WO2014051358A1 - 미생물을 이용한 ｄ-카이로 이노시톨의 생산 방법 - Google Patents

미생물을 이용한 ｄ-카이로 이노시톨의 생산 방법 Download PDF

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윤상활
이현서
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    • C12Y101/01018—Inositol 2-dehydrogenase (1.1.1.18)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing D-chiroinosino using microorganisms. More specifically, the present invention relates to a method for producing D-chiro inosyl from myo-inosyl by transformed microbial host cells.
  • D-chiro-inosyl (D-chi ro-osinositol, cis - l, 2, 4-tr ans— 3,5,6-cyclohexol) is derived from inyo-inositol, cis- l, 2,3,5—trans—4,6—cyclohexanehexol) is a stereoisomer of hydroxyl group 3 epimerized (Fig. 1).
  • D-Cyro-Inosyl is reported to be an important mediator of insulin signaling as an important component of phosphoglycans (IPG) and is known to be effective in the treatment of type 2 diabetes.
  • D-Cyro-inosyl is primarily found in eukaryotes and is biosynthesized by epimerization of myioininosyl.
  • D-Cyro-inosyl is mainly produced by hydrochloric acid hydrolysis of D-pi n itol or kasugamycin (US Pat No. 5827896, US Pat No. 5091596, US Pat No) 5463142, US Pat No. 5714643).
  • raw materials such as pinir and kasugamycin are expensive, and the organic synthesis method (US Pat No. 5406005, WO 96/25381) is also known, but it is not economically easy to separate by-products.
  • many papers and patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.
  • the present inventors have made efforts to produce chiro-inosine from myo-inosino using microorganisms, and as a result, myo-inosinotransporter (myo ⁇ inositol transporter), and inosi-dehydrogena were produced.
  • myo-inosinotransporter myo ⁇ inositol transporter
  • inosi-dehydrogena Inositol dehydrogenase and inosine areomerase ( ⁇ -3 ⁇ 4i) ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 " ⁇ "2; 2: 3 ⁇ 4 " host cells transformed with expression vectors
  • the present invention was completed by confirming that E. coli -Inosi can be produced in high yield.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for producing D-chiro-inos including the transformed host cell.
  • Another object of the present invention is to produce a D-chirozynosine comprising a recombinant vector having a DNA sequence encoding a myo-inosine transporter, an inosi dehydrogenase and an inososomerase To provide a kit.
  • the present invention provides a method for producing D-chiro-inositol from myo-inositol from myo-inositol.
  • A a recombinant vector comprising a myo-inositol transporter coding DNA sequence operably linked to a promoter;
  • transforming a host cell into a recombinant vector comprising an inositol dehydrogenase coding DNA sequence and an inosole isomerase coding DNA sequence operably linked to a promoter Obtaining a converted host cell; And (b) culturing the transformed host cell in a medium comprising myo-inosine.
  • myo inositol transporter refers to a transport enzyme that transfers myo-inosine into a cell. Most cells have an inos transport system that absorbs inos in the medium into the cell, and myo-inos transporters have been identified in a variety of cells, from mammalian cells to bacteria.
  • Aerobacter aerogenes [Deshusses, J., and Reber, G., 1972, Biochim. Biophys. Acta 274, Bacteriol. 126, 243-250, Pseudomonas put i da [Reber, G., Belet, M., and Deshusses, J., 1977, J. Bacterol. 131, 872-875], Pseudomonas species [Gauchat-Feiss, D., Frey, J., Belet, M., and Deshusses, J., 1985, J. Bacteriol. Myo-inosi transporter genes were isolated from bacteria such as 162 and 324-32.
  • the myo-inosity transporters used in the present invention may be those derived from mammalian cells, yeast cells or bacteria, and preferably bacteria-derived transporters. More preferably, those isolated from Bacillus subtilis, Salmonella typhi murium or Agrobacterium imef aciens can be used, and most preferably Salmonella typhimurium A transporter derived from (Salmonella typhi murium) is used.
  • the myo-inosity transporter of the present invention may use one or more transporters selected from the group consisting of proteins having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6.
  • the activity of catalyzing a chemical reaction or a reverse reaction thereof converting myo-inosine into 2-keto-myo-inositol by NAD dependent oxidation is an enzyme having.
  • Inosi dehydrogenase is also described herein as the gene name "iolG” encoding it.
  • Dehydrogenase is aerobacter aerogenes [Berman T, Magasanik ⁇ ] myopheninosine + NAD + ⁇ -> 2-keto-myo-inositol + NADH + H + inosine (1966). J. Biol. Chem. 241 (4): 800-806; LARNER J, JACKSON WT, GRAVES DJ, STAMER JR (1956). Arch. Biochem. Biophys. 60 (2): 352-363) and yeast Cryptococcus mel ibiosum [Vidal-Leir ia M, van Uden N (1973). Biochim. Biophys. Acta. 293 (2): 295-303].
  • the inosi dehydrogenase which can be used in the present invention is preferably Agrobacterium tumefaciens, Bacillus subtilis, Corynebacterium Isolated from Corynebacterium glutamicum, or Pantoea ananantis. More preferably, the inosino dehydrogenase of the present invention is SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 and so on. Any one selected from the group consisting of proteins having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 31 can be used.
  • inosomer isomerase refers to 2keketo-myo-inosyl and 1-keto-D-chiro-inosine (1-keto-chiro -inositol) is an enzyme having the activity of catalyzing isomerization reaction or its reverse reaction.
  • inosomer isomerase is also described by the gene name “ioll” encoding it.
  • Inosost isomerase that can be used in the present invention is preferably Agrobacterium tumefaciens, Bacillus subtil is, Corynebacterium glutamicum, or Panto It is isolated from Panantoea ananantis. More preferably, the inosost isomerase of the present invention may use any one selected from the group consisting of proteins having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, and SEQ ID NO: 30. have.
  • the 1-keto-D-chiro-inosi produced by the reaction formula 2 produces the final product of the present invention, D-chiropyinosino, by the following reaction formula 3.
  • the reaction of Scheme 3 below is catalyzed by the enzyme described above, "Inosi dehydrogenase.”
  • myopininosine is converted into D-chiro-inosyl by the continuous reaction of reactions 1 to 3 in the host cell, as described.
  • the reactions of reactions 1 and 3 are catalyzed by "inhydrosase dehydrogenase” and reaction of reactions 2 is catalyzed by "inosomer isomerase”.
  • Myo-inosity in the present invention is a transporter, inositol dehydrogenase, inososomerase coding.
  • the DNA sequence is operably linked to a promoter in a recombinant vector.
  • operatively linked means that the functional sequence is linked to the expression control sequence of the DNA sequence, the expression of the DNA sequence is controlled by the expression control sequence by the functional binding.
  • promoter means a DNA sequence capable of controlling the expression of a gene coding sequence or functional RNA.
  • the vector in the present invention may be constructed through various methods known in the art, and specific methods thereof are disclosed in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) by Sambrook et al. Which is hereby incorporated by reference.
  • the recombinant vector of the present invention can be constructed as a vector for cloning or expression, and can be constructed with prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter for example, a ⁇ promoter, a trp promoter, a lac promoter, a T7 promoter, a tac promoter, etc.
  • a strong promoter for example, a ⁇ promoter, a trp promoter, a lac promoter, a T7 promoter, a tac promoter, etc.
  • E. coli E. coli is used as a host cell
  • the promoter and operator sites of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158: 1018-1024 (1984)
  • phage A leftward promoter of ⁇ ⁇ promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14: 399 # 445 (1980)
  • ⁇ promoter Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14: 399 # 445 (1980)
  • the vector of the present invention is an optional marker and may include antibiotic resistance genes commonly used in the art, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin And resistance genes for tetracycline, but is not limited thereto.
  • the antibiotic resistance gene is operably linked with a promoter for its expression.
  • Vectors that can be used in the present invention are plasmids often used in the art (e.g., pSClOl, ColEl, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pGEX series® ET series and pUCl9, etc.), phage (e.g., Xgt4 o ⁇ , ⁇ ).
  • the vector of the present invention is preferably a vector for prokaryotic cells and comprises a nucleic acid sequence that allows replication in prokaryotic host cells, in particular E. coli.
  • the vector of the present invention may include a replication origin of a bacteriophage such as a replication origin or fl origin of a bacterium of coIA, colEl or ⁇ 15 ⁇ .
  • Any host cell capable of stably and continuously cloning and expressing the recombinant vector of the present invention may use any host cell known in the art.
  • mammalian cells, insect cells, eukaryotic cells such as yeast or prokaryotic cells may be used.
  • prokaryotic cells are used.
  • prokaryotic cells for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E.
  • Bacillus subtilis Bacillus chew Strains of the genus Bacillus, such as lingensis, and enterococci and strains, such as Salmonella typhimurium, Serratia marcensons, Corynebacterium glutaminum and various Pseudomonas species.
  • the method of carrying the vector of the present invention into a host cell is performed by the CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973), when the host cell is a prokaryotic cell). ), One method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)) and electroporation methods (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16: 612 6145 (1988)) and the like.
  • the myo-inosine transporter in the recombinant expression vector, the inosino dehydrogenase and the inosoles isomerase are expressed, and the myosininosine in the culture medium is expressed. It is absorbed into and converted into D-chiroinosyl by the catalysis of the enzymes.
  • Cultivation of transformed host cells can be carried out by a known host cell culture method or a modified method thereof.
  • the medium for culturing the transformed host cell may be a natural medium or a synthetic medium if it contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salt, etc. that E.
  • Carbon sources that can be used include carbohydrates such as glucose and fructose sucrose; Starch, hydrolyzate of starch; Organic acids such as acetic acid and propinic acid; Ethane, propane, alcohol such as glycerol and the like.
  • the nitrogen source is ammonia; Ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate; Peptone, meat extract, water extract, yeast extract corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean extract, soybean hydrolysate; Various fermented cells and their lysates and the like.
  • Inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, dipotassiumhydrogen phosphate ⁇ magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions, such as by shaking culture or rotation by a rotator.
  • the culture temperature is preferably in the range of 10 to 40 ° C., the incubation time is generally carried out for 5 hours to 7 days.
  • the pH of the medium is preferably maintained in the range of 3.0 to 9.0 in culture.
  • the pH of the medium can be adjusted with inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, and the like.
  • antibiotics such as ampicillin, streptomycin, chloramphenicol, kanamycin and tetracycline can be added for maintenance and expression of the recombinant vector, if necessary.
  • a suitable inducer may be added to the medium if necessary.
  • IPTG isopropyl- ⁇ —D—thiogalactopyranoside
  • indole acrylic acid Gndoleacrylic acid can be added to the medium.
  • the method of the present invention comprises the above steps
  • Step (b) thereafter, further comprising the step (c) isolating D-chiro-inosi from the culture cultured transgenic host cells.
