CN1243877A

CN1243877A - 红冬孢属d－氨基酸氧化酶

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Publication number: CN1243877A
Application number: CN 98117470
Authority: CN
Inventors: 廖国祯; 李易展; 李韫慧; 陈丽玲; 朱文深
Original assignee: FOODSTUFF INDUSTRIAL AND DEVELOPMENT INST
Current assignee: FOODSTUFF INDUSTRIAL AND DEVELOPMENT INST
Priority date: 1998-07-31
Filing date: 1998-07-31
Publication date: 2000-02-09
Anticipated expiration: 2018-07-31
Also published as: CN1119418C

Abstract

本发明涉及一种红冬孢属D－氨基酸氧化酶和编码该氧化酶的基团。

Description

红冬孢属D-氨基酸氧化酶

D-氨基酸氧化酶(″DAO″)是一种黄素蛋白，已知该蛋白能够把头孢菌素C(″Ceph C″)转化为α-酮基己二酰头孢菌素酸(″α-酮基己二酰7-ACA″)、过氧化氢、和氨。在与过氧化氢反应时，α-酮基己二酰7-ACA可以进一步转变成为戊二酰-7-氨基头孢菌素酸(″GL-7-ACA″)。由于GL-7-ACA是头孢烯抗生素的起始物质，因而DAO具有巨大的工业价值。

除α-酮酸产物(Tosa等，农业生物化学(Agric Biol Chem)[1974]38，1529-1536)外，DAO已用于氨基酸的外消旋混合物的拆开(Tu等，分离科学(Separation Sci)[1972]7，403-408)和氨基酸的分析测定(Guilbault等，分析化学学报(Anal Chim Actal)[1971]56，285-290)。DAO可以在不同的微生物、昆虫、以及动物中发现。

本发明涉及一种分离的核酸，该核酸编码红冬孢属的DAO，例如，双倒卵形红冬孢、球红冬孢、R.kratochvilovae、类酵母红冬孢、葡萄牙红冬孢、R.paludignenum、R.dacryoidum、R.babievae以及R.fluviale。术语″红冬孢属D-氨基酸氧化酶″指任何红冬孢属DAO的天然人工的变种。例如，该核酸可以具有序列SEQIDNO：1或者SEQ ID NO：2(二者都在下文显示)，具有在严格条件下与EQ ID NO：1或者2的序列杂交的序列，或者具有编码SEQ ID NO：3的蛋白质的序列。

包含这种核酸的载体和转化的宿主细胞包括在本发明范围内。″载体″指包含调节元件或者报道基因的任何核酸分子或者病毒，该调节元件或者报道基因用于但不限于在原核或真核细胞或者有机体中表达。″转化″的宿主细胞″指已借助分子生物学技术在其中(或在其祖先中)引入了编码来自于红冬孢属的DAO的核酸的宿主细胞。在引入细胞后，这种核酸可在染色体外存在或者整合到宿主基因组中。

本发明还涉及红冬孢属的分离的DAO，如SEQ ID NO：3(显示如下)或者与SEQ ID NO：3至少由一个保守氨基酸取代而不同的蛋白质。

术语″核酸″包括RNA和DNA(包括cDNA，基因组DNA，以及合成的，例如化学合成的或者修饰的DNA)。该核酸可以是双链或者单链。其中单链核酸可以是有义链或者反义链。术语″分离的核酸″是指在其侧翼可有非天然序列的核酸，如质粒或者病毒的核酸。因此，该核酸可以不包括，也可以包括一些或者所有的5′非编码(例如启动子)序列，该序列与编码序列紧密邻接。因此，该术语包括，例如重组DNA，该重组DNA掺入到载体(包括自主复制的质粒或者病毒)或者不同于红冬孢属的原核或真核生物基因组DNA中，或者作为独立于其它序列的单独的分子(如，通过PCR或者限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或者基因组DNA片段)存在。该术语也包括作为编码附加多肽序列的杂合基因的一部分的重组的DNA或者RNA。此外，该术语意欲包括并非天然以片断形式存在并且不能在天然状态中发现的核酸片段。

″在严格条件下杂交”意指在被认作严格的并由Sambrook等(分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.第二版[1989]冷泉港实验室出版社)(Cold SpringHarbor Laboratory Press)提出的低盐和高温条件下，核酸在溶液中或者在固体支持物上与SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2的核酸形成稳定的、序列-特异性的、非共价的键。例如，象SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2之类的参考核酸可以固定化在硝酸纤维滤膜上，在68℃下有0.2×SSC(1.75g/l NaCl，0.88g/l Na₃Citrate·2H₂O；pH7.0)和0.1％(w/v)十二烷基磺酸钠存在时，任何其它核酸特异性和非共价地结合到固定化的参照核酸上就被认为是在严格条件下杂交。

″分离的D-氨基酸氧化酶″是指纯化的或者从它的天然环境中富集的DAO(例如，由通过DAO表达载体转化的宿主细胞制备的DAO-富集抽提物)。″保守取代″是指在下列某组内的取代：缬氨酸，异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和欲氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。

红冬孢属DAO基因的分离与鉴定使得可以产生DAO蛋白质的变种形式，该蛋白质变种形式可以具有有利的活性(如对于底物转变的降低的Km)或者更大的蛋白质稳定性。

本发明的其它特性或者优点将从下列附图和内个实施方案的详细描述，及附加的权利要求书中显现出来。

本发明涉及红冬孢属DAO，并且涉及编码红冬孢属DAO的核酸，所说的红冬孢属例如双倒卵形红冬孢、球红冬孢、R.kratochvilovae、类酵母红冬孢、葡萄牙红冬孢、R.paludignenum、R.dacryoidum、R.babjevae、以及R.fluviale。

在本发明考虑范围之内的有重组核酸或者病毒，它们使得可以在转化细胞或者转基因有机体或者在DAO读码框内容易发生特异性或非特异性突变的有机体中产生DAO蛋白质。这些重组核酸或者病毒可能进一步包含各种各样的DAO编码序列的上游序列中的任何一种，如强组成型启动子；DAO编码序列内的序列，如包含可以使得高水平表达的顺式元件的内含子，或者包含各种各样的DAO编码序列的下游序列中的任何一种，如有效的聚腺苷酸化信号。本发明进一步包括任何含有或者产生这种核酸或者病毒的细胞，以及包含任何由这种细胞产生的DAO蛋白质。

