900
gacatactag atttgtcaac atgaaggaca cgtttggata caacgtttgg ccagaggagg 960
aataagaatt c 971
<210> 25
<211> 1103
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic gene adh1
<400> 25
aagctttgac tagtatgaaa ggacttgcta tgcttggaat tggaagaatt ggatggattg 60
aaaagaaaat cccagaatgt ggaccacttg atgcattagt tagaccatta gcacttgcac 120
catgtacatc agatacacat accgtttggg caggagctat tggagataga catgatatga 180
ttcttggaca tgaagcggtt ggacaaattg ttaaagttgg atcattagtt aagagattaa 240
aagttggaga taaagttatt gtaccagcta ttacaccaga ttggggagaa gaagaatcgc 300
aaagaggata tccaatgcat tcaggaggaa tgcttggagg atggaaattc tcaaatttca 360
aggatggagt tttttcagaa gttttccatg ttaatgaagc agatgccaat cttgcacttc 420
ttccaagaga tattaaacca gaagatgcag ttatgttatc agatatggta actactggat 480
tccatggagc agaattagct aatattaaac ttggagatac tgtttgtgtt attggtattg 540
gaccagttgg attaatgtca gttgcaggag caaaccatct tggagcagga agaatctttg 600
cagtaggatc aagaaaacat tgttgtgata ttgcattgga atatggagca acagatatta 660
ttaattataa aaatggagat attgtagaac aaattcttaa agctacagac ggcaaaggag 720
ttgataaagt cgttattgca ggaggtgatg ttcatacatt tgcacaagca gtcaaaatga 780
ttaaaccagg atcagatatt ggaaatgtta attatcttgg agaaggagat aatattgata 840
ttccaagaag tgaatgggga gttggaatgg gtcataaaca cattcatgga ggtttaaccc 900
caggtggaag agtcagaatg gaaaaattag catcacttat ttcaactggt aaattagata 960
cttctaaact tattacacat agatttgaag gattagaaaa agttgaagat gcattaatgt 1020
taatgaagaa taaaccagca gaccttatca aaccagttgt cagaattcat tatgatgatg 1080
aagatactct tcattaactc gag 1103
<210> 26
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide for yqhDE
<400> 26
atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60
ggtttacgcg aacaaattcc gtgtaggctg gagctgcttc g 101
<210> 27
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide for yqhDE
<400> 27
ttagccgccg aactggtcag gatcgggacc gagacgcttg ccctgatcga gttttgcaat 60
ttcgccgagt tcgtctttgc atatgaatat cctccttag 99
Claims (17)
- - 탄소의 공급원으로서 탄수화물을 포함하는 적절한 배양 배지에서 1,2-프로판디올의 생산을 위해 유전자 변형된 미생물을 배양하는 단계; 및
- 상기 배양 배지로부터 1,2-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하며,
상기 유전자 변형된 미생물에서, NADPH 의존성 아세톨 리덕타제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 또는 NADPH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 gldA * 유전자가 과발현되고, 상기 NADPH 의존성 아세톨 리덕타제가 클로스트리디움 베이제린크키이(Clostridium beijerinckii)로부터의 adh 유전자에 의해 코딩되는 것이고, 상기 NADPH 의존성 글리세롤 데히드로게나제가 이. 콜라이(E. coli)의 GldA 단백질 서열에 관하여 위치 37에서의 아스파르트산 아미노산 잔기의 글리신, 알라닌 또는 발린으로의 치환을 포함하는 것인, 발효적 공정에서의 1,2-프로판디올의 생산 방법. - 제1항에 있어서, NADPH 이용률이 미생물에서 하기 유전자 변형 중 적어도 하나에 의해 증가되는 것인 방법:
- 니코틴아미드 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제를 코딩하는 pntAB 유전자 오페론이 과발현됨,
- 포스포글루코스 이소머라제를 코딩하는 pgi 유전자가 약화됨,
- 포스포프룩토키나제를 코딩하는 pfkA 유전자가 약화됨,
- 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 zwf 유전자가 과발현됨,
- ADP-의존성 데히드라타제를 코딩하는 yjeF 유전자가 과발현됨,
- NADP-의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 gapN 유전자가 과발현됨, 및
