KR101447579B1 - 미생물을 이용한 ｄ-카이로 이노시톨의 생산 방법 - Google Patents

미생물을 이용한 ｄ-카이로 이노시톨의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상기 효소 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 형질전환 숙주세포를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면 높은 수율로 마이오-이노시톨을 D-카이로-이노시톨로 전환시킬 수 있다.

Description

미생물을 이용한 Ｄ-카이로 이노시톨의 생산 방법{Method for Preparing Ｄ- Chiro-Inositol by Using the Microorganism}
본 발명은 미생물을 이용한 Ｄ-카이로 이노시톨의 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 형질전환 미생물 숙주세포에 의한 마이오-이노시톨로부터 D-카이로 이노시톨로의 생산 방법에 관한 것이다.
D-카이로-이노시톨(D-chiro-inositol, cis-1,2,4-trans-3,5,6-cyclohexol)은 마이오-이노시톨(myo-inositol, cis-1,2,3,5-trans-4,6-cyclohexanehexol)의 스테레오이소머로서 3번 하이드록실 그룹이 에피머화 된 형태이다(도 1). D-카이로-이노시톨은 이노시톨 포스포글리칸(IPG)의 주요 구성성분으로 인슐린 신호전달의 중요한 매개체로 보고되어 있으며, 제2형 당뇨의 치료에 효과가 있다고 알려져 있다. D-카이로-이노시톨은 주로 진핵생물에서 발견되며, 마이오-이노시톨의 에피머화에 의해 생합성된다.
D-카이로-이노시톨은 주로 피니톨(D-pinitol)이나 카스가마이신(kasugamycin)의 염산 가수분해에 의해 생산하고 있다(U.S. Pat No. 5827896, U.S. Pat No. 5091596, U.S. Pat No. 5463142, U.S. Pat No.5714643). 그러나, 원료인 피니톨이나 카스가마이신이 고가이며, 유기합성법(U.S. Pat No. 5406005, WO 96/25381)도 알려져 있으나, 부산물의 분리가 용이하지 않아 경제성이 낮다.
Yamamoto 등은 Agrobacterium sp. AB10121의 MI 에피머라제(epimerase)를 발현시킨 세균을 이용하여 마이오-이노시톨로부터 카이로-이노시톨로 전환하는 방법을 제시하였다(JP2001-006878, WO2002/055715). Yamamoto 등에 의한 방법은 마이오-이노시톨로부터 약 15％ 수율로 D-카이로-이노시톨을 생산할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
JP 2001-006878, WO 2002/055715
본 발명자들은 미생물을 이용하여 마이오-이노시톨로부터 카이로-이노시톨을 생산하고자 연구 노력하였으며, 그 결과, 마이오-이노시톨 트랜스포터 (myo-inositol transporter), 이노시톨 디하이드로게나아제(inositol dehydrogenase) 및 이노시톨 이소머라아제(inositol isomerase) 코딩 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 이용하면 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 높은 수율로 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 형질전환 숙주세포를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 형질전환 숙주세포를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 숙주세포를 포함하는 D-카이로-이노시톨 생산용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 서열을 갖는 재조합 벡터를 포함하는 D-카이로-이노시톨 생산용 키트를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이오-이노시톨(myo-inositol)로부터 D-카이로-이노시톨(D-chiro-inositol)을 생산하는 방법을 제공한다: (a) (i) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시톨 트랜스포터(myo-inositol transporter) 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터; (ⅱ) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시톨 디하이드로게나아제(inositol dehydrogenase) 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제(inosose isomerase) 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환된 숙주세포를 얻는 단계; 및 (b) 상기 형질전환된 숙주세포를 마이오-이노시톨을 포함하는 배지에서 배양하는 단계.
이하에서 본 발명을 각 단계에 따라 보다 상세하게 설명한다.
단계 (a): 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환된 숙주세포를 얻는 단계.
본 명세서에서 용어 "마이오-이노시톨 트랜스포터(myo-inositol transporter)"는 마이오-이노시톨을 세포내로 이동시키는 수송효소를 의미한다. 대부분의 세포는 배지내의 이노시톨을 세포내로 흡수하는 이노시톨 수송 시스템을 갖고 있으며, 마이오-이노시톨 트랜스포터는 포유동물 세포에서부터 박테리아에 이르기 까지 다양한 세포에서 확인되어 있다. 에어로박터 에어로게네스(Aerobacter aerogenes) [Deshusses, J., and Reber, G., 1972, Biochim. Biophys. Acta 274, Bacteriol. 126, 243-250], 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) [Reber, G., Belet, M., and Deshusses, J., 1977, J. Bacterol. 131, 872-875], 슈도모나스(Pseudomonas) 종 [Gauchat-Feiss, D., Frey, J., Belet, M., and Deshusses, J., 1985, J. Bacteriol. 162, 324-327]와 같은 박테리아에서 마이오-이노시톨 트랜스포터 유전자가 분리되었다고 보고 되었으며, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) (Nikawa, J., Nagumo, T., and Yamashita, S. (1982) J. Bacteriol. 150, 441-446)와 같은 효모에서도 마이오-이노시톨 트랜스포터 유전자가 분리되어 보고되었다. 또한, 마이오-이노시톨 트랜스포터는 주타입(major)과 부타입(minor)이 존재하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 마이오-이노시톨 트랜스포터는 포유동물 세포, 효모세포 또는 박테리아로부터 유래된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 박테리아 유래 트랜스포터를 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium) 또는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 로부터 분리된 것을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium) 유래의 트랜스포터를 사용한다.
바람직하게는 본 발명의 마이오-이노시톨 트랜스포터는 서열번호 1 내지 서열번호 6에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 트랜스포터를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "이노시톨 디하이드로게나아제"은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이 마이오-이노시톨을 NAD 의존성 산화작용에 의해 2-케토-마이오-이노시톨(2-keto-myo-inositol)로 변환시키는 화학반응 또는 이의 역방향 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소이다. 본 명세서에서 "이노시톨 디하이드로게나아제"는 이를 코딩하는 유전자 명칭 "iolG"으로도 기재한다.
[반응식 1]
마이오-이노시톨 + NAD+ <------> 2-케토-마이오-이노시톨 + NADH + H+
이노시톨 디하이드로게나아제는 에어로박터 에어로게네스(Aerobacter aerogenes) [Berman T, Magasanik B (1966). J. Biol. Chem. 241 (4): 800-806; LARNER J, JACKSON WT, GRAVES DJ, STAMER JR (1956). Arch. Biochem. Biophys. 60 (2): 352-363)과 효모 크립토코커스 멜리비오숨(Cryptococcus melibiosum)[Vidal-Leiria M, van Uden N (1973). Biochim. Biophys. Acta. 293 (2): 295-303]에서 분리되었다고 보고 되어 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 이노시톨 디하이드로게나아제는 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 클루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananantis)로 부터 분리된 것이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 이노시톨 디하이드로게나아제는 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29 및 서열번호 31에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "이노소스 이소머라아제"는 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 2-케토-마이오-이노시톨을 1-케토-D-카이로-이노시톨(1-keto-D-chiro-inositol)로 전환하는 이성질체화 반응 또는 이의 역방향 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소이다. 본 명세서에서 "이노소스 이소머라아제"는 이를 코딩하는 유전자 명칭 "iolI"으로도 기재한다.
[반응식 2]
2-케토-마이오-이노시톨 <------> 1-케토-D-카이로-이노시톨
본 발명에서 사용할 수 있는 이노소스 이소머라아제는 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 클루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananantis)로 부터 분리된 것이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 이노소스 이소머라아제는 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28 및 서열번호 30에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
상기 반응식 2에 의해 생성된 1-케토-D-카이로-이노시톨은 하기 반응식 3에 의해 본 발명에서의 최종산물인 D-카이로-이노시톨을 생성한다. 하기 반응식 3의 반응은 앞서 설명된 효소인"이노시톨 디하이드로게나아제"가 촉매한다.
[반응식 3]
1-케토-D-카이로-이노시톨 + NADH + H+ <------> D-카이로-이노시톨 + NAD+
본 발명에서 마이오-이노시톨은 숙주세포내에서 반응식 1 내지 반응식 3의 연속반응에 의해 D-카이로-이노시톨로 전환되며, 설명된 바와 같이 반응식 1 및 반응식 3의 반응은 "이노시톨 디하이드로게나아제"가 촉매하며, 반응식 2의 반응은 "이노소스 이소머라아제"가 촉매한다.
본 발명에서 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제, 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 서열은 재조합 벡터내에서 프로모터에 작동적으로 결합되어 있다.
본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 DNA 서열의 발현조절 서열과 기능적으로 결합되어 있다는 의미로서, 기능적 결합에 의해 DNA 서열의 발현이 발현조절 서열에 의해 조절된다.
본 명세서에서 용어 "프로모터"는 유전자 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다.
본 발명에서의 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al.의 "Molecular Cloning, A Laboratory Manual"(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 재조합 벡터는 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있으며, 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)가 이용되는 경우, 대장균(E. coli) 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 항생제 내성 유전자는 이의 발현을 위한 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4ㅇλB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 벡터는 바람직하게는 원핵세포용 벡터이며, 원핵 숙주세포, 특히 대장균(E. coli)에서 복제가 가능하도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 벡터는 colA, colE1 또는 p15A의 박테리아의 복제 원점 또는 f1 origin과 같은 박테리오파아지의 복제 원점을 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다. 예를 들어, 포유동물세포, 곤충세포, 효모와 같은 진핵세포 또는 원핵세포를 들 수 있으나, 바람직하게는 원핵세포를 사용한다. 원핵세포로서는 예컨대, 대장균인 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스, 코리네박테리움 글루타미쿰 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic.Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.
