CN106559997B

CN106559997B - 基于nadph依赖型丙酮醇还原酶和改进的nadph供给用于生产1,2-丙二醇的新微生物和方法

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Publication number: CN106559997B
Application number: CN201580037894.4A
Authority: CN
Inventors: P·阿利普兰迪; E·纳瓦罗; C·雷诺; G·贝斯泰尔科尔; P·苏塞利
Original assignee: Metabolic Explorer SA
Current assignee: Metabolic Explorer SA
Priority date: 2014-05-12
Filing date: 2015-05-12
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2035-05-12
Also published as: US20170145446A1; CA2948718C; CN106559997A; BR112016026164B1; RU2016147512A3; RU2016147512A; JP6728064B2; BR112016026164A2; WO2015173247A1; JP2017515481A; US10689671B2; EP3143148A1; MX2016014821A; EP3143148C0; KR102621632B1; CA2948718A1; KR20170002574A; EP3143148B1; RU2711870C2

Abstract

本发明涉及用于生产1,2‑丙二醇的重组微生物和制备1,2‑丙二醇的方法。本发明的微生物以通过增强NADPH依赖的HAR活性改进1,2‑丙二醇生产的方式修饰。

Description

基于NADPH依赖型丙酮醇还原酶和改进的NADPH供给用于生产 1,2-丙二醇的新微生物和方法

发明领域

本发明涉及用于生产1,2-丙二醇的重组微生物和制备1,2-丙二醇的方法。本发明的微生物以如下方式修饰：通过增强NADPH依赖的丙酮醇还原酶活性而改进1,2-丙二醇生产。

发明背景

1,2-丙二醇或丙二醇是一种具有式C3H8O2或HO-CH2-CHOH-CH3的C3二醇，其在化学品中广泛使用。其CAS编号是57-55-6。其为无色、接近无味、澄清、粘稠的液体，具有微弱的甜味、吸湿性且可与水、丙酮和氯仿混溶。其为不饱和聚酯树脂、液体洗涤剂、冷却剂、用于飞机的防冻和除冰流体的成分。自1993-1994越来越多地使用丙二醇作为乙烯衍生物的替代物，所述乙烯衍生物被认为比丙烯衍生物毒性更强。

1,2-丙二醇目前通过化学手段使用环氧丙烷水合方法生产，所述方法消耗大量的水，使用高度毒性的物质并生成副产物如叔丁醇和1-苯基乙醇。

用于生产1,2-丙二醇的化学方法的缺点使得生物合成成为具有吸引力的替代。已表征了通过微生物从糖发酵生产1,2-丙二醇的两条路径。

在第一条路径中，6-脱氧糖(例如L-鼠李糖或L-岩藻糖)裂解为磷酸二羟丙酮和(S)-乳醛，其可进一步还原为(S)-1,2-丙二醇(Badia等,1985)。该路径在大肠杆菌中是有功能的，但由于脱氧己糖的高成本而不能得到经济上可行的工艺。

第二条路径是通过糖酵解途径随后丙酮醛途径的常规的糖(例如葡萄糖或木糖)的代谢。磷酸二羟丙酮转化为丙酮醛，其可还原为乳醛或羟基丙酮(丙酮醇)。这两种化合物随后转化成为1,2-丙二醇。该路径由(R)-1,2-丙二醇的天然生产者使用，如楔形梭菌和热解糖热厌氧杆菌。然而，用这些生物获得的性能改进可能由于缺乏可用的遗传工具而受到限制。

现有技术

丙酮醛途径在大肠杆菌或其他肠杆菌科中是有功能的，且已导致数项用于大肠杆菌基因修饰以获得使用简单碳源的1,2-丙二醇生产者的研究(WO 98/37204；Cameron等,1998；Altaras和Cameron,1999；Huang等,1999；Altaras和Cameron,2000；Berrios-Rivera等,2003；Jarboe,2011)。通过理性设计和进化的组合获得的改进的1,2-丙二醇生产大肠杆菌菌株描述于专利申请WO 2005/073364、WO 2008/116848、WO 2008/116852、WO 2008/116853、WO 2010/051849、WO 2011/012693、WO 2011/012697和WO 2011/012702，其通过提述包括在本文中。

在大肠杆菌1,2-丙二醇生产菌株中，将羟基丙酮还原至1,2-丙二醇使用NADH作为辅因子通过甘油脱氢酶GlyDH来实施，且不完全是由于细胞在有氧条件下的内部氧化还原状态所致。有氧下，NADH的主要作用是经由氧化磷酸化的呼吸ATP生成且作为其结果，NADH比NAD+的比率强烈有利于NAD+。相反，化学上非常相似的NADPH驱动合成代谢还原，且NADPH对NADP+的比率更高(Fuhrer和Sauer,2009)。

因此本发明的目的是通过增加NADPH依赖型丙酮醇还原酶的活性和通过改进NADPH供给而改进1,2-丙二醇的生产。

来自嗜热细菌嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的GlyDH的三维结构已建立，且完全表征了NAD+结合位点(Ruzheinikov等,2001)。已构建并表征了能够生产NADPH的嗜热脂肪芽孢杆菌突变体甘油醛-3-磷酸(Clermont等,1993)。

来自拜氏梭菌的NADPH依赖型仲醇脱氢酶(Sadh)天然地催化丙酮还原为异丙醇(Ismaiel等,1993)。在来自Mitsui Chemicals Inc.的专利申请EP2546331中，异丙醇在表达来自拜氏梭菌的sadh基因的大肠杆菌菌株中生产。

该酶以及其来自布氏热厌氧杆菌的同源物已显示催化羟基丙酮还原为1,2-丙二醇，且在专性光合自养蓝细菌细长聚球藻(Synechococcus elongates)中过表达以从作为碳源的非糖CO₂生产1,2-丙二醇(Li和Liao,2013)。

预料不到的是，发明人发现了仅sadh基因的过表达或与改进NADPH供给的其他方式组合显著改进了从作为碳源的糖生产1,2-丙二醇。

发明概述

本发明涉及重组微生物和使用所述微生物用于优化1,2-丙二醇生产的方法，其中在所述微生物中，NADPH依赖型丙酮醇还原酶(HAR)的活性增强。更具体地，在所述重组微生物中，至少一个编码NADPH依赖型丙酮醇还原酶活性的基因或编码NADPH依赖型甘油脱氢酶的突变基因gldA*过表达，其中所述NADPH依赖型丙酮醇还原酶与由下述基因编码的蛋白具有至少60％的氨基酸同一性：来自拜氏梭菌的adh基因或来自布氏热厌氧杆菌的adh基因或来自溶组织内阿米巴菌的adh1基因或来自氧化葡糖杆菌的GOX1615基因或来自红褐肉座菌的gld2基因或来自枯草芽孢杆菌的yhdN基因。

在本发明中使用的重组微生物还可包含其他基因修饰如：

-弱化编码NADH依赖型甘油脱氢酶的gldA基因的表达，和/或

-弱化编码醛还原酶的yqhD基因的表达，和/或

-增加编码烟酰胺核苷酸转氢酶的pntAB基因操纵子的表达，和/或

-弱化编码磷酸葡糖异构酶的pgi基因的表达，和/或

-弱化编码磷酸果糖激酶的pfkA基因的表达，和/或

-增加编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因的表达，和/或

-增加编码ADP-依赖型脱水酶的yjeF基因的表达，和/或

-增加编码NADP-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gapN基因的表达，和/或

-增加编码NADP-依赖型硫辛酰胺脱氢酶的lpd*突变基因的表达。

优选地，微生物是大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、热解糖热厌氧杆菌、楔形梭菌或酿酒酵母。

发明详述

详细描述本发明前，应该理解的是，本发明不限于具体示例的方法且当然可以变化。还应该理解的是，本文使用的术语仅出于描述本发明具体实施方案的目的，且并非意在限制，本发明仅通过所附权利要求限制。

无论上文或下文，本文引用的全部出版物、专利和专利申请在此处通过提述以其整体并入。

此外，除非另外指示，本发明的实践采用现有技术内常规的微生物和分子生物学技术。这些技术对于技术工人是已知的，且在文献中充分阐释。

必须注意的是，除非上下文另有明确规定，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数指称。因此，例如，“微生物”的指称包括该微生物的复数，且“内源基因”的指称是对一个或多个内源基因的指称等等。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管任何与本文所述相似或等同的材料和方法可用于实践或测试本发明，现描述优选的材料和方法。

在随后的权利要求和接下来的说明书中，除非上下文由于表达语言或必须的含义另外需要，词语“包含(comprise)”、“含有(contain)”、“涉及(involve)”或“包括(include)”或变型如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“containing(含有)”、“涉及(involved)”、“包括(includes)”、“包括(including)”以包容性的含义使用，即详明所述特征在本发明的多个实施方案中的存在但不排除其他特征的存在或添加。

本发明涉及用于在发酵过程中生产1,2-丙二醇的方法，所述方法包括培养基因修饰的微生物用于在包含糖作为碳源的适当的培养基中生产1,2-丙二醇并从所述培养基回收1,2-丙二醇的步骤，其中所述NADPH依赖型HAR活性在所述基因修饰的微生物中增强。本发明特别优选的实施方案在下文中进一步描述。

术语“丙酮醇还原酶”和“羟基丙酮还原酶”或“HAR”可互换使用且指代将丙酮醇(或羟基丙酮)还原成为1,2-丙二醇的酶活性。该活性可以是NADPH依赖型或NADH依赖型。

