CN103710361B - 一种编码D-氨基酸氧化酶的基因daoE及其应用 - Google Patents

Abstract

一种编码D-氨基酸氧化酶的基因daoE，其核苷酸序列如序列表No.1所示；氨基酸残基如序列表No.2所示。序列表No.1中的DNA从5’端第1个核苷酸开始起始密码子ATG到1074个碱基以终止密码子TAG结束，存在一个完整的ORF（核苷酸1-1074），自5’端的第1-3位核苷酸为daoE基因的起始密码子ATG，自5’端的第1072-1074位核苷酸为daoE基因的终止密码子TAG。本发明所提供的D-氨基酸氧化酶蛋白及其编码酶的基因在作为识别潜在药物靶点、针对转基因作物中降低作物体内D-氨基酸含量和食品检测等方面具有广泛的用途。

Description

一种编码D-氨基酸氧化酶的基因daoE及其应用

技术领域

本发明涉及一种编码D-氨基酸氧化酶的基因daoE及其应用。

背景技术

D-氨基酸氧化酶催化D-氨基酸脱氨基生成相应的α-酮酸，从结构较为简单原核生物的到结构相对复杂真核生物，再到功能进化高级的如哺乳动物的人类，都存在各种各样的D-氨基酸氧化酶，并在其中发挥着巨大的作用。D-氨基酸氧化酶一般为单一肽链蛋白质，较多为400个氨基酸左右。D-氨基酸氧化酶的一级序列包含保守的I-V保守区域，I区是极其保守GXGXXG序列，存在于DNA序列5’端起始位置，是结合上黄素腺嘌呤二核苷酸的保守位点，是一个包含α/β组合的Rossman结构。D-氨基酸氧化酶具有广泛的底物特异性，II-V保守区域执行对这些不同氨基酸的结合和催化功能通常包含2个Tyr和1个Arg氨基酸残基中的一个。D-氨基酸氧化酶具有典型的立体异构催化模式，即只会作用于D型氨基酸，它广泛底物特异性主要表现在能够催化除了酸性氨基酸D-谷氨酸和D-天门冬氨酸外的所有D-氨基酸。D-氨基酸氧化酶的活性中心主要由两部分组成，第一部分包含两条β-链弯曲围绕黄素腺嘌呤二核苷酸的异咯嗪环的主要活性中心位置，第二部分是由两条短的β-链组成的底物结合区域。

D-氨基酸氧化酶在人体疾病中的治疗靶点，这些疾病的机制都是D-氨基酸氧化酶的生成量过高。神经源性疼痛是由中枢或外周神经系统损伤、疾病引起的疼痛综合征，发生机制与多种机制有关，尚未明确。D-氨基酸氧化酶的抑制剂苯甲酸钠可以对慢性神经源性疼痛起到强效镇痛作用，慢性疼痛主要是由脊髓自由基过氧化氢介导，机制在于抑制脊髓过氧化氢的生成。在精神分裂症患者体内中D-氨基酸氧化酶与D-丝氨酸代谢模型：pLG蛋白表达量下降，而人的D-氨基酸氧化酶活性水平反常的升高，诱导体内D-丝氨酸浓度的减少，导致人精神分裂症的产生。所以，D-氨基酸氧化酶作为其中重要的识别位点发现精神分裂症和慢性神经源性疼痛的易感基因对于认识两种疾病的症代谢过程、识别潜在药物靶点和指导用药等方面具有指导意义。

D-氨基酸氧化酶的农业应用主要在于提高经济作物的生长能力。具有取代抗生素基因和除草剂基因的前景。植物容易从环境中吸收D-氨基酸，植物细胞不具有内源性D-氨基酸氧化酶的能力，它们具有D-氨基酸的代谢能力有限，D-氨基酸在植物细胞中的积累将会抑制其生长。2009年，Lin等证实三角酵母D-氨基酸氧化酶在水稻中的成功表达，植物异源的D-氨基酸氧化酶不引起植物生长的总异常，此功能已被利用作为开发一种有效的生物技术工具，将感兴趣的基因一起集成到D-氨基酸氧化酶标记中，通过生长植物的介质上包含D-丙氨酸的培养基中逆向性选择植物。目前，在拟南芥、苹果和水稻等作物中已经成功表达了D-氨基酸氧化酶，研究表明这些转基因植物有效地转换成D-氨基酸，生成对其无害的α-酮羧酸类产物。

