CN1558953A - 编码番茄红素环化酶 /八氢番茄红素合酶(carRP)和八氢番茄红素脱氢酶(carB)的三孢布拉霉β－胡萝卜素的生物合成基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及三孢布拉霉的β－胡萝卜素的生物合成基因，其编码番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶(carRP)和八氢番茄红素脱氢酶(carB)。carRP基因，其特征在于DNA序列SEQ ID NO：1，编码氨基酸序列SEQ IDNO：3，其具有番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶活性。carB基因，其特征在于DNA序列SEQ ID NO：2，编码氨基酸序列SEQ ID NO：4，其具有八氢番茄红素脱氢酶活性。本发明还涉及(i)构建表达附加拷贝的所述基因的质粒的方法和(ii)在所述基因的启动子控制下表达异源基因的方法。

Description

编码番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶(carRP)和八氢番茄红素脱氢酶 (carB)的三孢布拉霉β-胡萝卜素的生物合成基因

发明领域

本发明涉及命名为carRP和carB的三孢布拉霉(Blakeslea trispora)的2个新基因。基因carRP编码双功能酶番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶，而carB编码酶八氢番茄红素脱氢酶。2个基因都与三孢布拉霉的β-胡萝卜素生物合成途径有关(参见图解)。

现有技术

类葫萝卜素是类异戊二烯类型的色素，其由某些细菌，真菌和光合生物合成。由于它们对健康的有益效果和它们诱人的颜色，类葫萝卜素作为色素和食品添加剂具有重要的商业价值。β-胡萝卜素是一种类葫萝卜素，其化学合成从1956年起已经已知。它具有536.9的分子量，和含有11个共轭双键的分子(C₄₀H₅₆)。它的颜色在晶态是红紫色，在油性溶液中是黄橙色，在水性分散体中是橙色。合成的β-胡萝卜素具有全反式异构构型，而从各种天然来源获得的β-胡萝卜素具有各种形式：单-顺，双-顺和多-顺。

通过微生物合成生产类葫萝卜素是化学和生物方法之间竞争的典型实例。生物技术方法显示其中有可能以简单的方式获得具有更复杂结构的类葫萝卜素，如仅以天然形式存在的构象异构体。与化学合成竞争，用于生产β-胡萝卜素的工业生物技术方法是基于藻盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)和真菌三孢布拉霉的使用。使用三孢布拉霉的生产方法涉及进行(+)和(-)菌株的混合发酵以获得最大产量的β-胡萝卜素。这导致三孢酸的生物合成，其诱导β-胡萝卜素的生产。(+)菌株和(-)菌株都生产β-胡萝卜素，其被两者代谢成视黄醛，然后成4-二氢三孢醇。(+)菌株使用4-二氢三孢醇作为形成4-二氢三孢酸和它的甲酯(4-二氢三孢甲酯)的底物。对于它的部分，(-)菌株将4-二氢三孢醇代谢成三孢醇。最后，4-二氢三孢甲酯被(-)菌株转化成三孢酸并且三孢醇被(+)菌株转化成三孢酸。三孢酸生物合成的这种描述是简化，因为该方法产生许多共代谢物，其中有些对于(+)菌株和(-)菌株是共有的，但其它对于它们中之一是特异性的。这些共代谢物的相对量根据菌株而变化。

尽管真菌三孢布拉霉的巨大的生物技术重要性，关于β-胡萝卜素的生物合成的科学知识是缺乏的，因为：(i)还未描述关于它的遗传操作，即生物合成/调节基因的克隆和转化的基本方法和(ii)缺乏和β-胡萝卜素生物合成有关的酶的特性信息。然而，已经在系统发育相关的真菌如布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus)和卷枝毛霉(Mucor circinelloides)中描述β-胡萝卜素的生物合成途径(参见图解)(Arrach N.等(2001)Proceedings of the National Academy of Sciences USA 98：1687-1692；Velayos A.等(2000)European Journal of Biochemistry 267：5509-5519)。该生物合成至少需要3种酶：(i)八氢番茄红素合酶，其连接产生八氢番茄红素的2分子香叶基香叶基焦磷酸，(ii)八氢番茄红素脱氢酶，其将4个双键引入八氢番茄红素分子以合成番茄红素，和(iii)番茄红素环化酶，其使用番茄红素作为底物，负责形成位于β-胡萝卜素分子两端的环。