如本文使用的术语“微生物”指细菌、酵母或真菌，其不是人工修饰的。优选地，微生物选自肠杆菌科、芽孢杆菌科、梭菌科、链霉菌科和酵母。更优选地，微生物为埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、热厌氧杆菌属、梭菌属或酵母属的菌种。更优选地，微生物选自大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、热解糖热厌氧杆菌、楔形梭菌或酿酒酵母。优选地，微生物为异养微生物，即不能固定大气中的碳并取而代之使用有机碳源用于其生长。甚至更优选地，本发明的异养微生物是大肠杆菌。

如本文使用的术语“重组微生物”或“基因修饰的微生物”指并非在自然界发现的细菌、酵母或真菌，且与其在自然界中发现的等同物在基因上不同。这意味着，其通过基因元件的引入或缺失或修饰来进行修饰。其还通过组合特定选择压力下的进化和定点诱变而迫使新代谢途径的形成和进化，从而进行转化(参见例如WO2005/073364或WO2008/116852)。

如果将外源基因导入微生物，而所述微生物具有允许其在宿主微生物中表达的全部元件，则微生物可经修饰以表达这些基因。具有外源DNA的微生物的修饰或“转化”对于本领域的技术人员来说是常规任务。

微生物可经修饰以调节内源基因的表达水平。

术语“内源基因”意为基因在任何基因修饰前存在于微生物中。内源基因可通过下述过表达：在内源调节元件之外引入异源序列或取代内源调节元件，或将基因的一个或多个补充拷贝引入染色体或质粒。内源基因还可经修饰以调节其表达和/或活性。例如，可将突变引入编码序列以修饰基因产物或者在内源调节元件之外可引入异源序列或取代内源调节元件。内源基因的调节可导致基因产物活性的上调和/或增强，或可替换地，下调和/或降低内源基因产物的活性。

调节其表达的另一方式是用更强或更弱的启动子来交换基因的内源启动子(例如野生型启动子)以上调或下调内源基因的表达。这些启动子可以是同源或异源的。选择适当的启动子在本领域技术人员的能力之内。

相反，“外源基因”意为通过本领域的技术人员已知的手段将基因引入微生物，而该基因在微生物中并非天然存在。外源基因可整合入宿主染色体，或通过质粒或载体在染色体外表达。本领域已知在其复制来源和其在细胞中的拷贝数方面不同的多种质粒。这些基因可为同源的。“过表达(Overexpression或overexpressing)”也可用于指代外源基因在微生物中的表达。

在本发明的上下文中，术语“同源基因”不限于指代具有理论上共同的遗传祖先的基因，还包括遗传上不相关、已或多或少地进化以编码实施相似功能和/或具有相似结构的蛋白的基因。因此，就本发明而言，术语‘功能同源物”涉及如下事实：一些酶活性可不仅通过限定氨基酸序列的特定蛋白提供，也通过来自其他(不)相关微生物的相似序列的蛋白提供。

使用Uniprot(对于已知的蛋白)或Genbank(对于已知的基因)中给出的参照，本领域的技术人员能够获得蛋白和/或基因序列并确定其他生物体、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等同基因。该常规工作有利地使用共有序列完成，所述共有序列可通过如下确定：实施源自其他微生物的基因的序列比对并设计简并探针以在另一生物体中克隆相应的基因。这些分子生物学的常规方法对于本领域的技术人员是已知的。

根据本发明，术语“发酵过程/工艺’、‘发酵”或‘培养’可互换使用以指代微生物的生长。该生长一般在具有适于所使用的微生物的适当的培养基的发酵罐中实施。

“适当的培养基”指代包含对细胞的维持和/或生长必需或有益的营养物的培养基(例如无菌、液体介质)，所述营养物如碳源或碳底物、氮源例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源，例如磷酸二氢钾或磷酸氢二钾；微量元素(例如金属盐)，例如镁盐、钴盐和/或锰盐；以及生长因子如氨基酸和维生素。

根据本发明的术语“碳的来源”、“碳源”或“碳底物”指能够通过微生物代谢的任何碳源，其中所述底物包含至少一个碳原子。

术语“糖类”指能够由微生物代谢且包含至少一个碳原子、两个氢原子和一个氧原子的任何碳源。CO₂并非糖类，这是由于其并不包含氢。

糖类选自下组：单糖如葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等，二糖如蔗糖、纤维二糖、麦芽糖、乳糖等，寡糖如棉子糖(raffinose)、水苏糖(stacchyose)、麦芽糊精等，多糖如纤维素、半纤维素、淀粉等，甲醇、甲醛和甘油。特别优选的碳源是阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖或其混合物。更优选的碳源是蔗糖。

在本发明的具体实施方案中，碳源源自可再生原料。可再生原料定义为某些工业过程所需的原材料，其可在短暂延迟内再生且再生的量足以允许其转化成为预期的产物。处理或未处理的植物生物质是感兴趣的可再生碳源。

本领域的技术人员能够定义用于根据本发明的微生物的培养条件。具体地，细菌在20℃-55℃，优选25℃-40℃，且更优选对于大肠杆菌约30℃-37℃的温度发酵。

该过程可以分批工艺、补料分批工艺或以连续的工艺实施。其可在有氧、微氧或厌氧条件下实施。

‘在有氧条件下’意为通过将气体溶于液相将氧气提供至培养物。这可通过下述获得：(1)将含氧气体(例如空气)喷入液相或(2)摇动包含培养基的容器而将顶部空间中所含的氧气传递入液相。在有氧条件下发酵的主要优势是氧气作为电子受体的存在改进菌株产生更多ATP形式的能量用于细胞过程的能力。因此菌株的一般代谢得到改进。

微氧条件定义为其中低氧气百分比(例如使用含有0.1-10％氧气、以氮气补足至100％的气体混合物)溶于液相的培养条件。

厌氧条件定义为其中无氧气提供至培养基的培养条件。严格的厌氧条件通过将惰性气体像氮气喷入培养基以去除痕量的其他气体而获得。硝酸盐可用作电子受体以改进菌株的ATP生产并改进其代谢。

短语“从培养基回收1,2-丙二醇”定义为使用本领域的技术人员已知的方法纯化产生的1,2-丙二醇的过程。这样的方法具体公开于专利申请WO2011/076690和WO2012/130316中。

术语“经基因修饰用于生产1,2-丙二醇的微生物”指通过导入或缺失遗传元件或通过如专利申请WO 2005/073364所述的进化步骤修饰的微生物。具体地，其指代相比无基因修饰的相应野生型微生物的内源生产呈现改进的1,2-丙二醇生产的基因修饰的微生物。这样的微生物例如描述于专利申请WO 2008/116848、WO 2008/116853、WO 2011/012693、WO2011/012697、WO 2011/012702或EP2532751中，其通过提述并入。优选的基因修饰如下：

-选自下组的至少一种基因的表达增加：编码丙酮醛合酶的mgsA基因、编码丙酮醛还原酶的yqhD、yafB、ycdW、yqhE、yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG或ydbC基因，编码甘油脱氢酶的gldA基因和编码乳醛还原酶的fucO基因；

-缺失编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的edd基因或编码2-酮-3-脱氧葡糖酸盐6-磷酸醛缩酶的eda基因或两者；

-通过缺失编码涉及下述合成的酶的基因而弱化不想要的副产物的合成：从丙酮醛合成乳酸(如编码乙二醛酶I的gloA基因、编码醛脱氢酶A的aldA基因、编码乙醛脱氢酶的aldB基因)、从如下合成乳酸：丙酮酸(编码乳酸脱氢酶的ldhA基因)、甲酸(编码丙酮酸甲酸裂合酶的pflA基因、编码丙酮酸甲酸裂合酶的pflB基因)、乙醇(编码醛醇脱氢酶的adhE基因)和乙酸(编码乙酸激酶的ackA基因、编码磷酸乙酰转移酶的pta基因、编码丙酮酸氧化酶的poxB基因)；

-消除消耗PEP的途径像丙酮酸激酶(由pykA和pykF基因编码)和/或通过促进PEP的合成，例如通过过表达编码PEP合酶的ppsA基因；

-编码硫辛酰胺脱氢酶的lpd基因的特定突变；

-可缺失编码ArcA转录双调节因子的arcA基因和编码NADH:泛醌氧化还原酶II的ndh基因，

-编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的gapA基因受控于温度诱导型启动子，

-添加涉及蔗糖的输入和代谢的基因或增加其表达(编码蔗糖通透酶的cscB基因、编码蔗糖水解酶的cscA基因、编码果糖激酶的cscK基因、编码磷酸烯醇丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统的酶II的scrA基因、编码ATP依赖性果糖激酶的scrK基因、编码蔗糖6-磷酸水解酶(转化酶)的scrB基因、编码蔗糖孔蛋白(porine)的scrY基因)。

优选的基因修饰是丙酮醛还原酶活性的改进，通过增加基因yqhD*(G149E)的表达获得。

另一优选的基因修饰是丙酮醛合酶活性的改进，通过增加基因mgsA*(H21Q)的表达获得。

另一优选的基因修饰是羟基丙酮还原酶活性的改进，通过增加基因gldA*(A160T)的表达获得。该HAR突变体是NADH依赖型，与下文公开的HAR突变NADPH依赖型不同。