단계 (b): 상기 형질전환된 숙주세포를 마이오-이노시톨을 포함하는 배지에서 배양하는 단계
상기 형질전환 숙주세포가 배양되는 동안, 재조합 발현벡터 내의 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제가 발현되고, 배양액내의 마이오-이노시톨이 세포내로 흡수되어 상기 효소들의 촉매 작용에 의해 D-카이로 이노시톨로 전환된다.
형질전환된 숙주세포의 배양은 공지된 숙주세포 배양 방법 또는 이를 변형한 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 숙주세포가 대장균(E.coli)인 경우 형질전환 숙주세포의 배양을 위한 배지는 대장균이 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 포함한다면 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올, 글리세롤과 같은 알코올 등을 포함한다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄, 암모늄설페이트, 암모늄아세테이트 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄염; 펩톤, 육추출물(meat extract), 이스트추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두추출물, 대두가수분해물; 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함한다. 무기염은 포타슘디하이드로젠 포스페이트, 다이포타슘하이드로젠 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 소디엄 클로라이드, 망간 설페이트, 구리 설페이트, 칼슘 카보네이트 등을 포함한다.
배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 방법은 상기 단계 (b) 이후에, 상기 형질전환 숙주세포를 배양한 배양물로부터 D-카이로-이노시톨을 분리하는 단계 (c)를 더 포함한다.
단계 (c) : 상기 숙주세포를 배양한 배양액으로부터 D-카이로-이노시톨을 분리하는 단계
형질전환된 숙주세포를 배양한 배양액으로부터 D-카이로-이노시톨의 분리는 탄수화물(carbohydrate) 또는 당(sugar)을 분리 및 정제하는 공지된 방법 및 이의 변형된 방법을 이용하여 행한다.
D-카이로-이노시톨이 배지 상에 용해된 상태로 존재하는 경우, 배지로부터 배양된 형질전환체를 제거한다. 예를 들어, 배양한 형질전환 체는 원심분리 또는 마이크로여과(microfiltration) 방법 등에 의해 배양액으로부터 제거하여 배양 상층액만을 얻는다. 배양 상층액으로부터 D-카이로-이노시톨을 얻는 방법은 종래의 공지된 당의 분리 정제 방법 및 이를 변형한 방법을 이용할 수 있다.
종래 공지된 당의 분리 정제방법으로는, 제올라이트 분자체를 이용한 선택적 흡착 방법에 의한 분리방법(미국특허 제 4,482,761호), 양이온교환수지를 이용한 컬럼크로마토그래피에 의한 분리방법(미국특허 제 5,096,594호), 음이온 교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의한 분리방법(미국특허 제 5,482,631호), 활성탄에 의한 흡착 및 유기용매에 의한 용출 방법(대한민국특허 제10-0753982호), 동결건조 및 재결정화 방법 등이 있으며, 이러한 방법을 이용하거나 이 방법의 변형된 방법 및 이 방법들을 조합하여 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시톨 트랜스포터 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터; 및 (ⅱ) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시톨 디하이드로게나아제 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 형질전환 숙주세포를 포함하는 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하기 위한 용도의 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시톨 트랜스포터 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터; 및 (ⅱ) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시톨 디하이드로게나아제 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨의 생산용 재조합 벡터 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태인 숙주세포, 이를 포함하는 조성물 및 재조합 벡터를 포함하는 키트에서, 상기 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제; 이를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; 이 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 내용은 상술된 본 발명의 일 양태의 내용과 동일하므로, 중복하여 설명하지 않는다.
본 발명은 상기 효소 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 형질전환 숙주세포를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면 마이오-이노시톨을 D-카이로-이노시톨로 전환시킬 수 있다.
도 1은 마이오-이노시톨(myo-inositol)과 D-카이로-이노시톨(D-chiro-inositol)의 화학 구조를 보여준다.
도 2는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨 및 이들의 입체이성질체 또는 유도체들에 관한 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 3은 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 대장균에, 다양한 기원의 이노시톨 트랜스포터를 추가로 도입하여 얻은 형질전환 대장균에서 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨 전환율 및 균체 성장율을 측정한 결과를 보여준다. 각 이노시톨 트랜스포터에 대한 시험군은 트랜스포터 발현 벡터를 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf를 함께 도입하여 제조한 재조합 대장균을 24시간 및 48시간 배양한 결과이다. 흰색 막대는 24시간 배양후 측정한 값을 나타내고, 회색 막대는 48시간 배양후 측정한 값을 나타낸다.
도 4는 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제(iolG)의 상동성 분석에 의한 계통도(phylogenetic tree)를 보여준다.
도 5는 이노소스 이소머라아제(iolI)의 상동성 분석에 의한 계통도(phylogenetic tree)를 보여준다.
도 6a 내지 도 6c는 배양 온도에 따른 본 발명의 형질전환 대장균의 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨로의 전환율을 측정한 결과를 보여준다. 각각의 심볼에 대한 실험군은 다음과 같다. 도 6a에서 ●: 30℃, ○:37℃, 도 6b에서 30℃ 일 경우 ○: 균체성장, ●: pH, ▲: 남은 글리세롤의 양, 도 6c에서 37℃ 일 경우 ○: 균체성장, ●: pH, ▲: 남은 글리세롤의 양이다.
도 7은 본 발명의 형질전환 대장균의 배양시 유도(induction) 시기에 따른 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨로의 전환율을 측정한 결과를 보여준다. 각각의 심볼에 대한 실험군은 다음과 같다. ■: 유도하지 않음(No induction), ○: 0시간에서 유도(induction), ▲: OD 0.6에서 유도(induction), ▽: OD 3에서 유도(induction), ◆: OD 10에서 유도(induction).
도 8은 본 발명의 형질전환 대장균의 배양시 유도제 종류에 따른 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨로의 전환율을 측정한 결과를 보여준다. 각각의 심볼에 대한 실험군은 다음과 같다. ■: OD 0.6에서 1 mM IPTG 첨가, ○: 0시간에 0.5％ 락토스(lactose) 첨가, ▲: OD 0.6에서 0.5％ 락토스(lactose) 첨가, ▽: OD 7에서 0.5％ 락토스(lactose) 첨가, ◆: OD 0.6에서 0.1％ 락토스(lactose) 첨가.
도 9는 다양한 균주 유래의 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라제 유전자, 또는 이들의 조합을 도입한 재조합 균주의 D-카이로-이노시톨 생산율(패널 A), 균체 성장(패널 B), 및 생산속도에 대한 기울기(패널C)를 측정한 결과를 보여준다. 형질전환 대장균에 이노시톨 트랜스포터 발현 재조합 플라스미드 벡터 pACYCD-StiolT1-StiolT2를 함께 도입하여 실험을 수행하였다. 각각의 심볼에 대한 실험군은 다음과 같다. ■: pCOLAD-Cgiep-PaiolI, ○: pCOLAD-sAtiep-sAtiepf, ▲: pCOLAD-AGRL628-AGRL627, ▽: pCOLAD-BsiolG-BsiolI, ◆: pCOLAD-CgiolG-CgiolI0169, ▷: pCOLAD-Paidh-PaiolI.
도 10은 본 발명에서 선별된 형질전환 대장균을 이용하여 최적의 배양조건에서 1 리터 발효를 행하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨로의 생산을 확인한 실험 결과이다.
도 11은 본 발명의 균주에 의해 생산된 D-카이로-이노시톨 분획물의 GC-MS 분석 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 마이오-이노시톨 트랜스포터 유전자의 클로닝 및 트랜스포터를 포함하는 재조합 벡터의 제작
마이오-이노시톨을 탄소원으로 사용한다고 보고된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주로부터 마이오-이노시톨 트랜스포터(myo-inositol transporter)의 주타입(major) 및 부타입(minor) 유전자를 각각 클로닝하였다.
바실러스 서브틸리스(B. subtilis)의 경우 마이오-이노시톨 트랜스포터 유전자는 iolT 유전자와 iolF 유전자이며, 살모넬라 티피무리엄(S. typhimurium)의 경우 iolT1 유전자와 iolT2 유전자이며, 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens)에서는 Atu5935 유전자와 Atu2525 유전자이다. 이상의 유전자에 대한 정보는 표 1과 같다.
Figure 112012078453598-pat00001
1-1. 재조합 벡터 pACYCD-BsiolT(F2) 및 pACYCD-BsiolT-BsiolF(F2)의 제조
바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 균주의 경우, Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 (taxid:224308; GenBank NID: NC_000964, ATCC23857)의 지놈 DNA로부터 주타입 트랜스포터 iolT 및 부타입 트랜스포터 iolF를 pACYCDuet-1 발현벡터에 도입하여 pACYCD-BsiolT(F2)와 pACYCD-BsiolT-BsiolF(F2)를 구축하였다. 구체적으로 설명하면, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)의 지놈 DNA로부터 프라이머 BsiolT-F2와 BsiolT-R을 이용하여 iolT를 증폭한 후 제한효소 SacI과 BamHI으로 절단하여 벡터 pACYCDuet-1 (Novagen)의 동일 부위에 삽입하여 pACYCD-BsiolT(F2)를 제작하였다. 또한, 프라이머 BsiolF-F와 BsiolF-R을 이용하여 iolF를 증폭한 후 제한효소 NdeI과 SalI으로 절단하여 상기 제작한 pACYCD-BsiolT(F2)의 NdeI과 XhoI 부위로 삽입하여 pACYCD-BsiolT-BsiolF(F2)를 제작하였다.