分析三孢布拉霉的突变体已经得出结论，在该真菌中的β-胡萝卜素的生物合成途径类似于关于布拉克须霉的描述(Metha B.J.和Cerdá-Olmedo E.(1995)Applied Microbiology and Biotechnology 42：836-838)。在布拉克须霉的情形中，通过突变可以改变它菌丝体的黄色，产生菌丝体为红色，白色或各种梯度黄色的菌株。红色突变体累积番茄红素，而白色突变体缺乏类胡罗卜素的生产或累积八氢番茄红素。使用互补分析，已经鉴定称为carB和carRA的2个基因，其产物可能组织成酶复合体，其中4个脱氢作用由4个相同的八氢番茄红素脱氢酶单位催化并且2个环化由2个相同的番茄红素环化酶单位催化(Candau R.等(1991)Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 88：4936-4940)。已经克隆和表征carB基因(Ruiz-Hidalgo M.J.等(1997)Molecular and GeneralGenetics 253：734-744)和carRA基因(Arrach N.等(2001)Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 98：1687-1692)。carRA基因具有2个不同结构域：(i)结构域R，其位于更靠近5’末端并编码八氢番茄红素合酶活性和(ii)结构域A，其负责八氢番茄红素合酶活性。此外，已经在卷枝毛霉中表达布拉克须霉的carB基因(Ruiz-Hidalgo M.J.等(1999)Current Microbiolgy 39：259-264)。

也已经克隆和表征卷枝毛霉的基因carB(Velayos A.等(2000)Planta210：938-946)和carRP(Velayos A.等(2000)European Journal ofBiochemistry 267：5509-5519)。carRP基因编码具有两个结构域的双功能酶番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶：(i)结构域R，其位于更靠近5’末端并编码番茄红素环化酶活性和(ii)结构域P，其位于3’末端并负责八氢番茄红素合酶活性。即使在缺乏结构域P时结构域R也是有功能的，而结构域P需要结构域R的存在以适当地起作用。

发明详述

本发明首次描述三孢布拉霉的carB和carRP基因。如先前关于布拉克须霉和卷枝毛霉所述，carB基因编码八氢番茄红素脱氢酶并且carRP基因编码具有结构域R(更靠近5’末端和编码番茄红素环化酶活性)和结构域P(位于3’末端并负责八氢番茄红素合酶活性)的双功能酶番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶。具体地，由carB编码的产物进行八氢番茄红素至番茄红素的转化，由carRP编码的双功能酶催化从香叶基香叶基-PP的八氢番茄红素的生物合成和番茄红素至β-胡萝卜素的转化。两个基因：(i)涉及β-胡萝卜素的生物合成途径，(ii)在基因组中是紧接着和(iii)在位于两者之间的双向启动子的控制下表达。该双向启动子允许在一个方向或在相反方向的基因表达。缺乏这两个基因中任何一个的突变体不能生产β-胡萝卜素，而是累积相应的生物合成中间体(参见图解)。

三孢布拉霉是对于生物技术生产β-胡萝卜素有重要工业意义的真菌。实际上，该方法变得与目前工业使用的合成方法存在竞争性。可以使用前述的基因carRP和carB，例如用于(i)通过增加它的表达改善β-胡萝卜素的产率和(ii)通过产生能够生物合成其它类胡萝卜素的菌株修饰β-胡萝卜素的生物合成途径。通过将额外拷贝的所述基因以它们天然状态或在强启动子的控制下表达的形式插入于三孢布拉霉中可以增加carRP和carB的基因表达。例如通过操作carRP基因使番茄红素环化酶活性失活可以实现β-胡萝卜素生物合成途径的修饰。这样，将产生能够生产番茄红素，有重大工业和商业利益的类胡罗卜素的菌株。