D-氨基酸氧化酶的工业生产应用广泛。从猪肾中提取的D-氨基酸氧化酶可以直接于D型氨基酸将其脱氨基生产α-酮酸。利用D-氨基酸氧化酶的立体异构专一性，将D-氨基酸氧化酶作用于DL-丙氨酸，D-氨基酸氧化酶可以催化其中的D-氨基酸生成酮酸，其中的L-氨基酸不能被催化，从而达到分离DL-氨基酸来获得L-氨基酸的目的。D-氨基酸是构成细胞壁肽聚糖和胞壁酸的成分，微生物含有的D-氨基酸氧化酶，它们能够利用D-氨基酸进行生长，对食品D-氨基酸的检测是判断食品细菌污染的指标之一。Wcislo等在2007年报道了将D-氨基酸氧化酶固定在普鲁士蓝修饰的碳纳米管的安培生物传感器，利用普鲁士蓝修饰的碳纳米管作为载体工具，D-氨基酸氧化酶被固定在表面后用来检测食品D-氨基酸含量，这种检测方法的灵敏度可以达到5-200nmol/L。

众所周知，环境微生物是一个巨大的基因资源库。相关研究指出通过DNA-DNA杂交技术和其他独立培养技术揭示了一份100g土壤样品中微生物种类趋向于在4，000种到13，000种之间，平均每500mg的泥土中就可以提取出数十微克的DNA，这其中包含了大量的未知功能基因。相对于纯培养技术而言，利用宏基因组文库技术开发环境未培养微生物资源，可以使得占微生物通量99%的不可培养微生物资源开发变成现实，它将微生物基因的探索空间扩大了上百倍。宏基因组文库技术，就是以直接分离环境未培养微生物宏基因组DNA，克隆目标DNA到合适的载体，然后导入宿主菌进而实现对目标克隆的筛选。当前，科学家以E.coli（大肠杆菌）或者Streptomycin lividans（变铅青链霉菌）作为克隆宿主，构建了各种各样的文库如plasmid libraries（质粒文库）、cosmid libraries（柯斯质粒文库）、BAC libraries（细菌人工染色体基因组文库）、fosmid libraries（fosmid文库）等，基于基因功能表达和序列特异性的同源筛选等给人们带来了数量巨大的新型活性酶和各种生物活性物质。因此，利用宏基因组文库技术，研究极端环境体系未培养微生物和克隆各类新酶基因，分离筛选各类D-氨基酸氧化酶，在理论上及在实际应用中都具有特别重要的意义。本发明通过构建来自于广西南宁市堆肥土壤环境样品宏基因组文库，采用酶基因的直接测序筛选策略，从基因文库里面分离得到了编码D-氨基酸氧化酶的基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产酶蛋白，并利用D-氨基酸氧化酶活性，其在转基因作物、生产7-氨基头孢烷酸、生产酮酸、生物传感器等方面具有广泛的用途。

发明内容

本发明的目的是提供一种编码D-氨基酸氧化酶的基因daoE及其应用。

本发明采用的技术方案是：一种编码D-氨基酸氧化酶的基因daoE，来自于广西南宁市堆肥土壤环境样品宏基因组文库，采用酶的直接测序筛选策略，从基因文库里面分离得到了编码D-氨基酸氧化酶的基因，其核苷酸序列如序列表No.1所示；氨基酸残基如序列表No.2所示。序列表No.1中的DNA从5’端第1个核苷酸开始起始密码子ATG到1074个碱基以终止密码子TAG结束，存在一个完整的ORF（核苷酸1-1074），自5’端的第1-3位核苷酸为daoE基因的起始密码子ATG，自5’端的第1072-1074位核苷酸为daoE基因的终止密码子TAG。