羟基丙酮还原酶(HAR)是参与1,2-丙二醇生产的最终的酶。HAR催化下述反应：

羟基丙酮+NAD(P)H→1,2-丙二醇+NAD(P)⁺

其中gldA基因缺失的1,2-丙二醇生产菌株不再能够生产1,2-丙二醇并积累羟基丙酮(WO2008/116851)。GldA蛋白已纯化至均质并使用NADH作为辅因子(Kelley和Dekker,1984)。在有氧条件中，羟基丙酮至1,2-丙二醇的转化不全是由于细胞的内部氧化还原状态：在这种条件下，NADH的首要角色是经由氧化磷酸化的呼吸ATP生成，且其结果是，NADH对NAD+的比率强烈有利于NAD+。相反，化学上非常相似的NADPH驱动合成代谢还原，且NADPH对NADP+的比率更高(Fuhrer和Sauer,2009)。

根据该观察，本发明的目的是通过增加NADPH依赖型羟基丙酮还原酶活性改进1,2-丙二醇的生产。

增加活性可通过改进蛋白催化效率或减少蛋白周转或减少信使RNA(mRNA)周转或增加基因转录或增加mRNA翻译而获得。

改进蛋白的催化效率意为对于给定的底物和/或给定的辅因子增加kcat和/或减少Km，和/或对于给定的抑制剂增加Ki。Kcat、Km和Ki是本领域的技术人员能够确定的Michaelis-Menten常数(Segel,1993)。减少蛋白周转意为稳定所述蛋白。改进蛋白催化效率和/或减少蛋白周转的方法为本领域的技术人员已知。那些包括用序列和/或结构分析的理性工程化和定点诱变，以及随机诱变和筛选。突变可通过定点诱变由常规方法如聚合酶链式反应(PCR)或通过随机诱变技术引入，如使用诱变剂(紫外线或化学剂如亚硝基胍(NTG)或乙基甲磺酸酯(EMS))或使用PCR技术(DNA重排或易错PCR)。稳定蛋白可通过在蛋白的N末端或C末端添加称为“标签”的肽序列实现。标签为本领域的技术人员已知。例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)可用于稳定蛋白。

减少mRNA周转可通过修饰5’-非翻译区(5’-UTR)和/或编码区和/或3’-UTR的基因序列实现(Carrier和Keasling,1999)。

增加基因的转录可通过增加基因的拷贝数和/或使用导致更高水平基因表达的启动子实现。“过表达(Overexpression或overexpressing)”也用于指代在微生物中增加基因的转录。

为增加微生物中的基因拷贝数目，基因可染色体或染色体外编码。当基因位于染色体上时，数个基因拷贝可通过本领域的专家已知的重组方法(包括基因替换)引入染色体。当基因位于染色体外时，其可通过在其复制来源和其在细胞中的拷贝数方面不同的不同类型的质粒实施。这些质粒在微生物中以1-5个拷贝存在，或约20拷贝或至多500拷贝，取决于质粒的性质：具有严紧复制的低拷贝数质粒(例如用于大肠杆菌pSC101、RK2)、低拷贝数质粒(例如用于大肠杆菌pACYC、pRSF1010)或高拷贝数质粒(例如用于大肠杆菌pSKbluescript II)。

对于使用导致高水平基因表达的启动子，本领域的技术人员已知哪些启动子是最便利的，例如启动子Ptrc、Ptac、Plac，或λ启动子cI是广泛使用的。这些启动子可以是通过特定化合物或由特定外部条件如温度或光“诱导的”。这些启动子可以是同源或异源的。

增加mRNA的翻译可通过修饰核糖体结合位点(RBS)实现。RBS是mRNA上的序列，当初始蛋白翻译时其通过核糖体结合。其在真核生物中可以是mRNA的5'帽，或在原核生物中是起始密码子AUG的上游区6-7个核苷酸(称为Shine-Dalgarno序列)或病毒中的内部核糖体进入位点(IRES)。通过修饰该序列，可能改变蛋白翻译起始速率，成比例改变其生产率并控制其在细胞内的活性。相同的RBS序列根据mRNA的性质将不具有相同的影响。可能通过使用软件RBS CALCULATOR优化RBS序列的强度以实现靶向的翻译起始速率(Salis,2011)。

在本发明的第一方面中，通过在修饰的微生物中增强NADPH依赖型丙酮醇还原酶(NADPH HAR)活性改进1,2-丙二醇的生产。

在本发明的第一实施方案中，通过在修饰的微生物中过表达编码NADPH HAR的基因(NADPH HAR基因)增强NADPH HAR活性。

来自拜氏梭菌的Adh天然催化丙酮还原至异丙醇(Ismaiel等,1993)。该酶以及其来自布氏热厌氧杆菌的同源物已显示催化羟基丙酮还原至1,2-丙二醇并在专性光自养蓝细菌细长聚球藻(Synechococcus elongatus)中过表达以从作为碳源的CO₂生产1,2-丙二醇(Li和Liao,2013)。

数据挖掘和序列分析已用于确定一些候选的同源酶和编码这些酶的基因。这些候选物公开于下文表1中。

鉴定同源序列及其同源性百分比的方式为本领域的技术人员已知，且具体而言包括BLAST程序。获得的序列随后可使用例如程序CLUSTALW或MULTALIN进行利用(例如比对)。另一鉴定蛋白同源物的方式是通过使用本领域的技术人员已知的生物信息学程序构建系统发生树。

表1：NADPH依赖型HAR酶可能的候选物：

在本发明的该实施方案中，在重组微生物中过表达的编码NADPH HAR的基因编码选自上文所列蛋白的NADPH依赖型丙酮醇还原酶。由Uniprot编号，本领域的技术人员能够获得相应基因的数目和序列。优选地，本发明的微生物表达至少一种编码NADPH依赖型丙酮醇还原酶(NADPH HAR基因)的基因，其与由下述基因编码的完整蛋白具有至少60％、优选至少70％、更优选至少85％且甚至更优选至少90％的氨基酸同一性：来自拜氏梭菌的adh或来自布氏热厌氧杆菌的adh或来自溶组织内阿米巴菌的adh1或来自氧化葡糖杆菌的GOX1615或来自红褐肉座菌的gld2或来自枯草芽孢杆菌的yhdN。更优选地，本发明的微生物表达选自下组的基因：来自拜氏梭菌的adh或来自布氏热厌氧杆菌的adh或来自溶组织内阿米巴菌的adh1或来自氧化葡糖杆菌的GOX1615或来自红褐肉座菌的gld2或来自枯草芽孢杆菌的yhdN(即与由所述基因编码的蛋白序列的100％氨基酸序列同一性)。甚至更优选地，NADPH依赖型丙酮醇还原酶由来自拜氏梭菌的adh基因编码。

氨基酸序列间的序列同一性可通过在可出于比较目的而比对的每个序列中的比较位置确定。当比较的序列中的位置由相同的氨基酸占据时，则序列在该位置相同。蛋白间序列同一性的程度是由所述蛋白序列所共享的位置处相同氨基酸残基数目的函数。

为确定两个氨基酸序列间同一性的百分比，可将序列进行比对用于最佳比较。例如，可将缺口引入第一氨基酸序列的序列中用于与第二氨基酸序列进行最佳比对。随后比较在相应氨基酸位置的氨基酸残基。当第一序列中的位置由第二序列中相应位置的相同氨基酸残基占据时，分子在该位置相同。

两序列间同一性的百分比是由所述序列所共享的相同位置数目的函数。因此％同一性＝相同位置的数目/重叠位置的总数X 100。

序列的最佳比对可通过Needleman和Wunsch整体同源性比对算法(1970)，由该算法的计算机化执行或通过视觉检查来实施。选择由多种方法生成的最佳比对(即在比较序列间获得最高同一性百分比)。

换而言之，序列同一性的百分比通过比较两个最佳比对序列进行计算，确定在两序列中该处相同氨基酸发生的位置数目以获得匹配的位置数目，将匹配位置的数目除以位置总数，将结果乘以100以获得序列同一性的百分比。

在本发明另一优选的实施方案中，通过如上文所述增加NADPH依赖型HAR活性和/或通过减少NADH依赖型HAR活性而增强NADPH HAR活性。

减少酶活性意为通过如下来减少其特定催化活性：突变基因以改变氨基酸序列和/或通过突变核苷酸序列或通过缺失基因的编码区来减少细胞中的蛋白浓度。

在本发明中，NADH依赖型HAR活性的减少通过缺失gldA基因或通过在GldA酶上实施辅因子工程化实施，其导致NADH依赖型HAR活性减少以及NADPH依赖型HAR活性增加。

因此，本发明的微生物优选过表达编码NADPH依赖型甘油脱氢酶的突变gldA*基因和/或在内源gldA基因中缺失。

辅因子工程化意为通过替换GldA蛋白中的一些特定的氨基酸残基改变酶的辅因子特异性。这些获得的突变体(GldA*NADPH)为NADPH依赖型且不同于上文公开的为NADH依赖型的GldA*突变体(GldA*A160T)。管理称为‘Rossman折叠’的辅因子结合口袋中辅因子特异性的残基已详细研究(Scrutton等,1990；Clermont等,1993；Corbier等,1990；Wu等,2012)且本领域的技术人员能够确定修饰哪些氨基酸残基来改变辅因子特异性。辅因子工程化进来已在改变酶优选NADH作为辅因子替代NADPH中取得成功。实例是酶Gre2p，酿酒酵母中发现的倾向NADPH的脱氢酶，其通过直接诱变修饰以具有对NADPH减少的依赖性，和对NADH增加的亲和力(Katzberg等,2010)。