下页的图解显示涉及三孢布拉霉的β-胡萝卜素生物合成途径的基因和酶。八氢番茄红素合成酶活性连接2分子香叶基香叶基焦磷酸，产生八氢番茄红素。八氢番茄红素脱氢酶活性在八氢番茄红素分子中引入4个双键以合成番茄红素。番茄红素环化酶活性，其使用番茄红素作为底物，形成位于β-胡萝卜素分子两端的环。

                            图解

将真菌三孢布拉霉的基因组DNA用于构建在噬菌体载体λ-GEM12中的基因文库。为此，用限制酶Sau3AI实行部分消化并将产生的片段连接到λ-GEM12，如在Sambrook J.等(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA中所述。通过使用对应于卷枝毛霉的carRP基因的探针筛选所述三孢布拉霉的基因文库克隆基因carRP(番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶)和carB(八氢番茄红素脱氢酶)。使用基于卷枝毛霉的carRP基因(Velayos A.等(2000)European Journal of Biochemistry 267：5509-5519)设计的引物，通过PCR(多聚酶链式反应)获得探针。这样扩增560-bp的DNA片段并用于筛选基因文库，分离4个命名为fALBT1，fALBT4，fALBT12和fALBT15的重组噬菌体(图1)。用一系列限制酶分析所述克隆，然后将2.4-kb HindIII片段亚克隆至大肠杆菌的质粒载体中。前述片段的限制酶图谱在图解中显示。接下来，测定包括在前述HindIII片段中的2430bp的序列，发现2个不完整的可读框(ORF)，其在相反的方向上转录。基于它们与存在于数据库中的序列的相似性，将它们命名为carRP(SEQ ID NO：1)和carB(SEQ ID NO：2)。随后邻近于前述2.4kb片段HindIII的末端的DNA区域的亚克隆和  测序使可以完成两个ORF的核苷酸序列。

对应于carRP基因的ORF具有1894bp的长度，被位置406和475之间的70-bp内含子间断。所述ORF编码608个氨基酸，69,581Da和7.78的等电点的蛋白质。将它推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与SwissProt数据库比较显示与编码卷枝毛霉(67％)，布拉克须霉(55％)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(29％)的番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶的基因(Velayos A.等(2000)。European Journal ofBiochemistry 267：5509-5519；Arrach N等(2000)。Proceedings of the National Academy of Sciences USA98：1687-1692；Schmidhauser T.J.等(1994)。The Journal of BiologicalChemistry 269：12060-12066)的很高相似性。

对应于carB基因的ORF具有1955bp的长度并且被分别位于位置594-734和1584-1651的141bp和68bp的2个内含子中断。该ORF编码582个氨基酸，66,426Da和6.9的等电点的蛋白质。将它推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)与SwissProt数据库比较显示与编码卷枝毛霉(80％)，布拉克须霉(72％)和粗糙脉孢菌(48％)的八氢番茄红素脱氢酶的基因(Velayos A.等(2000)。Planta，210：938-946；Ruiz-Hidalgo等(1997)。Molecular and General Genetics 253：734-744；Ruiz-Hidalgo等(1999)。Current Microbiology 39：259-264；Schmidhauser等(1990)。Molecular and Cellular Biology 10：5064-5070)的很高相似性。

使用适当的限制目标将包括两个基因(carRP和carB)的6.9-kb DNA片段亚克隆至质粒载体，其能够以一个或多个拷贝结合到三孢布拉霉的基因组中，其允许在宿主真菌中表达这些基因。类似地，可以获得carRP和carB基因的启动子(使用适当的限制目标或通过PCR)并用于在三孢布拉霉中表达同源基因和异源基因。下列实施例描述在carRP和carB基因的启动子下印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)的腐草霉素抗性基因(ble^R)表达(Drocourt D.等(1990)。Nucleic Acids Research18：4009)。如前所述，可以将carRP和carB基因的启动子用于在三孢布拉霉中正确表达异源基因或用于过量表达弱转录的同源基因。