1-2. 재조합 벡터 pACYCD-StiolT1(F2) 및 pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)의 제조
살모넬라 티피무리엄(S. typhimurium) 균주의 경우, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2 ATCC700720 (taxid:99287; GenBank NID: NC_006511, ATCC700720)으로부터 주타입 트랜스포터로 알려진 iolT1 및 부타입 트랜스포터로 알려진 iolT2를 증폭하여 pACYCDuet-1 발현벡터에 도입하여, pACYCD-StiolT1(F2)와 pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)를 구축하였다. 구체적으로 설명하면, 살모넬라 티피무리엄(S. typhimurium)의 지놈 DNA로부터 프라이머 StiolT1-F2 및 StiolT1-R을 이용하여 iolT1을 증폭한 후 제한효소 NcoI과 BamHI으로 절단하여 pACYCDuet-1벡터의 동일 부위에 삽입하여 pACYCD-StiolT1(F2)를 제작하였다. 또한, 프라이머 StiolT2-F와 StiolT2-R을 이용하여 iolT2를 증폭한 후 제한효소 NdeI과 SalI으로 절단하여 상기 제작한 벡터 pACYCD-StiolT1(F2)의 NdeI과 XhoI 부위로 삽입하여 pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)를 제작하였다.
1-3. 재조합 벡터 pACYCD-Atu5935(F2) 및 pACYCD-Atu5935-Atu2525(F2)의 제조
아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens)의 경우, Agrobacterium tumefaciens str. C58 (taxid:176299; GenBank NID: NC_003062, ATCC33970)의 지놈 DNA로부터 프라이머 Atu5935-F2와 Atu5935-R을 이용하여 Atu5935를 증폭한 후 제한효소 NcoI과 BamHI으로 절단하여 pACYCDuet-1벡터의 동일 부위에 삽입하여 pACYCD-Atu5935(F2)를 제작하였다. 또한, 프라이머 Atu2525-F와 Atu2525-R을 이용하여 Atu2525를 증폭한 후 제한효소 NdeI과 SalI으로 절단하여 상기 제작한 pACYCD-Atu2525(F2)의 NdeI과 XhoI 부위로 삽입하여 pACYCD-Atu5935-Atu2525(F2)를 제작하였다.
1-4. 재조합 벡터 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf의 제조
상기 클로닝한 마이오-이노시톨 트랜스포터의 활성을 평가하기 위해, 마이오-이노시톨을 D-카이로-이노시톨로 전환하는 이노시톨 디하이드로게나아제(inositol dehydrogenase) 유전자 (iolG) 및 이노소스 이소머라아제(inosose isomerase) 유전자 (iolI)를 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens)로부터 클로닝하여, 이들을 벡터 pCOLADuet-1(Novagen)에 도입하여 재조합 플라스미드 벡터 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf를 제작하였다. 보다 상세히 설명하면, Agrobacterium sp. AB10121(WO 02/055715A)의 BD171257_CDS1과 CDS2의 아미노산 서열을 토대로 DNA 합성[GenScript Inc., 860 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854, USA]을 행하여, 합성한 DNA 분자 sAtiep(서열번호 50)와 합성한 DNA 분자 sAtiepf(서열번호 51)를 각각 제작하였다. 상기 합성한 DNA 분자 sAtiep을 주형으로 프라이머 sAtiep-TF와 sAtiep-TR을 사용하여 PCR 증폭한 후 제한효소 BspHI과 SacI으로 절단하고, 이를 pCOLADuet-1의 동일 제한효소 부위로 삽입하여 pCOLAD-sAtiep를 제작하였다. 이어서, 상기 합성한 DNA 분자 sAtiepf을 NdeI과 SalI으로 절단하고, 이를 상기 제작한 벡터 pCOLAD-sAtiep의 NdeI과 XhoI 부위로 삽입하여 최종적으로 재조합 벡터 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf를 제작하였다.
상기 재조합 벡터의 제작에 사용한 프라이머는 표 2에 정리하였으며, 제작한 재조합 벡터 및 이와 관련된 서열 정보는 표3에 정리하였다.
Figure 112012078453598-pat00002
Figure 112012078453598-pat00003
실시예 2: 마이오-이노시톨 트랜스포터의 활성 평가
상기 실시예 1에서 제작된 것으로서, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 살모넬라 티피무리엄(S. typhimurium), 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens) 유래의 마이오-이노시톨 트랜스포터를 함유하는 각각의 재조합 플라스미드, pACYCD-BsiolT(F2), pACYCD-BsiolT-BsiolF(F2), pACYCD-StiolT1(F2), pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2), pACYCD-Atu5935(F2), pACYCD-Atu5935-Atu2525(F2)을, 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨로로 전환시키는 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제 코딩 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf와 함께, 대장균(E. coli) BL21(DE3)에 형질전환 하여 형질전환 균주를 제작하였다.
제작한 재조합 형질전환 균주는 직경 25 mm, 높이 150 mm의 유리시험관에서 5 mL 배양하였다. 배양조건은 1％(w/v) 마이오-이노시톨, 50 mg/L 클로람페니콜, 50 mg/L 카나마이신을 함유한 M9 최소배지를 이용하여, 30℃, 250 rpm의 조건에서 균체가 OD 0.6에 도달하였을때 1 mM IPTG를 첨가하여 유도(induction)한 후 48시간 동안 배양하였다. 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨 분석을 위하여 배양액을 원심분리하여 배양 상층액 1 mL을 취하고 10분간 끓인 후 다시 원심분리하여 상층액 500 μL를 취하였다. 전처리한 배양상층액은 HPLC(Shimadzu LC10Avp)로 분석하였으며, 분석조건은 Kromasil 5NH2 칼럼(4.6 mm X 250 mm), 이동상 75％ 아세토니트릴, 칼럼 온도 40℃, RI 검출기를 이용하였다. 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨과 이들의 이성질체에 대한 HPLC 크로마토그램을 도 2에 나타내었다.
각 마이오-이노시톨 트랜스포터의 활성을 측정한 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3의 결과에 의하면, pACYCDuet-1에 살모넬라 티피무리엄(S. typhimurium) 유래의 주타입과 부타입의 트랜스포터 StiolT1과 StiolT2을 모두 함유한 pACYCD-StiolT1-StiolT2의 경우에서 D-카이로-이노시톨의 전환율이 가장 우수하였으며, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)와 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens) 유래의 마이오-이노시톨 트랜스포터에서는 D-카이로-이노시톨의 전환율이 매우 낮았다. 전환율이 가장 우수한 살모넬라 티피무리엄의 트랜스포터의 경우 10g/L 마이오-이노시톨로부터 24시간에 약 1.2 g/L의 D-카이로-이노시톨이 전환되었으며, 48시간에는 약 1.1g의 D-카이로-이노시톨이 전환되어 24시간 이후 전환율이 증가하지 않는 것으로 나타났다. 균체성장은 유전자를 도입했을 경우 약간 저해되는 양상을 보였으며, 이는 트랜스포터 단백질의 특성상 세포막에 위치하므로 과발현시 독성을 나타내는 것으로 보인다.
실시예 3 : 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제 유전자의 클로닝 및 이를 포함하는 재조합 벡터의 제작
하기 반응식 1 내지 반응식 3의 연속적 반응을 통해 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨이 전환된다. 반응식 1 및 반응식 3의 반응은 이노시톨 디하이드로게나아제(inositol dehydrogenase)에 의해 촉매되고, 반응식 2의 반응은 이노소스 이소머라아제(inosose isomerase)에 의해 촉매된다.
[반응식 1]
마이오-이노시톨 + NAD+ <------> 2-케토-마이오-이노시톨 + NADH + H+
[반응식 2]
2-케토-마이오-이노시톨 <------> 1-케토-D-카이로-이노시톨
[반응식 3]
1-케토-D-카이로-이노시톨 + NADH + H+ <------> D-카이로-이노시톨 + NAD+
이노시톨 디하이드로게나아제 유전자 (iolG) 및 이노소스 이소머라아제 유전자 (iolI)와 동등한 기능을 갖는 유전자를 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)으로부터 클로닝하였다. 상기 균주들의 지놈 DNA로부터 iolG 유전자 및 iolI 유전자에 대응하는 유전자들을 증폭하고, 증폭한 iolG 및 iolI 유전자들의 쌍 및 조합을 pCOLADuet-1 발현벡터(Novagen)에 삽입하여 6 종류의 재조합 플라스미드를 제작하였다. 상기 열거한 iolG와 iolI 상동 유전자들의 정보는 하기 표 4에 나타내었다.
Figure 112012078453598-pat00004
3-1. 재조합 벡터 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf의 제조
Agrobacterium sp. AB10121 균주(WO 02/055715A)로부터의 iolG 및 iolI 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf의 제조방법은 상기 실시예 1에서 설명하였다.
3-2. 재조합 벡터 pCOLAD-AGRL628-AGRL627의 제조
아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens) 유래 iolG와 iolI 유전자를 포함한 재조합 벡터는 다음의 방법을 통해 제작하였다. Agrobacterium tumefaciens str. C58(taxid:176299; GenBank NID: NC_003062, ATCC33970)의 지놈 DNA로부터 프라이머 AGRL628-F와 AGRL628-R을 이용하여 iolG에 해당하는 AGRL628 유전자를 증폭하였고, 이것을 제한효소 PciI과 SacI으로 절단하여 pCOLADuet-1(Novagen)의 NcoI과 SacI 부위에 도입하여 pCOLAD-AGRL628을 제작하였다. 또한, AGRL627-F와 AGRL627-R 프라이머를 이용하여 iolI에 해당하는 AGRL_627을 증폭하고 이를 제한효소 NdeI과 SalI으로 절단하여 pCOLAD-AGRL628의 NdeI과 XhoI 부위에 삽입하여 pCOLAD-AGRL628-AGRL627 재조합 벡터를 제작하였다.
