CN105229152B - 利用微生物的d-手性肌醇的生产方法 - Google Patents
利用微生物的d-手性肌醇的生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及利用表达酶肌醇转运体、肌醇脱氢酶及肌糖异构酶的转化的宿主细胞来从肌醇生产D‑手性肌醇的方法。根据本发明的方法，能够以高收率将肌醇转换为D‑手性肌醇。
Description
技术领域
本发明涉及利用微生物的D-手性肌醇的生产方法。更详细地，涉及基于转化的微生物宿主细胞从肌醇生产D-手性肌醇的方法。
背景技术
D-手性肌醇(D-chiro-inositol，cis-l,2,4-trans-3,5,6-cyclohexol)作为肌醇(myo-inositol，cis-l,2,3,5-trans-4,6-cyclohexanehexol)的立体异构体，是3号羟基被差向异构化的形态(图1)。据报告，D-手性肌醇为肌醇磷酸聚糖(IPG)的主要组成成分，是胰岛素信号传输的重要介质，众所周知，上述D-手性肌醇对二型糖尿病具有治疗效果。D-手性肌醇主要在真核生物中被发现，借助肌醇的差向异构化来实现生物合成。
D-手性肌醇主要通过D-松醇(D-pinitol)或春雷霉素(kasugamycin)的盐酸水解来生产(U.S.Pat No.5827896,U.S.Pat No.5091596,U.S.Pat No.5463142,U.S.PatNo.5714643)。但是，虽然作为原料的D-松醇或春雷霉素的价格高昂，并且，众所周知的还有有机合成法(U.S.Pat No.5406005,W096/25381)，由于难以分离副产物，因而经济性差。
山本(Yamamoto)等提出了利用表达农杆菌AB10121(Agrobacterium sp.AB10121)的MI差向异构酶(epimerase)的细菌来从肌醇转换为手性肌醇的方法(JP2001-006878、WO2002/055715)。山本等提出的方法能够以约15％的收率从肌醇生产D-手性肌醇。
本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术领域的水平及本发明的内容。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明人为了利用微生物来从肌醇生产手性肌醇而努力研究，其结果，确认如下情况来完成了本发明，即，若利用由包含肌醇转运体(myo-inositol transporter)、肌醇脱氢酶(inositol dehydrogenase)及肌醇异构酶(inositol isomerase)编码基因的重组表达载体转化的宿主细胞，则能够以高收率从肌醇生产D-手性肌醇。
因此，本发明的目的在于，提供利用转化的宿主细胞来从肌醇生产D-手性肌醇的方法。
本发明的再一目的在于，提供表达肌醇转运体、肌醇脱氢酶及肌糖异构酶的转化的宿主细胞。
本发明的另一目的在于，提供用于生产包含上述转化的宿主细胞的D-手性肌醇的组合物。
本发明的还一目的在于，提供包含具有将肌醇转运体、肌醇脱氢酶及肌糖异构酶编码的脱氧核糖核酸(DNA)序列的重组载体的、生产D-手性肌醇的试剂盒。
以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图，将更加明确本发明的目的及优点。
技术方案
根据本发明的一实施方式，本发明提供从肌醇(myo-inositol)生产D-手性肌醇(D-chiro-inositol)的方法，其特征在于，包括：步骤(a)，使用(i)包含操作性地与启动子相结合的肌醇转运体(myo-inositol transporter)编码脱氧核糖核酸序列的重组载体以及(ii)包含操作性地与启动子相结合的肌醇脱氢酶(inositol dehydrogenase)编码脱氧核糖核酸序列及肌糖异构酶(inosose isomerase)编码脱氧核糖核酸序列的重组载体来转化宿主细胞，从而得到转化的宿主细胞；以及步骤(b)，在包含肌醇的培养基中培养上述转化的宿主细胞。
以下，按照各步骤对本发明进行更详细的说明。
步骤(a)为使用包含肌醇转运体编码脱氧核糖核酸序列、肌醇脱氢酶编码脱氧核糖核酸序列及肌糖异构酶编码脱氧核糖核酸序列的重组载体来转化宿主细胞，从而得到转化的宿主细胞的步骤。
在本说明书中，术语“肌醇转运体(myo-inositol transporter)”意味着使肌醇向细胞内移动的运输酶。大部分细胞具有向细胞内吸收培养基内的肌醇的肌醇运输系统，从哺乳动物的细胞到细菌的多种细胞中确认了肌醇转运体。据报告，在产气杆菌(Aerobacteraerogenes)[Deshusses,J.,and Reber,G.,1972,Biochim.Biophys.Acta274,Bacteriol.126,243-250]、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)[Reber,G.,Belet,M.,andDeshusses,J.,1977,J.Bacterol.131,872-875]、假单胞菌(Pseudomonas)属[Gauchat-Feiss,D.,Frey,J.,Belet,M.,and Deshusses,J.,1985,J.Bacteriol.162，324-327]等的细菌中分离了肌醇转运体基因，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Nikawa,J.,Nagumo,T.,and Yamashita,S.(1982)J.Bacteriol.150,441-446)等的酵母中也分离了肌醇转运体基因。并且，众所周知，肌醇转运体存在主型(major)和副型(minor)。
本发明中所使用的肌醇转运体可使用源自哺乳动物细胞、酵母细胞或细菌的转运体，优选地，可使用源自细菌的转运体。更优选地，可使用从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)分离的转运体，最优选地，使用源自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的转运体。
优选地，本发明的肌醇转运体可使用选自由具有在SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6中公开的氨基酸序列的蛋白质组成的组中的一种以上的转运体。
在本说明书中，如以下反应式1所示，术语“肌醇脱氢酶”为具有催化借助烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖性氧化作用来将肌醇转换为2-酮基-肌醇(2-keto-myo-inositol)的化学反应或其逆向反应的活性的酶。在本说明书中，“肌醇脱氢酶”还被记载为对其进行编码的基因名称“iolG”。
[反应式1]
肌醇+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化态)(NAD+)＜---＞2-酮基-肌醇+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原态)(NADH)+H+
