CN117305209A - 一种合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌及其构建方法和应用，涉及生物工程技术领域。该合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法，包括将以下(a)‑(c)任一项所述的重组质粒转化入合成2，3‑二氨基丙酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌中，构建得到所述合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌的步骤：(a)携带OCS基因和BAHD基因的重组质粒；(b)携带OCS基因和gloxdh基因的重组质粒；(c)携带gloxdh基因的重组质粒。该合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌可以在自身的新陈代谢作用下，利用简单碳源生物合成三七素，从而为三七素工业化放大生产奠定了重要的基础，具有广阔的商业化应用前景。

Description

一种合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌及其构建方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
三七素(Dencichine)，主要来源于人参属植物三七，是一种天然存在的非蛋白类氨基酸，化学名称为β-N-草酰基-L-α，β-二氨基丙酸(β-ODAP)。三七素的分子式为C5H8N2O5，分子量为176.13。三七素是一种水溶性非蛋白类游离氨基酸，其固体为无色晶体。它在植物(如三七)中的含量非常少，并且天然分离得到的三七素都是L型。三七素有止血化瘀的美名，它作为效果显著的止血活性成分，能够缩短凝血时间，并增加血小板数量，还可以通过机体的代谢进而有效促进血小板释放不同凝血因子，从而产生止血作用。三七素在临床应用中最为广泛的就是制备云南白药，大量的实践证明，云南白药具有显著的化瘀止血功效，而研究人员在新的临床功效方面也在进行更多的探索。除此之外，三七素在国内外的临床应用也有不少成效，有注射、口服等不同方式的药剂，还分为片状、粒状、胶囊等各种制剂，它还被用于失血性贫血的临床治疗，目前也已经有多种成药。
目前三七素的供应主要来自植物提取和化学合成。然而，植物提取存在多种缺点，例如植物的生长周期长，大多为3-5年，并且通常对于生长环境有严格的要求，效率低，纯度低等，这些都限制了它的工业应用。化学合成所需要控制的条件也比较严格，同时反应过程中所使用的一些有机溶剂对于环境并不友好。正由于传统的植物提取法和化学合成法都存在各自的不足，因此开发微生物发酵法生产三七素将具有巨大的应用潜力。
目前利用微生物发酵法合成三七素的研究还处于起步阶段，现阶段只实现了在大肠杆菌中建立从头合成三七素的通路，其中还有很多限制其从头合成的关键步骤仍未被发现，因此以微生物为底盘细胞合成三七素还有很大发展潜力。谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是公认的“GRAS”食品级微生物，它具有适于进行灵活易改造的代谢网络，且对于碳源和目标产物具有耐受性，菌株性能稳定，目前尚未有用于生产三七素的谷氨酸棒状杆菌的报道。因此，有必要研发以谷氨酸棒状杆菌为底盘细胞进行发酵生产三七素的工程菌株，进而能够实现以相对廉价的原料合成高附加值产品三七素，从而开发一种具有周期短、绿色环保和经济价值高等优点的微生物发酵方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该谷氨酸棒状杆菌工程菌可以在自身的新陈代谢作用下，利用简单碳源生物合成三七素，本发明为三七素工业化放大生产奠定了重要的基础，具有广阔的商业化应用前景。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种合成2，3-二氨基丙酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：
在谷氨酸棒状杆菌SO26中导入serA基因、serB基因和serC基因的强启动子和RBS结合位点，构建得到过表达serA基因、serB基因和serC基因的重组菌株；
在所述重组菌株中敲入zmaU基因、zmaV基因和BAHD基因，构建得到所述合成2，3-二氨基丙酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌；
所述zmaU基因、所述zmaV基因和所述BAHD基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述强启动子为Peftu启动子。