在三孢布拉霉中表达叶黄素的生物合成基因可以产生转化体，其能够生物合成类胡萝卜素如玉米黄质，角黄素，虾青素或新的类胡萝卜素。另外，通过基因中断的方法，将可以阻断β-胡萝卜素的生物合成途径，获得能够生产例如作为终产物的番茄红素的转化体。

根据布达佩斯条约的微生物保藏

按照布达佩斯条约的条款，在09.17.01将携带质粒pALBT9(其包含carRP基因)和pALBT52(其包含carB基因)的2株大肠杆菌菌株保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)，巴伦西亚大学生物学院微生物系，Campus de Burjasot，46100 Burjasot，巴伦西亚，(西班牙)，保藏号分别为CECT5982和CECT 5981。

下列实施例详细而不限制性地描述本发明。

实施例1

构建三孢布拉霉的(+)和(-)菌株的基因文库

以下列方式构建三孢布拉霉的(+)和(-)菌株的基因文库：在600μl的反应体积中在37℃下用20单位的Sau3AI部分消化总共300μg的全DNA，并分别在45秒，1分钟和2分钟时收集3个200μl的等分试样，用冷EDTA 20mM终止消化。在于0.7％的琼脂糖凝胶中证实消化物后，将它们混合，在68℃下加热10分钟，让其缓慢冷却至室温并放置在38ml的蔗糖梯度(10-40％)上。将该梯度在26,000rpm下25℃离心24小时，其后收集0.5-ml等分试样，在0.4％琼脂糖凝胶中分析每个10μl。混合其DNA具有18和22kb之间大小的等分试样，然后用蒸馏水稀释至大约10％蔗糖。然后用乙醇沉淀DNA，重悬浮在50μl TE缓冲液中，在0.4％琼脂糖凝胶中分析3μl最后提到的溶液。在该凝胶中证实DNA片段的大小正确并且它们的浓度大约为50ng/μl。

平行地，通过先前所述方法(Sambrook J.等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)制备噬菌体λ-GEM12(Promega)的DNA。在37℃下用内切核酸酶BamHI和EcoRI将来自噬菌体的50μg DNA消化2小时。用苯酚/CIA和CIA萃取双消化物，用乙醇沉淀并重悬浮在50μl TE缓冲液中。在收集2-μl等分试样后，向剩余中加入MgCl₂至10mM，然后在42℃下将它温育1小时以促进载体的臂在它的粘性末端环化。再收集2-μl级分并且与前述级分一起在0.5％琼脂糖凝胶中分析以证实在粘性末端的正确环化和测定它的近似浓度(大约100ng/μl)。

接下来，改变插入片段/载体比率，使用0.25μg插入片段和0.25-0.75μg数量的载体进行一系列的连接。将反应物在12-14℃下温育16小时。使用‘Packagene’(Promega)体外包装提取物进行在连接后产生的重组噬菌体DNA的包壳。将来源于包壳反应的产物重悬浮在500μl SM中，进行大肠杆菌NM538(Promega)的感染以测定存在的噬菌体和大肠杆菌NM539(Promega)的数量，旨在测定重组噬菌体的百分比。大肠杆菌NM539是P2噬菌体的溶原性菌株，当感染它的噬菌体缺乏非必需中央区域时只生产溶菌噬菌斑。

构建的基因文库的效价证明如下：对于三孢布拉霉(+)125,000pfu，对于三孢布拉霉(-)50,000pfu。在两种情形中大约80％的噬菌体是外源DNA片段的载体。

实施例2

克隆和表征三孢布拉霉的carB和carRP基因

将两种基因文库转移至硝化纤维滤器并用对应于卷枝毛霉的carRP基因的560-bp探针扫描。该探针是通过PCR扩增获得的，所述PCR使用引物#61(SEQ ID NO：5)和#62(SEQ ID NO：6)，其被设计成卷枝毛霉的carRP基因DNA序列的功能(Velayos A.等(2000)European Journal ofBiochemistry 267：5509-5519)。按照先前所述的杂交方法(Sambrook J.等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)进行选择阳性噬菌体的方法。一旦完成预杂交，杂交，洗涤和放射自显影，选择4个克隆，其命名为fALBT1，fALBT4，fALBT12和fALBT15，其与探针DNA产生阳性信号。通过使用标准技术(Sambrook J.等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)用适当的限制酶消化噬菌体fALBT4或fALBT15(图1)可以获得本发明要求的、包括carRP和carB基因的DNA。用1种或多种限制酶(图1)可以获得包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的DNA片段，并亚克隆至适当的载体(例如pBluescript)中。