据报告，肌醇脱氢酶从产气杆菌(Aerobacter aerogenes)[Berman T,MagasanikB(1966).J.Biol.Chem.241(4):800-806；LARNER J,JACKSON WT,GRAVES DJ,STAMER JR(1956).Arch.Biochem.Biophys.60(2):352-363]和酵母隐球菌蜜二糖(Cryptococcusmelibiosum)[Vidal-Leiria M,van Uden N(1973).Biochim.Biophys.Acta.293(2):295-303]分离。
优选地，在本发明中可使用的肌醇脱氢酶从根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)或菠萝泛菌(Pantoea ananantis)分离。更优选地，本发明的肌醇脱氢酶可使用选自由具有在SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ IDNO.29及SEQ ID NO.31中公开的氨基酸序列的蛋白质组成的组中的一种。
在本说明书中，如以下反应式2所示，术语“肌糖异构酶”为具有催化将2-酮基-肌醇转换为1-酮基-D-手性肌醇(1-keto-D-chiro-inositol)的异构化反应或其逆向反应的活性的酶。在本说明书中，“肌糖异构酶”还被记载为对其进行编码的基因名称“ioll”。
[反应式2]
2-酮基-肌醇＜---＞1-酮基-D-手性肌醇
优选地，在本发明中可使用的肌糖异构酶从根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)或菠萝泛菌(Pantoea ananantis)分离。更优选地，本发明的肌糖异构酶可使用选自由具有在SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28及SEQ IDNO.30中公开的氨基酸序列的蛋白质组成的组中的一种。
借助上述反应式2生成的1-酮基-D-手性肌醇借助以下反应式3来生成作为本发明中的最终产物的D-手性肌醇。由前述的“肌醇脱氢酶”催化以下反应式3的反应。
[反应式3]
1-酮基-D-手性肌醇+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原态)(NADH)+H+＜---＞D-手性肌醇+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化态)(NAD+)
在本发明中，肌醇在宿主细胞内借助反应式1至反应式3的连续反应来转换为D-手性肌醇，如上所述，由“肌醇脱氢酶”催化反应式1及反应式3的反应，由“肌糖异构酶”催化反应式2的反应。
在本发明中，肌醇转运体编码脱氧核糖核酸序列、肌醇脱氢酶编码脱氧核糖核酸序列、肌糖异构酶编码脱氧核糖核酸序列在重组载体内操作性地与启动子相结合。
在本说明书中，术语“操作性地相结合(operatively linked)”意味着功能性地与脱氧核糖核酸序列的表达调节序列相结合，借助功能性结合，由表达调节序列调节脱氧核糖核酸序列的表达。
在本说明书中，术语“启动子”意味着可调节基因编码序列或功能性核糖核酸(RNA)的表达的脱氧核糖核酸序列。
本发明中的载体可通过本领域公知的多种方法构建，其相关具体方法公开于山姆布鲁克等(Sambrook et al.)的“分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning，ALaboratory Manual)”(冷泉港实验室出版社，2001)中，该文献插入于本说明书作为参照。
本发明的重组载体可由用于克隆或表达的载体构建，并且可将原核细胞或真核细胞作为宿主来构建。
例如，在本发明的载体为表达载体，并以原核细胞作为宿主的情况下，通常，载体包含可进行转录的强力启动子(例如，ρLλ启动子、trp启动子、lac启动子、T7启动子、tac启动子等)、用于开始翻译的核糖体结合部位及转录/翻译终止序列。在利用大肠杆菌(E.coli)作为宿主细胞的情况下，大肠杆菌色氨酸生物合成途径的启动子、操纵子部位(Yanofsky,C.,J.Bacteriol.,158:1018-1024(1984))及噬菌体λ的左向启动子(ρLλ启动子，Herskowitz,I.and Hagen,D.,Ann.Rev.Genet.,14:399-445(1980))可被用作调节部位。
本发明的载体可包含本领域中通常所使用的抗生素抗性基因作为选择标记，例如有氨苄西林(ampicilin)、庆大霉素(gentamicin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、链霉素(streptomycin)、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)、新霉素(neomycin)及四环素(tetracycline)的抗性基因，但并不限定于此。上述抗生素抗性基因以可操作的方式与用于表达其的启动子相连接。
本发明中可使用的载体可通过对在本领域中经常使用的质粒(例：pSClOl、ColEl、pBR322、pUC8/9、pHC79、pGEX系列、pET系列及pUCl9等)、噬菌体(例：λgt4δλΒ、λ-Charon、λΓzL及M13等)或病毒(例：SV40等)进行操作来制备。
优选地，本发明的载体为原核细胞用载体，包含在原核宿主细胞，尤其在大肠杆菌(E.co1i)中可复制的核酸序列。因此，本发明的载体可包含coIA、colEl或ρ15Α的细菌的复制原点或如fl origin等的噬菌体的复制原点。
作为可稳定且连续克隆及表达本发明的重组载体的宿主细胞，还可使用本领域公知的任何宿主细胞。例如，可举哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母等的真核细胞或原核细胞，但优选地，使用原核细胞。原核细胞例如有作为大肠杆菌的E.coli JM109、E.coli BL21、E.coli RR1、E.coli LE392、E.coli B、E.coli X 1776、E.coli W3110、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等的芽孢杆菌属菌株、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷菌、谷氨酸棒状杆菌及多种假单胞菌属等的肠道菌和菌株等。
在宿主细胞为原核细胞的情况下，将本发明的载体向宿主细胞内运输的方法有CaCl2方法(Cohen,S.N.et al.,Proc.Natl.Acac.Sci.USA,9:2110-2114(1973))、Hanahan方法(Cohen,S.N.et al.,Proc.Natl.Acac.Sci.USA,9:2110-2114(1973)；及Hanahan,D.，J.Mol.Biol.,166:557-580(1983))及电穿孔方法(Dower,W.J.et al.,Nucleic.AcidsRes.,16:6127-6145(1988))等。
步骤(b)：在包含肌醇的培养基中培养上述转化的宿主细胞