在本发明中，从来自嗜热脂肪芽孢杆菌的酶的三维结构建立了来自大肠杆菌的GldA的三维结构模型(Ruzheinikov等,2001)。本领域的技术人员已知如何使用例如软件如Discovery Studio(Accelrys)建立三维同源模型。这样的模型对于确定哪些氨基酸突变从而实现辅因子特异性中的预期改变是有用的。从来自大肠杆菌的GldA的三维结构，发明人已鉴定了在相同位置将由不同的氨基酸残基替换的氨基酸残基：

-D37

-F39

-V40

-F43

-T116

-P161

-L164

根据本发明，GldA辅因子特异性的改变由至少一个在位置D37的突变介导。在优选的实施方案中，在位置D37的氨基酸残基由甘氨酸(D37G)、丙氨酸(D37A)或缬氨酸(D37V)替换。在最优选的实施方案中，在位置D37的氨基酸残基由甘氨酸(D37G)替换。

在优选的实施方案中，GldA辅因子特异性的改变通过将位置D37的突变与至少一种位置P161的突变组合改进。优选地，位置P161的氨基酸残基由丝氨酸(P161S)或苏氨酸(P161T)替换。更优选地，位置P161的氨基酸残基由丝氨酸(P161S)替换。

在最优选的实施方案中，GldA辅因子特异性的改变通过将位置D37和P161的突变与位置L164的至少一种突变组合改进。优选地，位置L164的氨基酸残基由丙氨酸(L164A)、甘氨酸(L164G)或缬氨酸(L164V)替换。更优选地，位置L164的氨基酸残基由丙氨酸(L164A)替换。

在特定的实施方案中，本发明的微生物过表达编码GldA*突变的突变gldA*，其包含至少一种下列突变：D37G、P161S和L164A。

在本发明优选的实施方案中，可将这些突变引入之前构建并包含突变A160T的GldA*突变体中。

由大肠杆菌(菌株K12)表达的甘油脱氢酶的氨基酸序列在UniprotKB数据库中基于参照P0A9S5是公共可获得的。

因此，为增强NADPH HAR依赖活性，本发明的微生物优选过表达至少一种编码如上文所述的NADPH依赖型丙酮醇还原酶(NADPH HAR)的基因或编码如上文所述的NADPH依赖型甘油脱氢酶的突变gldA*基因。

在本发明其他特定的实施方案中，本发明修饰的微生物可以：

-过表达至少一种NADPH HAR基因且可在gldA基因中缺失，

-过表达至少一种NADPH HAR基因和gldA*NADPH突变体，或

-过表达至少一种NADPH HAR基因和gldA*NADPH突变体，且可在gldA基因中缺失。

在本发明的另一方面中，通过将如上文所述的NADPH依赖型HAR活性的增加与细胞中NADPH利用度的增加组合进一步改进1,2-丙二醇的生产。

用于增加细胞中NADPH利用度的策略为本领域的技术人员已知(Lee等综述,2013)。本发明中，细胞中的NADPH利用度通过下述增加：

-过表达编码膜结合转氢酶的pntAB操纵子(WO2012/055798A1)，和/或

-减弱编码磷酸葡糖异构酶的pgi基因，和/或

-通过减少由pfkA基因编码的磷酸果糖激酶的活性来增加通过戊糖磷酸途径的通量(WO2005/047498)并过表达编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(Shin等,2002)，和/或

-过表达来自变形链球菌(Streptococcus mutans)的gapN基因，其编码生成NADPH的甘油醛-3-磷酸(Centeno-Leija等,2013)，

-和/或过表达突变的lpd*基因，其编码能够生成NADPH的硫辛酰胺脱氢酶(Bocanegra等,1993)，

-和/或过表达yjeF基因，其编码重新激活由酶或热依赖性水合产生的NADH(X)和NADPH(X)的ADP-依赖型脱水酶(Marbaix等,2011)。

在本发明的进一方面中，当本发明的微生物过表达NADPH HAR基因时，编码丙酮醛还原酶(MGR)的yqhD基因已缺失。在这种条件下，HAR蛋白不仅作为NADPH依赖型HAR酶发挥作用，还作为NADPH依赖型MGR酶发挥作用，实施丙酮醛成为1,2-丙二醇的两步NADPH依赖型还原。这种活性可通过上文已列举的用于NADPH依赖型HAR酶的任何候选物实施。

在本发明更优选的实施方案中，通过重组微生物(其中NADPH依赖型丙酮醇还原酶活性根据上述的任何修饰而增强)在发酵过程中从作为碳源的糖类生产1,2-丙二醇可通过在所述微生物中组合上文讨论的修饰而实现，例如：

-增强至少一种NADPH HAR基因和pntAB基因的表达，

-增强至少一种NADPH HAR基因的表达并缺失gldA基因，

-增强至少一种NADPH HAR基因和pntAB的表达而缺失gldA基因，

-增强至少一种NADPH HAR基因和yjeF表达而缺失gldA基因，

-增强至少一种NADPH HAR基因的表达并减弱pgi而缺失gldA基因，

-增强至少一种NADPH HAR基因和zwf的表达而减弱gldA基因和pfkA基因，

-增强至少一种NADPH HAR基因和gapN的表达而缺失gldA基因，

-增强至少一种NADPH HAR基因和lpd*突变体的表达而缺失gldA基因，

-增强突变GldA*NADPH编码基因的表达并缺失gldA基因，

-增强突变GldA*NADPH编码基因和pntAB基因的表达，

-增强突变GldA*NADPH编码基因和pntAB基因的表达而缺失gldA基因，

-增强至少一种NADPH HAR基因的表达并减弱yqhD基因而缺失gldA基因，

-增强至少一种NADPH HAR基因和pntAB基因的表达而缺失yqhD基因和gldA基因。

实施例

实施例1：方法

在下文给出的实施例中，使用本领域已知的方法构建大肠杆菌菌株，其包含复制载体和/或多种染色体缺失，和使用由Datsenko&Wanner,(2000)详述用于大肠杆菌的同源重组进行的取代。以相同的方式，使用质粒或载体在重组微生物中表达或过表达一种或数种基因为本领域的技术人员已知。适当的大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc、pACYC184npBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236等。

在下述实施例中使用了数种方案。本发明中使用的方案1(通过同源重组的染色体修饰、重组体的选择)、方案2(噬菌体P1的转导)和方案3(抗生素盒切除，当需要时去除抗性基因)已完整描述于专利申请EP 2532751。染色体修饰由PCR分析用本领域的技术人员能够设计的适当的寡核苷酸验证。

方案4：重组质粒的构建

重组DNA技术已在本领域详述。DNA片段和所选质粒使用兼容的限制性内切酶消化(本领域的技术人员能够对其确定)，随后连接并转化入感受态细胞。分析转化体并通过DNA测序验证感兴趣的重组质粒。

表2：下文实施例中引用的序列

方案5：1,2-丙二醇生产菌株的评估

1,2-丙二醇生产菌株在烧瓶培养物中如专利申请EP 2532751中所述培养，除了使用20g/L葡萄糖或蔗糖和40g/L MOPS。当需要时，将100μM IPTG添加至介质。1,2-丙二醇(PG)和羟基丙酮(HA)通过HPLC定量。PG(gPG/L)的生产和HA向PG的转化(gPG/L/(gHA/L+gPG/L))给出菌株生产1,2-丙二醇表现的评估。

方案6：重组蛋白生产的烧瓶培养

重组蛋白生产的烧瓶培养如专利申请WO 2010/076324中所述实施，只是以5.0g/L葡萄糖补充LB培养液。

实施例2：菌株1、2、3和4的构建

菌株1的构建

为失活由frdABCD操纵子编码的富马酸还原酶黄素蛋白复合物和由ptsG基因编码的葡萄糖磷酸转移酶IIBC(Glc)，使用了同源重组策略(根据方案1和3)。将对于DfrdABCD的寡核苷酸：SEQ ID NO 1和2(列于表2)和对于DptsG的寡核苷酸：SEQ ID NO 3和4(列于表2)用于PCR扩增抗性盒。保留的菌株称为MG1655DfrdABCD::Cm和MG1655DptsG::Km。最终，DfrdABCD::Cm和DptsG::Km缺失由P1噬菌体转导(根据方案2)转移入专利申请WO2008/116852所述的进化的菌株MG1655lpd*DtpiA DpflAB DadhE DldhA DgloA DaldA DaldBDedd DarcA Dndh，生成菌株1。

菌株2的构建

将gldA*(A160T)基因克隆入如专利申请EP 2532751中所述的pME101VB06质粒。将此名为pPG0078的质粒转化入菌株1，生成菌株2。

菌株3的构建

为表达由tpiA基因编码的丙糖磷酸异构酶并调节由gapA基因编码的甘油醛磷酸脱氢酶的表达，使用了同源重组策略(根据方案1和3)。将tpiA基因如专利WO2008/116852中所述引入进化的菌株MG1655lpd*DtpiA DpflAB DadhE DldhA DgloA DaldA DaldB DeddDarcA Dndh DfrdABCD。然后将调节gapA表达的基因组修饰“CI857-PR01/RBS11-gapA”如专利EP 2532751所述引入之前的菌株以生成菌株3。

菌株4的构建

为允许大肠杆菌在蔗糖上生长，将来自质粒pUR400(Schmid等,1982)的基因scrK、scrYAB和scrR克隆在质粒pBBR1MCS3上的其天然启动子下。该质粒称为pPG0231。将质粒pPG0078和pPG0231转化入菌株3，生成菌株4。