- 이. 콜라이 Lpd 단백질에 관하여 A55V, G185A, G189A, E203V, M204R, F205K, D206H, 및 P210R 치환을 포함하는 NADP-의존성 리포아미드 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 lpd * 유전자가 과발현됨. - 제1항 또는 제2항에 있어서, NADH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 gldA 유전자가 미생물에서 결실되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물이 메틸글리옥살 리덕타제를 코딩하는 yqhD 유전자의 결실을 더 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물이 장내세균과 (Enterobacteriaceae), 바실루스과 (Bacillaceae), 클로스트리디움과 (Clostridiaceae), 스트렙토미세스과 (Streptomycetaceae) 및 효모로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 미생물이 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클레브시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 써모안아에로박테리움 써모사카롤리티쿰 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum), 클로스트리디움 스페노이데스 (Clostridium sphenoides) 및 사카로미세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 미생물이 이. 콜라이 (E. coli)인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, NADPH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 gldA * 유전자가 돌연변이 A160T를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, NADPH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 gldA * 유전자가 위치 161에서의 프롤린 아미노산 잔기의 세린 또는 트레오닌으로의 대체를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, NADPH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 gldA * 유전자가 위치 161에서의 프롤린 아미노산 잔기의 세린 또는 트레오닌으로의 대체를 추가로 포함하고, 위치 164에서의 류신 아미노산 잔기의 알라닌, 글리신 또는 발린으로의 대체를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 탄소의 공급원으로서 탄수화물로부터 1,2-프로판디올의 생산을 위해 유전자 변형된 미생물이며, 여기서 상기 미생물에서 NADPH 의존성 아세톨 리덕타제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 또는 NADPH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 gldA * 유전자가 과발현되고, 상기 NADPH 의존성 아세톨 리덕타제는 클로스트리디움 베이제린크키이로부터의 adh 유전자에 의해 코딩되는 것이고, 상기 NADPH 의존성 글리세롤 데히드로게나제가 이. 콜라이의 GldA 단백질 서열에 관하여 위치 37에서의 아스파르트산 아미노산 잔기의 글리신, 알라닌 또는 발린으로의 치환을 포함하는 것인, 탄소의 공급원으로서 탄수화물로부터 1,2-프로판디올의 생산을 위해 유전자 변형된 미생물.
- 제11항에 있어서, 하기 유전자 변형 중 적어도 하나를 더 포함하는 미생물:
- NADH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 gldA 유전자의 결실,
- 알데히드 리덕타제를 코딩하는 yqhD 유전자의 결실,
- 포스포글루코스 이소머라제를 코딩하는 pgi 유전자의 결실,
- 포스포프룩토키나제를 코딩하는 pfkA 유전자의 결실,
- 니코틴아미드 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제를 코딩하는 pntAB 유전자의 과발현,
- 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 zwf 유전자의 과발현,
- ADP-의존성 데히드라타제를 코딩하는 yjeF 유전자의 과발현,
- NADP-의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 gapN 유전자의 과발현, 및
- 이. 콜라이 Lpd 단백질에 관하여 A55V, G185A, G189A, E203V, M204R, F205K, D206H, 및 P210R 치환을 포함하는 NADP-의존성 리포아미드 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 lpd * 유전자의 과발현. - 제11항 또는 제12항에 있어서, 장내세균과, 바실루스과, 클로스트리디움과, 스트렙토미세스과, 코리네박테리움과 (Corynebacteriaceae) 및 효모로 이루어진 군 중에서 선택되는 미생물.
- 제13항에 있어서, 에스케리키아 콜라이, 클레브시엘라 뉴모니아에, 써모안아에로박테리움 써모사카롤리티쿰, 클로스트리디움 스페노이데스 및 사카로미세스 세레비지아에로 이루어진 군 중에서 선택되는 미생물.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, NADPH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 gldA * 유전자가 돌연변이 A160T를 추가로 포함하는 것인 미생물.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, NADPH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 gldA * 유전자가 위치 161에서의 프롤린 아미노산 잔기의 세린 또는 트레오닌으로의 대체를 추가로 포함하는 것인 미생물.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, NADPH 의존성 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이 gldA * 유전자가 위치 161에서의 프롤린 아미노산 잔기의 세린 또는 트레오닌으로의 대체를 추가로 포함하고, 위치 164에서의 류신 아미노산 잔기의 알라닌, 글리신 또는 발린으로의 대체를 추가로 포함하는 것인 미생물.
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