将从fALBT1噬菌体获得的2.4-kb HindIII DNA片段(图1)以两个可能的方向亚克隆至质粒pBluescript I KS(+)的HindIII限制位点中。产生的质粒命名为pALBT3和pALBT11。按照厂商的说明书使用‘Erase-a-base’试剂盒将这些质粒进行序列缺失。使用‘Dye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Kit’进行缺失克隆的序列反应，并按照厂商的说明书在ABI PRISM自动测序仪(Perkin Elmer)中分离DNA片段。这样我们在两条链上获得总共2430bp的核苷酸序列。使用Geneplot程序(DNASTAR)，鉴定两个不完整的ORF，其对应于carRP和carB基因。为了完成两个基因的核苷酸序列，我们进行邻近于前述HindIII片段的DNA区域的亚克隆和随后测序。从fALBT1噬菌体开始，将1.0-kb XhoI片段亚克隆至pBluescript I KS(+)(图1)中，其包括carRP基因的3’末端，产生pALBT12质粒。包括在所述质粒中片段的两条链的测序使可以完成carRP基因的核苷酸序列。

另外，为了测定carB基因3’区域的序列，在pBluescript I KS(+)中进行从fALBT15获得的5.1-kb ClaI-NotI片段的亚克隆。按照厂商的说明书使用‘Erase-a-base’试剂盒(Promega)将命名为pALBT59和pALBT82的获得的质粒(双向)进行序列缺失。使用‘Dye Terminator Cycle SequencingReady Reaction Kit’进行缺失克隆的序列反应，并按照厂商的说明书在ABI PRISM自动测序仪(Perkin Elmer)中分离DNA片段。

完整的carRP基因的核苷酸序列显示1894bp的ORF，其被70bp的内含子间断，所述内含子位于位置406-475之间，两侧是下列内含子/外显子剪接序列：5’(g/GTATGCA)和3’(TTAG/c)。当将它们与关于真菌所述的共有序列：5’(g/GTAHGTYW)和3’(MYAG/g)比较时，它是个保守序列的问题。该基因编码608个氨基酸的多肽，推断的分子量为69,581Da，等电点为7.78。从该序列(SEQ ID NO：3)推断的蛋白质与在数据库中所述的卷枝毛霉(67％)，布拉克须霉(55％)和粗糙脉孢菌(29％)的具有番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶活性的酶(Velayos A.等(2000)。European Journal of Biochemistry 267：5509-5519；Arrach N等(2000)。Proceedings of the National Academy of Sciences USA 98：1687-1692；Schmidhauser T.J.等(1994)。The Journal of Biological Chemistry 269：12060-12066)显示很高的相似性。

carB基因，长度为1955bp，被141和68bp的两个内含子间断，所述内含子分别位于位置594-734bp和1584-1651bp处，两侧是与关于carRP基因所述的那些类似的保守真菌内含子/外显子剪接序列[对于141-bp内含子5’(g/GTAAGTA)和3’(ATAG/t)，对于68-bp内含子5’(g/GTAATAC)和3’(GTAG/t)]。carB基因编码582个氨基酸的多肽，推断的分子量为66,426Da，等电点为6.9。从该序列(SEQ ID NO：4)推断的蛋白质与在数据库中所述的卷枝毛霉(80％)，布拉克须霉(72％)和粗糙脉孢菌(48％)的具有八氢番茄红素脱氢酶活性的酶(Velayos A.等(2000)。Planta，210：938-946；Ruiz-Hidalgo等(1997)。Molecular and General Genetics253：734-744；Ruiz-Hidalgo等(1999)。Current Microbiology 39：259-264；Schmidhauser等(1990)。Molecular and Cellular Biology 10：5064-5070)显示很高的相似性。