3-3. 재조합 벡터 pCOLAD-BsiolG-BsiolI의 제조
바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 유래 iolG와 iolI 유전자를 포함한 재조합 벡터는 다음의 방법을 통해 제작하였다. Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 (taxid:224308; GenBank NID: NC_000964, ATCC23857)의 지놈 DNA로부터 BsiolG-F 및 BsiolG-R 프라이머를 이용하여 iolG에 해당하는 BsiolG를 증폭한 후, 제한효소 PciI과 NotI으로 절단하여 pCOLADuet-1의 NcoI과 NotI 부위로 삽입하여 pCOLAD-BsiolG를 제작하였다. 또한, BsiolI-F와 BsiolI-R 프라이머를 이용하여 iolI에 해당하는 BsiolI를 증폭하고 이를 제한효소 NdeI과 PacI으로 처리하여 앞서 구축한 플라스미드 pCOLAD-BsiolG의 동일 제한효소 부위로 삽입하여 pCOLAD-BsiolG-BsiolI를 제작하였다.
3-4. 재조합 벡터 pCOLAD-CgiolG-CgiolI0169의 제조
코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 유래 iolG와 iolI 유전자를 포함한 재조합 벡터는 하기 방법을 통해 제작하였다. Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (taxid:196627; GenBank NID:NC_003450, ATCC13032)의 지놈 DNA로부터 CgiolG-F와 CgiolG-R 프라이머를 이용하여 iolG에 해당하는 CgiolG를 증폭한 후 제한효소 BspHI과 NotI으로 절단하여 pCOLADuet-1의 NcoI과 NotI 부위로 삽입하여 pCOLAD-CgiolG를 제작하였다. 또한, CgiolI0169-F와 CgiolI0169-R 프라이머를 이용하여 iolI에 해당하는 CgiolI0169를 증폭하고 이를 NdeI과 PacI으로 처리하여 앞서 구축한 pCOLAD-CgiolG의 동일한 제한효소 부위로 삽입하여 pCOLAD-CgiolG-CgiolI0169 벡터를 제조하였다.
3-5. 재조합 벡터 pCOLAD-Paidh-PaiolI의 제조
판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래 iolG와 iolI 유전자를 포함한 재조합 벡터는 하기 방법을 통해 제작하였다. Pantoea ananatis LMG 20103 (taxid:706191, GenBank NID:NC_013956, KCCM40419)의 지놈 DNA 로부터 Paidh-F와 Paidh-R 프라이머를 이용하여 iolG에 해당하는 Paidh를 증폭한 후, 제한효소 PciI과 NotI으로 절단하여 pCOLADuet-1의 NcoI과 NotI 부위로 삽입하여 pCOLAD-Paidh를 제작하였다. 또한, PaiolI-F와 PaiolI-R 프라이머를 이용하여 iolI에 해당하는 PaiolI를 증폭하고 이를 NdeI과 PacI으로 처리한 후, 상기 제작한 벡터 pCOLAD-Paidh의 동일한 제한효소 부위로 삽입하여 pCOLAD-Paidh-PaiolI를 제작하였다.
3-6. 재조합 벡터 pCOLAD-Cgiep-PaiolI의 제조
서로 다른 균주에서 유래한 iolG 유전자 및 iolI 유전자를 조합한 재조합 벡터를 제조하기 위해, 먼저 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 지놈상에 iolG 유전자인 BD171257_CDS 1(GI:27877069)과 상동성이 낮으면서 기능이 보고되지 않은 iolG 상동 유전자 Cgiep (NCgl2957 또는 GI:19554252)를 클로닝 하였다. 또한, iolI 해당 유전자의 경우, 역시 iolI 유전자인 BD171257_CDS 2(GI:27877069)와 상동성이 낮으면서 기능이 보고되지 않은 판토에아 아나나티스(P. ananatis) 유래 iolI인 PaiolI를 조합에 사용하였다. 보다 상세히 설명하면, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (taxid:196627; GenBank NID:NC_003450, ATCC13032)의 지놈 DNA로부터 프라이머 Cgiep-F와 Cgiep-R을 이용하여 Cgiep를 증폭한 후 제한효소 BspHI과 NotI으로 처리하여 절단하고, pCOLADuet-1의 NcoI과 NotI 부위로 삽입하여 pCOLAD-Cgiep를 제작하였다. 이어서, pCOLAD-Cgiep를 NdeI과 PacI으로 처리하여 절단하고, 여기에 동일한 제한 효소로 절단한 PaiolI를 삽입하여 최종적으로 pCOLAD-Cgiep-PaiolI 벡터를 제작하였다.
상기 실시예 3에서 재조합 벡터의 제조에 사용한 프라이머는 하기 표 5에 나타내었고, 상기 제작한 재조합 벡터에 대해서는 하기 표 6에 정리하였다.
Figure 112012078453598-pat00005
Figure 112012078453598-pat00006
3-7. 클로닝한 유전자들의 상동성
클로닝한 이노시톨디하이드로게나아제(iolG) 및 이노소스 이소머라아제(iolI) 유전자들의 계통도는 도 4 및 도 5에 나타내었으며, 이들 유전자들의 상동성 분석 결과는 하기 표 7 및 표 8에 나타내었다.
Figure 112012078453598-pat00007
Figure 112012078453598-pat00008
실시예 4 : D-카이로-이노시톨 생산균주의 최적 배양조건 확립
실시예 3에서 제작한 재조합 플라스미드 중 pCOLAD-Cgiep-PaiolI를 pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)와 함께 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하여 재조합 균주의 배양 최적화를 시도하였다.
4-1. 배양 온도에 따른 D-카이로-이노시톨의 생산성 조사
300 mL의 홈이 파인(baffled) 삼각플라스크에서 50 mL 배양하였다. 배양조건은 15％(w/v) 마이오-이노시톨, 50 mg/L 클로람페니콜, 50 mg/L 카나마이신을 함유한 TB(terrific broth)를 이용하여 30℃와 37℃, 180 rpm의 조건에서 약 40시간 동안 배양하였다. 유도(induction)은 OD 0.6에서 IPTG를 1 mM 농도로 첨가하였다. 배양조건 중 첨가한 마이오-이노시톨의 농도는 해당 온도에서의 용해도(약 16-17％(w/v))에 준하여 정하였다.
마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨 분석을 위하여 배양액을 원심분리 하여 배양 상층액 1 mL을 취하고 10 분간 끓인 후 다시 원심분리하여 상층액 500 μL를 취하였다. 전처리한 배양 상층액은 HPLC(Shimadzu LC10Avp)로 분석하였으며, 분석조건은 Kromasil 5NH2 칼럼(4.6 mm X 250 mm), 이동상 75％ 아세토니트릴, 칼럼 온도 40℃, RI 검출기를 이용하였다. 이상의 결과를 도 6에 나타내었다.
TB 배지중의 탄소원 글리세롤은 30℃ 및 37℃에서 모두 약 24시간에 고갈되었으며, 균체성장도 이에 맞춰 약 24시간에 정지되었다. 탄소원이 고갈되고 균체성장이 정지된 24시간에 D-카이로-이노시톨은 30℃에서 약 12 g/L으로 생성되었고, 37℃에서 약 14 g/L로서 약 1.2배 높게 생성되었다. 균체 성장이 정지된 후에도 D-카이로-이노시톨은 계속 전환되어 37℃에서 약 28시간, 30℃에서 약 32시간에 약 19 g/L으로 증가하였다.
이러한 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨로의 전환은 반응평형이 관여한다고 알려져 있다(Yoshida et al., AEM72, 2006)). 즉, 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨간에 약 86:14의 물리화학적 반응평형이 관여하므로, 150 g/L 마이오-이노시톨에 해당하는 D-카이로-이노시톨의 양은 약 20 g/L이다. 이는 본 실시예에서도 실험적으로 확인되었다. 즉, D-카이로-이노시톨을 첨가하여 배양했을 경우 이상의 반응 평형 비율에 가깝게 마이오-이노시톨이 생성되었다(결과는 나타내지 않았음). 이러한 결과로 인해 생산된 19 g/L의 D-카이로-이노시톨 양은 150 g/L의 마이오-이노시톨을 첨가한 배양의 최대치이다. 37℃의 경우 이러한 반응평형에 도달하는 시점 역시 30℃에서 보다 약 4시간 빠른 것으로 나타났다. 결과적으로 배양 온도에 관해서는 37℃가 적합한 배양 온도인 것을 확인하였다.
4-2. 유도시기에 따른 D-카이로 이노시톨의 생산성
pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)와 pCOLAD-Cgiep-PaiolI를 도입한 대장균 BL21(DE3) 균주의 유도(induction) 시기에 따른 D-카이로-이노시톨의 생산성을 살펴보았다. 유도제인 IPTG를 첨가하지 않는 군을 음성대조구로 하여, 배양초기인 0시간, OD 0.6, OD 3, OD 10에 각각 투여하면서 37℃에서 생산성을 확인하였다. 이외의 배양조건은 상기 항목 4-1.에서와 같으며, 배양결과는 도 7에 나타내었다.
IPTG에 의한 유도(induction)를 행하지 않은 그룹과, 완전히 성장을 멈춘 후인 OD 10에서 IPTG를 첨가하여 유도한 그룹에서는 매우 저조한 D-카이로-이노시톨 생산량을 보였다. 배양시작 시에 IPTG를 투여한 그룹에서는 초기에 심각한 균체 성장저해 양상이 나타났다. OD 0.6와 OD 3 에서도 유도(induction)가 되면 곧바로 균체 성장이 저해되는 양상을 보였으며, IPTG에 의해 단백질이 발현되면서 균체 성장에 사용되어야 할 질소원, 탄소원 등이 단백질 합성에 소모되거나, 이노시톨 트랜스포터 단백질에 의한 막의 손상도 원인일 수 있다. 결과적으로 OD 0.6 또는 OD 3, 즉, 대수기 초기에 균체가 새로운 배지 환경에 어느 정도 적응하고 대수 성장을 시작할 무렵에 유도제(inducer)를 투여하는 것이 가장 바람직한 것으로 확인되었다.