在培养上述转化的宿主细胞期间，重组表达载体内的肌醇转运体、肌醇脱氢酶及肌糖异构酶被表达，培养液内的肌醇被吸收到细胞内，从而借助上述酶的催化作用，转换为D-手性肌醇。
转化的宿主细胞的培养可通过公知的宿主细胞培养方法或对其进行变形的方法来执行。例如，在宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)的情况下，若用于培养转化的宿主细胞的培养基包含大肠杆菌可有效利用的碳源、氮源、无机盐等，则可使用天然培养基或合成培养基。可使用的碳源包含葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、蔗糖(sucrose)等的碳水化合物；淀粉、淀粉的水解物；乙酸(acetic acid)及丙酸(propionic acid)等的有机酸；乙醇(ethanol)、丙醇(propanol)、甘油(glycerol)等的乙醇(alcohol)等。氮源包含氨(ammonia)；氯化铵(ammonium chloride)、硫酸铵(ammonium sulfate)、醋酸铵(ammoniumacetate)及磷酸铵(ammonium phosphate)等的无机酸或有机酸的铵盐；蛋白胨(peptone)、肉类提取物(meat extract)、酵母提取物(yeast extract)、玉米浆(corn steep liquor)、干酪素(casein)水解物、大豆提取物、大豆水解物；多种发酵的细胞及它们的分解物等。无机盐包含磷酸二氢钾(potassium dihydrogen phosphate)、磷酸氢二钾(dipotassiumhydrogen phosphate)、磷酸镁(magnesium phosphate)、硫酸镁(magnesium sulphate)、氯化钠(sodium chloride)、硫酸锰(manganese sulfate)、硫酸铜(copper sulfate)、碳酸钙(calcium carbonate)等。
通常，在振荡培养或借助旋转器的旋转等的有氧条件下进行培养。优选地，培养温度在10至40℃的范围内，培养时间通常为5小时至7天。优选地，在培养过程中，培养基的pH维持在3.0至9.0的范围内。培养基的pH可由无机酸或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等调节。在培养的过程中，若有需要，可为了维持及表达重组载体而添加氨苄西林、链霉素、氯霉素、卡那霉素及四环素等的抗生素。在培养转化为具有可诱导(induction)的启动子的重组表达载体的宿主细胞的情况下，若有需要，可向培养基添加适当的诱导剂(inducer)。例如，在表达载体包含lac启动子的情况下，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)，在表达载体包含trp启动子的情况下，可向培养基添加吲哚丙烯酸(indoleacrylic acid)。
根据本发明的优选实例，本发明的方法在上述步骤(b)之后，还包括从培养了上述转化的宿主细胞的培养物分离D-手性肌醇的步骤(c)。
步骤(c)：从培养了上述宿主细胞的培养液分离D-手性肌醇
使用分离及纯化碳水化合物(carbohydrate)或糖(sugar)的公知的方法及其变形的方法，来从培养了转化的宿主细胞的培养液分离D-手性肌醇。
在D-手性肌醇以溶解于培养基上的状态存在的情况下，从培养基去除所培养的转化体。例如，通过离心分离法或微孔过滤法(microfiltration)等，来从培养液去除所培养的转化体，从而仅得到培养上清液。从培养上清液得到D-手性肌醇的方法可使用以往的公知的糖的分离纯化方法及其变形的方法。
以往公知的糖的分离纯化方法有基于利用沸石(zeolite)分子筛的选择性吸附方法的分离方法(美国专利第4482761号)、基于利用阳离子交换树脂的柱层析法的分离方法(美国专利第5096594号)、基于使用阴离子交换树脂的柱层析法的分离方法(美国专利第5482631号)、基于活性炭的吸附及基于有机溶剂的溶出方法(韩国特许第10-0753982号)、冷冻干燥及再结晶化方法等，可使用这些方法，或组合这些方法的变形的方法及这些方法来使用，但并不限定于此。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供宿主细胞，使用(i)包含操作性地与启动子相结合的肌醇转运体编码脱氧核糖核酸序列的重组载体以及(ii)包含操作性地与启动子相结合的肌醇脱氢酶编码脱氧核糖核酸序列及肌糖异构酶编码脱氧核糖核酸序列的重组载体来转化上述宿主细胞。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含上述转化的宿主细胞的用于从肌醇生产D-手性肌醇的用途的组合物。
根据本发明的还一实施方式，本发明提供用于从肌醇生产D-手性肌醇的重组载体试剂盒，上述用于从肌醇生产D-手性肌醇的重组载体试剂盒包含如下重组载体作为有效成分，上述重组载体分别为(i)包含操作性地与启动子相结合的肌醇转运体编码脱氧核糖核酸序列的重组载体以及(ii)包含操作性地与启动子相结合的肌醇脱氢酶编码脱氧核糖核酸序列及肌糖异构酶编码脱氧核糖核酸序列的重组载体。
在作为本发明的再一实施方式的宿主细胞、包含该宿主细胞的组合物及包含重组载体的试剂盒中，关于上述肌醇转运体、肌醇脱氢酶及肌糖异构酶、包含对上述肌醇转运体、肌醇脱氢酶及肌糖异构酶进行编码的脱氧核糖核酸序列的重组表达载体、包含上述重组表达载体的宿主细胞的内容与上述的本发明的一实施方式的内容相同，因而不进行重复说明。
有益效果
本发明涉及利用表达上述酶肌醇转运体、肌醇脱氢酶及肌糖异构酶的转化的宿主细胞来从肌醇生产D-手性肌醇的方法。根据本发明的方法，能够将肌醇转换为D-手性肌醇。
附图说明
图1示出肌醇(myo-inositol)和D-手性肌醇(D-chiro-inositol)的化学结构。
图2示出肌醇和D-手性肌醇以及它们的立体异构体或衍生物的高效液相色谱法(HPLC)色谱图。
图3示出在向表达肌醇脱氢酶及肌糖异构酶的大肠杆菌追加导入多源的肌醇转运体来得到的转化大肠杆菌中，测定从肌醇到D-手性肌醇的转换率及菌体生长率的结果。对肌醇转运体的各试验组为培养将转运体表达载体与pCOLAD-sAtiep-sAtiepf一同导入来制备的重组大肠杆菌24小时及48小时的结果。白色柱表示在培养24小时之后测定的值，灰色柱表示在培养48小时之后测定的值。
图4示出基于肌醇脱氢酶(iolG)的同源性分析的系统树(phylogenetic tree)。
图5示出基于肌糖异构酶(ioll)的同源性分析的系统树(phylogenetic tree)。
图6a至图6c示出基于培养温度的本发明的转化的大肠杆菌的从肌醇到D-手性肌醇的转换率的测定结果。各符号的实验组如下。在图6a中，●：30℃，○：37℃，在图6b中，温度为30℃的情况下，○：菌体生长，●：pH，▲：甘油的剩余量，在图6c中，温度为37℃的情况下，○：菌体生长，●：pH，▲：甘油的剩余量。
图7示出当培养本发明的转化的大肠杆菌时基于诱导(induction)时期的从肌醇到D-手性肌醇的转换率的测定结果。各符号的实验组如下。■：未诱导(No induction)，○：在时间为0时诱导(induction)，▲：在光密度(OD)为0.6时诱导(induction)，▽：在光密度为3时诱导(induction)，◆：在光密度为10时诱导(induction)。