虽然没有进一步作详细说明，但是人们知道，基于上述公开和下述的DAO蛋白质和来源于类酵母红冬孢的DAO基因的分离，本领域技术人员可以最大程度上利用本发明。下列两个实施例仅仅用来阐述本领域技术人员如何从红冬孢属中分离DAO基因和蛋白质，并且不以任何方式上限制本公开的其余部分。在本公开中所引用的任何出版物本文一并参考。

实施例1

本实施例说明纯化和鉴定来自红冬孢属的对头孢菌素C有活性的D-氨基酸氧化酶。

从美国典型培养物保藏中心获得的类酵母红冬孢(No.10788)用作分离DAO蛋白质的来源。

蛋白质如下进行纯化：(1)将D-丙氨酸添加到类酵母红冬孢的无细胞抽提物中，终浓度为0.3M，将混合物加热到70℃4分钟。(2)在13000×g下离心40分钟以除去沉淀物。(3)用1.5升缓冲液A(50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0，2mMEDTA，5mM β-巯基乙醇，1mMPMSF，和2.5g/ml胃酶抑制剂A)透析上清液。(4)将透析的蛋白质溶液加到DEAE-葡聚糖纤维素柱(15×2.4cm)上，用缓冲液A进行洗脱。收集具有DAO活性的组分，并且在Amicon池(YM30)中进行浓缩。(5)将浓缩物加到苯基-葡聚糖纤维素CL-4B柱(15×2.0cm)上，该柱已经用150ml补充了20％甘油的缓冲液B(同缓冲液A一样，但是没有胃酶抑制剂A)平衡。补充了40％甘油的缓冲液B洗脱结合的DAO。收集具有DAO活性的组分，并用含10％甘油的缓冲液B透析。(6)将透析物浓缩至2ml，并且在快速蛋白质液相层析(FPLC)Mono Q HR 5/5柱上进行层析，该层析柱预先用30ml添加了10％甘油的缓冲液B进行平衡。空柱体积之后即刻洗脱DAO。收集包含酶活性的组分并且浓缩至1ml。(7)将浓缩液加到FPLC凝胶-过滤Superose 12HR10/30柱上并用含10％甘油和0.25M NaCl的缓冲液B进行洗脱。收集活性组分，存储在20℃下。

利用Superose 12HR 10/30柱的最终层析使得从蛋白质样品中凝胶渗透和有效除去少量不纯物。

从大约100g(湿重)类酶母红冬孢中获得0.88mg纯化DAO，产率为21％，蛋白质的比活性为60U/mg(Lee等，生物技术通讯(BiotechnolLett)[1994]16，467-472给出了DAO单位活性定义和测定条件)。在天然PAGE下得到的制剂是单带。酶对高碘酸/希夫试剂染色不敏感，这表明它不是糖蛋白。

在FPLC Superase 12柱上通过凝胶过滤与参照蛋白质的标准曲线相比较估计出天然酶的分子量是72kDa。SDS/PAGE表明分子量为37kDa的单带。其结果表明类酵母红冬孢DAO的天然形式由二个相同大小的亚基组成。NH₂-末端氨基酸序列的前22个残基确定为Met His Ser Gln Lys ArgVal Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly Leu Ser Ser Ala Leu Ile(SEQ ID NO：10)。

来源于类酵母红冬孢的DAO的吸收光谱显示两个畸峰，分别在370nm和455nm处，这对于黄素生色团来说是典型的。E280/E445比率(它是经常用以估计黄素蛋白纯度的参数)是8.1。高效液态层析(HPLC)分析显示从煮沸的蛋白质制剂释放的黄素与标准黄素腺嘌呤二核苷酸FAD具有相同的保留时间。FAD的浓度确定为6.34g/ml，该FAD是从0.297mg/ml的蛋白质溶液中提取出来的。基于这个结果和SDS/PAGE分析，获得比率大约为1.73摩尔FAD/摩尔蛋白质，这表明在每一亚单位中都有一FAD。

在不同温度下测量DAO的酶活性。该蛋白质在35℃时显示最大活性。该酶在30-50℃的温度范围内都具有活性(高于最大活性的70％)。在60℃时该酶活性突然减少至最大活性的30％。该酶在高于35℃的温度时不稳定。在40℃和50℃时分别进行温育10分钟之后，仅仅保持最大活性的20％和10％。

DAO活性的最适pH是9.0。该酶在pH范围7.5-10.0内具有活性。DAO在pH范围7.0-8.0内是稳定的，此时测定出超过80％的残余活性。然而，在pH高于8.5失去相当多的活性，pH11.0时该酶70％失活。

测量在各种D-氨基酸底物上纯化的DAO的相对活性。该纯化酶在所有试验的D-氨基酸上都具有活性。其最好的底物是D-色氨酸，其次为D-甲硫氨酸，D-苯丙氨酸，D-丙氨酸以及D-亮氨酸。该酶显示较小活性(少于最大活性的20％)的有D-苏氨酸，D-谷氨酸，D-天冬氨酸以及D-赖氨酸。测定出在L-氨基酸上没有活性，包括L-丙氨酸，L-脯氨酸，L-苯丙氨酸以及L-甲硫氨酸。D-色氨酸，D-甲硫氨酸，D-丙氨酸和D-丝氨酸的表观Km分别为0.18mM，0.22mM，0.68mM和3.4mM。在对氨基苯甲酸，苯甲酸和烟酸存在下分别72％，49％和21％地抑制该酶的活性。将这些芳香族酸都确定为类酵母红冬孢DAO的竞争性抑制剂。在所试验的芳香族酸中，对氨基苯甲酸具有最低K1(0.3mM)。

将具有序列SEQ ID NO：3(显示如下)的纯化的DAO蛋白质用来转化Ceph C。与在D-丙氨酸上酶活性相比，该酶在Ceph C上具有95％的活性。该酶对Ceph C的表观Km是0.65mM。产率是91％，并且进一步孵育没有增加产率。这个反应不需要外源H₂O₂。