4-3. 유도제의 종류에 따른 D-카이로-이노시톨 생산성 확인
pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)와 pCOLAD-Cgiep-PaiolI를 도입한 대장균 BL21(DE3) 균주의 유도제(inducer)의 종류에 따른 D-카이로-이노시톨의 생산성을 살펴보았다. 유도제인 IPTG가 세포성장을 저해하는 양상을 가지므로 이를 대체할 수 있는 락토스(lactose)를 유도제로 첨가하였다. 락토스는 첨가시기와 양을 조절하여 첨가하였으며, 0.5%(w/v) 락토스를 초기, OD 0.6, OD 7에서 첨가하거나, OD 0.6에서 0.1%를 첨가하였다. 이 외의 배양조건은 상기 항목 4-1.에서 설명된 내용과 같으며, 결과는 도 8에 나타내었다. IPTG의 경우 상기 항목 4-2.의 결과와 마찬가지로 초기 성장이 저해됨을 확인하였으며, 락토스를 첨가한 군에서는 이러한 양상이 확인되지 않았다. 락토스 0.5％를 초기에 첨가했을 경우 D-카이로-이노시톨의 생산속도가 가장 빨랐으며, OD 7에서 첨가한 경우 그만큼 D-카이로-이노시톨도 늦게 생산되기 시작하는 양상을 확인하였다. 락토스는 균체가 성장하면서 발현되는 lacZ 유전자에 의해 알로락토스(allolactose)가 형성되며 이것이 본 발명의 발현벡터의 T7 프로모터를 작동시키게 된다. 즉, 균체가 고농도의 마이오-이노시톨, 즉 높은 삼투압 환경에 적응이 되며 성장하기 시작해야만 프로모터가 작동하므로, 이러한 락토스에 의한 발현이 균체에 대한 독성을 감소시키는 것으로 보인다.
이상의 실시예 4를 통해 확립한 최적의 배양조건은 TB 배지를 사용하여 락토스를 배양배지에 미리 첨가하고 37℃에서 배양하는 것으로 정하였으며, 이 조건을 이용하여 이후 실험을 수행하였다.
실시예 5 : D-카이로-이노시톨 전환 유전자들의 활성 비교
상기 실시예 3에서 구축한 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 발현 벡터들인 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf, pCOLAD-AGRL628-AGRL627, pCOLAD-BsiolG-BsiolI, pCOLAD-CgiolG-CgiolI0169, pCOLAD-Paidh-PaiolI, pCOLAD-Cgiep-PaiolI 각각의 벡터들을, 실시예 2에서 트랜스포터 활성을 확인한 이노시톨 트랜스포터인 pACYCD-StiolT1-StiolT2 재조합 플라스미드 벡터와 함께 대장균 (E. coli) BL21 (DE3)에 도입하여 6종의 재조합 균주를 제작하였다. 제작한 재조합 균주들은 실시예 4에서 실험한 최적 발효조건을 이용하여 배양하였다. 배양의 측정 결과는 도 9에 나타내었다.
D-카이로-이노시톨의 대수적인 생산시기 (약 8시간 에서 24시간)의 생산속도(도 9의 패널 C)에서 볼 때 재조합 플라스미드 pCOLAD-AGRL628-AGRL627의 경우 0.09로서 가장 낮았으며, pCOLAD-sAtiep-sAtiepf (WO 02/055715)의 경우 0.14로서 역시 낮았다. 본 발명에서 선별한 유전자에서 마이오-이노시톨 디하이드로게나아제는 Cgiep와 이노소스 이소머라아제는 PaiolI의 조합, 즉, pCOLAD-Cgiep-PaiolI에서 기울기 0.48로서 가장 빠르게 D-카이로-이노시톨로 전환되는 것으로 나타났으며, 이 값은 가장 낮은 pCOLAD-AGRL628-AGRL627의 경우보다 약 5.3배 빠르며, 두 번째 속도를 나타낸 pCOLAD-CgiolG-CgiolI0169 (0.26)의 경우 보다도 1.8배 높았다. 40 시간 배양 후의 생산된 D-카이로-이노시톨 농도 역시 pCOLAD-Cgiep-PaiolI의 경우에서 가장 높았다. 최종 균체 성장속도는 전체적으로 약 12 시간 이전에 정지기에 들었으며, 균체 농도 역시 이상의 D-카이로-이노시톨의 생산 속도에 비례하여 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf에서 가장 낮았고, pCOLAD-Cgiep-PaiolI에서 가장 높았다. 결과적으로 pCOLAD-Cgiep-PaiolI를 도입했을 경우 150g/L의 마이오-이노시톨로부터 22.7 g/L의 D-카이로-이노시톨을 전환하였으며, 전환율은 약 15.1％였다. 전환율이 가장 낮았던 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf의 경우 약 12.5 g/L를 전환하여 전환율은 약 8.3％에 머물렀다. 상기 결과로부터 pCOLAD-Cgiep-PaiolI를 도입한 재조합 대장균주를 생산균주로 하여 발효 실험을 진행하였다.
실시예 6: 재조합 균주의 발효를 통한 생산량 증대
상기에서 수행한 배양 최적화 결과와 우수한 유전자의 선별 결과 얻어진 최적 재조합 균주를 이용하여 1 리터 발효를 수행하였다. 발효는 MARADO-PDA [(주)씨엔에스, 대전, 한국)] 3리터 발효조에 1리터 용량으로 실시하였다. 종배양(seed culture)은 2YT 배지를 이용하였으며, 본 배양은 TB배지에 15％ 마이오-이노시톨, 0.5％ 락토스를 첨가하였다. OD 3까지 배양한 종배양액 50 mL을 온도, pH, DO를 안정화시킨 발효조에 접종한후 약 20시간 동안 배양하였다. 발효온도는 37℃로 조절하고, pH는 암모니아수를 이용하여 7.0으로 조절하였으며, DO는 40％이하로 감소한 후부터 RPM을 증가시키면서 40％이상으로 유지하였다. 발효결과는 도 10에 나타내었다. 균체는 18시간에 최대 약 OD 18에 도달하였으며, D-카이로-이노시톨은 약 12시간에 평형농도인 약 20 g/L에 도달한 후 이후 증가하지 않았다.
실시예 7: 생산된 D-카이로-이노시톨의 분획 및 GC-MS 분석
미생물로부터 생산된 D-카이로-이노시톨의 분획은 HPLC(Shimadzu LC10Avp)를 이용하여 행하였다. 분석조건은 Kromasil 5NH2 프렙 칼럼 (10 mm X 250 mm), 이동상 75％ 아세토니트릴, 칼럼 온도 40℃, RI 검출기를 이용하였고, 100 ㎕의 시료를 주입하여 4 mL/분의 유속으로 흘리면서 해당 피크(peak)에 대한 용출액을 취하였다. 수집한 용출액은 진공 농축기(EYELA, 일본)를 이용하여 농축 및 건조한 후 5 mL의 증류수에 녹여 GC-MS 분석을 실시하였다.
GC-MS 분석은 Shimadzu GCMS-QP2010을 이용하였다. 분석 전처리는 1-트리메틸실릴-이미다졸(1-trimethylsylyl-imidazole)과 피리딘(pyridine)을 1:1로 혼합한 용액 1 mL에 시료 1 mg을 녹인 후, 70℃에서 30분 반응시켜 분석에 이용하였다. 분석조건은 HP-1 capillary column (30 m Length, 0.25 ㎜ ID, 0.25 ㎛ Film)을 이용하였고, Split mode injector (1:50)에 1 ㎕의 시료를 주입하여, 1 mL/분의 유속으로 분석하였다. 시료 주입 온도는 280℃, 오븐 온도는 150℃에서 2분 동안 유지한 후 20℃/분 속도로 300℃까지 상승 후 2분 유지하였다. 분석결과에 대한 MS 프로파일을 표준시료 D-카이로-이노시톨 (Sigma 468045, 미국)의 프로파일과 비교하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다. 표준시료와 비교한 결과 정확히 일치하는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Solgent Co., Ltd. <120> Method for Preparing D-Chiro-Inositol By Using the Microorganism <160> 51 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 473 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 1 Met Asn Lys Gln Gly Asn Gln Met Ser Phe Leu Arg Thr Ile Ile Leu 1 5 10 15 Val Ser Thr Phe Gly Gly Leu Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Gly Val Leu 20 25 30 Asn Gly Ala Leu Pro Tyr Met Gly Glu Pro Asp Gln Leu Asn Leu Asn 35 40 45 Ala Phe Thr Glu Gly Leu Val Thr Ser Ser Leu Leu Phe Gly Ala Ala 50 55 60 Leu Gly Ala Val Phe Gly Gly Arg Met Ser Asp Phe Asn Gly Arg Arg 65 70 75 80 Lys Asn Ile Leu Phe Leu Ala Val Ile Phe Phe Ile Ser Thr Ile Gly 85 90 95 Cys Thr Phe Ala Pro Asn Val Thr Val Met Ile Ile Ser Arg Phe Val 100 105 110 Leu Gly Ile Ala Val Gly Gly Ala Ser Val Thr Val Pro Ala Tyr Leu 115 120 125 Ala Glu Met Ser Pro Val Glu Ser Arg Gly Arg Met Val Thr Gln Asn 130 135 140 Glu Leu Met Ile Val Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Val Phe Asn Ala 145 150 155 160 Ile Leu Gly Thr Thr Met Gly Asp Asn Ser His Val Trp Arg Phe Met 165 170 175 Leu Val Ile Ala Ser Leu Pro Ala Leu Phe Leu Phe Phe Gly Met Ile 180 185 190 Arg Met Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val Ser Lys Gly Arg Lys Glu 195 200 205 Asp Ala Leu Arg Val Leu Lys Lys Ile Arg Asp Glu Lys Arg Ala Ala 210 215 220 Ala Glu Leu Gln Glu Ile Glu Phe Ala Phe Lys Lys Glu Asp Gln Leu 225 230 235 240 Glu Lys Ala Thr Phe Lys Asp Leu Ser Val Pro Trp Val Arg Arg Ile 245 250 255 Val Phe Ile Gly Leu Gly Ile Ala Ile Val Gln Gln Ile Thr Gly Val 260 265 270 Asn Ser Ile Met Tyr Tyr Gly Thr Glu Ile Leu Arg Asn Ser Gly Phe 275 280 285 Gln Thr Glu Ala Ala Leu Ile Gly Asn Ile Ala Asn Gly Val Ile Ser 290 295 300 Val Leu Ala Thr Phe Val Gly Ile Trp Leu Leu Gly Arg Val Gly Arg 305 310 315 320 Arg Pro Met Leu Met Thr Gly Leu Ile Gly Thr Thr Thr Ala Leu Leu 325 330 335 Leu Ile Gly Ile Phe Ser Leu Val Leu Glu Gly Ser Pro Ala Leu Pro 340 345 350 Tyr Val Val Leu Ser Leu Thr Val Thr Phe Leu Ala Phe Gln Gln Gly 355 360 365 Ala Ile Ser Pro Val Thr Trp Leu Met Leu Ser Glu Ile Phe Pro Leu 370 375 380 Arg Leu Arg Gly Leu Gly Met Gly Val Thr Val Phe Cys Leu Trp Met 385 390 395 400 Val Asn Phe Ala Val Ser Phe Thr Phe Pro Ile Leu Leu Ala Ala Ile 405 410 415 Gly Leu Ser Thr Thr Phe Phe Ile Phe Val Gly Leu Gly Ile Cys Ser 420 425 430 Val Leu Phe Val Lys Arg Phe Leu Pro Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu 435 440 445 Glu Gln Leu Glu Glu Asn Phe Arg Ala Tyr Asp His Ser Gly Ala Lys 450 455 460 Lys Asp Ser Gly Ala Glu Val Ile Gly 465 470 <210> 2 <211> 438 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 2 Met Gly Asn Thr Asn Gly Asp Ser Ala Phe Asn Lys Arg Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ala Ala Leu Ala Asn Tyr Ile Asp Ala Gly Ser Ile Val Ala Gly Ser 