  • E. coli -Inosyl Separation of E. coli -Inosyl from the culture medium in which the transformed host cell is cultured is carried out using known and modified methods of isolating and purifying carbohydrates or sugars.
  • cultured transformants are removed from the medium.
  • the cultured transformant is removed from the culture by centrifugation or microfiltration, to obtain only the culture supernatant.
  • a method for obtaining a kkairo-inosi from the culture supernatant it is possible to use a conventionally known method for separation and purification of sugars and a modified method thereof.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a myo-inosi transporter-coding DNA sequence operably linked to a ( ⁇ ) promoter; And (ii) an inos operably linked to a promoter is provided with a host cell transformed with a recombinant vector comprising a dehydrogenase coding DNA sequence and an inosso isomerase coding DNA sequence.
  • the present invention provides a composition for use in producing acairo-inosi from myo-inosi comprising a transgenic host cell described above.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising: (i) a recombinant vector comprising a Myo-Inosi transporter coding DNA sequence operably linked to a promoter; And ( ⁇ ) an inos operably linked to a promoter comprising a recombinant vector comprising a dehydrogenase coding DNA sequence and an inosso isomerase coding DNA sequence as an active ingredient.
  • kits comprising a host cell, a composition comprising the same, and a recombinant vector, wherein the myo-inosity transporter, the inosi dehydrogenase, and the inososomerase; A recombinant expression vector comprising a DNA sequence encoding the same; Since the contents of the host cell including the recombinant expression vector are the same as those of the above-described aspect of the present invention, the description thereof will not be repeated.
  • the present invention relates to D-Cyro-Inosio from Myo-Inosio using transforming host cells expressing the enzyme Myo-Inosi transporter, Inosi dehydrogenase and Inososomerase. It is about how to produce a mold. According to the method of the present invention, it is possible to convert myo-inosine to chirojaninosino.
  • FIG. 2 shows HPLC chromatograms for myioininosine and D-chiro-inosothol and their stereoisomers or derivatives.
  • FIG. 3 shows myo-inosine in E. coli expressing dehydrogenase and inososomerase, and ino-inosity in transgenic E. coli obtained by additionally introducing a transporter of inos of various origins. D-Cairo-inosity shows the results of measurement of conversion and cell growth rate.
  • test group for each inositol transporter is the result of incubating the transporter expression vector with the recombinant Escherichia coli prepared for 24 hours and 48 hours by introducing pCOLAD-sAtiep-sAtiepf together.
  • White bars represent values measured after 24 hours of incubation and gray bars represent values measured after 48 hours of incubation.
  • Figure 5 shows a phylogenetic tree by homology analysis of inosos isomerase (ioll).
  • Figures 6a to 6c shows the results of measuring the conversion rate from the myo-inosity of the transformed E. coli of the present invention to D-chiro-inosilo depending on the culture temperature.
  • the experimental group for each symbol is as follows. If the 37 ° C, also at 6b '30 ° C O:: In Figure 6a ⁇ : 30 ° C, O if the amount of the remaining glycerol, in Figure 6c 37 ° C O: cell growth, ⁇ : H, ⁇ : Cell growth, ⁇ : pH, A: amount of remaining glycerol.
  • Figure 7 shows the results of measuring the conversion rate from myoininosi to E. cairo-inositol according to the induction time in culture of the transformed E. coli of the present invention.
  • the experimental group for each symbol is as follows. ⁇ : No induction, O: Induct ion at 0 hours, A: Induct ion at 0D 0.6, V: Induct ion at 0D 3 ⁇ : Induction at 0D 10 ( induct ion).
  • Figure 8 shows the results of measuring the conversion rate from myoininosi to D-Cairo-inosino in accordance with the type of inducer in the culture of the transformed E. coli of the present invention.
  • the experimental group for each symbol is as follows. ⁇ : Add 1 mM IPTG at 0D 0.6 ⁇ O: Add 0.5% lactose at 0 hours, A: Add 0.5% lactose at 0D 0.6, ⁇ : Add 0.5% lactose at 0D 7, ⁇ : Add 0.1% lactose at 0D 0.6.
  • PCOLAD-Cgiep-PaiolI PCOLAD-Cgiep-PaiolI, ⁇ : pCOLAD-sAt iep-sAt iepf, ⁇ : pCOLAD-AGRL628-AGRL627, V: pCOLAD-BsiolG-Bsiol I, ⁇ : pCOLAD-CgiolG- Cgiol 10169, t> : pCOLAD-Paid -Paiol I.
  • Figure 10 is an experimental result confirming the production of D-chirojan inosolo from myo-inosile by 1 liter fermentation under optimal culture conditions using the transformed E. coli selected in the present invention.
  • FIG. 11 shows the results of GC-MS analysis of the fractions of D—chirophyllosinosi produced by the strain of the present invention.
  • Myo-inosity from Bacillus subtilis, Salmonel la typhimurium, and Agrobacterium tumefaciens strains reported to use myoininosi as a carbon source Were cloned the major and minor genes of the transporter (my inositol transporter), respectively.
  • B. subtilis is a transporter for myosininos
  • the genes are the iolT gene and the iolF gene, the Salmonella typhi murium, iolTl and iolT2 genes, and the Atu5935 gene and Atu2525 gene in A. iefaciens. Information on the above genes is shown in Table 1.
  • strain B. subtil Bacillus subt i 1 i s subsp. subtil is str. 168 (tax id: 224308; GenBank NID: NC_000964, ATCC23857) introduced main type transporter iolT and subtype transporter iolF into pACYCDuet-1 expression vector by genome DNA of pACYCD-BsiolT (F2) and pACYCD-BsiolT-BsiolF (F2) was constructed. Specifically, amplification of iolT from the genome DNA of B.
  • subtilis using primers BsiolT—F2 and BsiolT-R, followed by digestion with restriction enzymes Sacl and BamHI, yielded the vector pACYCDuet-l (Novagen). Inserted into the same site to prepare BsiolT (F2) as pACYC.
  • the enzyme was digested with restriction enzymes Ndel and Sail and inserted into the Ndel and Xhol sites of pACYCD-BsiolT (F2) prepared above, and pACYCD-BsiolT—BsiolF (F2 ) Was produced.
  • IolTl for strain S. typhimurium, Salmonella enter ica subsp. enter ica serovar Typhimurium str.
  • IolTl known as the main type transporter and iolT2, known as the subtype transporter, was amplified from LT2 ATCC700720 (taxid: 99287; GenBank NID: NC_006511, ATCC700720) and introduced into pACYCDuet-1 expression vector, and with pACYCD-St iolTl (F2).
  • pACYCD-StiolTl-StiolT2 (F2) was constructed.
  • iolTl was amplified from the genome DNA of Salmonella typhimurium (S ..
  • Atu5935 was amplified from the genome DNA of C58 (taxid: 176299; GenBank NID: NC— 003062, ATCC33970) using primers Atu5935-F2 and Atu5935-R and cleaved with restriction enzymes Ncol and BamHI to the same site of pACYCDuet-1 vector. Was inserted into pACYC to prepare Atu5935 (F2).
  • Atu2525 was amplified using the primers Atu2525-F and Atu2525-R, and then digested with restriction enzymes Ndel and Sail and inserted into the Ndel and Xhol sites of pACYCD-Atu2525 (F2) prepared above, pACYCD-Atu5935-Atu2525 (F2). ) was produced.
  • the inosio dehydrogenase gene (iolG) converting myo-inosity to D-chiro-inosio And the inosose isomerase gene (ioll) were cloned from Agrobacterium tumefaciens to obtain the vector pCOLADuet- It was introduced into l (Novagen) to produce a recombinant plasmid vector pCOLAD—sAt iep-sAt iepf.
  • the synthesized DNA molecule sA ep was PCR amplified using primers sAtiep-TF and sAtiep-TR as a template, and then cleaved with restriction enzymes BspHI and Sacl, and inserted into the same restriction enzyme site of pCOLADuet— 1 to pCOLAD-sA ep Was produced.
  • the synthesized DNA molecule sAtiepf was cleaved with Ndel and Sail, and inserted into the Ndel and Xhol sites of the prepared vector pCOLAD-sAtiep to finally produce a recombinant vector pCOLAD-sAt i ep-sAt i epf.
  • Example 1 myopinino derived from Bacillus subtilis, S. typhi murium, Agrobacterium tumefaciens (A. t ume faci ens) Recombinant plasmids containing c.
  • the prepared recombinant transformed strain was cultured 5 mL in a glass test tube having a diameter of 25 mm, height 150 mm. Cultivation conditions were 0D at 30 ° C and 250 rpm, using M9 minimum medium containing l% (w / v) myo-inosine, 50 mg / L chloramphenicol and 50 mg / L kanamycin. 1 mM when it reaches 0.6 IPTG was added to induce ion and incubated for 48 hours.
  • the culture solution was centrifuged to take 1 mL of the culture supernatant, boiled for 10 minutes, and centrifuged again to obtain the supernatant 500 UL.
  • the pretreated culture supernatant was analyzed by HPUXShimadzu LClOAvp).
  • Kromasil 5NH2 column (4.6 mm X 250 mm), mobile phase 75% acetonitrile, column silver 40 ° C, RI detector were used.
  • HPLC chromatograms for Myiox Inosyl and D-Cyro-Inosyl and their isomers are shown in FIG. 2.
  • the results of measuring the transporter activity of each myo-inosi are shown in FIG.
  • the Salmonella typhimurium transporter which has the best conversion rate, converts about 1.2 g / L of D—Cairo—Inosi from 10 g / L myo-inosi in 24 hours, and approximately l.lg in 48 hours. It has been shown that D-Cairopinosino is not converted and the conversion rate does not increase after 24 hours. Cell growth was slightly inhibited when the gene was introduced, which appears to be toxic upon overexpression because it is located in the cell membrane due to the nature of the transporter protein.
  • Example 3 Cloning of Inosino Dehydrogenase and Inososomerase Gene and Construction of a Recombinant Vector Comprising the Same
  • Amplified genes for iolG gene and ioll gene from the genome DNA of the strains, and amplified pairs and combinations of iolG and ioll genes were inserted into pCOLADuet-1 expression vector (Novagen) to prepare six kinds of recombinant plasmids.
  • Information on the iolG and ioll homologous genes listed above is shown in Table 4 below.
  • Agrobacterium sp The preparation method of the recombinant vector pCOLAD-sAtiep-sAtiepf containing iolG and ioll genes from AB10121 strain (TO 02 / 055715A) was described in Example 1 above.
  • Recombinant vectors containing the iolG and ioll genes from Agrobacterium tumefaciens were prepared by the following method.
  • the genome DNA of C58 (tax id: 176299; GenBank NID: NC_003062, ATCC33970) was used to amplify the AGRL628 gene corresponding to iolG using primers AGRL628-F and AGRL628-R, which were cleaved with restriction enzymes Pcil and Sacl to pCOLADuet- pC0LAD-AGRL628 was prepared by introducing into Ncol and Sacl sites of l (Novagen).