实施例3

构建用于在三孢布拉霉中异源表达的质粒

将pALFleo7质粒(Díez B.等(1999)Applied Microbiology andBiotechnology 52：196-207)用作构建在三孢布拉霉中异源表达质粒的起点。所述质粒包含印度斯坦链异壁菌的腐草霉素抗性基因(ble^R)(DrocourtD.等(1990)。Nucleic Acids Research 18：4009)，NcoI限制位点位于ATG翻译起始密码子处，BamHI限制位点在NcoI之前。pALFleo7还具有构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC基因终止子(TtrpC)。通过用BamHI加上BglII双消化pALFleo7纯化由ble^R基因和TtrpC形成的聚簇并亚克隆至pBluescript I KS(+)的BamHI位点。产生的质粒命名为pALfleo8。接下来，通过定向诱变使用‘QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit’(Stratagene)将两个NcoI位点插入carB和carRP基因的ATG翻译起始密码子中。为了将NcoI切割位点插入carB基因，设计下列寡核苷酸，其由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8表示。为了将NcoI切割位点插入carRP基因，设计由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10表示的寡核苷酸。在两种情形中将pALBT3用作PCR扩增的模板。一旦插入相应的突变，获得pALBT56质粒。

从pALBT56质粒开始，使用‘Quiaex II’试剂盒(Quiagen)，对应于carB和carRP基因的双向启动子(PcarB-PcarRP)纯化0.6-kb NcoI片段。将该片段连接至预先用内切核酸酶NcoI消化的pALfleo8质粒，获得两个不同质粒：pALBT57(其在PcarRP启动子下表达ble^R基因)和pALBT58(其在PcarB启动子下表达ble^R基因)。质粒pALBT57和pALBT58(图2)允许在三孢布拉霉中异源表达印度斯坦链异壁菌的ble^R基因。

实施例4

构建用于将附加拷贝的carRP和carB基因插入三孢布拉霉中的质粒。

为了将附加拷贝的carRP和carB基因插入三孢布拉霉，构建质粒pALBT83，pALBT84和pALBT85(图2)。在所有3种情形中，将先前所述的pALBT57质粒用作起点。以下列方法进行pALBT83的构建：用内切核酸酶SphI消化fALBT4，然后用来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I的Klenow片段补平它的末端(为了促进它外切核酸酶活性的作用未加入dNTP)并最后用内切核酸酶NotI消化。接下来，用‘Quiaex II’试剂盒(Quiagen)纯化6.9-kb片段，其包含carB和carRP基因。另外，用内切核酸酶SacI消化pALBT57质粒，然后与DNA聚合酶I的Klenow片段温育以获得平端(为了促进它外切核酸酶活性的作用未加入dNTP)并最后用NotI消化。连接质粒和插入片段的可匹配末端，并通过电穿孔将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中。在LB培养基(Sambrook J.等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)中选择氨苄青霉素抗性(存在于pALBT57载体中)转化体。通过限制酶切分析选择所需构建体，获得pALBT83质粒(图2)。

以下列方法进行pALBT84的构建：用内切核酸酶NdeI消化pALBT9，然后用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段补平它的末端。接下来，使用‘Quiaex II’试剂盒(Quiagen)纯化包含carRP基因的3.5kb片段。另外，用内切核酸酶SacI消化pALBT57质粒，然后与DNA聚合酶I的Klenow片段温育以补平末端(为了促进它外切核酸酶活性的作用未加入dNTP)。连接质粒和插入片段的平端，并通过电穿孔将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中。在LB培养基(Sambrook J.等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)中选择氨苄青霉素抗性(存在于pALBT57载体中)转化体。通过限制酶切分析选择所需构建体，获得pALBT84质粒(图2)。