实施例3：1,2-丙二醇的生产在过表达来自拜氏梭菌的仲醇脱氢酶adh的菌株中改进

菌株5的构建

将来自拜氏梭菌的adh基因(Hanai等,2007)克隆入专利申请WO 2008/116853中所述的pME101VB01质粒中。将此名为pPG0468的质粒转化入菌株1，生成菌株5。

菌株6的构建

为失活gldA基因，使用了同源重组策略(根据方案1和3)。将对于DgldA的寡核苷酸：SEQ ID NO 5和6(列于表2)用于PCR扩增抗性盒。保留的菌株称为MG1655DgldA::Cm。DgldA::Cm缺失通过P1噬菌体转导(根据方案2)转入菌株5，生成菌株6。

菌株7的构建

将质粒pPG0468和pPG0231转入菌株3，生成菌株7。

菌株8的构建

为失活gldA基因，将之前所述的DgldA::Cm缺失通过P1噬菌体转导(根据方案2)转入菌株7，生成菌株8。

如方案5中所述评估的表达来自拜氏梭菌的adh的菌株5、6、7和8与其各自的对照菌株2和4相比产生更多的1,2-丙二醇(PG)且具有更好的转化率和收率(表3)。

表3：通过表达来自拜氏梭菌的adh的菌株5、6、7和8的1,2-丙二醇生产。(符号～指示菌株间不存在显著差异，符号+指示与对照菌株相比表现上10-100％的增加，符号++指示与对照菌株相比100-200％的增加，符号+++指示与对照菌株相比200-300％的增加，且符号++++指示与对照菌株相比大于300％的增加)：

实施例4：通过在过表达来自拜氏梭菌的仲醇脱氢酶adh的菌株中过表达吡啶核苷酸转氢酶pntAB改进1,2-丙二醇的生产

菌株9的构建

pntAB的天然启动子区由诱导型trc启动子(来自质粒pTRC99A，AmershamPharmacia)和定义的核糖体结合位点RBS120(来自RBS Calculator软件)(列于表2的SEQID NO 7)使用同源重组策略(根据方案1和3)替换。对于染色体整合，通过重叠PCR技术(重叠寡核苷酸)PCR扩增片段，所述片段携带人工启动子区和两侧翼为与靶向的整合基因座pntAB的同源DNA序列的抗性标记物。用于重组入pntAB的序列称为SEQ ID NO 8和9(列于表2)。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入菌株MG1655(pKD46)。保留的菌株称为MG1655Ptrc01/OP01/RBS120-pntAB::Cm。然后，将Ptrc01/OP01/RBS120-pntAB::Cm修饰通过P1噬菌体转导(根据方案2)转移入菌株6，生成菌株9。

菌株10的构建

将之前所述的Ptrc01/OP01/RBS120-pntAB::Cm修饰通过P1噬菌体转导(根据方案2)转移入菌株8，生成菌株10。

如方案5中所述评估的过表达pntAB的菌株9和10与菌株6和8相比分别生产更多的1,2-丙二醇(PG)且具有更好的转化率和收率(表4)。

表4：通过过表达pntAB的菌株9和10的1,2-丙二醇生产。(符号～指示在菌株间不存在显著差异，符号+指示与对照菌株相比在表现上10-100％的增加，符号++指示与对照菌株相比100-200％的增加，符号+++指示与对照菌株相比200-300％的增加，且符号++++指示与对照菌株相比大于300％的增加)：

菌株	对照菌株	培养条件	PG	转化	收率
						6	2	葡萄糖37℃	++	++	++
9	2	葡萄糖37℃	+++	+++	+++
						8	4	蔗糖30℃	+	+	+
10	4	蔗糖30℃	+++	+++	+++

实施例5：在过表达来自拜氏梭菌的仲醇脱氢酶adh的菌株中改进1,2-丙二醇生产的pntAB过表达的替代

菌株11的构建

将来自大肠杆菌的yjeF基因克隆在定义的核糖体结合位点RBS121(来自RBSCalculator软件)下具有adh的操纵子(列于表2的SEQ ID NO 10)中，进入实施例3所述的pPG0468质粒。该质粒名为pPG0518。最终，将pPG0518和pPG0231转化入中间菌株8(无质粒)，生成菌株11。

菌株12的构建

为失活pgi基因，使用了同源重组策略(根据方案1和3)。将对于Dpgi的寡核苷酸：SEQ ID NO 11和12(列于表2)用于PCR扩增抗性盒。保留的菌株称为MG1655Dpgi::Cm。将Dpgi::Cm缺失通过P1噬菌体转导(根据方案2)转移入菌株8，生成菌株12。

菌株13的构建

天然的pfkA基因由突变的pfkA*(L98Q)基因使用同源重组策略(根据方案1和3)替换。首先，使用寡核苷酸SEQ ID NO 13和14(列于表2)缺失pfkA基因以扩增抗性盒。保留的菌株称为MG1655DpfkA::Km。然后，对于染色体整合，通过重叠PCR技术(重叠寡核苷酸)PCR扩增片段，所述片段携带突变的pfkA*(L98Q)区和两侧翼为与靶向的整合基因座pfkA同源的DNA序列的抗性标记物。用于重组入pfkA的序列称为SEQ ID NO 15和16(列于表2)。获得的PCR产物然后通过电穿孔导入菌株MG1655DpfkA::Km(pKD46)。保留的菌株称为MG1655pfkA*(L98Q)::Cm。将pfkA*(L98Q)::Cm修饰通过P1噬菌体转导(根据方案2)转移入菌株8(无质粒的菌株)。将来自大肠杆菌的zwf基因克隆在定义的核糖体结合位点RBS113(来自RBS Calculator软件)下具有adh的操纵子(列于表2的SEQ ID NO 17)中，进入如实施例3所述的pPG0468质粒。将该质粒名为pPG0532。最终，将pPG0532和pPG0231转化入之前的菌株，生成菌株12。

菌株14的构建

为失活gldA基因，将之前所述的DgldA::Cm缺失通过P1噬菌体转导(根据方案2)转移入中间进化的菌株3(无gapA调节)。为表达来自变形链球菌的由gapN基因编码的NADP+-依赖型甘油醛3-磷酸脱氢酶，使用了同源重组策略(根据方案1和3)。如Centeno-Leija等(2013)所述，将来自大肠杆菌的gapA基因通过来自变形链球菌的gapN基因替换。将获得的PCR产物通过电穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。保留的菌株称为MG1655gapN::Cm。将gapN::Cm修饰通过P1噬菌体转导(根据方案2)转移入之前的菌株。为染色体表达基因scrK、scrYAB和scrR，使用了由Datsenko&Wanner,2000所述的同源重组策略(根据方案1和3)。对于染色体整合，通过重叠PCR技术(重叠寡核苷酸)PCR扩增片段，所述片段携带在其天然启动子(与两侧翼为与靶向的整合基因座ykiA的同源DNA序列的抗性标记物连接)下表达的基因scrK、scrYAB和scrR。用于重组入ykiA的序列称为SEQ ID NO 18和19(列于表2)。获得的PCR产物“DykiA::scrKYABR”然后通过电穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。保留的菌株称为MG1655DykiA::scrKYABR::Cm。DykiA::scrKYABR::Cm修饰通过P1噬菌体转导(根据方案2)转移入之前的菌株。为允许来自变形链球菌的NADP+-依赖型甘油醛3-磷酸脱氢酶的过生产，如Centeno-Leija等(2013)所述将gapN基因克隆在pACYC184质粒上。该质粒称为pPG0548。最终，将质粒pPG0468和pPG0548转化入之前的菌株，生成菌株13。

菌株15的构建

为失活由lpd基因编码的NAD+依赖型硫辛酰胺脱氢酶，使用了重组策略(根据方案1和3)。因此将针对Dlpd的寡核苷酸：SEQ ID NO 20和21(列于表2)用于PCR扩增抗性盒。保留的菌株称为MG1655Dlpd::Cm。最终，Dlpd::Cm缺失通过P1噬菌体转导(根据方案2)转移入中间菌株8(无质粒的菌株)。来自大肠杆菌的突变的lpd*(A55V/G185A/G189A/E203V/M204R/F205K/D206H/P210R)基因通过重叠PCR技术(重叠寡核苷酸)PCR扩增并克隆在定义的核糖体结合位点RBS131(来自RBS Calculator软件)下具有adh的操纵子(列于表2的SEQID NO 22)中，进入如实施例3所述的pPG0468质粒。该质粒名为pPG0523。最终，将质粒pPG0231和pPG0523转化入之前的菌株，生成菌株14。

如方案5中所述评估的菌株11、12、13、14和15与菌株8相比生产更多的1,2-丙二醇(PG)且具有更好的转化率(表5)。

表5：通过菌株11、12、13、14和15的1,2-丙二醇生产。(符号～指示在菌株间不存在显著差异，符号+指示与对照菌株相比在表现上10-100％的增加，符号++指示与对照菌株相比100-200％的增加，符号+++指示与对照菌株相比200-300％的增加，且符号++++指示与对照菌株相比大于300％的增加)：

实施例6：来自拜氏梭菌的adh的替换

同源序列的鉴定和系统发育树的构建

来自序列集合的系统发育树的构建使用可在网站http://www.phylogeny.fr/获得的生物信息学程序实施，且软件描述于Dereeper等(2008)和Dereeper等(2010)。