  • AGRL_627 corresponding to ioll was amplified using AGRL627-F and AGRL627-R primers and cleaved with restriction enzymes Ndel and Sail to insert pC0LAD-AGRL628-AGRL627 recombinant vector by inserting them into the Ndel and Xhol sites of pCOLAD—AGRL628. It was.
  • Recombinant vectors containing iolG and ioll genes derived from B. subtilis were constructed using the following method. Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BsiolG corresponding to iolG was amplified from the genome DNA of 168 (taxi (1: 224308; GenBank NID: NC_000964, ATCC23857) using BsiolG ⁇ F and BsiolG ⁇ R primers, and then cleaved with restriction enzymes Pcil and Notl to pCOLADuet- PCOLAD-BsiolG was prepared by inserting into Ncol and Notl sites of 1.
  • Bsioll—F and Bsioll-R primers were used to amplify Bsioll corresponding to ioll, and then treated with restriction enzymes Ndel and Pacl to construct the previously constructed plasmid.
  • pCOLAD-BsiolG-BsiolI was prepared by insertion into the same restriction enzyme site of pCOLAD-BsiolG. 3-4. Preparation of Recombinant Vector pCOLAD— CgiolG-CgiolI0169
  • Recombinant vector containing iolG and ioll gene derived from Corynebacterium glutamicum was prepared by the following method.
  • CgioIG corresponding to iolG was amplified from the genome DNA of Corynebacter ium lutamicum ATCC 13032 (tax id- ' 196627; GenBank NID: NC_003450, ATCC13032) using CgiotG_F and CgiolG-R primers, and cleaved with restriction enzymes BspHI and Notl by pCOLADuet PCOLAD-CgiolG was prepared by inserting into Ncol and Notl sites of ⁇ 1.
  • Recombinant vectors containing iolG and ioll genes from Pantoea ananatis were prepared by the following method. Amplify Paidh corresponding to iolG from the genome DNA of Pantoea ananatis LMG 20103 (taxid: 706191, GenBank NID: NC_013956, KCCM40419) using Paidh-F and Paidh-R primers, and then cleaved with restriction enzymes Pcil and Notl to pCOLADuet PCOLAD-Paidh was prepared by inserting into Ncol and Notl sites of -1.
  • iolG gene BD171257_CDS 1 (GI: 27877069) on the Corynebacterium glutamicum genome was first performed. This low and unreported function of the iolG homologous gene Cgiep (NCgl2957 or GI: 19554252) was cloned.
  • ioll is a gene derived from Pantoea ananatis (P. ananatis), whose function is not reported with low homology with the CDS 2 (GI: 27877069), which is also ioll gene BD17125.
  • Example 4 Establishing Optimal Culture Conditions of D-Cyro-Inosi Producing Strains
  • the recombinant plasmid pCOLAD-Cgiep-PaiolI prepared in Example 3 was introduced into the strain of Escherichia coli BL2KDE3 together with pACYCD-StiolTl-StiolT2 (F2). Trial optimization of recombinant strains was attempted.
  • the culture supernatant was centrifuged to obtain 1 tnL of culture supernatant, boiled for 10 minutes, and then centrifuged to obtain 500 yL of supernatant.
  • Pretreated culture supernatant was analyzed by HPLC (Shimadzu LClOAvp) and the analysis conditions were Kromasil 5NH2 Column (4.6 mm ⁇ 250 mm 3), mobile phase 75% acetonitrile, column silver 40 ° C., RI detector was used. The above result is shown in FIG.
  • the carbon source glycerol in TB medium was depleted at about 24 hours at both 30 ° C. and 37 ° C., and cell growth was also stopped at about 24 hours accordingly.
  • D-Cyro-inoshilt was produced at about 12 g / L at 30 ° C and about 1.2 fold higher at about 14 g / L at 37 ° C.
  • D- Cairo after the cell growth stationary - the Inno when continues the conversion was increased to about 19 g / L in about 28 hours, about 32 hours at 30 ° C at 37 ° C.
  • the amount of 19 g / L of D-chiro-inosi produced is the maximum of the culture with 150 g / L of myo-inosi added.
  • the time to reach this equilibrium was also about 4 hours faster than at 30 ° C.
  • 37 ° C is a suitable culture silver with respect to the culture temperature.
  • Example 5 Comparison of Activity of Conversion Genes with D-Cyro-Inosine
  • the inosi constructed in Example 3, were expression vectors pCOLAD-sAtiep-sAtiepf, PC0LAD-, which are expression vectors expressing dehydrogenase and inosus isomerase AGRL628-AGRL627, pCOLAD-Bs iolG-BsiolI, pCOLAD-Cg io 1 G-Cg io 110169 pCOLAD-Paidh-PaiolI, pCOLAD-Cgiep-Paiol I
  • Each of the vectors, the inos for confirming the transporter activity in Example 2 Six recombinant strains were prepared by introducing into the Escherichia
  • the production rate of D-Cairo-Inosi was lowest (0.09 for the recombinant plasmid pCOLAD—AGRL628-AGRL627), with the lowest production rate (pCOLAD-).
  • sAt iep-sAt iepf W0 02/055715
  • myo-inosine dehydrogenase was the fastest combination of Cgiep and inosus isomerase with Paioll, ie, the slope of 0.48 in pCOLAD-Cgiep-PaiolI.
  • This value was about 5.3 times faster than the lowest pC0LAD-AGRL628-AGRL627 and 1.8 times higher than the second rate of pCOLAD-CgiolG-Cgi ol 10169 (0.26).
  • the concentration of D-chiro-inosi produced after 40 hours of incubation was also highest in the case of pCOLAD- Cgiep-Paioll.
  • the final cell growth rate was at a standstill before about 12 hours overall, and the cell concentration was also the lowest in pCOLAD-sAtiep-sAtiepf and the highest in pCOLAD-Cgiep-PaiolI in proportion to the production rate of D-chiro-inosi above. .
  • MARADO-PDA [C & S, Daejeon, Korea)] A 3 liter fermenter was used at a capacity of 1 liter. The seed culture was 2YT medium, and 15% myo-inos and 0.5% lactose were added to the TB medium. 50 mL of the culture medium cultured to 0D 3 was inoculated into a fermenter stabilized with temperature, pH, and DO, followed by incubation for about 20 hours. The fermentation temperature was adjusted to 37 ° C and ⁇ pH was adjusted to 7.0 using ammonia water, and DO was maintained above 40% with increasing RPM after decreasing below 40%. Fermentation results are shown in FIG. 10.
  • GC-MS analysis was performed using Shimadzu GCMS-QP2010.
  • Pre-assay treatments consisted of 1-trimethylsylyl-imidazole and
  • the reaction was carried out for 30 minutes at 70 ° C and used for analysis.
  • the analysis conditions were HP-1 capillary column (30 m Length, 0.25 Dim ID, 0.25 Film), and a sample of 1 was injected into the split mode injector (1:50), and analyzed at a flow rate of 1 mL / min.
  • Sample injection temperature was maintained at 28 CTC, oven temperature for 2 minutes at 150 ° C. and then rose to 300 ° C at 20 ° C / min rate and maintained for 2 minutes.
  • the MS profile for the assay was determined using the standard D-Cairo-Inoshi (Sigma 468045, USA). Compared with the profile, the results are shown in FIG. As a result of comparing with the standard sample, it was confirmed that the exact match.

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Abstract

본 발명은 효소 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 형질전환 숙주세포를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면 높은 수율로 마이오-이노시톨을 D-카이로-이노시톨로 전환시킬 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
미생물을 이용한 D-카이로 이노시를의 생산 방법
【기술 분야】
본 발명은 미생물을 이용한 D-카이로 이노시를의 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 형질전환 미생물 숙주세포에 의한 마이오- 이노시를로부터 D-카이로 이노시를로의 생산 방법에 관한 것이다.
【배경 기술】
D-카이로-이노시를 (D-chi ro- inositol , cis~l,2, 4-t r ans— 3 ,5,6- cyclohexol)은 마이오一이노시를 (inyo—inositol , cis— l,2,3,5—trans—4,6— cyclohexanehexol)의 스테레오이소머로서 3번 하이드록실 그룹이 에피머화 된 형태이다 (도 1). D-카이로 -이노시를은 이노시를 포스포글리칸 (IPG)의 주요 구성성분으로 인슐린 신호전달의 중요한 매개체로 보고되어 있으며, 제 2형 당뇨의 치료에 효과가 있다고 알려져 있다. D-카이로 -이노시를은 주로 진핵생물에서 발견되며， 마이오ᅳ이노시를의 에피머화에 의해 생합성된다.
D-카이로 -이노시를은 주로 피니를 (D-pinitol)이나 카스가마이신 (kasugamycin)의 염산 가수분해에 의해 생산하고 있다 (U.S. Pat No. 5827896, U.S. Pat No. 5091596, U.S. Pat No. 5463142, U.S. Pat No.5714643). 그러나， 원료인 피니를이나 카스가마이신이 고가이며， 유기합성법 (U.S. Pat No. 5406005, W0 96/25381)도 알려져 있으나, 부산물의 분리가 용이하지 않아 경제성이 낮다.