本发明提供的一种编码D-氨基酸氧化酶的基因daoE的克隆方法，包括如下步骤：

（1）从广西南宁市堆肥土壤环境样品中提取未培养微生物宏基因组DNA，构建环境宏基因组文库；

（2）从该宏基因组文库中利用直接测序筛选策略分离含D-氨基酸氧化酶的克隆。

本发明通过构建环境宏基因组文库，利用直接测序筛选策略，得到了一种新的D-氨基酸氧化酶的基因，可在宿主细胞中大量表达，产生的D-氨基酸氧化酶对D-甲硫氨酸底物有较好的催化作用。携带该基因的质粒E.coliTunner(DE3)pLacI/pGXDAOE保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），编号为CGMCC No.7474，保存日期为2013年4月15日，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

序列表No.1的DNA是克隆重组质粒pGXDAOE所含的外源DNA片段中携带的完整开放阅读框（ORF，Open Reading Frame），该ORF由1074个碱基组成，为一个可能完整的新型D-氨基酸氧化酶基因，新基因命名为daoE。从5’端第1个核苷酸开始起始密码子ATG到1074个碱基以终止密码子TAG结束，存在一个完整的ORF（核苷酸1-1074），自5’端的第1-3位核苷酸为daoE基因的起始密码子ATG，自5’端的第1072-1074位核苷酸为daoE基因的终止密码子TAG。该ORF一共1074个核苷酸可编码由一个由357个氨基酸组成的多肽。通过Blastx分析该氨基酸序列和来自于Flavobacterium psychrophilum的一个“D-amino acid oxidase（deaminating）family protein”存在72％的相似性，55％的一致性。

本发明所提供的编码D-氨基酸氧化酶的基因，可在宿主细胞中大量表达以生产酶蛋白，D-氨基酸氧化酶及其编码酶基因在作为识别潜在药物靶点、针对转基因作物中降低作物体内D-氨基酸含量和食品检测等方面具有广泛的用途。

附图说明

图1为从广西南宁市堆肥土壤环境样品中提取的未培养微生物的宏基因组DNA。

图2为广西南宁市土壤宏基因组DNA的HindⅢ和PstⅠ双酶切消化。

图3为广西南宁市堆肥土壤环境宏基因文库克隆的限制性内切酶酶切分析以判断文库质量。

图4为宏基因组文库克隆pGXAP10018的HindⅢ和PstⅠ酶切检测结果。

图5为重组表达克隆E.coli Tunner(DE3)pLacI/pGXDAOE的构建。

图6为daoE基因重组表达质粒DNA序列分析图。

图7为重组质粒所携带daoE基因转化大肠杆菌E.coli Tuner(DE3)pLacI后得到的重组表达克隆的SDS-PAGE分析结果。

图8为重组质粒pE.coli Tunner(DE3)pLacI/pGXDAOE重组表达克隆纯化蛋白SDS-PAGE分析结果。

图9为不同pH值对DaoE重组蛋白的酶活影响。

图10为不同温度为DaoE重组蛋白的酶活影响。

图11为D-氨基酸氧化酶的反应速率测定。

具体实施方式

在本发明的实施例中所用到的主要材料包括：限制性内切酶（PstⅠ及HindⅢ）及T4DNA连接酶均购自Fermentas公司、克隆载体pGEM-3Zf(+)及表达载体pETBlue-2均购自Promega公司、PVPP（交联聚乙烯吡咯烷酮）购自Sigma公司、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）购自Sigma公司。

实施例1

一种编码D-氨基酸氧化酶的基因daoE的克隆方法，包括如下步骤：

步骤1：从土壤中提取和纯化宏基因组DNA

（1）首先配制DNA提取液：100mM磷酸钠缓冲液（pH8.0），1%（w/v）CTAB，100mM EDTA（pH8.0），0.3M NaCl，0.01mM Tris-HCl（pH8.0）；

（2）PVPP酸洗处理：称取10g PVPP，加入3M HCl，浸泡12h，有滤纸过滤，用20mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）清洗搅拌PVPP，重复几次直至悬浮液达到中性，将PVPP过滤，于50℃烘干；

（3）称取1g样品于15mL离心管，加入0.25g酸化的PVPP，4mL提取缓冲液，混匀，70℃和液氮反复冻融3次，每次30min。最后一次溶解后，加入SDS至终浓度为1%，颠倒混匀，放置室温20min，5000rpm离心8min，取上清待用；