步骤1：同源序列的鉴定

相似序列的鉴定从仲醇脱氢酶家族和醛/酮还原酶家族使用BLAST软件通过设置下列参数实施：数据库(Swissprot/UNIPROT)，e-值＝0.01和用于低复杂性序列的过滤器。

步骤2：系统发育树的构建

使用MUSCLE软件比对序列并使用Gblocks程序去除模糊区。然后，使用在PhyML程序中执行的最大可能性方法重新构建系统发育树。使用TreeDyn实施系统发育树的图像表示和版本。

表6：NADPH依赖型HAR酶的候选物：

来自拜氏梭菌的Adh与布氏热厌氧杆菌、溶组织内阿米巴菌和肺炎支原体的酶最密切相关。其次最佳匹配是与在真核生物中发现的醇脱氢酶。克隆了来自氧化葡糖杆菌、红褐肉座菌、溶组织内阿米巴菌和枯草芽孢杆菌的酶，纯化并测定了NADPH依赖型羟基丙酮还原酶的活性。

菌株16的构建

为失活gldA基因，使用了同源重组策略(根据方案1和3)。将针对DgldA的寡核苷酸：SEQ ID NO 5和6(列于表2)用于PCR扩增抗性盒。保留的菌株称为MG1655DgldA::Km。最终，DgldA::Km缺失通过P1噬菌体转导(根据方案2)转移入菌株BL21(DE3)*。为表征来自氧化葡糖杆菌的甘油脱氢酶，将为大肠杆菌优化的合成的基因gld(列于表2的SEQ ID NO 23)克隆入表达质粒pPAL7

该质粒名为pPG0381，并将其转化入菌株BL21(DE3)*DgldA::Km，生成菌株16。

菌株17的构建

为表征来自红褐肉座菌的甘油脱氢酶，将为大肠杆菌优化的合成的基因gld2(列于表2的SEQ ID NO 24)克隆入表达质粒pPAL7

该质粒名为pPG0418并将其转化入之前所述的菌株BL21(DE3)*DgldA::Km，生成菌株17。

菌株18的构建

为表征来自溶组织内阿米巴菌的乙醇脱氢酶，将为大肠杆菌优化的合成的基因adh1(列于表2的SEQ ID NO 25)克隆入表达质粒pPAL7

该质粒名为pPG0539，并将其转化入菌株BL21(DE3)codonplus，生成菌株18。

菌株19的构建

为表征来自枯草芽孢杆菌的醛酮还原酶，将来自枯草芽孢杆菌的基因yhdN克隆入表达质粒pPAL7

该质粒名为pPG0357，并将其转化入菌株BL21(DE3)，生成菌株19。

重组蛋白纯化

如方案6所述培养菌株16、17、18和19。将细胞(350-500mg干重)在具有蛋白酶抑制剂混合物的提取缓冲液(60-90ml)中重悬。悬浮的细胞在冰上通过6次30秒的声处理循环(Branson sonifier,70W)破坏，然后在室温以1mM MgCl₂和2UI/ml的DNaseI温育1小时。细胞碎片通过在12000g在4℃离心30分钟去除。保留上清液作为粗细胞提取物。根据制造商的说明通过使用枯草杆菌蛋白酶(subtilisine)亲和层析(PROfinity EXact Cartridge5ml,BIORAD)从粗提取物纯化重组蛋白。汇集含有蛋白的级分，浓缩并装载在凝胶过滤柱上(Superdex 200 10/300 GL柱,GE Healthcare)。蛋白浓度使用Bradford测定法确定。

纯化的酶的NADPH依赖型羟基丙酮还原酶(HAR NADPH)

HAR NADPH活性通过测量在分光光度计上于340nm和在30℃的NADPH消耗来确定(ε_340nm＝6290M^-1cm^-1)。包含测定缓冲液、0.2mM NADPH和纯化的蛋白的反应混合物(1mL)在30℃温育5分钟。然后，添加30mM羟基丙酮以初始反应。一个单位的酶活性定义为每分钟催化1μmol的NADPH减少的酶量。比酶活性表示每mg蛋白的酶活性单位。减去无羟基丙酮测定的活性值。

表7：对于特定候选物的HAR NADPH依赖型活性：

酶	测定缓冲液	HAR NADPH(mUI/mg)
			Gld	20mM Hepes(pH 7.5)	5461
Gld2	10mM磷酸钠(pH 7)	9623
			Adh1	50mM Tris-HCl(pH 7.5)	13325
YhdN	20mM Tris-HCl(pH 7.5)	1975

菌株20的构建

将来自溶组织内阿米巴菌的优化的adh1基因克隆入专利申请WO 2008/116853中所述的pME101VB01质粒。该质粒名为pPG0544。将质粒pPG0544和pPG0231转化入实施例2中所述的菌株3，然后如实施例3所述失活gldA基因并如实施例4所述过表达pntAB操纵子，生成菌株19。

如方案5中所述评估的菌株20与菌株4相比生产更多的1,2-丙二醇(PG)且具有更好的转化率(表8)。

表8：通过表达来自溶组织内阿米巴菌的adh1基因的菌株20的1,2-丙二醇生产。(符号～指示在菌株间不存在显著差异，符号+指示与对照菌株相比在表现上10-100％的增加，符号++指示与对照菌株相比100-200％的增加，符号+++指示与对照菌株相比200-300％的增加，且符号++++指示与对照菌株相比大于300％的增加)：

菌株	对照菌株	培养条件	PG	转化
					20	4	蔗糖37℃	+++	+++

实施例7：GldA*(A160T)的辅因子重构

酶设计和结构分析

从嗜热脂肪芽孢杆菌的甘油脱氢酶X-射线结构建立GldA*(A160T)的同源性模型。通过使用Discovery Studio软件(Accelrys)计算模型。将这些模型与具有至少30％同一性且其结构已知的NAD和NADP依赖型酶的结构进行比较。

参与辅因子特异性的氨基酸通过下述鉴定：GldA*(A160T)和数种NAD和NADP依赖型脱氢酶的序列间的序列比对、GldA*(A160T)和RCSB蛋白数据库中存在的甘油脱氢酶的同源模型间的叠加以及与Clermont等(1993),Ruzheinikov等(2001),Corbier等(1990)和Wu等(2012)中发现的数据的比较。

从顺序和结构分析确定了两种突变体：D37G和D37G/P161S/L164A。

菌株21的构建

为表征来自大肠杆菌的突变的1,2-丙二醇:NAD+氧化还原酶，首先将基因gldA克隆入表达质粒pET101/D-TOPO

该质粒名为pPG0029。为过表达突变的gldA*(A160T)基因，使用在pPG0029上的定点诱变。该质粒名为pPG0394，并将其转化入菌株BL21(DE3)*DgldA::Km，生成菌株21。

菌株22的构建

为过表达突变的gldA*(A160T/D37G)基因，使用了在pETTOPO-gldA*(A160T)上的定点诱变。该质粒名为pPG0425，并将其转化入菌株BL21(DE3)*DgldA::Km，生成菌株22。

菌株23的构建

为表达突变的gldA*(A160T/D37G/P161S/L164A)基因，使用了在pPG0425上的定点诱变。该质粒名为pPG0438，并将其转化入菌株BL21(DE3)*DgldA::Km，生成菌株23。

GldA*(A160T)、GldA*(A160T/D37G)和GldA*(A160T/D37G/P161S/L164A)的纯化

如方案6中所述培养菌株21、22和23。在90mL的提取缓冲液(100mM磷酸钾pH 7.6，20mM咪唑和蛋白酶抑制剂混合物)中重悬细胞(500mg干重)。在冰上通过8个30秒的声处理循环(Branson sonifier,70W)破坏悬浮的细胞，然后在室温以5mM MgCl₂和2UI/ml的DNaseI温育45分钟。通过在12000g于4℃离心30分钟去除细胞碎片。保留上清液作为粗提取物。根据制造商的说明通过使用镍亲和层析(HisTrapFF 1mL,GE Healthcare)从粗提取物纯化酶。通过使用在100mM磷酸钾(pH 7.6)中的咪唑线性梯度(20-500mM)洗脱酶。在通过以100mM MES-KOH(pH 6.5)平衡的凝胶过滤(Superdex20010/300GL柱,GE Healthcare)的脱盐步骤后，使用Bradford测定法确定蛋白浓度。

GldA*(A160T)、GldA*(A160T/D37G)和GldA*(A160T/D37G/P161S/L164A)的表征

NADPH依赖型羟基丙酮还原酶活性(HAR NADPH)通过测量在分光光度计上于340nm和在30℃的NADPH消耗来确定(ε_340nm＝6290M^-1cm^-1)。包含100mM MES-KOH(pH 6.5)、0.1mMFeSO4、30mM硫酸铵、0.05-0.4mM NADPH和纯化的酶的反应混合物(1mL)在30℃温育5分钟。然后，添加0.1-10mM羟基丙酮以初始反应。NADH依赖型羟基丙酮还原酶(HAR NADH)测定在与HAR NADPH相同条件下实施，只是反应混合物中NADPH由NADH替换且通过测量在340nm处的NADH消耗来确定活性。通过拟合至Michaelis-Menten方程用Sigmaplot确定动力学参数。

GldA*(A160T/D37G)和GldA*(A160T/D37G/P161S/L164A)酶显示与GldA*(A160T)相比使用NADPH增加的催化效率和使用NADH减少的催化效率(表9)。