进一步地，所述强启动子和RBS结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供一种根据上述的构建方法构建得到的合成2，3-二氨基丙酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌。
本发明还提供一种合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法，包括将以下(a)-(c)任一项所述的重组质粒转化入上述的合成2，3-二氨基丙酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌中，构建得到所述合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌的步骤：
(a)携带OCS基因和BAHD基因的重组质粒；
(b)携带OCS基因和gloxdh基因的重组质粒；
(c)携带gloxdh基因的重组质粒；
所述BAHD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述OCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述gloxdh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供一种根据上述的构建方法构建得到的合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌。
本发明还提供上述的合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌在发酵合成三七素中的应用。
本发明还提供一种三七素的生产方法，包括利用上述的合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌发酵合成三七素的步骤。
本发明还提供上述的合成2，3-二氨基丙酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌在发酵合成2，3-二氨基丙酸的中的应用。
本发明还提供一种2，3-二氨基丙酸的生产方法，包括利用合成2，3-二氨基丙酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌发酵合成2，3-二氨基丙酸的步骤。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以谷氨酸棒状杆菌SO26为基础，通过启动子改造得到过表达serA基因、serB基因和serC基因的重组菌株，再将编码合成2，3-二氨基丙酸生物合成酶的基因zmaU/zmaV和编码合成2,3-二氨基丙酸N-草酰基转移酶BAHD的基因敲入至重组菌株的ncgl1221位点，通过过表达手段对其2，3-二氨基丙酸合成代谢途径进行改造，得到了能稳定遗传的合成2，3-二氨基丙酸的宿主菌。在该宿主菌的基础上，进一步导入编码合成草酰辅酶A的酶的基因，从而构建得到了合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌，其中合成草酰辅酶A的酶可以选择乙醛酸脱氢酶gloxdh和/或草酰辅酶A合成酶OCS。
简单碳源可以在本发明构建的谷氨酸棒状杆菌工程菌的新陈代谢作用下，经过糖酵解途径进入三羧酸循环，在三羧酸循环中可以产生异柠檬酸，异柠檬酸通过异柠檬酸裂合酶AceA转化为乙醛酸，乙醛酸在乙醛酸脱氢酶gloxdh的作用下生成草酸，草酸在草酰辅酶A合成酶OCS的作用下生成草酰辅酶A。上述简单碳源还可以在本发明构建的谷氨酸棒状杆菌工程菌的新陈代谢作用下生成丝氨酸，丝氨酸和氨基供体鸟氨酸在2，3-二氨基丙酸生物合成酶ZmaU和ZmaV的作用下合成2.3-二氨基丙酸。最终，草酰辅酶A和2，3-二氨基丙酸共同在2，3-二氨基丙酸N-草酰基转移酶BAHD的作用下合成三七素。
本发明建立了利用谷氨酸棒状杆菌生物合成三七素的方法，该方法合成三七素具有耗时短、方法简单且环境友好等优点，为三七素工业化放大生产奠定了重要的基础，具有广阔的商业化应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为ZmaU表达情况的SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M：marker；W：全蛋白；S：上清液；I：沉淀；
图2为中ZmaV表达情况的SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M：marker；W：全蛋白；S：上清液；I：沉淀；
图3为OCS(A)和BAHD(B)在谷氨酸棒状杆菌中表达的WB检测图；在A和B中，M：marker；W：全蛋白；S：上清液；I：沉淀；