Yamamoto 등은 Agrobacter ium sp. AB10121의 MI 에피머라제 (epimerase)를 발현시킨 세균을 이용하여 마이오-이노시를로부터 카이로 -이노시를로 전환하는 방법을 제시하였다 (JP2001-006878, W02002/055715) . Yamamoto 등에 의한 방법은 마이오ᅳ이노시를로부터 약 15% 수율로 D-카이로 -이노시틀을 생산할 수 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 미생물을 이용하여 마이오-이노시를로부터 카이로- 이노시를을 생산하고자 연구 노력하였으며 , 그 결과 , 마이오ᅳ이노시를 트랜스포터 (myo一 inositol transporter) , 이노시를 디하이드로게나아제 (inositol dehydrogenase) 및 이노시를 이소머라아제 (inositol isomer ase) "^- ¾i지" § ΐ¾ "ᄒ ΗΞ" ᅫ；2：¾" 발현백터로 형질전환된 숙주세포를 이용하면 마이오-이노시를로부터 으 카이로 -이노시를을 높은 수율로 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 형질전환 숙주세포를 이용하여 마이오- 이노시를로부터 D-카이로ᅳ이노시를을 생산하는 방법을 제공하는 데에 있다. 본 발명의 다른 목적은 마이오—이노시를 트랜스포터， 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 형질전환 숙주세포를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 숙주세포를 포함하는 D- 카이로-이노시를 생산용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 마이오-이노시를 트랜스포터， 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 서열을 갖는 재조합 백터를 포함하는 D-카이로ᅳ이노시를 생산용 키트를 제공하는 데에 있다. 본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이오-이노시를 (myo— inositol)로부터 으카이로- 이노시를 (D-chiro-inositol)을 생산하는 방법을 제공한다: (a) (i) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시틀 트랜스포터 (my으 inositol transporter) 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 백터 ; ( ii ) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시를 디하이드로게나아제 (inositol dehydrogenase) 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 (inosose isomerase) 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 백터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환된 숙주세포를 얻는 단계; 및 (b) 상기 형질전환된 숙주세포를 마이오- 이노시를을 포함하는 배지에서 배양하는 단계. 이하에서 본 발명을 각 단계에 따라 보다 상세하게 설명한다. 단계 (a): 마이오-이노시를 트랜스포터， 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 백터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환된 숙주세포를 얻는 단계. 본 명세서에서 용어 "마이오ᅳ이노시를 트랜스포터 (myo— inositol transporter)"는 마이오 -이노시를을 세포내로 이동시키는 수송효소를 의미한다. 대부분의 세포는 배지내의 이노시를을 세포내로 흡수하는 이노시를 수송 시스템을 갖고 있으며, 마이오-이노시를 트랜스포터는 포유동물 세포에서부터 박테리아에 이르기 까지 다양한 세포에서 확인되어 있다. 에어로박터 에어로게네스 (Aerobacter aerogenes) [Deshusses, J., and Reber , G. , 1972, Biochim. Biophys. Acta 274, Bacteriol . 126， 243- 250] , 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas put i da) [Reber , G. , Belet, M. , and Deshusses, J., 1977, J. Bacterol . 131, 872-875] , 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 [Gauchat-Feiss, D. , Frey , J., Belet , M. , and Deshusses, J. , 1985, J. Bacteriol. 162， 324-32기와 같은 박테리아에서 마이오-이노시를 트랜스포터 유전자가 분리되었다고 . 보고 되었으며, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) (Nikawa, J. , Nagumo, T.， and Yamashita, S. (1982) J. Bacteriol. 150, 441-446)와 같은 효모에서도 마이오-이노시를 트랜스포터 유전자가 분리되어 보고되었다. 또한， 마이오ᅳ이노시를 트랜스포터는 주타입 (major)과 부타입 (minor)이 존재하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 마이오-이노시를 트랜스포터는 포유동물 세포， 효모세포 또는 박테리아로부터 유래된 것을 사용할 수 있으며， 바람직하게는 박테리아 유래 트랜스포터를 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리엄 (Salmonella typhi murium) 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium imef aciens)로부터 분리된 것을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 살모넬라 티피무리엄 (Salmonella typhi murium) 유래의 트랜스포터를 사용한다.
바람직하게는 본 발명의 마이오-이노시를 트랜스포터는 서열번호 1 내지 서열번호 6 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 트랜스포터를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "이노시를 디하이드로게나아제' '은 하기 반웅식
1 에 나타낸 바와 같이 마이오 -이노시를을 NAD 의존성 산화작용에 의해 2- 케토 -마이오-이노시를 (2-keto-myo-inositol)로 변환시키는 화학반웅 또는 이의 역방향 반웅을 촉매하는 활성을 갖는 효소이다. 본 명세서에서 "이노시를 디하이드로게나아제 "는 이를 코딩하는 유전자 명칭 "iolG"으로도 기재한다.
[반웅식 1]
마이오ᅳ이노시를 + NAD+ <― > 2-케토 -마이오-이노시틀 + NADH + H+ 이노시를 디하이드로게나아제는 에어로박터 에어로게네스 (Aerobacter aerogenes) [Berman T, Magasanik Β (1966). J. Biol . Chem. 241 (4)： 800- 806; LARNER J, JACKSON WT, GRAVES DJ, STAMER JR (1956). Arch. Biochem. Biophys. 60 (2)： 352-363)과 효모 크립토코커스 멜리비오숨 (Cryptococcus mel ibiosum) [Vidal-Leir ia M, van Uden N (1973) . Biochim. Biophys . Acta. 293 (2)： 295-303]에서 분리되었다고 보고 되어 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 이노시를 디하이드로게나아제는 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) , 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 코리네박테리움 클루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 또는 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananantis)로 부터 분리된 것이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 이노시를 디하이드로게나아제는 서열번호 21， 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29 및. 서열번호 31 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "이노소스 이소머라아제 "는 하기 반웅식 2 에 나타낸 바와 같이, 2ᅳ케토-마이오 -이노시를을 1-케토 -D-카이로-이노시를 (1- keto-으 chiro-inositol)로 전환하는 이성질체화 반웅 또는 이의 역방향 반웅을 촉매하는 활성을 갖는 효소이다. 본 명세서에서 "이노소스 이소머라아제 "는 이를 코딩하는 유전자 명칭 "ioll"으로도 기재한다.
[반웅식 2]
2-케토-마이오 -이노시를 <——> 1ᅳ케토ᅳ으카이로-이노시를
본 발명에서 사용할 수 있는 이노소스 이소머라아제는 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) , 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtil is), 코리네박테리움 클루타미큼 (Corynebacterium glutamicum) , 또는 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananantis)로 부터 분리된 것이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 이노소스 이소머라아제는 서열번호 22， 서열번호 24, 서열번호 26， 서열번호 28 및 서열번호 30 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다. 상기 반웅식 2 에 의해 생성된 1-케토 -D-카이로 -이노시를은 하기 반웅식 3에 의해 본 발명에서의 최종산물인 D-카이로ᅳ이노시를을 생성한다. 하기 반응식 3 의 반웅은 앞서 설명된 효소인 "이노시를 디하이드로게나아제 "가 촉매한다 .
[반웅식 3]
1-케토 -D-카이로ᅳ이노시를 + NADH + H+ <—ᅳᅳ > D-카이로-이노시를 + 励 +
본 발명에서 마이오ᅳ이노시를은 숙주세포내에서 반웅식 1 내지 반웅식 3 의 연속반웅에 의해 D-카이로 -이노시를로 전환되며, 설명된 바와 같이 반웅식 1 및 반웅식 3 의 반웅은 "이노시를 디하이드로게나아제 "가 촉매하며， 반웅식 2의 반응은 "이노소스 이소머라아제 "가 촉매한다.
본 발명에서 마이오-이노시를 트랜스포터， 이노시톨 디하이드로게나아제， 이노소스 이소머라아제 코딩 . DNA 서열은 재조합 백터내에서 프로모터에 작동적으로 결합되어 있다.
본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합된 (operatively linked)' '은 DNA 서열의 발현조절 서열과 기능적으로 결합되어 있다는 의미로서， 기능적 결합에 의해 DNA 서열의 발현이 발현조절 서열에 의해 조절된다.
본 명세서에서 용어 "프로모터' '는 유전자 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA서열을 의미한다.
본 발명에서의 백터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며， 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al.의 "Molecular Cloning, A Laboratory Manual "(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)에 개시되어 있으며， 이 문헌은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 재조합 백터는 클로닝 또는 발현을 위한 백터로서 구축될 수 있으며， 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어， 본 발명의 백터가 발현 백터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는， 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, ρίλ프로모터， trp 프로모터， lac 프로모터， T7 프로모터， tac 프로모터 등)ᅳ 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균 (E. coli)가 이용되는 경우， 대장균 (E. coli) 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C. , J. Bacteriol . , 158： 1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (ρίλ프로모터 , Herskowitz, I. and Hagen, D. , Ann. Rev. Genet., 14 :399ᅳ 445 (1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 백터는 선택표지로서， 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며， 예를 들어 암피실린， 겐타마이신， 카베니실린, 클로람페니콜， 스트렙토마이신, 카나마이신， 게네티신， 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 항생제 내성 유전자는 이의 발현을 위한 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 백터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSClOl, ColEl, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈ᅳ ET 시리즈 및 pUCl9 등)， 파지 (예: Xgt4 ο λΒ, λ -Charon, λ Δζΐ 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 백터는 바람직하게는 원핵세포용 백터이며， 원핵 숙주세포， 특히 대장균 (E. coli)에서 복제가 가능하도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 백터는 coIA, colEl 또는 ρ15Α 의 박테리아의 복제 원점 또는 fl origin과 같은 박테리오파아지의 복제 원점을 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 백터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다. 예를 들어, 포유동물세포， 곤충세포， 효모와 같은 진핵세포 또는 원핵세포를 들 수 있으나， 바람직하게는 원핵세포를 사용한다. 원핵세포로서는 예컨대, 대장균인 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스， 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주， 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스， 코리네박테리움 글루타미큼 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 백터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우， CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al. , Proc. Natl. Acac. Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)； 및 Hanahan, D.， J. Mol . Biol., 166：557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al . , Nucleic .Acids Res. , 16 :612그 6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 단계 (b): 상기 형질전환된 숙주세포를 마이오ᅳ이노시를을 포함하는 배지에서 배양하는 단계
상기 형질전환 숙주세포가 배양되는 동안， 재조합 발현백터 내의 마이오-이노시를 트랜스포터， 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제가 발현되고， 배양액내의 마이오ᅳ이노시를이 세포내로 흡수되어 상기 효소들의 촉매 작용에 의해 D-카이로 이노시를로 전환된다. 형질전환된 숙주세포의 배양은 공지된 숙주세포 배양 방법 또는 이를 변형한 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 숙주세포가 대장균 (E.coH)인 경우 형질전환 숙주세포의 배양을 위한 배지는 대장균이 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원， 질소원， 무기염 등을 포함한다면 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 글루코오스， 프럭토오스 수크로오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피은산과 같은 유기산; 에탄을, 프로판을, 글리세를과 같은 알코을 등을 포함한다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄， 암모늄설페이트， 암모늄아세테이트 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄염; 펩톤， 육추출,물 (meat extract), 이스트추출물 옥수수 침지액， 카제인 가수분해물， 대두추출물， 대두가수분해물; 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함한다. 무기염은 포타슘디하이드로젠 포스페이트， 다이포타슘하이드로젠 포스페이트ᅳ 마그네슘 포스페이트， 마그네슘 설페이트， 소디엄 클로라이드， 망간 설페이트， 구리 설페이트, 칼슘 카보네이트 등을 포함한다.
배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10 내지 40°C의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH 는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0 의 범위를 유지한다. 배지의 pH 는 무기 또는 유기산， 알칼리 용액， 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 백터의 유지 및 발현을 위해 암피실린， 스트렙토마이신， 클로람페니콜， 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도 (induct ion) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 백터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제 (inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어， 발현 백터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-β— D— thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산 Gndoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 방법은 상기 단계
(b) 이후에， 상기 형질전환 숙주세포를 배양한 배양물로부터 D-카이로- 이노시를을 분리하는 단계 (c)를 더 포함한다. 단계 (C): 상기 숙주세포를 배양한 배양액으로부터 D-카이로- 이노시를을 분리하는 단계
형질전환된 숙주세포를 배양한 배양액으로부터 으카이로 -이노시를의 분리는 탄수화물 (carbohydrate) 또는 당 (sugar)을 분리 및 정제하는 공지된 방법 및 이의 변형된 방법을 이용하여 행한다.