实施例2

本实施例说明来自红冬孢属的D-氨基酸氧化酶基因的分离与表达。

如实施例1所述的方法纯化来自类酵母红冬孢的DAO蛋白质。用十二烷基磺酸钠(SDS)/聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)替代最后两次柱层析(MonoQ HR 5/5和Supersoe 10HR)。从SDS/PAGE凝胶中纯化出大约300皮摩尔的DAO，由美国斯坦福大学蛋白质和核酸实验室测定出肽序列。已确定出三种内部肽序列(YCQYLARELQ[SEQ ID NO：11]，IAGGIDDQAAEPIR[SEQ ID NO：12]，和RCTMDSSDP[SEQ ID NO：13])。为了分离来自类酵母红冬孢的DAO基因，以该肽序列为基础合成四种全简并寡核苷酸引物。它们是引物15′-AARTAYTGYCARTAYC-3′)(SEQ ID NO：6)，引物25′-ATNGAYGAYCAYGCNGC-3′(SEQ)ID NO：7)，引物35′-GCNGCYTGRTCRTCNAT-3′(SEQ ID NO：8)，以及引物45-ATGGAYAGYAGYGAYCC-3′(SEQ ID NO：9)，其中N表示G，A，T或者C；Y表示T或者C；并且R表示A或者G。

当引物1单独使用时，以类酵母红冬孢的染色体DNA作为模板的PCR反应没有产物产生。在仅仅包含引物2，3或者4的PCR反应中合成出几种非特异性产物。具有引物2和4的PCR反应也得到几种非特异性产物。利用引物1和3时除非特异性产物外，其典型结果是还得到长约210bp的特异性PCR产物。当用这一片段作为模板时，在PCR反应中用引物1和3可以进行重扩增。

测定该片段的核苷酸序列。它包含如下的214个核苷酸：5′-AAGTACTGCCAGTACCTTGCAAGAGAGCTGCAGAAGCTCGGCGCGACGTTTGAGAGACGGACCGTTACGTCGCTTGAGCAGGCGTTCGACGGTGCGGATTTGGTGGTCAACGCTACGGGACTTGgtatgtcccgaactgcccctctctacctgcaattttgctgattgatatgctcgcagGCGCCAAGTCGATTGCGGGCATCGACGACCAAGC-3′(SEQID NO：15)

(SEQ ID NO：15)(小写字母表示内含子序列，以下述的cDNA为基础。)

YCQYLARELQ(SEQ ID NO：11)和IAGIDDQA(SEQ ID NO：14)，它们是由所说的214bp片段编码的推断出的氨基酸序列的一部分，与所确定的DAO蛋白质序列的一部分相同。结果表明该214bpDNA片段是编码类酵母红冬孢DAO基因的一部分。于是，把该片段用作分离DAO基因的探针。

用地高辛配基标记的上述214bp DNA片段的Southern印迹杂交识别出大约3.3kb的杂交片段。通过将3.0至3.5kb范围内的HindIII-消化基因组DNA片段插入到pBluescript SK+中来构建小基因组DNA文库。以相同的探针筛选该文库。从筛选的大约200个克隆中获得十五个在放射自显影信号中具有两种级别的强度的阳性克隆。对插入片段的限制酶谱选择和分析了来自每种类型的三个随机克隆。其结果显示这些克隆包含两种不同的DNA插入片段，这导致在信号中具有两种级别的强度。选择一种类型的克隆用于进一步的研究中，该研究以它们在信号上的更高强度以及插入片断与214bp探针的杂交图谱为基础。发现这些克隆包含有基因组DNA片段，该基因组DNA片段包含DAO基因序列。将DAO基因编码区的基因组序列显示如下：5′-ATGCACTCTCAGAAGCGCGTCGTTGTCCTCGGATCAGGCGgtgcgtcttttccctctcctccccacacccgacagtcctcgacgaggtgtaggacggcgagcaaagctgccgagggcgatctgggctgactgagcgctcgagtgtacagTTATCGGTCTGAGCAGCGCCCTCATCCTCGCTCGGAAGGGCTACAGCGTGCATATTCTCGCGCGCGACTTGCCGGAGGACGTCTCGAGCCAGACTTTCGCTTCACCATGGGCTgtgcgtcgtctcactgtagttggaggatgtcagcgagagctgatcaatctcgtcatccccgcagGGCGCGAATTGGACGCCTTTCATGACGCTTACAGACGGTCCTCGACAAGCAAAATGGGAAGAATCGACTTTgtgcgtctccttctacctcattcttggcctcgagctgacgagtgtatgatacacagCAAGAAGTGGGTCGAGTTGGTCCCGACGGGCCATGCCATGTGGCTCAAGGGGACGAGGCGGTTCGCGCAGAACGAAGACGGCTTGCTCGGGCACTGGTACAAGGACATCACGCCAAATgtgcgcccacattcactcttcccttcgcatgtctccgtttactgacccgccctctttcgccgtgcgcagTACCGCCCCCTCCCATCTTCCGAATGTCCACCTGGCGCTATCGGCGTAACCTACGACACCCTCTCCGTCCACGCACCAAAGTACTGCCAGTACCTTGCAAGAGAGCTGCAGAAGCTCGGCGCGACGTTTGAGAGACGGACCGTTACGTCGCTTGAGCAGGCGTTCGACGGTGCGGATTTGGTGGTCAACGCTACGGGACTTGgtatgtcccgaactgcccctctctacctgcaattttgctgattgatatgctcgcagGCGCCAAGTCGATTGCGGGCATCGACGACCAAGCCGCCGAGCCAATCCGCGGCCAAACCGTCCTCGTCAAGTCCCCATGCAAGCGATGCACGATGGACTCGTCCGACCCCGCTTCTCCCGCCTACATCATTCCCCGACCAGGTGGCGAAGTCATCTGCGGCGGGACGTACGGCGTGGGAGACTGGGACTTGTCTGTCAACCCAGAGACGGTCCAGCGGATCCTCAAGCACTGCTTGCGCCTCGACCCGACCATCTCGAGCGACGGAACGATCGAAGGCATCGAGGTCCTCCGCCACAACGTCGGCTTGCGACCTGCACGACGAGGCGGACCCCGCGTCGAGGCAGAACGGATCGTCCTGCCTCTCGACCGGACAAAGTCGCCCCTCTCGCTCGGCAGGGGCAGCGCACGAGCCGCGAAGGAGAAGGAGGTCACGCTTGTGCATGCGTATGGCTTCTCGAGTGCGGGATACCAGCAGAGTTGGGGCGCGGCGGAGGATGTCGCGCAGCTCGTCGACGAGGCGTTCCAGCGGTACCACGGCGCGGCGCGGGAGTCGAAGTTG-3′(SEQ ID NO：1)