图4为gloxdh在谷氨酸棒状杆菌中表达的WB图检测图；其中，M：marker；W：全蛋白；S：上清液；I：沉淀；
图5为利用ZmaU和ZmaV在体外联合底物催化合成2,3-二氨基丙酸的HPLC图谱；
图6为利用BAHD和OCS在体外联合底物催化合成三七素的HPLC图谱；
图7为DH12菌株发酵液的HPLC图谱。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中涉及的菌株和质粒信息如表1所示：
表1本发明实施例中涉及的质粒和菌株列表
以下实施例中涉及的基因序列如下：
ZmaU的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；ZmaV的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；Peftu启动子和RBS结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；BAHD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；OCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；gloxdh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
实施例1
1.ZmaU的表达和纯化：
将来自于蜡样芽孢杆菌中的ZmaU基因经密码子优化后送至生物公司合成，随后以此为模板扩增得到ZmaU片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，同时以质粒pET28a为模板，扩增质粒骨架。随后将ZmaU片段与质粒骨架在50℃下用同源重组酶进行连接，得到连接产物。将连接产物加入到E.coli trans5α感受态细胞中，采用热激法进行转化。将转化混合物涂布于固体LB平板上，倒置放于37℃恒温培养箱培养12h，待平板上长出单菌落，用测序引物对其进行菌落PCR验证，得到测序正确的pET28a-ZmaU菌株。将构建好的pET28a-ZmaU菌株于37℃活化培养12h，抽提得到重组质粒。然后将重组质粒热激转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并进一步筛选阳性克隆。
挑取质粒成功转化至BL21(DE3)中的菌株，将其接入5mL LB培养基中，置于摇床37℃，220rpm活化12h，随后再转移到新的5mL LB培养基中继续活化12h，最后转移到100mL LB培养基中活化2h，待OD600达到0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.2mM，置于20℃低温摇床，220rpm条件下培养16h。培养结束后，将菌体离心，用PBS清洗重悬后超声破碎，镍住纯化，SDS-PAGE电泳分析，结果如图1所示。
ZmaV的表达和纯化：
按照与上述ZmaU相同的方法，将ZmaV片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)与质粒pET28a连接后得到重组质粒，再热激转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，随后进行表达、纯化和电泳分析，结果如图2所示。
2.ZmaU和ZmaV体外酶功能验证
ZmaU和ZmaV相继催化丝氨酸和鸟氨酸生成L-DAP(2,3-二氨基丙酸)，而该过程还需要辅因子磷酸吡哆醛(PLP)以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)参与，因此为了确定其酶活作用，采用体外孵育的方法进行验证。
分别配制50mg/LNAD+溶液、50mg/L PLP溶液、1g/L鸟氨酸(L-ornithine)溶液、1g/L丝氨酸(L-serine)溶液和50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)，之后按照表2所示配制不同的反应体系，混合好后于37℃水浴锅反应30min，最后反应体系经2,4-二硝基氟苯进行衍生化处理后，用HPLC测定转化效果，结果如图5所示。在图5中，L-DAP为标准品经衍生化处理后的色谱峰图，3为添加ZmaU和ZmaV时混合体系的色谱图，2为不添加ZmaU和ZmaV的色谱图，1为衍生化试剂本身的色谱图。通过这四组色谱峰图的比较，本发明分析，只有当ZmaU和ZmaV都添加的情况下，混合体系的色谱图与单独鸟氨酸、丝氨酸、空白对照相比，出现了新的产物峰，且该产物峰的出峰位置与L-DAP的出峰位置吻合，故此我们判定ZmaU和ZmaV在体外确实能够以鸟氨酸、丝氨酸为前体物质生成L-DAP，证明ZmaU和ZmaV具有相应的酶活。
表2ZmaU、ZmaV体外孵育反应体系