（4）加入2mL提取液重悬沉淀，离心取上清，重复此步骤两次，合并所有上清；

（5）加入蛋白酶K至终浓度为0.2mg/mL，65℃水浴1h；加入0.5g酸化PVPP及0.5g Sephadex G-200混匀，室温结合30min，5000rpm离心8min，取上清待用；

（6）加入2mL提取液重悬沉淀，离心取上清，重复此步骤两次，合并所有上清；

（7）加入PEG-8000使其终浓度达到10%，加入NaCl使其终浓度为1.1M，放至4℃静止2h后，分装于2mL离心管中，4℃，13000rpm离心10min，弃上清；

（8）用75%乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤1次，真空浓缩至乙醇挥发完全，加入TE缓冲液溶解，-20℃保存。

对照图1，为提取的宏基因组DNA电泳图。泳道1为λ/HindⅢMarker，片段大小从大到小依次为：23.13kb，9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb；泳道2-5为从堆肥土壤环境中提取和纯化的宏基因组DNA。

步骤2：土壤宏基因组文库的构建

首先通过手工法提取宏基因组DNA，采用HindⅢ和PstⅠ两种限制性内切酶对宏基因组DNA进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收3-10kb的片段（见图1），与经同样的两种限制性内切酶双酶切和纯化的克隆载体pGEM-3Zf(+)连接，导入E.coli DH5α宿主中，涂布于含有40μg/mL X-gal、40μg/mL IPTG及50μg/mL Amp的LA平板上进行蓝白筛选。将白色克隆挑至含有50μg/mL Amp的LA平板上，37℃倒置培养至菌落为2-3mm后，再次挑板，将转化子挑取到文库保存培养基于96孔培养板孔中，37℃恒温培养24h左右,然后保存于-80℃低温冰箱中。最终得到了32,100个白色转化子。随机挑取14个转化子提取质粒，用HindⅢ和PstⅠ进行酶切检测，发现10个带有随机插入的外源DNA片段，平均长度为3.4kb，结果见图2。

取适量宏基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，所得的宏基因组DNA片段完整性较好（见图1），经HindⅢ和PstⅠ双酶切后成弥散条带（见图2），证实其纯度已符合分子实验要求。

对照图2，为宏基因组DNA酶切后电泳图。泳道1为λ/HindⅢMarker，片段大小从大到小依次为：23.13kb，9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb；泳道2为宏基因组DNA用HindⅢ和PstⅠ进行双酶切结果。

对照图3，为土壤宏基因组文库的质量检测。泳道1为1kb Marker，从上至下片段大小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb，1.0kb，750bp，500bp，250bp；泳道2-15为随机挑取的重组质粒用HindⅢ和PstⅠ进行双酶切结果。

步骤3：采用直接测序筛选策略从宏基因组文库中分离D-氨基酸氧化酶基因

采用直接测序分离筛选方法，用双脱氧核苷酸法在ABI377DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列。得到一个编号为pGXAP10018的阳性克隆，携带一个可能的编码D-氨基酸氧化酶的基因。电泳检测结果表明，pGXAP10018克隆所携带的外源DNA片段大小为1.9kb。

对照图4，其中，1：1kb ladder标准样，片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb,2.5kb,2.0kb,1.5kb，1.0kb，750bp，500bp，250bp pGXAG59/EcoRI；2：文库克隆子pGXAP10018的质粒DNA的HindⅢ和PstⅠ双酶切结果。

步骤4：克隆pGXAP10018测序及生物信息学分析

采用双脱氧核苷酸法在ABI377DNA自动测序仪上测定克隆pGXAP10018的核苷酸序列，用软件DNAStar对测序所得到的序列进行拼接。使用ORF Finder工具分析其测序结果，发现pGXAP10018克隆子含有多个ORF，而编码D-氨基酸氧化酶基因的ORF位于pGXAP10018克隆子第298至第1372个核苷酸之间，全长为1074bp，由ATG起始，TAG终止，编码一个由357个氨基酸组成的多肽。将该基因命名为daoE，其序列见序列表。