图8示出当培养本发明的转化的大肠杆菌时基于诱导剂种类的从肌醇到D-手性肌醇的转换率的测定结果。各符号的实验组如下。■：在光密度为0.6时添加1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，○：在时间为0时添加0.5％的乳糖(lactose)，▲：在光密度为0.6时添加0.5％的乳糖(lactose)，▽：在光密度为7时添加0.5％的乳糖(lactose)，◆：在光密度为0.6时添加0.1％的乳糖(lactose)。
图9示出导入了源自多种菌株的肌醇脱氢酶及肌糖异构酶基因或它们的组合的重组菌株的D-手性肌醇生产率(图9的(A)部分)、菌体生长(图9的(B)部分)及生产速度的梯度(图9的(C)部分)的测定结果。向转化的大肠杆菌一同导入肌醇转运体表达重组质粒载体pACYCD-StiolTl-StiolT2来执行了实验。各符号的实验组如下。■：pCOLAD-Cgiep-PaiolI，○：pCOLAD-sAtiep-sAtiepf，▲：pCOLAD-AGRL628-AGRL627，▽：pCOLAD-BsiolG-BsiolI，◆：pCOLAD-CgiolG-Cgiol10169，：pCOLAD-Paidh-PaiolI。
图10示出利用在本发明中选择的转化的大肠杆菌来在最佳的培养条件下执行1L的发酵，从而确认从肌醇生产D-手性肌醇的实验结果。
图11为借助本发明的菌株生产的D-手性肌醇分馏物的气相色谱-质谱(GC-MS)分析结果。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅用于更加具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并不受这些实施例的限制，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例
实施例1：肌醇转运体基因的克隆及包含转运体的重组载体的制备
从有报告指出将肌醇用作碳源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)分别克隆了肌醇转运体(myo-inositol transporter)的主(major)基因及副(minor)基因。
在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中，肌醇转运体基因为iolT基因和iolF基因，在鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)中，肌醇转运体基因为iolT1基因和iolT2基因，在根癌农杆菌(A.tumefaciens)中，肌醇转运体基因为Atu5935基因和Atu2525基因。以上基因的信息如表1。
表1
1-1.重组载体pACYCD-BsiolT(F2)及pACYCD-BsiolT-BsiolF(F2)的制备
在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株的情况下，从Bacillus subti1issubsp.subtilis str.168(taxid:224308；GenBank NID:NC_000964,ATCC23857)的基因组脱氧核糖核酸将主转运体iolT及副转运体iolF导入pACYCDuet-1表达载体，来构建pACYCD-BsiolT(F2)和pACYCD-BsiolT-BsiolF(F2)。若具体说明，则利用引物BsiolT-F2和BsiolT-R来从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的基因组脱氧核糖核酸扩增iolT之后，用限制酶SacI和BamHI裂解，并插入于载体pACYCDuet-1(Novagen)的相同部位来制备了pACYCD-BsiolT(F2)。并且，利用引物BsiolF-F和BsiolF-R来扩增iolF之后，用限制酶NdeI和SalI裂解，并插入于所制备的上述pACYCD-BsiolT(F2)的NdeI和XhoI部位，从而制备了pACYCD-BsiolT-BsiolF(F2)。
1-2.重组载体pACYCD-StiolT1(F2)及pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)的制备
在鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)菌株的情况下，从Salmonella entericasubsp.enterica serovar Typhimurium str.LT2ATCC700720(taxid:99287；GenBank NID:NC_006511,ATCC700720)扩增作为主转运体的iolT1及作为副转运体的iolT2，来向pACYCDuet-1表达载体导入，从而构建了pACYCD-StiolT1(F2)和pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)。若具体说明，则利用引物StiolT1-F2及StiolT1-R来从鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的基因组脱氧核糖核酸扩增iolT1之后，用限制酶NcoI和BamHI裂解，并插入于pACYCDuet-1载体的相同部位，来制备了pACYCD-StiolT1(F2)。并且，利用引物StiolT2-F和StiolT2-R来扩增iolT2之后，用限制酶NdeI和SalI裂解，并插入于所制备的上述载体pACYCD-StiolT1(F2)的NdeI和XhoI部位，从而制备了pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)。
1-3.重组载体pACYCD-Atu5935(F2)及pACYCD-Atu5935-Atu2525(F2)的制备
在根癌农杆菌(A.tumefaciens)的情况下，利用引物Atu5935-F2和Atu5935-R来从Agrobacterium tumefaciens str.C58(taxid:176299；GenBank NID:NC_003062,ATCC33970)的基因组脱氧核糖核酸扩增Atu5935之后，用限制酶NcoI和BamHI裂解，并插入于pACYCDuet-1载体的相同部位，来制备了pACYCD-Atu5935(F2)。并且，利用引物Atu2525-F和Atu2525-R来扩增Atu2525之后，用限制酶NdeI和SaiI裂解，并插入于所制备的上述pACYCD-Atu2525(F2)的NdeI和XhoI部位，从而制备了pACYCD-Atu5935-Atu2525(F2)。
1-4.重组载体pCOLAD-sAtiep-sAtiepf的制备