HPLC分析方法：进样量为5μL，色谱分析柱型号为RPC-18column(250×4.5mm；Kromasil)，以0.02M乙酸钠(pH 4.5)和乙腈为流动相梯度洗脱，设置流速为1mL/min，柱温设置为40℃，紫外吸收波长为360nm。
3.以简单碳源为源头从头合成L-DAP并通过代谢工程提高L-DAP的产量
通过增强上游途径可增加合成L-DAP的前体的供应以提高L-DAP的产量。
(1)构建启动子敲入质粒：pK18mobsacB-Peftu-serA、pK18mobsacB-Peftu-serB、pK18mobsacB-Peftu-serC
为了实现对谷氨酸棒状杆菌基因组的编辑，本发明主要借助pK18mobsacB质粒。作为一种自杀质粒，pK18mobsacB质粒不能在菌株中长期存在，其根据相同的同源臂与基因组上的基因进行交换，交换后的基因能够同步基因组的复制和表达。借助pK18mobsacB质粒构建serA、serB、serC过表达菌株，具体构建过程如下所示：
PCR扩增上下同源臂、启动子及质粒骨架。以谷氨酸棒状杆菌SO26为模板，分别设计引物扩增serA、serB、serC上游区域的上下同源臂800bp左右，用于启动子敲入。其中serA的上下同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；serB的上下同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；serC的上下同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
设计引物扩增强启动子Peftu和RBS结合位点，Peftu启动子和RBS结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。以质粒pK18mobsacB为模板，扩增质粒骨架，用于敲入质粒的构建。融合PCR构建敲入融合臂。用前面获得的PCR片段用于融合PCR，设计引物将serA上同源臂、启动子和RBS结合位点以及serA下同源臂三个片段进行融合得到融合臂。将构建好的融合臂与pK18mobsacB质粒骨架，在同源重组酶的作用下进行连接，随后热激法转入E.colitrans5α感受态细胞中。在平板上挑取单克隆，进行菌落PCR验证并送测序，将阳性单克隆接种于5mL的液体LB中进行质粒提取，分别得到重组质粒pK18mobsacB-Peftu-serA。
本发明所指的serA、serB和serC基因是丝氨酸合成酶的编码基因，它们编码的丝氨酸合成酶可以使3-磷酸甘油酸合成丝氨酸，其中serA编码合成3-磷酸甘油酸脱氢酶，serB编码合成磷酸丝氨酸磷酸酶，serC编码合成磷酸丝氨酸转氨酶。
(2)过表达菌株的构建：DH01、DH02、DH03(见表1)
将上面构建好的敲入质粒pK18mobsacB-Peftu-serA电转至谷氨酸棒状杆菌SO26的感受态中，具体的操作步骤如下：将谷氨酸棒状杆菌SO26的感受态放在冰上5min；取7μL质粒(质粒的浓度150ng/μL)加入感受态中，冰浴30min；将酒精中浸泡的电转杯放在超净台中晾干，晾干后放在冰上预冷；将感受态和质粒混合液转移至电转杯中；3kV，4ms连续电击两次后立即加入800μL LBHIS培养基；将菌液从电转杯转移至1.5mL EP管中；于46℃水浴6min后在30℃，220rpm摇床中活化4h；活化结束后于6000rpm离心1min，去掉上清液，剩余100μL重悬菌体，涂至含有相应抗生素的平板上于30℃培养箱静置培养48h，等待单菌落生成。挑取在卡那霉素平板上的单菌落，并将其转移至新的卡那霉素平板上进一步筛选，具体操作如下：将长出的单克隆转移至新的卡那霉素平板上，30℃培养箱静置培养6h；将转接的单克隆继续转移到含有50μL LB的1.5mL EP管中，30℃，220rpm培养2h；往EP管中加满LB培养基，混匀后取100μL菌液涂至含有10％蔗糖的LB平板上，于30℃培养箱静置培养48h等待单菌落生成；将长出的单菌落分别转接至含有卡那霉素的平板和无抗平板上，于30℃培养箱静置培养12h；选取在含有卡那霉素的平板不生长而在无抗平板上生长的单菌落进行菌落PCR验证并测序。将阳性单克隆于无抗的5mL的LB中活化24h即可获得serA上游区域含有强启动子Peftu的过表达菌株DH01。
其中，LBHIS培养基配方：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、18.5g/L脑心浸出液肉汤培养基和91g/L山梨醇。
将DH01菌株制作成感受态，利用上述相同方法构建在serA和serC上游区域均含有强启动子Peftu的过表达菌株DH02。
将DH02菌株制作成感受态，利用上述相同方法构建在serA、serC和serB上游区域均含有强启动子Peftu的过表达菌株DH03。
(3)重组质粒pEC-ZmaU-ZmaV的构建