(小写字母表示内含子序列，以下述的cDNA为基础)。

将cDNA末端的5′和3′快速扩增(RACE)用来分离DAO基因的cDNA末端。根据制造商的方案利用来自Gibco BRL的RACE试剂盒进行RACE。在5′RACE和3′RACE中分别扩增出大约550bp和720bp的DNA片段。为了确定核苷酸序列，将这些片段克隆到pGEM-T载体中。其结果显示两条cDNA片段具有124bp的重叠区。组合两条片段的核苷酸序列产生预料的编码氨基酸序列的开放读码框(ORF)，该编码氨基酸序列包含与上述的三条内部肽具有完全等同性的区域。将DAO的cDNA编码区显示如下：5′--ATGCACTCTCAGAAGCGCGTCGTTGTCCTCGGATCAGGCGTTATCGGTCTGAGCAGCGCCCTCATCCTCGCTCGGAAGGGCTACAGCGTGCATATTCTCGCGCGCGACTTGCCGGAGGACGTCTCGAGCCAGACTTTCGCTTCACCATGGGCTGGCGCGAATTGGACGCCTTTCATGACGCTTACAGACGGTCCTCGACAAGCAAAATGGGAAGAATCGACTTTCAAGAAGTGGGTCGAGTTGGTCCCGACGGGCCATGCCATGTGGCTCAAGGGGACGAGGCGGTTCGCGCAGAACGAAGACGGCTTGCTCGGGCACTGGTACAAGGACATCACGCCAAATTACCGCCCCCTCCCATCTTCCGAATGTCCACCTGGCGCTATCGGCGTAACCTACGACACCCTCTCCGTCCACGCACCAAAGTACTGCCAGTACCTTGCAAGAGAGCTGCAGAAGCTCGGCGCGACGTTTGAGAGACGGACCGTTACGTCGCTTGAGCAGGCGTTCGACGGTGCGGATTTGGTGGTCAACGCTACGGGACTTGGCGCCAAGTCGATTGCGGGCATCGACGACCAAGCCGCCGAGCCAATCCGCGGCCAAACCGTCCTCGTCAAGTCCCCATGCAAGCGATGCACGATGGACTCGTCCGACCCCGCTTCTCCCGCCTACATCATTCCCCGACCAGGTGGCGAAGTCATCTGCGGCGGGACGTACGGCGTGGGAGACTGGGACTTGTCTGTCAACCCAGAGACGGTCCAGCGGATCCTCAAGCACTGCTTGCGCCTCGACCCGACCATCTCGAGCGACGGAACGATCGAAGGCATCGAGGTCCTCCGCCACAACGTCGGCTTGCGACCTGCACGACGAGGCGGACCCCGCGTCGAGGCAGAACGGATCGTCCTGCCTCTCGACCGGACAAAGTCGCCCCTCTCGCTCGGCAGGGGCAGCGCACGAGCCGCGAAGGAGAAGGAGGTCACGCTTGTGCATGCGTATGGCTTCTCGAGTGCGGGATACCAGCAGAGTTGGGGCGCGGCGGAGGATGTCGCGCAGCTCGTCGACGAGGCGTTCCAGCGGTACCACGGCGCGGCGCGGGAGTCGAAGTTG-3′(SEQ ID NO：2)

ORF长为1104个核苷酸，它编码分子量为40079Da，368个氨基酸的蛋白质。将该蛋白质序列(从N-末端到C-末端)显示如下：M H S Q K R V V V L G S G V I G L S SA L I L A R K G Y S V H I L A R D L PE D V S S Q T F A S P W A G A N W T PF M T L T D G P R Q A K W E E S T F KK W V E L V P T G H A M W L K G T R R

F A Q N E D G L L G H W Y K D I T P N

Y R P L P S S E C P P G A I G V T Y D

T L S V H A P K Y C Q Y L A R E L Q K

L G A T F E R R T V T S L E Q A F D G

A D L V V N A T G L G A K S I A G I D

D Q A A E P I R G Q T V L V K S P C K

R C T M D S S D P A S P A Y I I P R P

G G E V I C G G T Y G V G D W D L S V

N P E T V Q R I L K H C L R L D P T I

S S D G T I E G I E V L R H N V G L R

P A R R G G P R V E A E R I V L P L D

R T K S P L S L G R G S A R A A K E K

E V T L V H A Y G F S S A G Y Q Q S W

G A A E D V A Q L V D E A F Q R Y H G

A A R E S K L (SEQ ID NO：3)

比较cDNA与基因组DNA之间的核苷酸序列，表明DAO基因包含6个外显子和5个内含子(参见上面的SEQ ID NO：1)。DAO基因内含子相对较小，其大小在56bp-109bp范围内。5个内含子的两个末端都包含外显子-内含子连接共有序列GT......AG。

与起始密码子5′端紧密相邻并位于DAO基因的推定翻译起始位点周围的核苷酸序列与共有序列CCACCATGGC(SEQ ID NO：16)一致(Kozak，核酸研究(Nuc Acids Res)[1984]12，857-872)，其中位置-3(起始密码子的A残基定为+1)的核苷总是G或者A。将起始密码子的5′端如下所示：5′ -AAGCTTCGGCACGAGCATGAGTGTGAATGATGGTCCAAGGAGGACAGCGCAGAGTCAACAGGAGGGCACATGGAGGCAGAGCGTGGGGCGGAGGAGGCAGATGGGGAGTCGCGCTGGGGGACGAGGGGGTGTCGCTCGACTAACAGCTCTCTATCGCTCTTGCTGCTGCTTGTACTACTCGAACGACGCC 3′(SEQ ID NO：4)