为了评价克隆的上述肌醇转运体的活性，从根癌农杆菌(A.tumefaciens)克隆将肌醇转换为D-手性肌醇的肌醇脱氢酶(inositol dehydrogenase)基因(iolG)及肌糖异构酶(inosose isomerase)基因(ioll)，并将它们导入载体pCOLADuet-1(Novagen)，来制备了重组质粒载体pCOLAD-sAtiep-sAtiepf。若更详细地说明，则以Agrobacterium sp.AB10121(WO 02/055715A)的BD171257_CDS1和CDS2的氨基酸序列为基础，执行脱氧核糖核酸合成[GenScript Inc.,860Centennial Ave.,Piscataway,NJ 08854,USA]，来分别制备了合成的脱氧核糖核酸分子sAtiep(SEQ ID NO.50)和合成的脱氧核糖核酸分子sAtiepf(SEQ IDNO.51)。以上述合成的脱氧核糖核酸分子sAtiep为模板，使用引物sAtiep-TF和sAtiep-TR来进行多聚酶链式反应(PCR)扩增之后，用限制酶BspHI和SacI裂解，并将其插入于pCOLADuet-1的相同限制酶部位，来制备了pCOLAD-sAtiep。接着，将上述合成的脱氧核糖核酸分子sAtiepf用NdeI和SaiI裂解，并将其插入于上述所制备的载体pCOLAD-sAtiep的NdeI部位和XhoI部位，最终制备了重组载体pCOLAD-sAtiep-sAtiepf。
表2整理了用于上述重组载体的制备的引物，表3整理了所制备的重组载体及与此相关的序列信息。
表2
| 引物 | 序列号 | 限制酶部位 |
| BsiolT-F2 | SEQ ID NO.7 | SacI |
| BsiolT-R | SEQ ID NO.8 | BamHI |
| BsiolF-F | SEQ ID NO.9 | BamHI-NdeI |
| BsiolF-R | SEQ ID NO.10 | SalI |
| StiolTl-F2 | SEQ ID NO.11 | EcoRI-NcoI |
| StiolTl-R | SEQ ID NO.12 | BamHI |
| StiolT2-F | SEQ ID NO.13 | BamHI-Ndel |
| StiolT2-R | SEQ ID NO.14 | SalI |
| Atu5935-F2 | SEQ ID NO.15 | EcoRI-NcoI |
| Atu5935-R | SEQ ID NO.16 | BamHI |
| Atu2525-F | SEQ ID NO.17 | BamHI-NdeI |
| Atu2525-R | SEQ ID NO.18 | SalI |
| sAtiep-TF | SEQ ID NO.19 | BspHI |
| sAtiep-TR | SEQ ID NO.20 | SacI |
表3
实施例2：肌醇转运体的活性的评价
将作为在上述实施例1中制备的，包含源自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、根癌农杆菌(A.tumefaciens)的肌醇转运体的各重组质粒、pACYCD-BsiolT(F2)、pACYCD-BsiolT-BsiolF(F2)、pACYCD-StiolT1(F2)、pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)、pACYCD-Atu5935(F2)、pACYCD-Atu5935-Atu2525(F2)与包含将肌醇转换为D-手性肌醇的肌醇脱氢酶及肌糖异构酶编码基因的重组质粒pCOLAD-sAtiep-sAtiepf一同转化于大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)，从而制备了转化菌株。
在直径为25mm、高度为150mm的玻璃试验管培养了5mL的所制备的重组转化菌株。培养条件如下：利用含有1％(w/v)的肌醇、50mg/L的氯霉素、50mg/L的卡那霉素的M9最小培养基，来在30℃温度及250rpm的条件下，当菌体达到光密度为0.6时，添加1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷来进行诱导(induction)后，培养了48小时。为了分析肌醇及D-手性肌醇，对培养液进行离心分离，来取1mL的培养上清液，并煮10分钟之后，重新进行离心分离，从而取500μL的上清液。对经预处理的培养上清液进行高效液相色谱法(Shimadzu LClOAvp)分析，分析条件如下：采用Kromasil-5NH2柱(4.6mm×250mm)，流动相为75％的乙腈(acetonitrile)，柱温度为40℃，并利用示差折射率(RI)检测器。图2示出肌醇及D-手性肌醇及它们的异构体的高效液相色谱法色谱图。
图3示出测定各肌醇转运体的活性的结果。根据图3的结果，在pACYCDuet-1均含有源自鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的主转运体和副转运体的StiolT1和StiolT2的pACYCD-StiolT1-StiolT2的情况下，D-手性肌醇的转换率最优秀，在源自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和根癌农杆菌(A.tumefaciens)的肌醇转运体中，D-手性肌醇的转换率非常低。在转换率最优秀的鼠伤寒沙门氏菌的转运体的情况下，在24小时内，从10g/L的肌醇转换为约1.2g/L的D-手性肌醇，在48小时内，转换出约1.1g的D-手性肌醇，呈现出在24小时之后，转换率并不上升。在菌体生长方面，在导入基因的情况下，呈现出稍微被抑制的形态，由于转运体蛋白质的特性，转运体位于细胞膜，因而当过度表达时，呈现出毒性。
实施例3：肌醇脱氢酶及肌糖异构酶基因的克隆以及包含其的重组载体的制备
通过以下反应式1至反应式3的连续反应，从肌醇转换为D-手性肌醇。由肌醇脱氢酶(inositol dehydrogenase)催化反应式1及反应式3的反应，由肌糖异构酶(inososeisomerase)催化反应式2的反应。
[反应式1]
肌醇+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化态)(NAD+)＜---＞2-酮基-肌醇+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原态)(NADH)+H+
[反应式2]
2-酮基-肌醇＜---＞1-酮基-D手性肌醇
[反应式3]
1-酮基-D-手性肌醇+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原态)(NADH)+H+＜---＞D-手性肌醇+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化态)(NAD+)
从根癌农杆菌(A.tumefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、菠萝泛菌(Pantoea ananantis)克隆具有与肌醇脱氢酶(iolG)及肌糖异构酶(iolI)相同的功能的基因。从上述菌株的基因组脱氧核糖核酸扩增与iolG基因及iolI基因相对应的基因，并将扩增的iolG基因及iolI基因的基因对及组合插入于pCOLADuet-1表达载体(Novagen)，来制备了6种重组质粒。下列表4示出上述所列的iolG及iolI的同源基因的信息。