以pEC-XK99E质粒为模板，扩增质粒骨架，之后将质粒骨架与ZmaU片段(SEQ IDNO.1)和ZmaV片段(SEQ ID NO.2)，在同源重组酶的作用下进行连接，得到连接产物(每个基因前面带有启动子和RBS，每个基因后面带有终止子)，随后将连接产物热激转化至E.colitrans5α感受态细胞中。然后对平板上的单克隆进行挑选进行菌落PCR验证。随后将正确的阳性克隆活化后提取质粒，得到重组质粒pEC-ZmaU-ZmaV。
(4)从头合成L-DAP的谷氨酸棒状杆菌：DH05、DH06、DH07、DH08(见表1)
将重组质粒pEC-ZmaU-ZmaV分别电转进谷氨酸棒状杆菌感受态细胞SO26、DH01、DH02和DH03中(电转步骤同上)，即可分别获得合成L-DAP的谷氨酸棒状杆菌DH05、DH06、DH07和DH08。
(5)合成L-DAP的谷氨酸棒状杆菌的应用：
工程菌DH03、DH04、DH05、DH06、DH07和DH08，以及谷氨酸棒状杆菌SO26，分别通过简单碳源发酵培养生产L-DAP。
将构建好的菌株接种至含有相应抗生素的LB平板上，30℃培养箱静置培养24h；用枪头挑取菌泥并划线至新的含有相应抗生素的LB平板上，继续在30℃培养箱内培养12h；将平板上的菌落转移到含有相应抗生素的种子培养基中，置于30℃摇床，220rpm培养11h；按照10％接种量转接到含有相应抗生素及诱导剂的发酵培养基中，注意初始OD600保持一致，置于30℃摇床，220rpm培养；每隔12h取样，以监测培养过程。将发酵液进行HPLC分析检测并计算产量，HPLC分析方法同“2.ZmaU和ZmaV体外酶功能验证”部分。各工程菌的L-DAP产量结果见表3。
种子培养基配方：30g/L葡萄糖、10g/L玉米浆、15g/L(NH4)2SO4、10g/L酵母粉、2.5g/L MgSO4·7H2O、1g/LKH2PO4、0.5g/L K2HPO4、0.5g/LNa2HPO4、10g/L CaCO3和25mg/L卡那霉素，pH 7.2。
发酵培养基配方：100g/L葡萄糖、20g/L玉米浆、50g/L(NH4)2SO4、2.5g/LMgSO4·7H2O、1g/L KH2PO4、0.5g/L K2HPO4、0.5g/LNa2HPO4、0.02g/L MnSO4·4H2O、0.02g/L FeSO4·7H2O、10g/L CaCO3和25mg/L卡那霉素，pH 7.2。
表3工程菌DH05、DH06、DH07和DH08的L-DAP产量
菌株 L-DAP产量(mg/L)
SO26 0
DH03 513
DH04 229
DH05 325
DH06 426
DH07 490
DH08 402
4.ZmaU、ZmaV和BAHD基因敲入谷氨酸棒状杆菌基因组
在前面本发明以质粒的形式过表达了ZmaU、ZmaV，并将其导入到谷氨酸棒状杆菌中，成功建立了L-DAP的合成通路。本部分将ZmaU、ZmaV和BAHD借助自杀质粒pK18mobsacB无痕敲入到谷氨酸棒状杆菌基因组上。
(1)构建基因敲入质粒：pK18mobsacB-Δncgl1221::BAHD-ZmaU-ZmaV
该自杀质粒主要是将ZmaU(SEQ ID NO.1)、ZmaV(SEQ ID NO.2)和BAHD(SEQ IDNO.4)这三个基因以及ncgl1221上下同源臂连接至同一载体pK18mobsacB上，得到敲入质粒pK18mobsacB-Δncgl1221::BAHD-ZmaU-ZmaV，每个基因前面带有启动子和RBS，每个基因后面带有终止子。具体构建方法参考“3.以简单碳源为源头从头合成L-DAP并通过代谢工程提高L-DAP的产量”部分。
ncgl1221上下同源臂分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
(2)构建基因敲入工程菌：DH04
将DH03制作成感受态，随后将敲入质粒pK18mobsacB-Δncgl1221::BAHD-ZmaU-ZmaV电转到DH03感受态细胞中，经过电转及筛选(电转及筛选方法同“3.以简单碳源为源头从头合成L-DAP并通过代谢工程提高L-DAP的产量”部分)，即可得到新的突变株DH04菌株。
5.BAHD和OCS在谷氨酸棒状杆菌中的表达情况
将密码子优化的基因OCS(SEQ ID NO.5)和BAHD(SEQ ID NO.4)构建至pXMJ19中，并分别在OCS和BAHD前面添加His和Flag标签，构建得到重组质粒pXMJ19-His-OCS-Flag-BAHD，其构建方法同“3.以简单碳源为源头从头合成L-DAP并通过代谢工程提高L-DAP的产量”部分。随后将构建成功的重组质粒pXMJ19-His-OCS-Flag-BAHD电转进DH04感受态菌株中得到菌株DH11，其感受态制作、电转等方法同“3.以简单碳源为源头从头合成L-DAP并通过代谢工程提高L-DAP的产量”部分。经过测序比对，将正确的菌株进行活化，培养24h后分别取全蛋白(W)、上清液(S)和沉淀(I)进行Westernblot(WB)实验，分析蛋白表达水平。OCS的蛋白大小为60.5kDa，BAHD的蛋白大小为49.3kDa，WB结果(图3)显示两个蛋白大小都符合预期，而且条带单一，没有其它杂带存在，说明酶OCS和BAHD在谷氨酸棒状杆菌中均已成功表达，并且两种蛋白在上清液和沉淀中都存在，因此，本发明认为两种蛋白均能够以可溶的形式存在并被细胞利用。