与真菌基因一致，在类酵母红冬孢DAO基因的5′侧翼区没有发现明显的TATA盒。

与ORF的3′紧密相邻的序列中，没有聚腺苷酸化信号的共有序列。然而，定位在多聚(A)加成位点上游11到18残基的序列TGTATTGC(SEQ IDNO：18)与已知的在哺乳类mRNA的正确3′末端的形成中涉及到的序列YGTGTTYY(SEQ ID NO：17)(其中Y表示嘧啶)相类似。将序列的ORF 3′端表示如下：

5′-GGCGGGATTTGTGGCTGTATTGCGGGCATCTACAAGACCAGCTTCATCTCGGAC

GACAACACGAGAGCGGCGAGTCTTCGTACCGTCTGACCTTCGCAATCCGCCGAGTCC

TTGCCCGTTGCCCTGCTTGCTCCTTTCGTATCTCCTGTGACTCGGAACGTCGCTCTT

CGCCTCTGTCACTTGCCAGGCCGTCCCTTCAAACTGTCGCCGCCCTCCTCCTCCCAA

TCTCCTCCTCACGCGACTTGCCACTACTCTCACTTCTCCTGCTTACCAAGGCTTACA

CTACGCAACACTAAGCGCGGCATCAGGTTCCGTTGCGCGCCTCGTCACGACCCGACT

TTTTTTCGCCCGTTCGCTCGCCTCGCTCCGTTGCCGAGCGAAGAACTTCGCCTGCCT

TCGAATCTCTCGCCTTGCTCGTCTCGTCCTGCTCCGTTCCACCACAGATAGACTCAC

AGCAACACACTCACAATGGTCAAGGTGCGCACCCACTCCCGCCAGTCCAACTCGCGC

GACGAGAGACCACCGTCTCGTTGACATCACTGACCTCGTCGCTCGCCACCCACCCTC

CCGCTCGTCCATGCACACAGGCAGCACCACGATCAGACGAGCAGCAGCACTACCACG

CCACAGTCATGGGCGGACTCAAGGGCGGCGCGATGGGGTTGGCGGCGGGTGGAGCGG

GTGCGGTTGCGCTGCAGAGGGCGAACGTACAGGCGTTCACGAGGTTGACGCTGCCTC

TCAAGGCGTTTGCTGTCACGTACGTCCCGCGATCCCTTACTATGCGACTCCCTCGGT

GAATTC-3′(SEQ ID NO：5)

利用pET23a载体构建表达质粒pDAO-23(携带类酵母红冬孢DAO的cDNA)，并且将该质粒引入到大肠杆菌BL21[DE3]中。异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)-诱导转化体在细胞裂解液中显示DAO活性，这表明活性DAO在大肠杆菌中表达。细胞裂解液的SDS/PAGE分析显示出一条明显的37kDa的蛋白质区带(DAO亚单位的估计大小)，该区带不存在从pET23a转化宿主以相似方法制备的裂解液中。将该蛋白用IPTG充分诱导30分钟。利用镍-柱层析将DAO纯化至接近均一性。从250ml大肠杆菌培养物中一步可以获得约为4mg的蛋白质。纯化蛋白质显示1,211U/mg比活性，比粗提物增加7倍，比纯化的类酵母红冬孢DAO蛋白质增加20倍。该活性与在FAD存在下通过透析制备的酶的活性类似，这表明重组DAO可能包含作为辅基的FAD。

还制备了表达DAO的大肠杆菌菌株(pDA023-转化的DH5α)，并保藏在美国典型培养物保藏中心，其保藏号为No.98485。

为明白起见，虽然结合详细描述描述了本发明，但前面的描述旨在说明，而不是限制本发明的范围，本发明的范围由附加的权利要求书的范围来限定。其它方面(优点以及改良)在本发明范围之内。

例如，本发明的DAO蛋白质包括但不限于重组蛋白质、天然蛋白质和合成蛋白质以及前蛋白或原蛋白。重组DAO蛋白质包括含有邻接的或非邻接的氨基酸缺失的DAO或者包含信号肽的DAO，该信号肽允许转运到细胞的各种区室，如壁膜间隙、内质网、线粒体、或者胞外间隙。

序列表(1)一般信息

(i)申请人：Lao，Gwo-Jen

Lee，Yi-Jang

Lee，Yun-Huey

Chen，Li-Lin

Chu，Wen-Shen

(ii)发明名称：红冬孢属D-氨基酸氧化酶

(iii)序列数：18

(iv)通讯地址：

(A)收信人：Fish & Richardson，P.C.

(B)街道：225 Franklin Street

(C)城市：波士顿(Boston)