20 25 30 Ala Gly Leu Ser Leu Trp Val Ser Tyr Leu Lys Leu Ser Asp Thr Gln 35 40 45 Ile Gly Leu Leu Gly Ala Leu Ser Ala Asn Ala Ile Ser Ala Ala Val 50 55 60 Gly Ala Leu Leu Gly Gly Phe Leu Ala Asp Lys Val Gly Arg Lys Ala 65 70 75 80 Val Tyr Thr Asn Ser Met Leu Val Tyr Ala Leu Gly Ile Cys Leu Val 85 90 95 Leu Phe Gly Val Asn Phe Pro Met Leu Leu Ser Gly Tyr Ile Ile 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Val Met Cys Pro Leu Asn Asp Gly Thr Ala Val Ser Phe Asp 100 105 110 Asn Leu Val Thr Ala Leu Lys Ala Met Lys Leu Ile Leu Glu Glu Arg 115 120 125 Gly Leu Thr Gly Leu Val Glu Pro Leu Gly Phe Pro Val Ser Ser Leu 130 135 140 Arg Thr Lys Ala Glu Ala Val Arg Ala Ile Asp Ala Ala Gly Gly Gly 145 150 155 160 Asp Val Tyr Lys Leu Val His Asp Thr Phe His His His Leu Ala Gly 165 170 175 Glu Thr Glu Leu Phe Pro Glu Arg Thr Gly Leu Val His Ile Ser Gly 180 185 190 Val Thr Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Asp Met Leu Asp Ala His Arg 195 200 205 Val Leu Val Asp Gly Asp Asp Arg Leu Glu Asn Ile Ala Gln Ile Lys 210 215 220 Thr Leu Glu Ala Ala Gly Tyr Lys Gly Pro Tyr Ser Phe Glu Pro Phe 225 230 235 240 Ala Thr Glu Val His Glu Leu Lys Asp Pro Ala Val Val Val Lys Asp 245 250 255 Ser Ile Asp His Ile Ser Arg Ala Leu 260 265 <210> 25 <211> 344 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 25 Met Ser Leu Arg Ile Gly Val Ile Gly Thr Gly Ala Ile Gly Lys Glu 1 5 10 15 His Ile Asn Arg Ile Thr Asn Lys Leu Ser Gly Ala Glu Ile Val Ala 20 25 30 Val Thr Asp Val Asn Gln Glu Ala Ala Gln Lys Val Val Glu Gln Tyr 35 40 45 Gln Leu Asn Ala Thr Val Tyr Pro Asn Asp Asp Ser Leu Leu Ala Asp 50 55 60 Glu Asn Val Asp Ala Val Leu Val Thr Ser Trp Gly Pro Ala His Glu 65 70 75 80 Ser Ser Val Leu Lys Ala Ile Lys Ala Gln Lys Tyr Val Phe Cys Glu 85 90 95 Lys Pro Leu Ala Thr Thr Ala Glu Gly Cys Met Arg Ile Val Glu Glu 100 105 110 Glu Ile Lys Val Gly Lys Arg Leu Val Gln Val Gly Phe Met Arg Arg 115 120 125 Tyr Asp Ser Gly Tyr Val Gln Leu Lys Glu Ala Leu Asp Asn His Val 130 135 140 Ile Gly Glu Pro Leu Met Ile His Cys Ala His Arg Asn Pro Thr Val 145 150 155 160 Gly Asp Asn Tyr Thr Thr Asp Met Ala Val Val Asp Thr Leu Val His 165 170 175 Glu Ile Asp Val Leu His Trp Leu Val Asn Asp Asp Tyr Glu Ser Val 180 185 190 Gln Val Ile Tyr Pro Lys Lys Ser Lys Asn Ala Leu Pro His Leu Lys 195 200 205 Asp Pro Gln Ile Val Val Ile Glu Thr Lys Gly Gly Ile Val Ile Asn 210 215 220 Ala Glu Ile Tyr Val Asn Cys Lys Tyr Gly Tyr Asp Ile Gln Cys Glu 225 230 235 240 Ile Val Gly Glu Asp Gly Ile Ile Lys Leu Pro Glu Pro Ser Ser Ile 245 250 255 Ser Leu Arg Lys Glu Gly Arg Phe Ser Thr Asp Ile Leu Met Asp Trp 260 265 270 Gln Arg Arg Phe Val Ala Ala Tyr Asp Val Glu Ile Gln Asp Phe Ile 275 280 285 Asp Ser Ile Gln Lys Lys Gly Glu Val Ser Gly Pro Thr Ala Trp Asp 290 295 300 Gly Tyr Ile Ala Ala Val Thr Thr Asp Ala Cys Val Lys Ala Gln Glu 305 310 315 320 Ser Gly Gln Lys Glu Lys Val Glu Leu Lys Glu Lys Pro Glu Phe Tyr 325 330 335 Gln Ser Phe Thr Thr Val Gln Asn 340 <210> 26 <211> 278 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 26 Met Lys Leu Cys Phe Asn Glu Ala Thr Thr Leu Glu Asn Ser Asn Leu 1 5 10 15 Lys Leu Asp Leu Glu Leu Cys Glu Lys His Gly Tyr Asp Tyr Ile Glu 20 25 30 Ile Arg Thr Met Asp Lys Leu Pro Glu Tyr Leu Lys Asp His Ser Leu 35 40 45 Asp Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Gln Thr His His Ile Lys Pro Leu Ala 50 55 60 Leu Asn Ala Leu Val Phe Phe Asn Asn Arg Asp Glu Lys Gly His Asn 65 70 75 80 Glu Ile Ile Thr Glu Phe Lys Gly Met Met Glu Thr Cys Lys Thr Leu 85 90 95 Gly Val Lys Tyr Val Val Ala Val Pro Leu Val Thr Glu Gln Lys Ile 100 105 110 Val Lys Glu Glu Ile Lys Lys Ser Ser Val Asp Val Leu Thr Glu Leu 115 120 125 Ser Asp Ile Ala Glu Pro Tyr Gly Val Lys Ile Ala Leu Glu Phe Val 130 135 140 Gly His Pro Gln Cys Thr Val Asn Thr Phe Glu Gln Ala Tyr Glu Ile 145 150 155 160 Val Asn Thr Val Asn Arg Asp Asn Val Gly Leu Val Leu Asp Ser Phe 165 170 175 His Phe His Ala Met Gly Ser Asn Ile Glu Ser Leu Lys Gln Ala Asp 180 185 190 Gly Lys Lys Ile Phe Ile Tyr His Ile Asp Asp Thr Glu Asp Phe Pro 195 200 205 Ile Gly Phe Leu Thr Asp Glu Asp Arg Val Trp Pro Gly Gln Gly Ala 210 215 220 Ile Asp Leu Asp Ala His Leu Ser Ala Leu Lys Glu Ile Gly Phe Ser 225 230 235 240 Asp Val Val Ser Val Glu Leu Phe Arg Pro Glu Tyr Tyr Lys Leu Thr 245 250 255 Ala Glu Glu Ala Ile Gln Thr Ala Lys Lys Thr Thr Val Asp Val Val 260 265 270 Ser Lys Tyr Phe Ser Met 275 <210> 27 <211> 337 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 27 Met Ser Lys Ser Leu Arg Val Gly Val Val Gly Ala Gly Ala Met Gly 1 5 10 15 Ala Asp His Ile Asp Arg Ile Asn Asn Arg Thr Ser Gly Ala His Ile 20 25 30 Ser Ala Ile Ile Glu Pro Asp Ala Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Glu 35 40 45 Asp Ala Pro Gly Ala Gln Ala Phe Thr Arg Ile Glu Asp Ala Ile Ala 50 55 60 Ala Asp Ala Val Asp Ala Val Leu Ile Ala Val Pro Gly Gln Phe His 65 70 75 80 Glu Pro Val Leu Val Pro Ala Leu Glu Ala Gly Leu Pro Ile Leu Cys 85 90 95 Glu Lys Pro Leu Thr Pro Asp Ser Glu Ser Ser Leu Arg Ile Val Glu 100 105 110 Leu Glu Gln Lys Leu Asp Lys Pro His Ile Gln Val Gly Phe Met Arg 115 120 125 Arg Phe Asp Pro Glu Tyr Asn Asn Leu Arg Lys Leu Val Glu Ser Gly 130 135 140 Glu Ala Gly Glu Leu Leu Met Leu Arg Gly Leu His Arg Asn Pro Ser 145 150 155 160 Val Gly Glu Ser Tyr Thr Gln Ser Met Leu Ile Thr Asp Ser Val Val 165 170 175 His Glu Phe Asp Val Ile Pro Trp Leu Ala Gly Ser Arg Val Val Ser 180 185 190 Val Glu Val Lys Tyr Pro Lys Thr Ser Ser Leu Ala His Ser Gly Leu 195 200 205 Lys Glu Pro Ile Leu Val Ile Met Glu Leu Glu Asn Gly Val Leu Val 210 215 220 Asp Val Glu Met Asn Val Asn Ile Gln Phe Gly Tyr Gln Val Ala Thr 225 230 235 240 Glu Ala Val Phe Glu Lys Gly Leu Ala Arg Ile Gly Gln Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gln Arg Trp Arg Asp Gly Glu Phe Leu Ile Asn Glu His Thr Asp 260 265 270 Phe Thr Thr Arg Phe Ala Thr Ala Tyr Asp Arg Gln Ile Gln Ser Trp 275 280 285 Val Asp Ala Val His Glu Gly Thr Leu Val Ala Gly Pro Asn Ala Trp 290 295 300 Asp Gly Tyr Leu Val Ala Leu Ser Cys Glu Ala Gly Val Lys Ala Leu 305 310 315 320 Asp Gly Gly Val Ile Pro Val Asp Ala Ala Pro Arg Pro Asp Phe Tyr 325 330 335 Ala <210> 28 <211> 337 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 28 Met Lys Leu Gly Leu Tyr Asn Ala Ile Phe His Asp Arg Thr Leu Pro 1 5 10 15 Glu Ala Leu Ala Ala Ile Lys Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ile Glu Leu 20 25 30 Asn Thr Gly Gly Phe Leu Pro Ala Thr His Ile Pro Thr Ile Asp Asp 35 40 45 Ile Leu Val Ser Asp Asp Ala Arg Asp Glu Phe Leu Gly Ile Phe Glu 50 55 60 Gly Thr Gly