6.BAHD和OCS联合底物在体外进行酶功能验证
将DH11菌株活化培养24h后进行超声破碎获得粗酶液。随后将获得的粗酶液在体外进行反应，混合体系中含有草酸钠，L-DAP和辅因子，混合好后在30℃条件下反应1h。随后反应液经衍生化处理并采用HPLC测定是否有三七素生成，结果如图6所示。结果显示，标准品三七素有两个峰，前者为β-ODAP的出峰位置，后者为α-ODAP的出峰位置，而在反应液中，出现了β-ODAP的产物峰，说明粗酶液OCS和BAHD能够在体外以L-DAP和草酸钠为前体转化得到三七素，即这两个酶都具有相关活性，可用于三七素通路的建立。
HPLC分析三七素的方法：进样量为5μL，色谱分析柱型号为RPC-18column(250×4.5mm；Kromasil)，以0.5M醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.5)和乙腈为流动相进行等度梯度洗脱，醋酸-醋酸钠缓冲液和乙腈的比例为83：17，设置流速为1mL/min，柱温设置为40℃，紫外吸收波长为360nm。
7.gloxdh在谷氨酸棒状杆菌中的表达情况
将密码子优化后的基因gloxdh(SEQ ID NO.6)构建至pXMJ19质粒中，并在gloxdh基因前面添加Flag标签，得到重组质粒pXMJ19-Flag-gloxdh。将构建成功的重组质粒pXMJ19-Flag-gloxdh电转进DH04感受态菌株中得到菌株DH12。利用与“5.BAHD和OCS在谷氨酸棒状杆菌中的表达情况”部分相同操作，可得到gloxdh在谷氨酸棒状杆菌的表达情况，WB结果如图4所示。同样地，结果表明gloxdh在谷氨酸棒状杆菌中能成功表达，并且在上清中存在，认为其能够以可溶的形式存在并被细胞利用。
8.联合草酸钠合成三七素
(1)构建重组质粒PEC-OCS-BAHD
该重组质粒PEC-OCS-BAHD是将OCS基因(SEQ ID NO.5)和BAHD基因(SEQ ID NO.4)连接至同一表达载体pEC-XK99E中获得，其构建方法同“3.以简单碳源为源头从头合成L-DAP并通过代谢工程提高L-DAP的产量”部分。
(2)合成三七素的谷氨酸棒状杆菌的构建：DH09
将重组质粒PEC-OCS-BAHD电转至DH04中得到合成三七素的谷氨酸棒状杆菌DH09。
9.以简单碳源从头合成三七素
(1)构建重组质粒PEC-OCS-gloxdh
该重组质粒PEC-OCS-gloxdh是将OCS基因(SEQ ID NO.5)和gloxdh基因(SEQ IDNO.6)连接至同一表达载体pEC-XK99E中获得，其构建方法同“3.以简单碳源为源头从头合成L-DAP并通过代谢工程提高L-DAP的产量”部分。
(2)合成三七素的谷氨酸棒状杆菌的构建：DH10
将重组质粒PEC-OCS-gloxdh电转至DH04中得到合成三七素的谷氨酸棒状杆菌DH10。
10.合成三七素的谷氨酸棒状杆菌的应用
将上述构建得到的工程菌DH09、DH10、DH11和DH12，分别进行发酵测试，发酵方法和培养基同“3.以简单碳源为源头从头合成L-DAP并通过代谢工程提高L-DAP的产量”部分。发酵结束后，分别对各发酵液进行HPLC分析检测并计算产量。各工程菌的产量结果如表4所示，DH12菌株发酵液的HPLC图谱见图7。结果显示，工程菌DH09、DH10、DH11和DH12均能利用简单碳源从头合成得到三七素。
表4工程菌DH09、DH10、DH11和DH12的发酵产量
菌株 L-DAP产量(mg/L) 三七素产量(mg/L)
DH09 606 21
DH10 628 28
DH11 630 31.75
DH12 626 45
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种合成2，3-二氨基丙酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
在谷氨酸棒状杆菌SO26中导入serA基因、serB基因和serC基因的强启动子和RBS结合位点，构建得到过表达serA基因、serB基因和serC基因的重组菌株；
在所述重组菌株中敲入zmaU基因、zmaV基因和BAHD基因，构建得到所述合成2，3-二氨基丙酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌；