(D)州：MA

(E)国家：US

(F)ZIP：02110-2804

(v)计算机可读形式：

(R)介质类型：软盘

(R)计算机：IBM兼容机

(C)操作系统：Windows 95

(D)软件：Fast SEQ for Windows Version 2.0

(vi)当前申请的数据：

(A)申请号：

(R)申请日：1997年7月30日

(C)分类号：

(vii)在先申请的数据：

(A)申请号：

(B)申请日：

(viii)律师/代理人信息：

(A)名称：Tsao，Y.Rocky

(B)登记号：34,053

(C)证书号：06497/006001

(ix)电讯信息：

(A)电话：617-542-5070

(B)传真：617-542-8906

(C)电传：200154(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1458个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：基因组DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：ATGCACTCTC AGAAGCGCGT CGTTGTCCTC GGATCAGGCG GTGCGTCTTT TCCCTCTCCT 60CCCCACACCC GACAGTCCTC GACGAGGTGT AGGACGGCGA GCAAAGCTGC CGAGGGCGAT 120CTGGGCTGAC TGAGCGCTCG AGTGTACAGT TATCGGTCTG AGCAGCGCCC TCATCCTCGC 180TCGGAAGGGC TACAGCGTGC ATATTCTCGC GCGCGACTTG CCGGAGGACG TCTCGAGCCA 240GACTTTCGCT TCACCATGGG CTGTGCGTCG TCTCACTGTA GTTGGAGGAT GTCAGCGAGA 300GCTGATCAAT CTCGTCATCC CCGCAGGGCG CGAATTGGAC GCCTTTCATG ACGCTTACAG 360ACGGTCCTCG ACAAGCAAAA TGGGAAGAAT CGACTTTGTG CGTCTCCTTC TACCTCATTC 420TTGGCCTCGA GCTGACGAGT GTATGATACA CAGCAAGAAG TGGGTCGAGT TGGTCCCGAC 480GGGCCATGCC ATGTGGCTCA AGGGGACGAG GCGGTTCGCG CAGAACGAAG ACGGCTTGCT 540CGGGCACTGG TACAAGGACA TCACGCCAAA TGTGCGCCCA CATTCACTCT TCCCTTCGCA 600TGTCTCCGTT TACTGACCCG CCCTCTTTCG CCGTGCGCAG TACCGCCCCC TCCCATCTTC 660CGAATGTCCA CCTGGCGCTA TCGGCGTAAC CTACGACACC CTCTCCGTCC ACGCACCAAA 720GTACTGCCAG TACCTTGCAA GAGAGCTGCA GAAGCTCGGC GCGACGTTTG AGAGACGGAC 780CGTTACGTCG CTTGAGCAGG CGTTCGACGG TGCGGATTTG GTGGTCAACG CTACGGGACT 840TGGTATGTCC CGAACTGCCC CTCTCTACCT GCAATTTTGC TGATTGATAT GCTCGCAGGC 900GCCAAGTCGA TTGCGGGCAT CGACGACCAA GCCGCCGAGC CAATCCGCGG CCAAACCGTC 960CTCGTCAAGT CCCCATGCAA GCGATGCACG ATGGACTCGT CCGACCCCGC TTCTCCCGCC 1020TACATCATTC CCCGACCAGG TGGCGAAGTC ATCTGCGGCG GGACGTACGG CGTGGGAGAC 1080TGGGACTTGT CTGTCAACCC AGAGACGGTC CAGCGGATCC TCAAGCACTG CTTGCGCCTC 1140GACCCGACCA TCTCGAGCGA CGGAACGATC GAAGGCATCG AGGTCCTCCG CCACAACGTC 1200GGCTTGCGAC CTGCACGACG AGGCGGACCC CGCGTCGAGG CAGAACGGAT CGTCCTGCCT 1260CTCGACCGGA CAAAGTCGCC CCTCTCGCTC GGCAGGGGCA GCGCACGAGC CGCGAAGGAG 1320AAGGAGGTCA CGCTTGTGCA TGCGTATGGC TTCTCGAGTG CGGGATACCA GCAGAGTTGG 1380GGCGCGGCGG AGGATGTCGC GCAGCTCGTC GACGAGGCGT TCCAGCGGTA CCACGGCGCG 1440GCGCGGGAGT CGAAGTTG 1458(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1104个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征

(A)名称/关键词：编码序列

(B)位置：1...1104

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：ATG CAC TCT CAG AAG CGC GTC GTT GTC CTC GGA TCA GGC GTT ATC GGT 48Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly1 5 10 15CTG AGC AGC GCC CTC ATC CTC GCT CGG AAG GGC TAC AGC GTG CAT ATT 96Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile

20 25 30CTC GCG CGC GAC TTG CCG GAG GAC GTC TCG AGC CAG ACT TTC GCT TCA 144Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser

35 40 45CCA TGG GCT GGC GCG AAT TGG ACG CCT TTC ATG ACG CTT ACA GAC GGT 192Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly

50 55 60CCT CGA CAA GCA AAA TGG GAA GAA TCG ACT TTC AAG AAG TGG GTC GAG 240Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu65 70 75 80TTG GTC CCG ACG GGC CAT GCC ATG TGG CTC AAG GGG ACG AGG CGG TTC 288Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe

85 90 95GCG CAG AAC GAA GAC GGC TTG CTC GGG CAC TGG TAC AAG GAC ATC ACG 336Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr

100 105 110CCA AAT TAC CGC CCC CTC CCA TCT TCC GAA TGT CCA CCT GGC GCT ATC 384Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile

115 120 125GGC GTA ACC TAC GAC ACC CTC TCC GTC CAC GCA CCA AAG TAC TGC CAG 432Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln

130 135 140TAC CTT GCA AGA GAG CTG CAG AAG CTC GGC GCG ACG TTT GAG AGA CGG 480Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg145 150 155 160ACC GTT ACG TCG CTT GAG CAG GCG TTC GAC GGT GCG GAT TTG GTG GTC 528Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val

165 170 175AAC GCT ACG GGA CTT GGC GCC AAG TCG ATT GCG GGC ATC GAC GAC CAA 576Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln

180 185 190GCC GCC GAG CCA ATC CGC GGC CAA ACC GTC CTC GTC AAG TCC CCA TGC 624Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys

195 200 205AAG CGA TGC ACG ATG GAC TCG TCC GAC CCC GCT TCT CCC GCC TAC ATC 672Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile

210 215 220ATT CCC CGA CCA GGT GGC GAA GTC ATC TGC GGC GGG ACG TAC GGC GTG 720Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val225 230 235 240GGA GAC TGG GAC TTG TCT GTC AAC CCA GAG ACG GTC CAG CGG ATC CTC 768Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu

245 250 255AAG CAC TGC TTG CGC CTC GAC CCG ACC ATC TCG AGC GAC GGA ACG ATC 816Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile

260 265 270GAA GGC ATC GAG GTC CTC CGC CAC AAC GTC GGC TTG CGA CCT GCA CGA 864Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg

275 280 285CGA GGC GGA CCC CGC GTC GAG GCA GAA CGG ATC GTC CTG CCT CTC GAC 912Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp

290 295 300CGG ACA AAG TCG CCC CTC TCG CTC GGC AGG GGC AGC GCA CGA GCC GCG 960Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala305 310 315 320AAG GAG AAG GAG GTC ACG CTT GTG CAT GCG TAT GGC TTC TCG AGT GCG 1008Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala

325 330 335GGA TAC CAG CAG AGT TGG GGC GCG GCG GAG GAT GTC GCG CAG CTC GTC 1056Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val

340 345 350GAC GAG GCG TTC CAG CGG TAC CAC GGC GCG GCG CGG GAG TCG AAG TTG 1104Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu

355 360 365(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：368个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(ii)片段类型：内部 (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly1 5 10 15Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile

20 25 30Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser

35 40 45Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly

50 55 60Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu65 70 75 80Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe

85 90 95Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr

100 105 110Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile

115 120 125Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln

130 135 140Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg145 150 155 160Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val

165 170 175Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln

180 185 190Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys

195 200 205Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile

210 215 220Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val225 230 235 240Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu

245 250 255Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile

260 265 270Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg

275 280 285Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp

290 295 300Arg Thr Lys Ser Pro Leu ger Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala305 310 315 320Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala

325 330 335Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val

340 345 350Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu

355 360 365(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：190个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：基因组DNA (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：AAGCTTCGGC ACGAGCATGA GTGTGAATGA TGGTCCAAGG AGGACAGCGC AGAGTCAACA 60GGAGGGCACA TGGAGGCAGA GCGTGGGGCG GAGGAGGCAG ATGGGGAGTC GCGCTGGGGG 120ACGAGGGGGT GTCGCTCGAC TAACAGCTCT CTATCGCTCT TGCTGCTGCT TGTACTACTC 180GAACGACGCC 190(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：801个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：基因组DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GGCGGGATTT GTGGCTGTAT TGCGGGCATC TACAAGACCA GCTTCATCTC GGACGACAAC 60ACGAGAGCGG CGAGTCTTCG TACCGTCTGA CCTTCGCAAT CCGCCGAGTC CTTGCCCGTT 120GCCCTGCTTG CTCCTTTCGT ATCTCCTGTG ACTCGGAACG TCGCTCTTCG CCTCTGTCAC 180TTGCCAGGCC GTCCCTTCAA ACTGTCGCCG CCCTCCTCCT CCCAATCTCC TCCTCACGCG 240ACTTGCCACT ACTCTCACTT CTCCTGCTTA CCAAGGCTTA CACTACGCAA CACTAAGCGC 300GGCATCAGGT TCCGTTGCGC GCCTCGTCAC GACCCGACTT TTTTTCGCCC GTTCGCTCGC 360CTCGCTCCGT TGCCGAGCGA AGAACTTCGC CTGCCTTCGA ATCTCTCGCC TTGCTCGTCT 420CGTCCTGCTC CGTTCCACCA CAGATAGACT CACAGCAACA CACTCACAAT GGTCAAGGTG 480CGCACCCACT CCCGCCAGTC CAACTCGCGC GACGAGAGAC CACCGTCTCG TTGACATCAC 540TGACCTCGTC GCTCGCCACC CACCCTCCCG CTCGTCCATG CACACAGGCA GCACCACGAT 600CAGACGAGCA GCAGCACTAC CACGCCACAG TCATGGGCGG ACTCAAGGGC GGCGCGATGG 660GGTTGGCGGC GGGTGGAGCG GGTGCGGTTG CGCTGCAGAG GGCGAACGTA CAGGCGTTCA 720CGAGGTTGAC GCTGCCTCTC AAGGCGTTTG CTGTCACGTA CGTCCCGCGA TCCCTTACTA 780TGCGACTCCC TCGGTGAATT C 801(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：16个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：简并寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：AARTAYTGYC AKTAYC 16(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：简并寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：ATNGAYGAYC AYGCNGC 17(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：简并寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：GCNGCYTGRT CRTCNAT 17(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：简并寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：ATGGAYAGYA GYGAYCC 17(2)SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：22个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gy Val Ile Gly1 5 10 15Leu Ser Ser Ala Leu Ile

20(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：Tyr Cys Gln Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln1 5 10(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：14个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Ile Ala Gly Gly Ile Asp Asp Gln Ala Ala Glu Pro Ile Arg1 5 10(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro1 5(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：8个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln Ala1 5(2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：214个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：基因组DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：AAGTACTGCC AGTACCTTGC AAGAGAGCTG CAGAAGCTCG GCGCGACGTT TGAGAGACGG 60ACCGTTACGT CGCTTGAGCA GGCGTTCGAC GGTGCGGATT TGGTGGTCAA CGCTACGGGA 120CTTGGTATGT CCCGAACTGC CCCTCTCTAC CTGCAATTTT GCTGATTGAT ATGCTCGCAG 180GCGCCAAGTC GATTGCGGGC ATCGACGACC AAGC 214(2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：10个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：Kozak序列

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：CCACCATGGC 10(2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：8个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：共有序列

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：YGTGTTYY 8(2)SEQ ID NO：18的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：8个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：基因组DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：TGTATTGC 8

序列表(1)一般信息

(i)申请人：食品工业研究与开发研究所(Food Industry Research andDevelopment Institute)

(ii)发明名称：红冬孢属D-氨基酸氧化酶

(iii)序列数：18

(iv)通讯地址：

(A)收信人：Fish & Richardson P.C.

(B)街道：225 Franklin Street

(C)城市：波士顿(Boston)

(D)州：MA

(E)国家：USA

(F)ZIP：02110-2804

(v)计算机可读形式：

(R)介质类型：软盘

(R)计算机：IBM兼容机

(C)操作系统：Windows 95

(D)软件：Fast SEQ for Windows Version 2.0b

(vi)当前申请的数据：

(A)申请号：08/903,624

(R)申请日：1997年7月31日

(vii)在先申请的数据：

(A)申请号：

(B)申请日：

(viii)律师/代理人信息：

(A)名称：Tsao，Y.Rocky

(B)登记号：34,053

(C)证书号：06497/006CA1

(ix)电讯信息：

(A)电话：617-542-5070

(B)传真：617-542-8906

(C)电传：200154(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1458个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：基因组DNA

(i)序列特征：

(A)长度：1104个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征

(A)名称/关键词：编码序列

(B)位置：1...1104

325 330 335GGA TAC CAG CAG AGT TGG GGC GCG GCG GAG GAT GTC GCG CAG CTC GTC 1056Gly Tyr Gln Gln Ser Trp G1y Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val