으카이로—이노시를이 배지 상에 용해된 상태로 존재하는 경우， 배지로부터 배양된 형질전환체를 제거한다. 예를 들어， 배양한 형질전환 체는 원심분리 또는 마이크로여과 (microfiltration) 방법 등에 의해 배양액으로부터 제거하여 배양 상층액만을 얻는다. 배양 상층액으로부터 으카이로 -이노시를을 얻는 방법은 종래의 공지된 당의 분리 정제 방법 및 이를 변형한 방법을 이용할 수 있다.
종래 공지된 당의 분리 정제방법으로는, 제을라이트 분자체를 이용한 선택적 흡착 방법에 의한 분리방법 (미국특허 제 4，482，761 호)， 양이온교환수지를 이용한 컬럼크로마토그래피에 의한 분리방법 (미국특허 제 5,096,594 호), 음이온 교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의한 분리방법 (미국특허 제 5,482,631 호)， 활성탄에 의한 흡착 및 유기용매에 의한 용출 방법 (대한민국특허 제 1으 0753982 호)， 등결건조 및 재결정화 방법 등이 있으며， 이러한 방법을 이용하거나 이 방법의 변형된 방법 및 이 방법들을 조합하여 이용할 수 있으나， 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 (ί) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시를 트랜스포터 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 백터; 및 (ii) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시를 디하이드로게나아제 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 백터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 형질전환 숙주세포를 포함하는 마이오-이노시를로부터 으카이로 -이노시를을 생산하기 위한 용도의 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 (i) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시를 트랜스포터 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 백터; 및 (Π) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시를 디하이드로게나아제 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 백터를 유효성분으로 포함하는， 마아오- 이노시를로부터 D-카이로 -이노시를의 생산용 재조합 백터 키트를 제공한다. 본 발명의 다른 일 양태인 숙주세포, 이를 포함하는 조성물 및 재조합 백터를 포함하는 키트에서, 상기 마이오-이노시를 트랜스포터， 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제; 이를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 백터; 이 재조합 발현 백터를 포함하는 숙주세포에 관한 내용은 상술된 본 발명의 일 양태의 내용과 동일하므로, 중복하여 설명하지 않는다.
【유리한 효과】
본 발명은 상기 효소 마이오—이노시를 트랜스포터, 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 형질전환 숙주세포를 이용하여 마이오-이노시를로부터 D-카이로 -이노시틀을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면 마이오 -이노시를을 으 카이로ᅳ이노시를로 전환시킬 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 마이오ᅳ이노시를 (myo-inositol)과 D-카이로-이노시를 (D- chir으 inositol)의 화학 구조를 보여준다.
도 2 는 마이오ᅳ이노시를과 D-카이로-이노시틀 및 이들의 입체이성질체 또는 유도체들에 관한 HPLC 크로마토그램을 보여준다. 도 3 은 마이오-이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 대장균에， 다양한 기원의 이노시를 트랜스포터를 추가로 도입하여 얻은 형질전환 대장균에서 마이오-이노시를로부터 D- 카이로-이노시를 전환율 및 균체 성장율올 측정한 결과를 보여준다. 각 이노시틀 트랜스포터에 대한 시험군은 트랜스포터 발현 백터를 pCOLAD- sAtiep-sAtiepf 를 함께 도입하여 제조한 재조합 대장균올 24 시간 및 48 시간 배양한 결과이다. 흰색 막대는 24 시간 배양후 측정한 값을 나타내고， 회색 막대는 48시간 배양후 측정한 값을 나타낸다.
도 4 는 마이오-이노시를 디하이드로게나아제 (iolG)의 상동성 분석에 의한 계통도 (phylogenetic tree)를 보여준다.
도 5 는 이노소스 이소머라아제 (ioll)의 상동성 분석에 의한 계통도 (phylogenetic tree)를 보여준다.
도 6a 내지 도 6c 는 배양 온도에 따른 본 발명의 형질전환 대장균의 마이오-이노시를로부터 D-카이로-이노시를로의 전환율을 측정한 결과를 보여준다. 각각의 심볼에 대한 실험군은 다음과 같다. 도 6a 에서 ·: 30 °C, O: 37 °C, 도 6b 에서 ' 30°C 일 경우 O: 균체성장, ·: H, ▲： 남은 글리세롤의 양， 도 6c 에서 37°C 일 경우 O: 균체성장， ·: pH, A: 남은 글리세를의 양이다.
도 7 은 본 발명의 형질전환 대장균의 배양시 유도 (induction) 시기에 따른 마이오ᅳ이노시를로부터 으카이로-이노시틀로의 전환율을 측정한 결과를 보여준다. 각각의 심볼에 대한 실험군은 다음과 같다. ■： 유도하지 않음 (No induction), O: 0 시간에서 유도 ( induct ion)， A: 0D 0.6 에서 유도 (induct ion), V： 0D 3 에서 유도 ( induct ion)， ♦: 0D 10 에서 유도 ( induct ion) .
도 8 은 본 발명의 형질전환 대장균의 배양시 유도제 종류에 따른 마이오ᅳ이노시를로부터 D-카이로—이노시를로의 전환율을 측정한 결과를 보여준다. 각각의 심볼에 대한 실험군은 다음과 같다. 醒: 0D 0.6 에서 1 mM IPTG 첨가ᅳ O: 0 시간에 0.5% 락토스 (lactose) 첨가， A: 0D 0.6 에서 0.5% 락토스 (lactose) 첨가， ▽: 0D 7 에서 0.5% 락토스 (lactose) 첨가, ♦: 0D 0.6에서 0.1% 락토스 (lactose) 첨가. 도 9 는 다양한 균주 유래의 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라제 유전자， 또는 이들의 조합을 도입한 재조합 균주의 D- 카이로-이노시를 생산율 (패널 A), 균체 성장 (패널 B), 및 생산속도에 대한 기을기 (패널 C)를 측정한 결과를 보여준다. 형질전환 대장균에 이노시를 트랜스포터 발현 재조합 플라스미드 백터 pACYCD-StiolTl-StiolT2 를 함께 도입하여 실험을 수행하였다. 각각의 심볼에 대한 실험군은 다음과 같다. ■ : pCOLAD-Cgiep-PaiolI, ◦: pCOLAD-sAt iep-sAt iepf , ▲： pCOLAD- AGRL628-AGRL627, V： pCOLAD-BsiolG-Bsiol I , ♦: pCOLAD-CgiolG- Cgiol 10169, t>： pCOLAD-Paidh-PaiolI.
도 10 은 본 발명에서 선별된 형질전환 대장균을 이용하여 최적의 배양조건에서 1 리터 발효를 행하여 마이오-이노시를로부터 D-카이로ᅳ 이노시를로의 생산을 확인한 실험 결과이다.
도 11 은 본 발명의 균주에 의해 생산된 D—카이로ᅳ이노시를 분획물의 GC-MS분석 결과이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에、있어서 자명할 것이다. 실시예 실시예 1: 마이오-이노시를 트랜스포터 유전자의 클로닝 및 트랜스포터를 포함하는 재조합 백터의 제작
마이오ᅳ이노시를을 탄소원으로 사용한다고 보고된 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리엄 (Salmonel la typhimurium) , 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacter ium tumefaciens) 균주로부터 마이오-이노시를 트랜스포터 (my으 inositol transporter )의 주타입 (major) 및 부타입 (minor) 유전자를 각각 클로닝하였다.
바실러스 서브틸리스 (B. subtilis)의 경우 마이오ᅳ이노시를 트랜스포터 유전자는 iolT 유전자와 iolF 유전자이며， 살모넬라 티피무리엄 (S. typhi murium)의 경우 iolTl 유전자와 iolT2 유전자이며, 아그로박테리움 투메파시엔스 (A. iefaciens)에서는 Atu5935 유전자와 Atu2525 유전자이다. 이상의 유전자에 대한 정보는 표 1과 같다.
【표 1】
Figure imgf000015_0001
1-1. 재조합 백터 pACYCD-BsiolT(F2) 및 PACYCD-BsiolT-BsiolF(F2)의 제조
바실러스 서브틸리스 (B. subtil is) 균주의 경우， Bacillus subt i 1 i s subsp. subtil is str. 168 (tax id :224308； GenBank NID: NC_000964, ATCC23857)의 지놈 DNA 로부터 주타입 트랜스포터 iolT 및 부타입 트랜스포터 iolF 를 pACYCDuet-1 발현백터에 도입하여 pACYCD-BsiolT(F2)와 pACYCD-BsiolT-BsiolF(F2)를 구축하였다. 구체적으로 설명하면， 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis)의 지놈 DNA로부터 프라이머 BsiolT— F2 와 BsiolT- R 을 이용하여 iolT 를 증폭한 후 제한효소 Sacl 과 BamHI 으로 절단하여 백터 pACYCDuet-l (Novagen)의 동일 부위에 삽입하여 pACYC으 BsiolT(F2)를 제작하였다. 또한, 프라이머 BsiolF-F 와 BsiolF-R 을 이용하여 iolF 를 증폭한 후 제한효소 Ndel 과 Sail 으로 절단하여 상기 제작한 pACYCD- BsiolT(F2)의 Ndel 과 Xhol 부위로 삽입하여 pACYCD-BsiolT— BsiolF(F2)를 제작하였다.
1-2. 재조합 백터 pACYCD-StiolTl(F2) 및 pACYCD-StiolTl- StiolT2(F2)의 제조 4
살모넬라 티피무리엄 (S. typhimurium) 균주의 경우, Salmonella enter ica subsp. enter ica serovar Typhimurium str . LT2 ATCC700720 (taxid: 99287； GenBank NID: NC_006511, ATCC700720)으로부터 주타입 트랜스포터로 알려진 iolTl 및 부타입 트랜스포터로 알려진 iolT2 를 증폭하여 pACYCDuet -1 발현백터에 도입하여， pACYCD-St iolTl(F2)와 pACYCD- StiolTl-StiolT2(F2)를 구축하였다. 구체적으로 설명하면, 살모넬라 티피무리엄 (S.. typhimurium)의 지놈 DNA 로부터 프라이머 StiolTl-F2 및 StiolTl- 을 이용하여 iolTl 을 증폭한 후 제한효소 Ncol 과 BamHI 으로 절단하여 pACYCDuet-1 백터의 동일 부위에 삽입하여 pACYCD-St iolTl(F2)를 제작하였다. 또한, 프라이머 StiolT2-F 와 StiolT2-R을 이용하여 iolT2를 증폭한 후 제한효소 Ndel 과 Sail 으로 절단하여 상기 제작한 백터 pACYCD— StiolTl(F2)의 Ndel 과 Xhol 부위로 삽입하여 pACYCD— St iolTl— St iolT2(F2)를 제작하였다. 1-3. 재조합 백터 pACYCD-Atu5935(F2) 및 pACYCD-Atu5935-
Atu2525(F2)의 제조
아그로박테리움 투메파시엔스 (A. imefaciens)의 경우, Agrobacter ium tumefaciens str . C58 (taxid: 176299; GenBank NID: NC— 003062， ATCC33970)의 지놈 DNA로부터 프라이머 Atu5935-F2 와 Atu5935- R을 이용하여 Atu5935를 증폭한 후 제한효소 Ncol 과 BamHI 으로 절단하여 pACYCDuet -1백터의 동일 부위에 삽입하여 pACYC으 Atu5935(F2)를 제작하였다. 또한， 프라이머 Atu2525-F 와 Atu2525-R 을 이용하여 Atu2525 를 증폭한 후 제한효소 Ndel 과 Sail 으로 절단하여 상기 제작한 pACYCD-Atu2525(F2)의 Ndel과 Xhol 부위로 삽입하여 pACYCD-Atu5935-Atu2525(F2)를 제작하였다.