Val Asp Ile Tyr Gly Leu Asn Cys Asn Gly Asn Pro Leu 65 70 75 80 His Pro Asn Lys Ala Ile Gly Asp Lys His Ala Glu Asp Ile Arg Arg 85 90 95 Ser Ile Arg Leu Ala Glu Arg Leu Gly Gln Asn Arg Val Val Thr Met 100 105 110 Ser Gly Leu Pro Gly Gly Glu Pro Gly Ala Lys Tyr Thr Asn Trp Val 115 120 125 Val Asn Ala Trp Asn Ser Ala Ala Leu Asp Val Leu Asp Tyr Gln Trp 130 135 140 Asp Ile Ala Ala Glu Phe Trp Arg Glu Thr Asp Arg Phe Ala Ala Asp 145 150 155 160 His Gly Val Lys Val Ala Leu Glu Leu His Pro Gln Asn Ile Val Phe 165 170 175 Asn Ser Ala Asp Val His Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gly Ala Thr His 180 185 190 Val Gly Val Glu Leu Asp Ala Ser His Leu Phe Trp Gln Gln Met Asp 195 200 205 Pro Ile Ala Val Ile Asp His Leu Gly Glu Leu Ile Phe His Ala Ala 210 215 220 Ala Lys Asp Val Arg Val Asn Lys Glu Trp Ala Gln Leu Asn Gly Val 225 230 235 240 Leu Asp Asn Ser Phe Arg Arg Leu Asp Pro Ser Glu Asn Arg Thr Asn 245 250 255 Leu Gly Gly Asp Glu Trp Ala Asn Glu Trp Pro Lys Asn Ser Ala Trp 260 265 270 Asp Phe Val Ala Leu Gly Arg Gly His Asp Val Ala Tyr Trp Thr Glu 275 280 285 Phe Leu Arg Ala Leu His Arg Val Asp Pro Asn Met Leu Val Asn Ile 290 295 300 Glu His Glu Asp Val Ser Leu Gly Arg Glu Glu Gly Val Asn Glu Ala 305 310 315 320 Ala Lys Val Leu Ile Glu Ala Asn Lys Ala Leu Glu Glu Ser Leu Val 325 330 335 Ser <210> 29 <211> 336 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 29 Met Ser Leu Lys Leu Gly Val Ile Gly Thr Gly Ala Ile Gly Gln Glu 1 5 10 15 His Ile Arg Arg Cys Asn Asn Val Leu Gln Gly Ala Arg Val Val Ala 20 25 30 Val Ser Asp Ile Asn Val Glu Gly Ala Gln Ala Ala Leu Gln Arg Leu 35 40 45 Asn Ser Asp Ala Gln Val Cys Lys Asp Gly Tyr Glu Val Ile Gln Ser 50 55 60 Pro Asp Val Asp Ala Val Leu Val Thr Ser Trp Asp Pro Thr His Glu 65 70 75 80 Glu Phe Thr Leu Ala Ala Ile Ala Ala Gly Lys Pro Val Phe Cys Glu 85 90 95 Lys Pro Leu Ala Met Ser Ala Glu Gly Cys Arg Arg Val Val Glu Ala 100 105 110 Glu Ile Gln His Gly Lys Arg Leu Val Gln Val Gly Phe Met Arg Pro 115 120 125 Tyr Asp Ala Gly Tyr Arg Ala Leu Lys Lys Val Ile Thr Asp Gly Glu 130 135 140 Ile Gly Glu Pro Leu Met Leu His Cys Ala His Arg Asn Pro Thr Val 145 150 155 160 Pro Glu Asn Tyr Asn Thr Glu Met Ala Ile Thr Asn Thr Leu Ile His 165 170 175 Glu Leu Asp Val Leu Arg Trp Leu Thr Ser Asp Asp Tyr Lys Ser Val 180 185 190 Gln Val Val Phe Pro Arg Val Ser Ser Lys Ala Arg Pro His Leu Lys 195 200 205 Asp Pro Gln Ile Val Leu Phe Glu Thr Gln Lys Gly Val Arg Ile Asp 210 215 220 Val Glu Ile Phe Val Asn Cys Thr Tyr Gly Tyr Asp Ile Gln Cys Glu 225 230 235 240 Val Val Gly Glu Glu Gly Ile Ala Arg Leu Pro Glu Pro Ser Ser Val 245 250 255 Gln Leu Arg Lys Gln Ala Lys Leu Ser Asn Thr Ile Leu Val Asp Trp 260 265 270 Lys Asp Arg Phe Ile Glu Ala Tyr Asp Val Glu Leu Gln Ala Phe Ile 275 280 285 Asn Asp Val Lys Ala Gly Gln Leu Thr Gly Pro Ser Ala Trp Asp Gly 290 295 300 Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Asp Ala Cys Ile Lys Ala Gln Lys Ser 305 310 315 320 Gly Ala Ile Glu Pro Ile Glu Met Pro Ala Arg Pro Ala Phe Tyr Asn 325 330 335 <210> 30 <211> 273 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 30 Met Thr Ile Ala Ala Glu Arg Phe Cys Ile Asn Arg Lys Ile Ala Pro 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Glu Ala Phe Phe Arg Leu Val Asn Gly Leu Gly Leu 20 25 30 Asn Lys Val Glu Leu Arg Asn Asp Leu Pro Ser Gly Asn Val Met Asp 35 40 45 Asn Leu Ser Ala Ala Gln Val Cys Ala Leu Ala Glu Arg Tyr Gly Ile 50 55 60 Asp Ile Ile Thr Ile Asn Ala Val Tyr Pro Phe Asn Gln Arg Thr Glu 65 70 75 80 Gln Val Arg Gln Leu Thr Glu Ser Leu Leu Ala Asp Ala Lys Ala Val 85 90 95 Gly Ala Arg Ser Leu Val Leu Cys Pro Leu Asn Asp Gly Ser Ser Val 100 105 110 Ala Pro Glu Val Thr Leu Asn Ala Leu Arg Asp Leu Ala Pro Leu Phe 115 120 125 Ala Thr Tyr Gly Ile Thr Gly Leu Val Glu Pro Leu Gly Phe Pro Gln 130 135 140 Ser Ser Leu Arg Ser Ala Ala Gln Ala Gln Lys Leu Ile Arg Asp Ala 145 150 155 160 His Val Pro Phe Lys Leu Leu Ile Asp Thr Phe His His His Leu Tyr 165 170 175 Pro Asp Ala Asp Ala Glu Phe Ser Gln Val Asp Ile Ala Gln Ile Gly 180 185 190 Leu Val His Leu Ser Gly Val Glu Asp Lys Arg Pro Arg Glu Ser Leu 195 200 205 Thr Asp Ala Glu Arg Ile Met Leu Thr Pro Glu Asp Arg Leu Phe Thr 210 215 220 Cys Arg Gln Val Lys Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Lys Gly Ile Tyr 225 230 235 240 Ala Phe Glu Pro Phe Ala Pro Glu Leu Ala Asp Trp Asp Glu Asn Lys 245 250 255 Ile Gln His Glu Ile Lys Asn Ser Ile Gln Leu Ile Gln His Ser Leu 260 265 270 Lys <210> 31 <211> 335 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 31 Met Thr Leu Arg Ile Ala Leu Phe Gly Ala Gly Arg Ile Gly His Val 1 5 10 15 His Ala Ala Asn Ile Ala Ala Asn Pro Asp Leu Glu Leu Val Val Ile 20 25 30 Ala Asp Pro Phe Ile Glu Gly Ala Gln Arg Leu Ala Glu Ala Asn Gly 35 40 45 Ala Glu Ala Val Ala Ser Pro Asp Glu Val Phe Ala Arg Asp Asp Ile 50 55 60 Asp Gly Ile Val Ile Gly Ser Pro Thr Ser Thr His Val Asp Leu Ile 65 70 75 80 Thr Arg Ala Val Glu Arg Gly Ile Pro Ala Leu Cys Glu Lys Pro Ile 85 90 95 Asp Leu Asp Ile Glu Met Val Arg Ala Cys Lys Glu Lys Ile Gly Asp 100 105 110 Gly Ala Ser Lys Val Met Leu Gly Phe Asn Arg Arg Phe Asp Pro Ser 115 120 125 Phe Ala Ala Ile Asn Ala Arg Val Ala Asn Gln Glu Ile Gly Asn Leu 130 135 140 Glu Gln Leu Val Ile Ile Ser Arg Asp Pro Ala Pro Ala Pro Lys Asp 145 150 155 160 Tyr Ile Ala Gly Ser Gly Gly Ile Phe Arg Asp Met Thr Ile His Asp 165 170 175 Leu Asp Met Ala Arg Phe Phe Val Pro Asn Ile Val Glu Val Thr Ala 180 185 190 Thr Gly Ala Asn Val Phe Ser Gln Glu Ile Ala Glu Phe Asn Asp Tyr 195 200 205 Asp Gln Val Ile Val Thr Leu Arg Gly Ser Lys Gly Glu Leu Ile Asn 210 215 220 Ile Val Asn Ser Arg His Cys Ser Tyr Gly Tyr Asp Gln Arg Leu Glu 225 230 235 240 Ala Phe Gly Ser Lys Gly Met Leu Ala Ala Asp Asn Ile Arg Pro Thr 245 250 255 Thr Val Arg Lys His Asn Ala Glu Ser Thr Glu Gln Ala Asp Pro Ile 260 265 270 Phe Asn Phe Phe Leu Glu Arg Tyr Asp Ala Ala Tyr Lys Ala Glu Leu 275 280 285 Ala Thr Phe Ala Gln Gly Ile Arg Asp Gly Gln Gly Phe Ser Pro Asn 290 295 300 Phe Glu Asp Gly Val Ile Ala Leu Glu Leu Ala Asn Ala Cys Leu Glu 305 310 315 320 Ser Ala Gln Thr Gly Arg Thr Val Thr Leu Asn Pro Ala Asn Val 325 330 335 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 32 cgaacatgtc tatgcctggg aagaccgcgt c 31 <210> 33 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 33 gcagagctct tattggtaaa gtgcgggacg g 31 <210> 34 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 34 ctaggatcca ggagatatac atatgaggtc tttcatgcgt tttg 44 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 35 cgagtcgact tagagcgccc gggagatatg