表4
3-1.重组载体pCOLAD-sAtiep-sAtiepf的制备
从Agrobacterium sp.AB10121菌株(WO 02/055715A)制备包含iolG基因及iolI基因的重组载体pCOLAD-sAtiep-sAtiepf的方法已经在上述实施例1中进行了说明。
3-2.重组载体pCOLAD-AGRL628-AGRL627的制备
通过以下方法制备了包含源自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的iolG基因及iolI基因的重组载体。利用引物AGRL628-F和AGRL628-R来从Agrobacterium tumefaciensstr.C58(taxid:176299；GenBank NID:NC_003062,ATCC33970)的基因组脱氧核糖核酸扩增相当于iolG基因的AGRL628基因，并将其用限制酶PciI和SacI裂解，来向pCOLADuet-1(Novagen)的NcoI和SacI部位导入，从而制备了pCOLAD-AGRL628。并且，利用AGRL627-F引物和AGRL627-R引物，来扩增相当于iolI基因的AGRL_627，并将其用限制酶NdeI和SaiI裂解，来插入于pCOLAD-AGRL628的NdeI和XhoI部位，从而制备了pCOLAD-AGRL628-AGRL627重组载体。
3-3.重组载体pCOLAD-BsiolG-BsiolI的制备
通过以下方法制备了包含源自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的iolG基因及iolI基因的重组载体。利用BsiolG-F引物及BsiolG-R引物来从Bacillus subtilissubsp.subtilis str.168(taxid:224308；GenBank NID:NC_000964,ATCC23857)的基因组脱氧核糖核酸扩增相当于iolG的BsiolG之后，用限制酶PciI和NotI裂解，并插入于pCOLADuet-1的NcoI和NotI部位，来制备了pCOLAD-BsiolG。并且，利用BsiolI-F引物和BsiolI-R引物，来扩增相当于iolI的BsiolI，并将其用限制酶NdeI和PacI处理，插入于在上述构建的质粒pCOLAD-BsiolG的相同的限制酶的部位，从而制备了pCOLAD-BsiolG-BsiolI。
3-4.重组载体pCOLAD-CgiolG-CgiolI0169的制备
通过以下方法制备了包含源自谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的iolG基因及iolI基因的重组载体。利用CgiolG-F引物和CgiolG-R引物，来从Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032(taxid:196627；GenBank NID:NC_003450,ATCC13032)的基因组脱氧核糖核酸扩增相当于iolG的CgiolG之后，用限制酶BspHI和NotI裂解，并插入于pCOLADuet-1的NcoI和NotI部位，从而制备了pCOLAD-CgiolG。并且，利用CgiolI0169-F引物和CgiolI0169-R引物来扩增相当于iolI的CgiolI0169，并用NdeI和PacI处理，来插入于在上述构建的pCOLAD-CgiolG的相同的限制酶部位，从而制备了pCOLAD-CgiolG-CgiolI0169载体。
3-5.重组载体pCOLAD-Paidh-PaiolI的制备
通过以下方法制备了包含源自菠萝泛菌(Pantoea ananantis)的iolG基因及iolI基因的重组载体。利用Paidh-F引物和Paidh-R引物，来从Pantoea ananatis LMG20103(taxid:706191,GenBank NID:NC_013956,KCCM40419)的基因组脱氧核糖核酸扩增相当于iolG的Paidh之后，用限制酶PciI和NotI裂解，并插入于pCOLADuet-1的NcoI和NotI部位，来制备了pCOLAD-Paidh。并且，利用PaiolI-F引物和PaiolI-R引物，来扩增相当于iolI的PaiolI，并将其用NdeI和PacI处理之后，插入于所制备的上述载体pCOLAD-Paidh的相同的限制酶部位，从而制备了pCOLAD-Paidh-PaiolI。
3-6.重组载体pCOLAD-Cgiep-PaiolI的制备
为了制备组合源自不同的菌株的iolG基因及iolI基因的重组载体，首先，在谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)基因组上，克隆了作为iolG基因的BD171257_CDS1(GI:27877069)的同源性低且未被报告功能的iolG同源基因Cgiep(NCg12957或GI:19554252)。并且，在相当于iolI的基因的情况下，同样将与作为iolI基因的BD171257_CDS 2(GI:27877069)的同源性低且未被报告功能的作为源自菠萝泛菌(P.ananatis)的iolI的PaiolI用于组合中。若更详细地说明，则利用引物Cgiep-F和Cgiep-R来从Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032(taxid:196627；GenBank NID:NC_003450,ATCC13032)的基因组脱氧核糖核酸扩增Cgiep之后，用限制酶BspHI和NotI处理并裂解，并插入于pCOLADuet-1的NcoI和NotI部位，来制备了pCOLAD-Cgiep。之后，用NdeI和PacI将pCOLAD-Cgiep处理并裂解，并在其中插入以相同的限制酶裂解的PaiolI，从而最终制备了pCOLAD-Cgiep-PaiolI载体。
下列表5示出在上述实施例3中用于制备重组载体的引物，下列表6对上述所制备的重组载体进行了整理。
表5
| 引物 | 序列号 | 限制酶部位 |
| AGRL628-F | SEQ ID NO.32 | PciI |
| AGRL628-R | SEQ ID NO.33 | SacI |
| AGRL627-F | SEQ ID NO.34 | BamHI-NdeI |
| AGRL627-R | SEQ ID NO.35 | SalI |
| BsiolG-F | SEQ ID NO.36 | PciI |
| BsiolG-R | SEQ ID NO.37 | NotI |
| BsiolI-F | SEQ ID NO.38 | NdeI |
| BsiolI-R | SEQ ID NO.39 | PacI |
| CgiolG-F | SEQ ID NO.40 | BspHI |
| CgiolG-R | SEQ ID NO.41 | NotI |
| CgiolI0169-F | SEQ ID NO.42 | NdeI |
| CgiolI0169-R | SEQ ID NO.43 | PacI |