1-4. 재조합 백터 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf 의 제조
상기 클로닝한 마이오-이노시를 트랜스포터의 활성을 평가하기 위해， 마이오 -이노시를을 D-카이로 -이노시를로 전환하는 이노시를 디하이드로게나아제 (inositol dehydrogenase) 유전자 (iolG) 및 이노소스 이소머라아제 (inosose isomerase) 유전자 (ioll)를 아그로박테리움 투메파시엔스 (A. tumefaciens)로부터 클로닝하여， 이들을 백터 pCOLADuet- l(Novagen)에 도입하여 재조합 플라스미드 백터 pCOLAD— sAt iep-sAt iepf 를 제작하였다. 보다 상세히 설명하면， Agrobacterium sp. AB1012KWO 02/055715A)의 BD171257_CDS1 과 CDS2 의 아미노산 서열을 토대로 DNA 합성 [GenScript Inc.ᅳ 860 Centennial Ave. , Pi scat away, NJ 08854, USA]을 행하여， 합성한 DNA 분자 sAti印 (서열번호 50)와 합성한 DNA 분자 sAtiepf (서열번호 51)를 각각 제작하였다. 상기 합성한 DNA 분자 sA ep을 주형으로 프라이머 sAtiep-TF 와 sAtiep-TR 을 사용하여 PCR 증폭한 후 제한효소 BspHI 과 Sacl 으로 절단하고, 이를 pCOLADuet— 1 의 동일 제한효소 부위로 삽입하여 pCOLAD-sA ep 를 제작하였다. 이어서， 상기 합성한 DNA 분자 sAtiepf 을 Ndel 과 Sail 으로 절단하고， 이를 상기 제작한 백터 pCOLAD-sAtiep 의 Ndel 과 Xhol 부위로 삽입하여 최종적으로 재조합 백터 pCOLAD-sAt i ep-sAt i epf 를 제작하였다 .
상기 재조합 백터의 제작에 사용한 프라이머는 표 2 에 정리하였으며, 제작한 재조합 백터 및 이와 관련된 서열 정보는 표 3에 정리하였다.
【표 2】
Figure imgf000017_0001
【표 3】
Figure imgf000018_0001
실시예 2: 마이오-이노시를 트랜스포터의 활성 평가
상기 실시예 1 에서 제작된 것으로서, 바실러스 서브틸리스 (Β. subtilis), 살모넬라 티피무리엄 (S. typhi murium), 아그로박테리움 투메파시엔스 (A. t ume faci ens) 유래의 마이오ᅳ이노시를 트랜스포터를 함유하는 각각의 재조합 플라스미드， pACYCD-BsiolT(F2), pACYCD-BsiolT- BsiolF(F2), pACYCD-StiolTKF2), pACYCD-St i o 1 Tl-St i o 1 T2 ( F2 ) , pACYCD- Atu5935(F2) , pACYCI)-AUi5935-Atu2525(F2)을， 마이오-이노시를로부터 으 카이로-이노시를로로 전환시키는 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제 코딩 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pCOLAD-sA epᅳ sAtiepf 와 함께， 대장균 (£； coin BL21(DE3)에 형질전환 하여 형질전환 균주를 제작하였다.
제작한 재조합 형질전환 균주는 직경 25 mm, 높이 150 mm 의 유리시험관에서 5 mL 배양하였다. 배양조건은 l%(w/v) 마이오 -이노시를， 50 mg/L 클로람페니콜, 50 mg/L 카나마이신을 함유한 M9 최소배지를 이용하여， 30°C, 250 rpm 의 조건에서 균체가 0D 0.6 에 도달하였을때 1 mM IPTG를 첨가하여 유도 (induct ion)한 후 48 시간 동안 배양하였다. 마이오- 이노시를 및 D-카이로ᅳ이노시를 분석을 위하여 배양액을 원심분리하여 배양 상층액 1 mL 을 취하고 10 분간 끓인 후 다시 원심분리하여 상층액 500 UL 를 취하였다. 전처리한 배양상층액은 HPUXShimadzu LClOAvp)로 분석하였으며， 분석조건은 Kromasil 5NH2 칼럼 (4.6 mm X 250 mm), 이동상 75% 아세토니트릴， 칼럼 은도 40°C, RI 검출기를 이용하였다. 마이오ᅳ 이노시를 및 D-카이로 -이노시를과 이들의 이성질체에 대한 HPLC 크로마토그램을 도 2에 나타내었다. 각 마이오-이노시를 트랜스포터의 활성을 측정한 결과는 도 3 에 나타내었다. 도 3 의 결과에 의하면， pACYCDuet-1 에 살모넬라 티피무리엄 (S. typhimurium) 유래의 주타입과 부타입의 트랜스포터 StiolTl 과 StiolT2 을 모두 함유한 PACYCD-StiolTl-StiolT2 의 경우에서 D- 카이로 -이노시를의 전환율이 가장 우수하였으며， 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis)와 아그로박테리움 투메파시엔스 (A. t Lime faci ens) 유래의 마이오- 이노시를 트랜스포터에서는 D-카이로 -이노시를의 전환율이 매우 낮았다. 전환율이 가장 우수한 살모넬라 티피무리엄의 트랜스포터의 경우 10g/L 마이오-이노시를로부터 24 시간에 약 1.2 g/L 의 D—카이로—이노시를이 전환되었으며， 48 시간에는 약 l.lg 의 D-카이로ᅳ이노시를이 전환되어 24 시간 이후 전환율이 증가하지 않는 것으로 나타났다. 균체성장은 유전자를 도입했을 경우 약간 저해되는 양상을 보였으며, 이는 트랜스포터 단백질의 특성상 세포막에 위치하므로 과발현시 독성을 나타내는 것으로 보인다. 실시예 3: 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제 유전자의 클로닝 및 이를 포함하는 재조합 백터의 제작
하기 반웅식 1 내지 반웅식 3 의 연속적 반웅을 통해 마이오- 이노시를로부터 D-카이로 -이노시를이 전환된다. 반웅식 1 및 반웅식 3 의 반응은 이노시를 디하이드로게나아제 (inositol . dehydrogenase)에 '의해 촉매되고, 반웅식 2의 반웅은 이노소스 이소머라아제 (inosose isomerase)에 의해 촉매된다. [반웅식 1]
마이오-이노시를 + NAD+ <― > 2—케토 -마이오-이노시를 + NADH + H+
[반응식 2]
2-케토ᅳ마이오-이노시를 <—ᅳ > 1ᅳ케토 -I)ᅳ카이로-이노시를
[반응식 3]
1-케토 -D-카이로-이노시를 + NADH + H+ <ᅳᅳ >으카이로-이노시를 + 励 + 이노시를 디하이드로게나아제 유전자 (iolG) 및 이노소스 이소머라아제 유전자 (ioll)와 동등한 기능을 갖는 유전자를 아그로박테리움 투메파시엔스 (A. tumefaciens), 바실러스 서브틸리스 (B. subt i 1 i s ) , 코리네박테리움 글루타미큼 (Corynebacter ium glutamicum) , 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananat is)으로부터 클로닝하였다. 상기 균주들의 지놈 DNA 로부터 iolG 유전자 및 ioll 유전자에 대웅하는 유전자들을 증폭하고， 증폭한 iolG 및 ioll 유전자들의 쌍 및 조합을 pCOLADuet-1 발현백터 (Novagen)에 삽입하여 6 종류의 재조합 플라스미드를 제작하였다. 상기 열거한 iolG 와 ioll 상동 유전자들의 정보는 하기 표 4에 나타내었다.
【표 4】
Figure imgf000020_0001
3-1. 재조합 백터 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf 의 제조
Agrobacterium sp. AB10121 균주 (TO 02/055715A)로부터의 iolG 및 ioll 유전자를 포함하는 재조합 백터 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf 의 제조방법은 상기 실시예 1에서 설명하였다.
3-2. 재조합 백터 pC0LAD-AGRL628-AGRL627의 제조
아그로박테리움 투메파시엔스 (A. tumefaciens) 유래 iolG 와 ioll 유전자를 포함한 재조합 백터는 다음의 방법을 통해 제작하였다. Agrobacterium tumefaciens str . C58( tax id: 176299； GenBank NID: NC_003062, ATCC33970)의 지놈 DNA 로부터 프라이머 AGRL628-F 와 AGRL628- R 을 이용하여 iolG 에 해당하는 AGRL628 유전자를 증폭하였고， 이것을 제한효소 Pcil 과 Sacl 으로 절단하여 pCOLADuet-l(Novagen)의 Ncol 과 Sacl 부위에 도입하여 pC0LAD-AGRL628 을 제작하였다. 또한， AGRL627-F 와 AGRL627-R 프라이머를 이용하여 ioll 에 해당하는 AGRL_627 을 증폭하고 이를 제한효소 Ndel 과 Sail 으로 절단하여 pCOLAD— AGRL628 의 Ndel 과 Xhol 부위에 삽입하여 pC0LAD-AGRL628-AGRL627 재조합 백터를 제작하였다.