gtc 33 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 36 gacacatgtc aatgagttta cgtattgg 28 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 37 ctagcggccg ccttcatatt ttcactcctc tg 32 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 38 cgacatatga aactttgttt taatgaagcg 30 <210> 39 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 39 cgattaatta attacatgct gaagtatttt gatacgac 38 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 40 gactcatgag caagagcctt cgcgttgg 28 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 41 ctagcggccg cctccttaag cgtagaaatc tgg 33 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 42 gttcatatga aactcggtct ctacaacg 28 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 43 cgattaatta agtagttttt ttaagaaacc agg 33 <210> 44 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 44 gacacatgtc attgaaactt ggtgtgattg g 31 <210> 45 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 45 ctagcggccg cttagttata gaatgccgga cg 32 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 46 cgacatatga ccatcgccgc agaacg 26 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 47 cgattaatta atgcatcaac gaagcctggg c 31 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 48 gactcatgac tcttcgtatc gccc 24 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 49 ctagcggccg cttaactaga cgttgactaa acg 33 <210> 50 <211> 1080 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 50 atgaaagcac gtgtgtcttg ttctgcaaaa cctggtgata tgtcccctaa tactggcaac 60 gaagtattcc agatgaccgt aaaaattggt gtgatcggta ctggtgctat tggccgcgac 120 cacgctcgcc gcatcaacga ggttctgggt ggcgctaaag tggtcgcact gtctgacgtg 180 aatcgcgcgt ccagcgaggc ggtaaaaaag gacattgcgc ctgacgccgc catcttcgcg 240 accggcgaag aactgatcgc cagcgctgac gtcgatgcgg tgctggtcac ttcctggggc 300 gctactcacg agcaatacgt actggcagct atcgcggcag gtaagccgtg cttctgcgaa 360 aaaccgctgg caaccactgc tgaaggtgct aagcgcattg ttgatgcgga ggttgcactg 420 ggtaaacgcc tggtccaagt aggtttcatg cgccgctacg acgccggtta tgttgcgctg 480 aaaaagaccg ttgataccat gattggcgct ccgatcatgg ttcatgctgc gcaccgcaac 540 ccgaccgtac cggaacagta cgtgaccccg atggcaatcc acgacactat gattcacgag 600 atcgacgtac tgcgttggct gctggatgat gattacgtgt ctgcgcgtgt cctgttcccg 660 cgtgcagcgg ctcgcagcca cgctaaactg cgcgatccgc aaattgttat cctggaaact 720 gcacgtggta ctatcatcga tgtagaaatc ttcgtgaact gccactacgg ctacgacatc 780 cagtgccagg ttgttggcga ggatggcatc gcctccctgc cggaaccgat ggcgatccag 840 acccgtctgg gtgctaagct gcaaaacgac attctgaccg actggaaaga ccgcttcatc 900 gcgtcttatg atgttgaact gcaagacttc attcacgcag cagcaaaagg caccgccagc 960 ggtccgaact cttgggacgg ctacgttgcg gcgatcacct ccgacgcttg cgttgctgct 1020 caagaaaccg acggtgcggc tgttgcgatc cgtctgccga ctcgtccggc actgtatcag 1080 1080 <210> 51 <211> 811 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 51 ggatccagga gatatacata tgcgttttgc tattaaccat attactgctc cggcactgtc 60 tctggaagac tttttccaga ctgcgcgtga actgggcctg accgaagtgg aaatccgcaa 120 cgacctgccg gacatcgtcg gtactgtgac tcctgctcag gttaaagctg ctgctgataa 180 agccggtgta accattatct ccatcaacgc tctgtacccg ttcaacgtct ggagcggcga 240 cctgccgcag cgtgcagttg caatggctga ctatgcggct gcgtctggcg ccaaagctct 300 ggtcatgtgt ccgctgaacg atggtcgcgc ggtatctttt gatgacctgg taaccgctct 360 gaaagcgatg aagccgatcc tggaggaacg tggtctgact ggtctggtag agccgctggg 420 tttcccggtg tcttctctgc gtactaaaac cgaagcggtg cgtgcaatcg atgttgcagg 480 cggcggtgac gtgtatcgcc tggtccacga caccttccac caccacctgg cgggtgaaac 540 tgccttcttc ccggaacgca ccggtctggt tcacatcagc ggtgtcaccg acccagcagt 600 gtctgttgcg gacatgctgg acgcgcaccg tgtgctggtg gacggcgcag atcgcctgga 660 aaatatcgca cagattcgtg cgctggaagc agcgggttac aaaggtccgt attccttcga 720 accattcgct accgaagtgc acgacctgaa ggacccagcg gcggcggtta aagcgtctat 780 cgaccacatc gcaggtgcac tgtaagtcga c 811

Claims (17)

  1. 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이오-이노시톨(myo-inositol)로부터 D-카이로-이노시톨(D-chiro-inositol)을 생산하는 방법:
    (a) (i) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시톨 트랜스포터 (myo-inositol transporter) 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터; 및 (ⅱ) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시톨 디하이드로게나아제(inositol dehydrogenase) 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제(inosose isomerase) 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환된 숙주세포를 얻는 단계; 및
    (b) 상기 형질전환된 숙주세포를 마이오-이노시톨을 포함하는 배지에서 배양하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 마이오-이노시톨 트랜스포터는 서열번호 1 내지 서열번호 6에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 이노시톨 디하이드로게나아제는 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29 및 서열번호 31에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 이노소스 이소머라아제는 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28 및 서열번호 30에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 숙주세포는 동물세포, 곤충세포, 효모 또는 원핵세포인 것으로 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 숙주세포는 원핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b) 이후에, 상기 형질전환 숙주세포를 배양한 배양물로부터 D-카이로-이노시톨을 분리하는 단계 (c)를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. (i) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시톨 트랜스포터 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터; 및 (ⅱ) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시톨 디하이드로게나아제 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 마이오-이노시톨 트랜스포터는 서열번호 1 내지 서열번호 6에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 이노시톨 디하이드로게나아제는 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29 및 서열번호 31에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 이노소스 이소머라아제는 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28 및 서열번호 30에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 숙주세포는 동물세포, 곤충세포, 효모 또는 원핵세포인 것으로 특징으로 하는 숙주세포.
  13. 상기 청구항 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항 기재의 숙주세포를 포함하는 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하기 위한 용도의 조성물.
  14. (i) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시톨 트랜스포터 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터; 및 (ⅱ) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시톨 디하이드로게나아제 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨의 생산용 재조합 벡터 키트.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 마이오-이노시톨 트랜스포터는 서열번호 1 내지 서열번호 6에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 이노시톨 디하이드로게나아제는 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29 및 서열번호 31에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 이노소스 이소머라아제는 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28 및 서열번호 30에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 키트.
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