根据Blastp结果，可知基因daoE在氨基酸序列上由阳性克隆pGXAP10018所携带的外源DNA由1074个碱基组成，对照图4，从5’端第1个核苷酸开始起始密码子ATG到1074个碱基以终止密码子TAG结束，存在一个最有可能的完整ORF（核苷酸1-1074），自5’端的第1-3位核苷酸为daoE基因的起始密码子ATG，自5’端的第1072-1074位核苷酸为daoE基因的终止密码子TAG。经过Blastn软件比较，暂未发现pGXAP10018携带的外源DNA序列在DNA水平上与现GenBanK数据库中的DNA序列存在一致性（检索时间：2013年6月1号）。表达D-氨基酸氧化酶的基因daoE编码一个含357个氨基酸的蛋白质，用Blastp分析该氨基酸序列，发现该氨基酸序列和来自于Flavobacteriumpsychrophilum的一个“D-amino acid oxidase（deaminating）family protein”存在72％的相似性，55％的一致性。该氨基酸序列含有已经报道的D-氨基酸氧化酶的GXGXXG保守序列，是结合上D-氨基酸氧化酶辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸的保守序列。该基因ORF氨基酸序列编码的唯一保守性假定蛋白没有明显的亲疏水性，没有形成明显的跨膜结构区域。

实施例2

daoE基因重组表达质粒的构建。

利用美国Novagen公司提供的质粒pETBlue-2作为表达载体和E.coli Tuner(DE3)pLacI作为宿主细胞进行目标基因的异源高效表达；设计正向扩增引物FD1:5’-CGCGGATCCGATGACAGAACAAATGCTTGATTATTTTATAGTAGGTG-3’，引入BamHI酶切位点GGATCC；反向扩增引物RD1:5’-CCCAAGCTTTTTA TTCGAGGATGTAAT-3’，引入HindIII酶切位点AAGCTT；以pGXAP10018为模板，采用Pfu DNA聚合酶进行PCR反应，扩增daoE基因。提取表达载体pETBlue-2质粒，用BamHI和HindⅢ两种酶进行双酶切，纯化后与同样经过双酶切并纯化的daoE扩增产物连接，构建重组质粒E.coli Tunner(DE3)pLacI/pGXDAOE，采用化学转化法转入E.coli DH5α，酶切验证后（酶切见图5）进行测序，序列结果见图6。利用ExPASy网站相关软件分析E.coli Tunner(DE3)pLacI/pGXDAOE的理论等电点和分子量，发现其理论等电点为8.26，分子量为44.9kDa.

重组质粒E.coli Tunner(DE3)pLacI/pGXDAOE已在中国普通微生物菌种保藏管理中心完成微生物保存，保存编号为CGMCC No.7474，保存日期为2013年4月15日。

实施例2请参考图5。图5为重组质粒E.coli Tunner(DE3)pLacI/pGXDAOE的构建过程的检测结果。1：1kb ladder标准样，片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb,2.5kb,2.0kb,1.5kb，1.0kb，750bp，500bp，250bp；2：E.coli Tunner(DE3)pLacI/pGXDAOE酶切之前的质粒DNA检测结果，跑样量为5μL；3：使用限制性内切酶BamHl酶切E.coliTunner(DE3)pLacI/pGXDAOE之后的质粒DNA检测结果，跑样量为5μL。4：使用限制性内切酶BamHl和HindIII酶切E.coli Tunner(DE3)pLacI/pGXDAOE之后的质粒DNA检测结果，跑样量为5μL。

对照图6，为克隆子pGXAP10018包含的daoE基因的重组质粒E.coli E.coliTunner(DE3)pLacI/pGXDAOE的DNA序列以及目标ORF所编码的氨基酸序列分析。