3-3. 재조합 백터 pCOLAD-BsiolG-BsiolI의 제조
바실러스 서브틸리스 (B. subtilis) 유래 iolG 와 ioll 유전자를 포함한 재조합 백터는 다음의 방법을 통해 제작하였다. Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 (taxi (1:224308; GenBank NID: NC_000964, ATCC23857)의 지놈 DNA 로부터 BsiolGᅳ F 및 BsiolGᅳ R 프라이머를 이용하여 iolG 에 해당하는 BsiolG 를 증폭한 후, 제한효소 Pcil 과 Notl 으로 절단하여 pCOLADuet-1 의 Ncol 과 Notl 부위로 삽입하여 pCOLAD-BsiolG 를 제작하였다. 또한， Bsioll— F 와 Bsioll-R 프라이머를 이용하여 ioll 에 해당하는 Bsioll 를 증폭하고 이를 제한효소 Ndel 과 Pacl 으로 처리하여 앞서 구축한 플라스미드 pCOLAD-BsiolG 의 동일 제한효소 부위로 삽입하여 pCOLAD-BsiolG-BsiolI를 제작하였다. 3-4. 재조합 백터 pCOLAD— CgiolG-CgiolI0169의 제조
코리네박테리움 글루타미쿰 (C. glutamicum) 유래 iolG 와 ioll 유전자를 포함한 재조합 백터는 하기 방법을 통해 제작하였다. Corynebacter ium lutamicum ATCC 13032 (tax id-' 196627； GenBank NID:NC_003450, ATCC13032)의 지놈 DNA 로부터 CgiotG_F 와 CgiolG-R 프라이머를 이용하여 iolG 에 해당하는 CgioIG 를 증폭한 후 제한효소 BspHI 과 Notl 으로 절단하여 pCOLADuet-1 의 Ncol 과 Notl 부위로 삽입하여 pCOLAD-CgiolG 를 제작하였다. 또한, CgiolI0169-F 와 CgiolI0169-R 프라이머를 이용하여 ioll에 해당하는 CgiolI0169를 증폭하고 이를 Ndel과 Pad 으로 처리하여 앞서 구축한 pCOLAD-CgiolG 의 동일한 제한효소 부위로 삽입하여 pCOLAD-CgiolG-Cgi ol 10169 백터를 제조하였다.
3-5. 재조합 백터 pCOLAD-Paidh-PaiolI의 제조
판토에아 아나나티스 (Pant oea ananatis) 유래 iolG 와 ioll 유전자를 포함한 재조합 백터는 하기 방법을 통해 제작하였다. Pantoea ananatis LMG 20103 (taxid: 706191, GenBank NID:NC_013956, KCCM40419)의 지놈 DNA 로부터 Paidh-F와 Paidh-R프라이머를 이용하여 iolG에 해당하는 Paidh를 증폭한 후， 제한효소 Pcil 과 Notl 으로 절단하여 pCOLADuet-1 의 Ncol 과 Notl 부위로 삽입하여 pCOLAD-Paidh 를 제작하였다. 또한, Paioll-F 와 Paioll-R 프라이머를 이용하여 ioll 에 해당하는 Paioll 를 증폭하고 이를 Ndel 과 Pacl 으로 처리한 후, 상기 제작한 백터 pCOLAD-Paidh 의 동일한 제한효소 부위로 삽입하여 pCOLAD— Paidh— Paioll를 제작하였다.
3-6. 재조합 백터 pCOLAD-Cgiep-PaiolI의 제조
서로 다른 균주에서 유래한 iolG 유전자 및 ioll 유전자를 조합한 재조합 백터를 제조하기 위해, 먼저 코리네박테리움 글루타미쿰 (C. glutamicum) 지놈상에 iolG 유전자인 BD171257_CDS 1(GI :27877069)과 상동성이 낮으면서 기능이 보고되지 않은 iolG 상동 유전자 Cgiep (NCgl2957 또는 GI: 19554252)를 클로닝 하였다. 또한， ioll 해당 유전자의 경우， 역시 ioll 유전자인 BD17125그 CDS 2 (GI :27877069)와 상동성이 낮으면서 기능이 보고되지 않은 판토에아 아나나티스 (P. ananatis) 유래 1
ioll 인 Paioll 를 조합에 사용하였다. 보다 상세히 설명하면，
Corynebacter ium glut ami cum ATCC 13032 (taxid: 196627； GenBank NID:NC_003450, ATCC13032)의 지놈 DNA 로부터 프라이머 Cgiep-F 와 Cgiep- R 을 이용하여 Cgiep 를 증폭한 후 제한효소 BspHI 과 Notl 으로 처리하여 절단하고, pCOLADuet-1 의 Ncol 과 Notl 부위로 삽입하여 pCOLAD-Cgiep 를 제작하였다. 이어서 , pCOLAD-Cgiep를 Ndel과 Pacl으로 처리하여 절단하고 여기에 동일한 제한 효소로 절단한 Paioll 를 삽입하여 최종적으로 pCOLAD- Cgiep-Paioll 백터를 제작하였다. 상기 실시예 3 에서 재조합 백터의 제조에 사용한 프라이머는 하기 표 5 에 나타내었고 상기 제작한 재조합 백터에 대해서는 하기 표 6 에 정리하였다.
【표 5】
Figure imgf000023_0001
【표 6]
Figure imgf000024_0001
3-7. 클로닝한 유전자들의 상동성
클로닝한 이노시를디하이드로게나아제 (iolG) 및 이노소스 이소머라아제 (ioll) 유전자들의 계통도는 도 4 및 도 5 에 나타내었으며， 이들 유전자들의 상동성 분석 결과는 하기 표 7 및 표 8에 나타내었다.
【표 7]
Figure imgf000024_0002
【표 8】
Figure imgf000025_0001
실시예 4: D-카이로-이노시를 생산균주의 최적 배양조건 확립 실시예 3 에서 제작한 재조합 플라스미드 증 pCOLAD-Cgiep-PaiolI 를 pACYCD-StiolTl-StiolT2(F2)와 함께 대장균 BL2KDE3) 균주에 도입하여 재조합 균주의 배양 최적화를 시도하였다.
4-1. 배양 온도에 따른 D-카이로 -이노시를의 생산성 조사
300 mL 의 홈이 파인 (baffled) 삼각플라스크에서 50 mL 배양하였다. 배양조건은 15%(w/v) 마이오—이노시를， 50 mg/L 클로람페니콜， 50 mg/L 카나마이신을 함유한 TB(terrific broth)를 이용하여 30°C와 37°C, 180 rpm 의 조건에서 약 40 시간 동안 배양하였다. 유도 ( induct ion)은 0D 0.6 에서 IPTG 를 1 mM 농도로 첨가하였다. 배양조건 중 첨가한 마이오- 이노시를의 농도는 해당 온도에서의 용해도 (약 16— 17%(w/v))에 준하여 정하였다.
마이오-이노시를 및 으카이로-이노시를 분석을 위하여 배양액을 원심분리 하여 배양 상층액 1 tnL 을 취하고 10 분간 끓인 후 다시 원심분리하여 상층액 500 yL 를 취하였다. 전처리한 배양 상층액은 HPLC(Shimadzu LClOAvp)로 분석하였으며， 분석조건은 Kromasil 5NH2 칼럼 (4.6 mm X 250 瞧)， 이동상 75% 아세토니트릴， 칼럼 은도 40°C， RI 검출기를 이용하였다. 이상의 결과를 도 6에 나타내었다.
TB 배지중의 탄소원 글리세를은 30°C 및 37°C에서 모두 약 24 시간에 고갈되었으며， 균체성장도 이에 맞춰 약 24 시간에 정지되었다. 탄소원이 고갈되고 균체성장이 정지된 24시간에 D-카이로-이노시틀은 30 °C에서 약 12 g/L으로 생성되었고， 37°C에서 약 14 g/L로서 약 1.2 배 높게 생성되었다. 균체 성장이 정지된 후에도 D-카이로 -이노시를은 계속 전환되어 37°C에서 약 28시간, 30°C에서 약 32시간에 약 19 g/L으로 증가하였다.
이러한 마이오-이노시를로부터 D-카이로-이노시를로의 전환은 반웅평형이 관여한다고 알려져 있다 (Yoshida et al. , ΑΕΜ72, 2006)). 즉， 마이오 -이노시를과 D-카이로-이노시를간에 약 86:14 의 물리화학적 반웅평형이 관여하므로， 150 g/L 마이오ᅳ이노시를에 해당하는 D-카이로- 이노시를의 양은 약 20 g/L 이다. 이는 본 실시예에서도 실험적으로 확인되었다. 즉, 으카이로 -이노시를을 첨가하여 배양했을 경우 이상의 반웅 평형 비율에 가깝게 마이오 -이노시를이 생성되었다 (결과는 나타내지 않았음). 이러한 결과로 인해 생산된 19 g/L 의 D-카이로-이노시를 양은 150 g/L 의 마이오—이노시를을 첨가한 배양의 최대치이다. 37°C의 경우 이러한 반응평형에 도달하는 시점 역시 30°C에서 보다 약 4 시간 빠른 것으로 나타났다. 결과적으로 배양 온도에 관해서는 37°C가 적합한 배양 은도인 것을 확인하였다.
4-2. 유도시기에 따른 D-카이로 이노시를의 생산성
pACYCD-StiolTl-StiolT2(F2)와 ' pCOLAD-Cgiep-Paiol I 를 도입한 대장균 BL2KDE3) 균주의 유도 (induct ion) 시기에 따른 D_카이로— 이노시를의 생산성을 살펴보았다. 유도제인 IPTG 를 첨가하지 않는 군을 음성대조구로 하여， 배양초기인 0 시간， 0D 0.6, 0D 3， 0D 10 에 각각 투여하면서 37°C에서 생산성을 확인하였다. 이외의 배양조건은 상기 항목 4-1. 에서와 같으며, 배양결과는 도 7에 나타내었다.
IPTG 에 의한 유도 (induct ion)를 행하지 않은 그룹과, 완전히 성장을 멈춘 후인 0D 10 에서 IPTG 를 첨가하여 유도한 그룹에서는 매우 저조한 D- 카이로-이노시를 생산량을 보였다. 배양시작 시에 IPTG 를 투여한 그룹에서는 초기에 심각한 균체 성장저해 양상이 나타났다. 0D 0.6 와 0D 3 에서도 유도 (induct ion)가 되면 곧바로 균체 성장이 저해되는 양상을 보였으며， IPTG 에 의해 단백질이 발현되면서 균체 성장에 사용되어야 할 질소원， 탄소원 등이 단백질 합성에 소모되거나， 이노시를 트랜스포터 단백질에 의한 막의 손상도 원인일 수 있다. 결과적으로 0D 0.6 또는 0D 3 즉, 대수기 초기에 균체가 새로운 배지 환경에 어느 정도 적응하고 대수 성장을 시작할 무렵에 유도제 (inducer)를 투여하는 것이 가장 바람직한 것으로 확인되었다. 4-3. 유도제의 종류에 따른 D-카이로-이노시톨 생산성 확인
pACYCD-StiolTl-StiolT2(F2)와 pCOLAD-Cgiep— Paiol I 를 도입한 대장균 BL2 DE3) 균주의 유도제 (inducer)의 종류에 따른 D-카이로- 이노시를의 생산성을 살펴보았다. 유도제인 IPTG 가 세포성장을 저해하는 양상을 가지므로 이를 대체할 수 있는 락토스 (lactose)를 유도제로 첨가하였다. 락토스는 첨가시기와 양을 조절하여 첨가하였으며， 0.5¾¾(w/v) 락토스를 초기， 0D 0.6, 0D 7 에서 첨가하거나， 0D 0.6 에서 0.1%를 첨가하였다. 이 외의 배양조건은 상기 항목 4-1.에서 설명된 내용과 같으며， 결과는 도 8 에 나타내었다. IPTG 의 경우 상기 항목 4-2.의 결과와 마찬가지로 초기 성장이 저해됨을 확인하였으며， 락토스를 첨가한 군에서는 이러한 양상이 확인되지 않았다. 락토스 0.5%를 초기에 첨가했을 경우 D-카이로 -이노시틀의 생산속도가 가장 빨랐으며， 0D 7 에서 첨가한 경우 그만큼 D-카이로 -이노시를도 늦게 생산되기 시작하는 양상을 확인하였다. 락토스는 균체가 성장하면서 발현되는 lacZ 유전자에 의해 알로락토스 (allolactose)가 형성되며 이것이 본 발명의 발현백터의 T7 프로모터를 작동시키게 된다. 즉， 균체가 고농도의 마이오ᅳ이노시를， 즉 높은 삼투압 환경에 적웅이 되며 성장하기 시작해야만 프로모터가 작동하므로， 이러한 락토스에 의한 발현이 균체에 대한 독성을 감소시키는 것으로 보인다.