所述zmaU基因、所述zmaV基因和所述BAHD基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2和SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述强启动子为Peftu启动子。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述强启动子和RBS结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的构建方法构建得到的合成2，3-二氨基丙酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌。
5.一种合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括将以下(a)-(c)任一项所述的重组质粒转化入权利要求4所述的合成2，3-二氨基丙酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌中，构建得到所述合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌的步骤：
(a)携带OCS基因和BAHD基因的重组质粒；
(b)携带OCS基因和gloxdh基因的重组质粒；
(c)携带gloxdh基因的重组质粒；
所述BAHD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述OCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述gloxdh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.一种根据权利要求5所述的构建方法构建得到的合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌。
7.一种如权利要求6所述的谷氨酸棒状杆菌工程菌在发酵合成三七素中的应用。
8.一种三七素的生产方法，其特征在于，包括利用权利要求6所述的谷氨酸棒状杆菌工程菌发酵合成三七素的步骤。
9.一种如权利要求4所述的谷氨酸棒状杆菌工程菌在发酵合成2，3-二氨基丙酸的中的应用。
10.一种2，3-二氨基丙酸的生产方法，其特征在于，包括利用权利要求4所述的谷氨酸棒状杆菌工程菌发酵合成2，3-二氨基丙酸的步骤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115896194A (zh) * 2021-09-22 2023-04-04 江南大学 一种生产三七素的菌株及方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACM79820.1: "ZmaU[Bacillus cereus]", 《GENBANK》, 15 February 2009 (2009-02-15) *
AJS62699.1: "Cyb2p [Saccharomyces cerevisiae YJM195]", 《GENBANK》, 6 June 2016 (2016-06-06) *
DANHUANG等: "Remodeling metabolism of Corynebacterium glutamicum for high-level dencichine production", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》, 23 September 2023 (2023-09-23), pages 1 - 2 *
QWE49617.1: "b-ODAP synthetase[Lathyrus sativus]", 《GENBANK》, 8 January 2022 (2022-01-08) *
WP_002083445.1: "MULTISPECIES: 2, 3-diaminopropionate biosynthesis protein SbnB [Bacillus cereus group]", 《GENBANK》, 20 January 2019 (2019-01-20) *
WP_230607453.1: "acyl--CoA ligase [Escherichia coli]", 《GENBANK》, 3 December 2021 (2021-12-03) *
李睿敏: "生物合成L-2，3-二氨基丙酸", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, 15 June 2020 (2020-06-15) *

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