实施例3

DaoE目标蛋白在大肠杆菌系统中的诱导表达和纯化。

将含有重组质粒的大肠杆菌转接于10mL含有羧苄青霉素的LB培养基中，培养10-15h。从10mL LB菌液中取5-10mL加入到盛有500mL含有羧苄青霉素LB液体培养基的1000mL的三角瓶中，37℃，220rpm振荡培养。2-3h后取出1mL菌液测定OD₆₀₀，当OD₆₀₀到0.4-0.6的时候加入IPTG至终浓度为1.0mmo/L，28℃、220rpm振荡培养10h后，制备粗酶液；采用Novagen公司的Ni-NTA、His-Bind Resins对重组蛋白进行分离纯化。对制备的对照样品以及分离纯化得到的目标蛋白进行SDS-PAGE蛋白表达检测。

实施例3请参照图7。图7为重组质粒pGXAP1008所携带daoE基因转化大肠杆菌E.coli Tuner(DE3)pLacI后得到的重组表达蛋白纯化后的SDS-PAGE分析结果。1：蛋白质标准样品，跑样量5μL；2：E.coli Tunner(DE3)pLacI/pETBlue-2对照的上清结果；3：E.coli Tunner(DE3)pLacI/pETBlue-2对照加IPTG诱导后的上清结果；4：为阳性重组质粒E.coli Tunner(DE3)pLacI/pGXDAOE的上清结果；5：阳性重组质粒E.coli Tunner(DE3)pLacI/pGXDAOE用加IPTG诱导后的上清结果，1-4孔跑样量为10μL。

对照图8为pGXAP1008所携带daoE基因转化大肠杆菌E.coliTuner(DE3)pLacI后得到的重组表达克隆表达D-氨基酸氧化酶蛋白的镍柱亲和层析纯化的SDS-PAGE分析结果。1：蛋白质标准样品，跑样量5μL；2：E.coliTunner(DE3)pLacI/pGXDAOE，跑样量10μL。

实施例4

不同温度和不同pH条件对D-氨基酸氧化酶的酶活影响

参照相关文献活性测定方法，进行部分改进：反应体系设置为1mL；0.045毫克/mL D-氨基酸氧化酶溶于预冷的1mmol/L HCl，完全活性对照不加DaoE蛋白。1.加入500μL100mmol/L pH8.0焦磷酸钠，10μL100mmol/L FAD，100μL200mmol/L D-甲硫氨酸，290μL去离子水，放入预先设定温度的水浴锅或金属浴中预热5min。加入100μL纯化后的酶液，混匀，开始反应，计时30min。加入600μl10%三氯乙酸溶液终止酶促反应，9000g离心5min去除沉淀。取离心后的上清液200μL加入80μL的2,4-二硝基苯肼，室温放置10min待完全反应。加入300μL的NaOH，室温静置10min，待产生完全颜色变化，吸取200μL加入96孔板，测OD550。

设置pH范围5.5-10的缓冲液，pH5.5-8.0采用柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液，pH8.0-9.0采用Tris-HCl缓冲液，pH9.0-10.0采用甘氨酸-NaOH缓冲液，缓冲液缓冲液梯度为0.5个pH值梯度，在37℃条件下反应30min，在OD550处检测吸光度变化。

结果参见图9。结果发现在pH8.0处目标蛋白具有最高的酶活。

从16℃到60℃，设置16℃、20℃、28℃、30℃、32℃、37℃、42℃、48℃、50℃、55℃、60℃的一系列不同实验温度条件，在最适合条件下测定不同温度下重组蛋白DaoE的酶活。

结果参见图10。结果发现在37℃时目标蛋白具有最高的酶活。

实施例5

DaoE催化D-甲硫氨酸的酶学性质测定。

实施例5请参见图11，D-氨基酸氧化酶的催化速度分析。将DaoE蛋白在底物终浓度分别为1mM、2mM、5mM、8mM和10mM时，在pH8.0，温度为37℃的条件下分别反应1min、2min、3min、4min和5min，计算不同底物浓度下的反应初速度后，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法进行作图，计算得到DaoE蛋白催化D-甲硫氨酸的最大反应速度为0.018mM/min，米氏常数为2.96mM。

Claims (3)

1.一种编码D-氨基酸氧化酶蛋白的基因daoE，其特征在于，其核苷酸序列如序列表No.1所示。

2.权利要求1的基因所编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如序列表No.2所示。

3.权利要求2所述的蛋白质在制备D-氨基酸氧化酶中的应用。