이상의 실시예 4 를 통해 확립한 최적의 배양조건은 TB 배지를 사용하여 락토스를 배양배지에 미리 첨가하고 37°C에서 배양하는 것으로 정하였으며, 이 조건을 이용하여 이후 실험을 수행하였다. 실시예 5: D-카이로-이노시를 전환 유전자들의 활성 비교 상기 실시예 3 에서 구축한 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 발현 백터들인 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf , PC0LAD-AGRL628-AGRL627， pCOLAD-Bs iolG-BsiolI, pCOLAD-Cg i o 1 G-Cg i o 110169 pCOLAD-Paidh-PaiolI, pCOLAD-Cgiep-Paiol I 각각의 백터들을, 실시예 2 에서 트랜스포터 활성을 확인한 이노시를 트랜스포터인 pACYCD-StiolTl-StiolT2 재조합 플라스미드 백터와 함께 대장균 E. coli) BL21 (DE3)에 도입하여 6 종의 재조합 균주를 제작하였다. 제작한 재조합 균주들은 실시예 4 에서 실험한 최적 발효조건을 이용하여 배양하였다. 배양의 측정 결과는 도 9에 나타내었다.
D-카이로 -이노시를의 대수적인 생산시기 (약 8 시간 에서 24 시간)의 생산속도 (도 9 의 패널 C)에서 볼 때 재조합 플라스미드 pCOLAD— AGRL628- AGRL627 의 경우 0.09 로서 가장 낮았으며， pCOLAD-sAt iep-sAt iepf (W0 02/055715)의 경우 0.14로서 역시 낮았다. 본 발명에서 선별한 유전자에서 마이오-이노시를 디하이드로게나아제는 Cgiep 와 이노소스 이소머라아제는 Paioll 의 조합， 즉， pCOLAD-Cgiep-PaiolI 에서 기울기 0.48 로서 가장 빠르게 D-카이로 -이노시를로 전환되는 것으로 나타났으며， 이 값은 가장 낮은 pC0LAD-AGRL628-AGRL627 의 경우보다 약 5.3 배 빠르며， 두 번째 속도를 나타낸 pCOLAD-CgiolG-Cgi ol 10169 (0.26)의 경우 보다도 1.8 배 높았다. 40 시간 배양 후의 생산된 D-카이로-이노시를 농도 역시 pCOLAD- Cgiep-Paioll 의 경우에서 가장 높았다. 최종 균체 성장속도는 전체적으로 약 12 시간 이전에 정지기에 들었으며， 균체 농도 역시 이상의 D-카이로- 이노시를의 생산 속도에 비례하여 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf 에서 가장 낮았고， pCOLAD-Cgiep-PaiolI 에서 가장 높았다. 결과적으로 pCOLAD-Cgiep- Paioll 를 도입했을 경우 150g/L 의 마이오-이노시를로부터 22.7 g/L 의 D- 카이로 -이노시를을 전환하였으며， 전환율은 약 15.1%였다. 전환율이 가장 낮았던 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf 의 경우 약 12.5 g/L 를 전환하여 전환율은 약 8.3%에 머물렀다. 상기 결과로부터 pCOLAD-Cgiep-PaiolI 를 도입한 재조합 대장균주를 생산균주로 하여 발효 실험을 진행하였다. 실시예 6: 재조합 균주의 발효를 통한 생산량 증대
상기에서 수행한 배양 최적화 결과와 우수한 유전자의 선별 결과 얻어진 최적 재조합 균주를 이용하여 1 리터 발효를 수행하였다. 발효는
MARADO-PDA [ (주)씨엔에스， 대전， 한국)] 3 리터 발효조에 1 리터 용량으로 실시하였다. 종배양 (seed culture)은 2YT 배지를 이용하였으며 , 본 배양은 TB 배지에 15% 마이오 -이노시를, 0.5% 락토스를 첨가하였다. 0D 3 까지 배양한 종배양액 50 mL 을 온도， pH, DO 를 안정화시킨 발효조에 접종한후 약 20 시간 동안 배양하였다. 발효온도는 37°C로 조절하고ᅳ pH 는 암모니아수를 이용하여 7.0 으로 조절하였으며， DO 는 40%이하로 감소한 후부터 RPM 을 증가시키면서 40%이상으로 유지하였다. 발효결과는 도 10 에 나타내었다. 균체는 18 시간에 최대 약 0D 18 에 도달하였으며， D- 카이로 -이노시를은 약 12 시간에 평형농도인 약 20 g/L 에 도달한 후 이후 증가하지 않았다. 실시예 7: 생산된 D-카이로 -이노시틀의 분획 및 GC-MS 분석
미생물로부터 생산된 D—카이로 -이노시를의 분획은 HPLCXShimadzu LClOAvp)를 이용하여 행하였다. 분석조건은 Kromasil 5NH2 프렙 칼럼 (10 睡 X 250 mm) , 이동상 75% 아세토니트릴， 칼럼 온도 40°C， RI 검출기를 이용하였고， 100 ^의 시료를 주입하여 4 mL/분의 유속으로 홀리면서 해당 피크 (peak)에 대한 용출액을 취하였다. 수집한 용출액은 진공 농축기 (EYELA, 일본)를 이용하여 농축 및 건조한 후 5 mL 의 증류수에 녹여 GC-MS 분석을 실시하였다.
GC-MS 분석은 Shimadzu GCMS-QP2010을 이용하였다. 분석 전 처리는 1-트리메틸실릴-이미다졸 (1-trimethylsylyl-imidazole)과
피리딘 (pyridine)을 1:1로 흔합한 용액 1 mL에 시료 1 mg을 녹인 후，
70°C에서 30분 반응시켜 분석에 이용하였다. 분석조건은 HP-1 capillary column (30 m Length, 0.25 Dim ID, 0.25 Film)을 이용하였고, Split mode injector (1:50)에 1 의 시료를 주입하여, 1 mL/분의 유속으로 분석하였다. 시료 주입 온도는 28CTC, 오븐 온도는 150°C에서 2분 동안 유지한 후 20°C/분 속도로 300°C까지 상승 후 2분 유지하였다. 분석결과에 대한 MS 프로파일을 표준시료 D-카이로-이노시를 (Sigma 468045, 미국)의 프로파일과 비교하였으며， 그 결과를 도 11에 나타내었다. 표준시료와 비교한 결과 정확히 일치하는 것을 확인하였다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이오ᅳ이노시를 (myo- inositol)로부터 D-카이로ᅳ이노시를 (D-chir으 inositol )을 생산하는 방법:
(a) (i) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시를 트랜스포터 (my으 inositol transporter) 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 백터; 및 (ii) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시를 디하이드로게나아제 (inositol dehydrogenase) 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 (inosose isomerase) 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 백터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환된 숙주세포를 얻는 단계; 및
(b) 상기 형질전환된 숙주세포를 마이오 -이노시를을 포함하는 배지에서 배양하는 단계. 【청구항 2】 '
제 1 항에 있어서， 상기 마이오-이노시를 트랜스포터는 서열번호 1 내지 서열번호 6 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법. 【청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 이노시를 디하이드로게나아제는 서열번호 21， 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27， 서열번호 29 및 서열번호 31 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 이노소스 이소머라아제는 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28 및 서열번호 30 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법 . 【청구항 5]
제 1 항에 있어서, 상기 숙주세포는 동물세포, 곤층세포, 효모 또는 원핵세포인 것으로 특징으로 하는 방법. 【청구항 6】
제 5 항에 있어서， 상기 숙주세포는 원핵세포인 것을 특징으로 하는 방법. 【청구항 7】
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (b) 이후에, 상기 형질전환 숙주세포를 배양한 배양물로부터 D-카이로 -이노시를을 분리하는 단계 (c)를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 8】
(0 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시를 트랜스포터 코딩
DNA 서열을 포함하는 재조합 백터; 및 (ii) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시를 디하이드로게나아제 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA서열을 포함하는 재조합 백터로 형질전환된 숙주세포. 【청구항 9】
제 8 항에 있어서 상기 마이오-이노시를 트랜스포터는 서열번호 1 내지 서열번호 6 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 숙주세포. 【청구항 10】
제 8 항에 있어서， 상기 이노시를 디하이드로게나아제는 서열번호 21 서열번호 23， 서열번호 25， 서열번호 27， 서열번호 29 및 서열번호 31 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 숙주세포. 【청구항 111
제 8 항에 있어서， 상기 이노소스 이소머라아제는 서열번호 22， 서열번호 24, 서열번호 26， 서열번호 28 및 서열번호 30에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
【청구항 12]
제 8 항에 있어서， 상기 숙주세포는 동물세포， 곤충세포, 효모 또는 원핵세포인 것으로 특징으로 하는 숙주세포.
【청구항 13】
상기 청구항 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항 기재의 숙주세포를 포함하는 마이오-이노시를로부터 으카이로 -이노시를을 생산하기 위한 용도의 조성물.
【청구항 14]
(0 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오—이노시를 트랜스포터 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 백터; 및 (ii) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시롤 디하이드로게나아제 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 서열을 포함하는 재조합 백터를 유효성분으로 포함하는， 마이오- 이노시를로부터 으카이로 -이노시를의 생산용 재조합 백터 키트.
【청구항 15】
제 14 항에 있어서, 상기 마이오ᅳ이노시를 트랜스포터는 서열번호 1 내지 서열번호 6 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 16】
제 14 항에 있어서， 상기 이노시를 디하이드로게나아제는 서열번호 21， 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27， 서열번호 29 및 서열번호 31 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 17]
제 14 항에 있어서， 상기 이노소스 이소머라아제는 서열번호 22， 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28 및 서열번호 30 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 키트.
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