表9：GldA*NADPH突变体的催化效率：

菌株24的构建

将突变的gldA*(A160T/D37G/P161S/L164A)基因克隆入如上所述的pME101衍生质粒用于构建专利申请EP 2532751中的pME101VB06-gldA*(A160T)。该质粒名为pPG0467。最终，将质粒pPG0467和pPG0231转化入如实施例2中所述的中间菌株8(无质粒的菌株)，生成菌株24。

如方案5所述评估的菌株24与菌株4相比生产更多的1,2-丙二醇(PG)且具有更好的转化率(表10)。

表10：通过菌株24的1,2-丙二醇生产。(符号～指示在菌株间不存在显著差异，符号+指示与对照菌株相比在表现上10-100％的增加，符号++指示与对照菌株相比100-200％的增加，符号+++指示与对照菌株相比200-300％的增加，且符号++++指示与对照菌株相比大于300％的增加)：

菌株	对照菌株	培养条件	PG	转化
					24	4	蔗糖37℃	+++	++

实施例8：通过来自拜氏梭菌的Adh的MG＝>PG活性

菌株25的构建

将来自拜氏梭菌的优化的adh基因(Hanai,Atsumi和Liao,2007)克隆入表达质粒pET28a。该质粒称为pPG0445，并将其转化入菌株BL21(DE3)，生成菌株25。

来自拜氏梭菌的Adh的纯化

如方案6中所述培养菌株25。在50mL的提取缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.3、0.1mMDTT、0.1mM苯甲脒、10％甘油、0.02％叠氮化钠和蛋白酶抑制剂混合物)中重悬细胞(315mg干重)。在冰上通过8个30秒的声处理循环(Branson sonifier,70W)破坏悬浮的细胞。通过在12000g于4℃离心30分钟去除细胞碎片。将上清液暴露至热(65°进行5分钟)然后在12000g于4℃再次离心30分钟。根据制造商的说明通过使用镍亲和层析(HisTrapFF 1mL,GEHealthcare)从上清液纯化蛋白。使用在50mM Tris-HCl(pH 7.4)中的咪唑线性梯度(20-500mM)洗脱蛋白。汇集包含蛋白的级分，浓缩并针对50mM Tris-HCl(pH 7)透析。使用Bradford测定法确定蛋白浓度。

从丙酮醛产生的1,2-丙二醇的定量

将5-10μg纯化的酶在50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM丙酮醛和5mM NADPH中于30℃温育30分钟。通过Adh从丙酮醛的产生的1,2-丙二醇的量通过GC-MS(AgilentTechnologies)直接测量。

在这种条件下产生了4.6mM的1,2-丙二醇，而当省略丙酮醛或酶时未产生1,2-丙二醇。

菌株26、27和28的构建

为失活gldA基因，将之前所述的DgldA::Km缺失和tpiA基因通过P1噬菌体转导(根据方案2)共转移入专利申请WO2008/116852中所述的菌株MG1655lpd*DtpiA DpflAB DadhEDldhA DgloA DaldA DaldB Dedd。将调节gapA表达的基因组修饰“CI857-PR01/RBS11-gapA”如专利EP 2532751中所述引入之前的菌株。为失活由yqhD基因编码的醛还原酶和由yqhE基因编码的乙二醛还原酶，使用了同源重组策略(根据方案1和3)。将针对DyqhDE的寡核苷酸：SEQ ID NO 26和27(列于表2)用于PCR扩增抗性盒。保留的菌株称为MG1655DyqhDE::Bs。DyqhDE::Bs缺失通过P1噬菌体转导(根据方案2)转入之前的菌株，生成菌株26。然后将质粒pPG0468转化入此菌株，生成菌株27。最终，之前所述的Ptrc01/OP01/RBS120-pntAB::Cm修饰通过P1噬菌体转导(根据方案2)转入菌株27，生成菌株28。

当如方案5中所述评估时，菌株27和28与菌株26相比生产更多的1,2-丙二醇(PG)。

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-Wu C,Hwa Y,Chen Y,Lim C(2012),J Phys Chem B,116(19):5644-5652

序列表

<110> 代谢探索者公司(METABOLIC EXPLORER)