| Paidh-F | SEQ ID NO.44 | PciI |
| Paidh-R | SEQ ID NO.45 | NotI |
| PaiolI-F | SEQ ID NO.46 | NdeI |
| PaiolI-R | SEQ ID NO.47 | PacI |
| Cgiep-F | SEQ ID NO.48 | BspHI |
| Cgiep-R | SEQ ID NO.49 | NotI |
表6
3-7.克隆的基因的同源性
图4及图5示出克隆的iolG基因及iolI基因的系统树，下列表7及表8示出这些基因的同源性分析结果。
表7
表8
实施例4：D-手性肌醇生产菌株的最佳培养条件的确定
在实施例3中制备的重组质粒中，将pCOLAD-Cgiep-PaiolI与pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)一同导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，来试图实现重组菌株培养的最佳化。
4-1.基于培养温度的D-手性肌醇的生产率的调查
在300mL的具有凹槽(baffled)的三角瓶中培养了50mL。培养条件如下：利用包含15％(w/v)的肌醇、50mg/L的氯霉素、50mg/L的卡那霉素的TB培养基(terrific broth)来在30℃和37℃的温度及180rpm的条件下培养了约40小时。在光密度为0.6时，添加浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，来进行了诱导(induction)。在培养条件中，所添加的肌醇的浓度以相应温度下的溶解度(约16～17％(w/v))为基准来定。
为了分析肌醇及D-手性肌醇，对培养液进行离心分离，取1mL的培养上清液，并煮10分钟后重新进行离心分离，来取500μL的上清液。对于经预处理的培养上清液进行高效液相色谱法(Shimadzu LClOAvp)分析，分析条件如下：采用Kromasil-5NH2柱(4.6mm×250mm)，流动相为75％的乙腈(acetonitrile)，柱温度为40℃，并利用示差折射率(RI)检测器。图6示出以上的结果。
TB培养基中的碳源甘油在30℃及37℃的温度下，均在约24小时时耗尽，与此相对应地，菌体生长也在约24小时时停止。在碳源耗尽、菌体生长停止的24个小时，D-手性肌醇在30℃的温度下，生成约12g/L，在37℃的温度下，生成约14g/L，是前者的约1.2倍。在菌体生长停止后，继续转换为D-手性肌醇，在37℃的温度下，经过约28小时，增加为约19g/L，在30℃的温度下，经过约32小时，增加为约19g/L。
众所周知，这种从肌醇到D-手性肌醇的转换有反应平衡的干预(Yoshida et al.,AEM72,2006)。即，在肌醇与D-手性肌醇之间有着约86:14的物理化学反应平衡的干预，相当于150g/L的肌醇的D-手性肌醇的量为约20g/L。这在本实施例中也实验性地得到了确认。即，在添加D-手性肌醇来进行培养的情况下，生成了接近以上的反应平衡比率的肌醇(结果未显示)。基于这种结果，所生产的19g/L的D-手性肌醇的量是添加150g/L的肌醇来进行培养所得到的最大值。在温度为37℃的情况下，达到这种反应平衡的时刻也比在30℃的温度条件快约4小时。最终，就培养温度方面，确认了合适的培养温度为37℃。
4-2.基于诱导时期的D-手性肌醇的生产率
观察了导入pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)和pCOLAD-Cgiep-PaiolI的大肠杆菌BL2(DE3)菌株基于诱导时期的D-手性肌醇的生产率。将未添加作为诱导剂的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的组为阴性对照组，分别在培养初期的0时间、光密度为0.6、光密度为3、光密度为10时，并分别进行投放来在37℃的温度下确认了生产率。除此之外的培养条件与上述项目4-1相同，图7示出培养结果。
在未执行基于异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导(induction)的组和在完全停止生长后的光密度为10时添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷来进行诱导的组中，呈现出非常低水平的D-手性肌醇的生产量。在开始培养时，投放异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的组中，初期呈现出严重的菌体生长抑制形态。即使在光密度为0.6和光密度为3的组中，若被诱导(induction)，则即刻呈现出菌体生长被抑制的形态，究其原因，可能是由于借助异丙基-β-D-硫代半乳糖苷来使蛋白质表达，并本应用于菌体生长的氮源、碳源等被消耗在蛋白质合成上，或蛋白质导致肌醇转运体的膜受损。最终，确认在光密度为0.6或光密度为3时，即在对数期初期，菌体多少适应新的培养基环境，并在开始对数生长时投放诱导剂(inducer)，这是最优选的。
4-3.基于诱导剂的种类的D-手性肌醇的生产率的确认
观察了导入pACYCD-StiolT1-StiolT2(F2)和pCOLAD-Cgiep-PaiolI的大肠杆菌BL21(DE3)菌株的基于诱导剂(inducer)的种类的D-手性肌醇的生产率。由于作为诱导剂的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷呈现出抑制细胞生长的形态，因而添加了可替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的乳糖作为诱导剂。以调节添加时期和添加量的方式添加乳糖，在初期，光密度为0.6、光密度为7时添加0.5％(w/v)的乳糖，或在光密度为0.6时添加0.1％的乳糖。除此之外的培养条件与上述项目4-1中所说明的内容相同，图8示出其结果。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的情况下，与上述项目4-2的结果相同，确认到初期生长被抑制，在添加乳糖的组中，未确认到这种形态。在初期添加0.5％的乳糖的情况下，D-手性肌醇的生产速度最快，在光密度为7时添加乳糖的情况下，确认到D-手性肌醇的生产也相应地变晚的形态。乳糖借助菌体生长并表达的lacZ基因，来形成异乳糖(allolactose)，这会启动本发明的表达载体的T7启动子。即，只有菌体适应高浓度的肌醇，即适应高渗透压环境并开始生长，启动子才会启动，因而基于这种乳糖的表达可被视为减少菌体的毒性。
通过以上实施例4确认的最佳培养条件为使用TB培养基来将乳糖预先添加于培养基中，并在37℃的温度下进行培养，利用该条件来执行了之后的实验。
实施例5：D-手性肌醇转换基因活性的比较