355 360 365(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：368个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(ii)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly1 5 10 15Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile

20 25 30Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser

35 40 45Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly

85 90 95Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr

100 105 110Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile

115 120 125Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln

165 170 175Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln

180 185 190Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys

195 200 205Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile

245 250 255Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile

260 265 270Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg

275 280 285Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp

290 295 300Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala305 310 315 320Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala

325 330 335Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val

340 345 350Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu

355 360 365(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：190个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：基因组DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：AAGCTTCGGC ACGAGCATGA GTGTGAATGA TGGTCCAAGG AGGACAGCGC AGAGTCAACA 60GGAGGGCACA TGGAGGCAGA GCGTGGGGCG GAGGAGGCAG ATGGGGAGTC GCGCTGGGGG 120ACGAGGGGGT GTCGCTCGAC TAACAGCTCT CTATCGCTCT TGCTGCTGCT TGTACTACTC 180GAACGACGCC 190(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：801个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：基因组DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GGCGGGATTT GTGGCTGTAT TGCGGGCATC TACAAGACCA GCTTCATCTC GGACGACAAC 60ACGAGAGCGG CGAGTCTTCG TACCGTCTGA CCTTCGCAAT CCGCCGAGTC CTTGCCCGTT 120GCCCTGCTTG CTCCTTTCGT ATCTCCTGTG ACTCGGAACG TCGCTCTTCG CCTCTGTCAC 180TTGCCAGGCC GTCCCTTCAA ACTGTCGCCG CCCTCCTCCT CCCAATCTCC TCCTCACGCG 240ACTTGCCACT ACTCTCACTT CTCCTGCTTA CCAAGGCTTA CACTACGCAA CACTAAGCGC 300GGCATCAGGT TCCGTTGCGC GCCTCGTCAC GACCCGACTT TTTTTCGCCC GTTCGCTCGC 360CTCGCTCCGT TGCCGAGCGA AGAACTTCGC CTGCCTTCGA ATCTCTCGCC TTGCTCGTCT 420CGTCCTGCTC CGTTCCACCA CAGATAGACT CACAGCAACA CACTCACAAT GGTCAAGGTG 480CGCACCCACT CCCGCCAGTC CAACTCGCGC GACGAGAGAC CACCGTCTCG TTGACATCAC 540TGACCTCGTC GCTCGCCACC CACCCTCCCG CTCGTCCATG CACACAGGCA GCACCACGAT 600CAGACGAGCA GCAGCACTAC CACGCCACAG TCATCGGCGG ACTCAAGGGC GGCGCGATGG 660GGTTGGCGGC GGGTGGAGCG GGTGCGGTTG CGCTGCAGAG GGCGAACGTA CAGGCGTTCA 720CGAGGTTGAC GCTGCCTCTC AAGGCGTTTG CTGTCACGTA CGTCCCGCGA TCCCTTACTA 780TGCGACTCCC TCGGTGAATT C 801(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：16个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：其它

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：AARTAYTGYC ARTAYC 16(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：简并寡核苷酸

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：简并寡核苷酸

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：简并寡核苷酸

(i)序列特征：

(A)长度：22个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：肽

20(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：Tyr Cys Gln Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln1 5 10(2) SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：14个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：肽

(i)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(ii)分子类型：肽

(i)序列特征：

(A)长度：8个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：肽

(i)序列特征：

(A)长度：214个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：基因组DNA

(i)序列特征：

(A)长度：10个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：Kozak序列

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：CCACCATGGC 10(2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：8个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：共有序列

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17YGTGTTYY 8(2)SEQ ID NO：18的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：8个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：基因组DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：TGTATTGC 8

Claims

1.一种分离的核酸，该核酸编码红冬孢属D-氨基酸氧化酶。

2.权利要求1的核酸，其中所说的核酸选自包含SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2；以及一种在严格条件下与SEQ ID NO：1或者SEQ IDNO：2杂交的核酸的组。

3.一种包含权利要求2的核酸的载体。

4.一种包含权利要求2的核酸的转化的宿主细胞。

5.权利要求2的核酸，其中所说的核酸是SEQ ID NO：1或者SEQ IDNO：2。

6.一种包含权利要求5的核酸的载体。

7.一种包含权利要求5的核酸的转化的宿主细胞。

8.权利要求1的核酸，其中所说的核酸编码SEQ ID NO：3。

9.一种包含权利要求8的核酸的载体。

10.一种包含权利要求8的核酸的转化的宿主细胞。

11.权利要求1的核酸，其中所说的核酸实质上由SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2组成。

12.一种包含权利要求11的核酸的载体。

13.一种包含权利要求11的核酸的转化的宿主细胞。

14.权利要求1的核酸，其中所说的核酸编码下列种的DAO；类酵母红冬孢、双倒卵形红冬孢、球红冬孢、kratochvilovae、葡萄牙红冬孢、paludignenum、dacryoidum、babjevae、以及fluviale。

15.权利要求14的核酸，其中所说的核酸编码类酵母红冬孢的DAO。

16.一种包含权利要求15的核酸的载体。

17.一种包含权利要求15的核酸的转化的宿主细胞。

18.一种包含权利要求1的核酸的载体。

19.一种包含权利要求1的核酸的转化的宿主细胞。

20.一种红冬孢属的分离的D-氨基酸氧化酶。

21.权利要求20的D-氨基酸氧化酶，其中所说的D-氨基酸氧化酶是SEQ ID NO：3或者至少由一个保守氨基酸取代而不同于SEQ ID NO：3的蛋白质。

22.权利要求20的D-氨基酸氧化酶，其中所说的D-氨基酸氧化酶是类酵母红冬孢、双倒卵形红冬孢、球红冬孢、kratochvilovae、葡萄牙红冬孢、paludignenum、dacryoidum、babjevae以及fluviale的D-氨基酸氧化酶。

23.权利要求22的D-氨基酸氧化酶，其中所说的D-氨基酸氧化酶是类酵母红冬孢种的D-氨基酸氧化酶。