<120> 基于NADPH依赖型丙酮醇还原酶和改进的NADPH供给用于生产1,2-丙二醇的新微生物和方法

<130> B367604D33761

<150> EP14305691.9

<151> 2014-05-12

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于 frdABCD的寡核苷酸

<400> 1

cgtgcaaacc tttcaagccg atcttgccat tgtaggcgcc ggtggcgcgg gattacgtgc 60

tgcaattgct gccgcgcagg ccatatgaat atcctcctta g 101

<210> 2

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于frdABCD的寡核苷酸

<400> 2

cgttagattg taacgacacc aatcagcgtg acaactgtca ggatagcagc cagaccgtag 60

aaaacccatt tgcccgcagg tgtaggctgg agctgcttcg 100

<210> 3

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于ptsG的寡核苷酸

<400> 3

atgtttaaga atgcatttgc taacctgcaa aaggtcggta aatcgctgat gctgccggta 60

tccgtactgc ctatcgcagg tgtaggctgg agctgcttcg 100

<210> 4

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于ptsG的寡核苷酸

<400> 4

ttagtggtta cggatgtact catccatctc ggttttcagg ttatcggatt tagtaccgaa 60

aatcgcctga acaccagaac catatgaata tcctccttag 100

<210> 5

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于gldA的寡核苷酸

<400> 5

atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 60

ctgggcgaat acctgaagcc gtgtaggctg gagctgcttc g 101

<210> 6

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于gldA的寡核苷酸

<400> 6

ttattcccac tcttgcagga aacgctgacc gtactggtcg gctaccagca gagcggcgta 60

aacctgatct ggcgtcgcgc catatgaata tcctccttag 100

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 核糖体结合位点RBS120

<400> 7

atccggtata ggaggtatag a 21

<210> 8

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于重组入pntAB的序列

<400> 8

gaccgtcgaa gacaattatc agtctttatc cggcgttcta aggtgtttat cccactatca 60

cggctgaatc gttaatattt tgcgagttca cgccgaaata ctgatttttg gcgctagatc 120

acaggcataa ttttcagtac gttatagggc gtttgttact aatttatttt aacggagtaa 180

catttagctc gtacatgagc agcttgtgtg gctcctgaca caggcaaacc atcatcaata 240

aaaccgatgg aagggaatat c 261

<210> 9

<211> 260

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于重组入pntAB的序列

<400> 9

atgcgaattg gcataccaag agaacggtta accaatgaaa cccgtgttgc agcaacgcca 60

aaaacagtgg aacagctgct gaaactgggt tttaccgtcg cggtagagag cggcgcgggt 120

caactggcaa gttttgacga taaagcgttt gtgcaagcgg gcgctgaaat tgtagaaggg 180

aatagcgtct ggcagtcaga gatcattctg aaggtcaatg cgccgttaga tgatgaaatt 240

gcgttactga atcctgggac 260

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 核糖体结合位点RBS121

<400> 10

agacaataat cgaacaacat attaaggaga gttt 34

<210> 11

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于Dgpi的寡核苷酸

<400> 11

ccaacgcaga ccgctgcctg gcaggcacta cagaaacact tcgatgaaat gaaagacgtt 60

acgatcgccg atctttttgc tgtaggctgg agctgcttcg 100

<210> 12

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于Dgpi的寡核苷酸

<400> 12

gcgccacgct ttatagcggt taatcagacc attggtcgag ctatcgtggc tgctgatttc 60

tttatcatct ttcagctctg catatgaata tcctccttag 100

<210> 13

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于pfkA的寡核苷酸

<400> 13

gttcctcggt tctgcgcgtt tcccggaatt ccgcgacgag aacatccgcg ccgtggctat 60

cgaaaacctg aaaaaacgtg gtgtaggctg gagctgcttc g 101

<210> 14

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于pfkA的寡核苷酸

<400> 14

ggcctgataa gcgaagcgca tcaggcattt ttgcttctgt catcggtttc agggtaaagg 60

aatctgcctt tttccgaaat cacatatgaa tatcctcctt ag 102

<210> 15

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于重组入Pfka的寡核苷酸

<400> 15

gttcctcggt tctgcgcgtt tcccggaatt ccgcgacgag aacatccgcg ccgtggctat 60

cgaaaacctg aaaaaacgtg g 81

<210> 16

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于重组入Pfka的寡核苷酸

<400> 16

ggcctgataa gcgaagcgca tcaggcattt ttgcttctgt catcggtttc agggtaaagg 60

aatctgcctt tttccgaaat ca 82

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 核糖体结合位点RBS113

<400> 17

aactcatttc gtttttaggg aggaataa 28

<210> 18

<211> 202

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于重组入ykiA的序列

<400> 18

cttccccttg aacgggaggg catttttctg aaatatcctt tctttagccc ataataatat 60

ttcctttgct gcgatttttt caatttccga tatattcata atttatcaag gttgatataa 120

atatcagtga agatctccag atattgttgc ggaactggct acgataaaag ataaatcaga 180

tgatgaatgg tggcgtgcat tg 202

<210> 19

<211> 254

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于重组入ykiA的序列

<400> 19

catcctgatg actggtgaac tggcagcgtt aattcaaaac ctgattgaag gattaggtgg 60

cgaagcacaa cgttaattgc tgattttcct ttaatgccgg atgcgacgcc tgccgcgtct 120

tatccggcgt acgaagccac accaggcata taattattcg ctacggcgag caataatttt 180

tagcgcagca atattatgcg ttttacgctg taacttgctc catggacgtt gtgtcattgt 240

ttttcctcaa gccg 254

<210> 20

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于lpd的寡核苷酸

<400> 20

atgagtactg aaatcaaaac tcaggtcgtg gtacttgggg caggccccgc aggttactcc 60

gctgccttcc gttgcgctga catatgaata tcctccttag 100

<210> 21

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于lpd的寡核苷酸

<400> 21

ttacttcttc ttcgctttcg ggttcggcag gtcggtaatg ctaccttcga acacttctgc 60

cgccaggccc acagactcgt tgtaggctgg agctgcttcg 100

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 核糖体结合位点RBS131

<400> 22

tggcaaggta agcaaactat aaggaggtca aat 33

<210> 23

<211> 1013

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的基因gld

<400> 23

aagctttgat ggcaagcgat accattcgta ttccgggtat tgatacaccg ctgagccgtg 60

ttgcactggg cacctgggca attggtggtt ggatgtgggg tggtccggat gatgataatg 120

gtgttcgtac cattcatgca gcactggatg aaggtattaa tctgattgat accgctccgg 180

tttatggttt tggtcatagc gaagaaattg ttggtcgtgc actggcagaa aaaccgaata 240

aagcacatgt tgcaaccaaa ctgggtctgc attgggttgg tgaagatgag aaaaacatga 300

aagtgtttcg tgatagccgt ccggcacgta ttcgtaaaga agttgaagat agcctgcgtc 360

gtctgcgtgt tgaaaccatt gatctggaac aaattcattg gcctgatgat aaaaccccga 420

ttgatgaaag cgcacgtgaa ctgcagaaac tgcatcagga tggtaaaatt cgtgccctgg 480

gtgttagcaa ttttagtccg gaacaaatgg atatctttcg tgaagttgca ccgctggcaa 540

ccattcagcc tccgctgaac ctgtttgaac gtaccattga aaaagatatt ctgccgtatg 600

ccgaaaaaca taatgcagtt gttctggcat atggtgcact gtgtcgtggt ctgctgaccg 660

gcaaaatgaa tcgtgatacc acctttccga aagatgatct gcgtagcaat gatccgaaat 720

ttcagaaacc gaacttcgag aaatatctgg ctgcaatgga tgagtttgaa aaactggccg 780

agaaacgtgg taaaagcgtt atggcatttg cagttcgttg ggttctggat cagggtccgg 840

ttattgcact gtggggtgca cgtaaaccgg gtcaggttag cggtgttaaa gatgtttttg 900

gttggagcct gaccgacgaa gaaaaaaaag cagttgatga tattctggca cgtcatgttc 960

cgaatccgat tgatccgacc tttatggcac cgcctgcacg tgattaagaa ttc 1013

<210> 24

<211> 971

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的基因gld2

<400> 24

aagctttgat ggcctccaag acgtacactc tgaacaccgg tgccaagata cccgcggtcg 60

ggttcggcac attcgccaat gagggtgcca agggcgagac atacgcagct gttacaaagg 120

cactggacgt tggataccgc caccttgatt gcgcgtggtt ttaccacaac gaagatgagg 180

ttggtgacgc ggtacgcgat tttctcgccc gccgacccga cgtgaaacgc gaggatctct 240

tcatttgcac caaagtttgg aaccacctgc atgagccaga ggacgtcaag tggagcgcca 300

agaactcgtg cgaaaacctc aaggtcgatt acattgacct gttcctcgtc cactggccaa 360

tcgcggccga gaagaacagc gacaggagcg tcaagctggg ccccgatggc aagtatgtca 420

tcaaccaagc cctgacggaa aacccagagc caacatggcg agccatggaa gagcttgttg 480

aaagcggcct cgtcaaggca attggagtat ccaactggac gattccgggg ttgaagaagc 540

tccttcagat cgccaagatc aagccggcag tgaaccagat tgagattcac ccattcctac 600

caaacgaaga gcttgtggcg ttctgctttg agaacgggat cctgcccgaa gcctactcgc 660

cgctgggctc gcagaaccag gtcccaagca ccggcgagcg agtgcgcgac aacccgacac 720

tcaaagcggt tgccgagcga agcggctaca gccttgccca gatcctattg gcatggggcc 780

tgaagcgagg atatgtggtc ctcccaaaga gctcaactcc aagccgtatt gaaagcaact 840

tcaacattcc ggagctgagt gatgaagact ttgaggcgat tcaacaggtt gctaagggga 900

gacatactag atttgtcaac atgaaggaca cgtttggata caacgtttgg ccagaggagg 960

aataagaatt c 971

<210> 25

<211> 1103

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的基因adh1

<400> 25

aagctttgac tagtatgaaa ggacttgcta tgcttggaat tggaagaatt ggatggattg 60

aaaagaaaat cccagaatgt ggaccacttg atgcattagt tagaccatta gcacttgcac 120

catgtacatc agatacacat accgtttggg caggagctat tggagataga catgatatga 180

ttcttggaca tgaagcggtt ggacaaattg ttaaagttgg atcattagtt aagagattaa 240

aagttggaga taaagttatt gtaccagcta ttacaccaga ttggggagaa gaagaatcgc 300

aaagaggata tccaatgcat tcaggaggaa tgcttggagg atggaaattc tcaaatttca 360

aggatggagt tttttcagaa gttttccatg ttaatgaagc agatgccaat cttgcacttc 420

ttccaagaga tattaaacca gaagatgcag ttatgttatc agatatggta actactggat 480

tccatggagc agaattagct aatattaaac ttggagatac tgtttgtgtt attggtattg 540

gaccagttgg attaatgtca gttgcaggag caaaccatct tggagcagga agaatctttg 600

cagtaggatc aagaaaacat tgttgtgata ttgcattgga atatggagca acagatatta 660

ttaattataa aaatggagat attgtagaac aaattcttaa agctacagac ggcaaaggag 720

ttgataaagt cgttattgca ggaggtgatg ttcatacatt tgcacaagca gtcaaaatga 780

ttaaaccagg atcagatatt ggaaatgtta attatcttgg agaaggagat aatattgata 840

ttccaagaag tgaatgggga gttggaatgg gtcataaaca cattcatgga ggtttaaccc 900

caggtggaag agtcagaatg gaaaaattag catcacttat ttcaactggt aaattagata 960

cttctaaact tattacacat agatttgaag gattagaaaa agttgaagat gcattaatgt 1020

taatgaagaa taaaccagca gaccttatca aaccagttgt cagaattcat tatgatgatg 1080

aagatactct tcattaactc gag 1103

<210> 26

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于yqhDE的寡核苷酸

<400> 26

atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60

ggtttacgcg aacaaattcc gtgtaggctg gagctgcttc g 101

<210> 27

<211> 99

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<213> 人工

<220>

<223> 用于yqhDE的寡核苷酸

<400> 27

ttagccgccg aactggtcag gatcgggacc gagacgcttg ccctgatcga gttttgcaat 60

ttcgccgagt tcgtctttgc atatgaatat cctccttag 99

Claims

1.用于在发酵过程中产生1,2-丙二醇的方法，其包括步骤：

- 培养基因修饰的大肠杆菌（Escherichia coli）微生物用于在适当的培养基中产生1,2-丙二醇，所述培养基包含糖作为碳源，和

- 从所述培养基回收1,2-丙二醇，

其中在所述基因修饰的微生物中，来自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的编码NADPH依赖型丙酮醇还原酶的adh基因是过表达的。

2.权利要求1的方法，其中所述微生物进一步包含内源性的编码NADH依赖型甘油脱氢酶的gldA基因的缺失。

3.权利要求1或权利要求2的方法，其中，进一步地，NADPH的利用度通过至少一种下述基因修饰在所述微生物中增加：

- 过表达编码烟酰胺核苷酸转氢酶的pntAB基因操纵子，

- 减弱编码磷酸葡糖异构酶的pgi基因，

- 减弱编码磷酸果糖激酶的pfkA基因，

- 过表达编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，

- 过表达编码ADP-依赖型脱水酶的yjeF基因，

- 过表达编码NADP-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gapN基因。

4.权利要求1或2的方法，其中所述微生物进一步包含编码丙酮醛还原酶的yqhD基因的缺失。

5.权利要求1或2的方法，其中所述微生物进一步包含质粒pUR400的基因scrK、scrYAB及scrR。

6.权利要求1或2的方法，其中所述糖类选自下组：葡萄糖或蔗糖。

7.一种经基因修饰用于从作为碳源的糖产生1,2-丙二醇的大肠杆菌微生物，其中在所述微生物中，来自拜氏梭菌的编码NADPH依赖型丙酮醇还原酶的adh基因过表达。

8.权利要求7的微生物，其中所述微生物进一步包含内源性的编码NADH依赖型甘油脱氢酶的gldA基因的缺失。

9.权利要求7或权利要求8的微生物，其进一步包含至少一种下述基因修饰：

- 缺失编码醛还原酶的yqhD基因，

- 缺失编码磷酸葡糖异构酶的pgi基因，

- 缺失编码磷酸果糖激酶的pfkA基因，

- 过表达编码烟酰胺核苷酸转氢酶的pntAB基因，

- 过表达编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，

- 过表达编码ADP-依赖型脱水酶的yjeF基因，

- 过表达编码NADP-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gapN基因。

10.权利要求7或8的微生物，其中所述微生物进一步包含质粒pUR400的基因scrK、scrYAB及scrR。