将在上述实施例3中构建的作为表达肌醇脱氢酶及肌糖异构酶的表达载体的pCOLAD-sAtiep-sAtiepf、pCOLAD-AGRL628-AGRL627、pCOLAD-BsiolG-BsiolI、pCOLAD-Cgio1G-CgiolI0169、pCOLAD-Paidh-PaiolI、pCOLAD-Cgiep-PaiolI的各载体与作为在实施例2中确认转运体活性的肌醇转运体的pACYCD-StiolT1-StiolT2重组质粒载体一同导入于大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)，来制备了6种重组菌株。利用在实施例4中经实验的最佳发酵条件来培养了所制备的重组菌株。图9示出对培养的测定结果。
从D-手性肌醇的对数生产时期(约8小时至24小时)的生产速度(图9的(C)部分)来看，重组质粒pCOLAD-AGRL628-AGRL627呈现最低，即0.09，pCOLAD-sAtiep-sAtiepf(WO 02/055715)也以0.14呈现出低水平。在本发明中选择的基因中，肌醇脱氢酶与Cgiep、肌糖异构酶与PaiolI的组合，即，在pCOLAD-Cgiep-PaiolI中，以0.48的梯度呈现出最快转换为D-手性肌醇，这个值比最低的pCOLAD-AGRL628-AGRL627的情况快约5.3倍，比表示第二次速度的pCOLAD-CgiolG-CgiolI0169(0.26)的情况高1.8倍。在培养40小时之后生产的D-手性肌醇的浓度也在pCOLAD-Cgiep-PaiolI中最高。最终菌体生长速度总体上在约12小时以内进入停止期，菌体浓度也与以上的D-手性肌醇的生产速度成正比，在pCOLAD-sAtiep-sAtiepf中最低，在pCOLAD-Cgiep-PaiolI中最高。最终，在导入pCOLAD-Cgiep-PaiolI的情况下，从150g/L的肌醇转换出22.7g/L的D-手性肌醇，转换率为约15.1％。在转换率最低的pCOLAD-sAtiep-sAtiepf中，转换出约12.5g/L的D-手性肌醇，转换率停留在约8.3％。基于上述结果，将导入pCOLAD-Cgiep-PaiolI的重组大肠杆菌菌株作为生产菌株来进行了发酵实验。
实施例6：通过重组菌株的发酵的生产量的增大
利用在以上执行的培养最佳化结果和从优秀基因的选择结果中得到的最佳重组菌株来执行了1L的发酵。在MARADO-PDA(韩国大田CNS公司)3L的发酵槽中以1L的容量执行发酵。种子培养(seed culture)使用2YT培养基，在本培养中，向TB培养基中添加15％的肌醇、0.5％的乳糖。在使温度、pH、DO稳定的发酵槽中接种培养到光密度为3的50mL的种子培养液之后，培养了约20小时。将发酵温度调节为37℃，利用氨水来将pH调节为7.0，并在将DO减少为40％以下之后，增加转速来维持在40％以上。图10示出发酵结果。菌体在18小时时最多达到光密度为18，D-手性肌醇在约12个小时时达到作为平衡浓度的约20g/L之后，不再增加。
实施例7：所生产的D-手性肌醇的分馏及气相色谱-质谱分析
从微生物生产的D-手性肌醇的分馏利用高效液相色谱法(Shimadzu LClOAvp)来执行。分析条件如下：采用Kromasil-5NH2制备柱(10mm×250mm)，流动相为75％的乙腈(acetonitrile)，柱温度为40℃，并利用示差折射率(RI)检测器，注入100μl的试样，并以4mL/分钟的流速流出，来取得相应峰值(peak)的溶出液。利用真空浓缩机(日本东京理化公司，EYELA)来对所收集的溶出液进行浓缩及干燥，之后溶解于5mL的蒸馏水，来实施了气相色谱-质谱分析。
气相色谱-质谱分析使用了Shimadzu GCMS-QP2010。分析之前的处理如下：在以1:1混合1-三甲基硅烷基咪唑(1-trimethylsylyl-imidazole)和吡啶(pyridine)而成的1mL的溶液中溶解1mg的试样，之后在70℃的温度下反应30分钟来用于分析。分析条件如下：使用HP-1毛细管柱(capillary column)(长度(Length)为30m，内径(ID)为0.25mm，薄度(Film)为0.25μm)，向分割模式注射器(Split mode injector)(1:50)注入1μl的试样，并以1mL/分钟的流速进行了分析。试样的注入温度为280℃，烘箱的温度在150℃下维持2分钟后，以20℃/分钟的速度上升至300℃后维持了2分钟。将分析结果的质谱(MS)文件与标准试样D-手性肌醇(Sigma 468045，美国西格玛公司)的文件进行了比较，并将其结果示于图11。与标准试样进行比较，其结果，确认到准确一致。
以上，对本发明的特定部分进行了详细记述，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，这种具体记述仅仅是优选实施例，很显然，本发明的范围并不限定于此。因此，本发明的实质性的范围应根据所附的发明要求保护范围和其等同技术方案来定义。
Claims (5)
1.一种从肌醇生产D-手性肌醇的方法，其包括：
步骤(a)，使用如下载体来转化大肠杆菌(E.coli)细胞：
(i)包含操作性地与启动子相结合的肌醇转运体编码DNA序列的重组载体、以及
(ii)包含操作性地与启动子相结合的肌醇脱氢酶编码DNA序列及肌糖异构酶编码DNA序列的重组载体，
从而得到转化的大肠杆菌(E.coli)细胞；以及
步骤(b)，在包含肌醇的培养基中培养所述转化的大肠杆菌(E.coli)细胞，
其中所述肌醇转运体由下列序列组成：
在SEQ ID NO:3中公开的氨基酸序列、或者
在SEQ ID NO:3和4中公开的氨基酸序列，
其中所述肌醇脱氢酶由在SEQ ID NO:31中公开的氨基酸序列组成，且
其中所述肌糖异构酶由在SEQ ID NO:30中公开的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤(b)之后，还包括从培养了所述转化的大肠杆菌(E.coli)细胞的培养物分离D-手性肌醇的步骤(c)。
3.一种大肠杆菌(E.coli)细胞，其使用如下载体来转化所述大肠杆菌(E.coli)细胞：
(i)包含操作性地与启动子相结合的肌醇转运体编码DNA序列的重组载体、以及
(ii)包含操作性地与启动子相结合的肌醇脱氢酶编码DNA序列及肌糖异构酶编码DNA序列的重组载体，
其中所述肌醇转运体由下列序列组成：
在SEQ ID NO:3中公开的氨基酸序列、或者
在SEQ ID NO:3和4中公开的氨基酸序列，
其中所述肌醇脱氢酶由在SEQ ID NO:31中公开的氨基酸序列组成，且
其中所述肌糖异构酶由在SEQ ID NO:30中公开的氨基酸序列组成。
4.一种用于从肌醇生产D-手性肌醇的用途的组合物，其中所述用于从肌醇生产D-手性肌醇的用途的组合物包含所述权利要求3所述的大肠杆菌(E.coli)细胞。
5.一种用于从肌醇生产D-手性肌醇的重组载体试剂盒，其包含如下重组载体作为有效成分：
(i)包含操作性地与启动子相结合的肌醇转运体编码DNA序列的重组载体、以及
(ii)包含操作性地与启动子相结合的肌醇脱氢酶编码DNA序列及肌糖异构酶编码DNA序列的重组载体，
其中所述肌醇转运体由下列序列组成：
在SEQ ID NO:3中公开的氨基酸序列、或者
在SEQ ID NO:3和4中公开的氨基酸序列，
其中所述肌醇脱氢酶由在SEQ ID NO:31中公开的氨基酸序列组成，且
其中所述肌糖异构酶由在SEQ ID NO:30中公开的氨基酸序列组成。
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