以下列方法进行pALBT85的构建：用内切核酸酶XhoI-XbaI消化pALBT52，然后用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段补平它的末端。接下来，使用‘Quiaex II’试剂盒(Quiagen)纯化包含carB基因的2.6-kb片段。另外，用内切核酸酶SacI消化pALBT57质粒，然后与DNA聚合酶I的Klenow片段温育以补平末端(为了促进它外切核酸酶活性的作用未加入dNTP)。连接质粒和插入片段的平端，并通过电穿孔将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中。在LB培养基(Sambrook J.等(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，USA)中选择氨苄青霉素抗性(存在于pALBT57载体中)转化体。通过限制酶切分析选择所需构建体，获得pALBT85质粒(图2)。

为了明确地阐述本发明，提供总共2副图。缩写BamHI，HindIII等是对限制酶的常规缩写。按照通过琼脂糖凝胶电泳测定的大小以千碱基(kb)显示DNA片段的近似长度。图未显示所有存在的限制位点。本发明的DNA可以通过各种方法插入到任何适当的载体中：粘性末端的直接连接，利用同聚物附着，通过衔接或连接分子等。

附图详述

图1.包含carB和carRP基因的三孢布拉霉基因组区域的限制酶图谱。箭头表示它们中每个的转录方向，矩形表示内含子的存在。图下部的线表示克隆到噬菌体载体λ-GEM12(fALBT)中或质粒(pALBT)中的DNA片段。该DNA片段的核苷酸序列在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中描述。

图2.质粒pALBT57，pALBT58，pALBT83，pALBT84和pALBT85的物理图谱。pALBT57由具有包括腐草霉素-抗性构建体PcarRP-ble^R-TtrpC的1.7-kbHindIII-BamHI插入片段的pBluescript KS(+)组成。pALBT58由具有包括腐草霉素-抗性构建体PcarB-ble^R-TtrpC的1.7-kbHindIII-BamHI插入片段的pBluescript KS(+)组成。pALBT83是由具有包括carB和carRP基因的6.9-kb SphI-NotI插入片段的pALBT57形成的。pALBT84由具有包括carRP基因的3.5-kb NdeI插入片段的pALBT57组成。pALBT85是具有包括carB基因的2.6-kb XhoI-XbaI插入片段的pALBT57。

                            序列表

<110>抗生素，S.A.U.

<120>“编码番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶(carRP)和八氢番茄红素脱氢酶(carB)的三孢布拉霉β-胡萝卜素的生物合成基因”

<130>P-99669

<160>10

<210>SEQ ID NO：1

<211>8786

<212>DNA

<213>三孢布拉霉(Blakeslea trispora)

<220>CDS

<221>carRP

<222>5688...7581

<220>外显子

<222>5688...6092

<220>外显子

<222>6163...7581

<223>直接来源：质粒pALBT9(CECT 5982)和pALBT52(CECT 5981).

<223>β-胡萝卜素生物合成基因。

<400>

GGGCTCACTT GTATCATCAC TGTTGTTAAT AAATTGTTGA GAATAAAGCT TGGATTGTAT    60

ACGACTGAGC CAGTTGGAGC CACTTGTAGG CCTTGTGGGT GATACAACAG CAGGCTTTGA   120

TACAGTGGTA TTTATTTCTG GCCTAAACTT CAATATACTT TTTGGACTGT TCATGCCTTG   180

ATATAACAAA ATAAAATAAA AAGGGACCTT GTACACTGAA AGCCAAATGA ATAAAATAAA   240

AAATAAAAAA TAAAAAGTTA TTTGCAGAAA CCCAAAAAGC CCGAAATTTC TTCTAAAAGA   300

AAGAAAATAA AAAAAAAGAG AGACTTACTT TTAGGCGATC AACAGTCTTT TTTTTTTGCT   360

TGAGCTTCTT TTAAGCTTTA CATTTAGGCA CTTTTATAAT TGCTGTATTG AATATGACAT   420

CTATCTTTTT TAACTTGAAC GATTTGTAGC TGTTTTCTCT TGACAATGTT AATTTTAAAG   480

CATGATTTTT TTTCTGAAAA AATAAAGACC GCTTACATAA TACAAAAGTC AGAATTGTAT   540

GGCTATTTTA TCCTGTCTCT TCTTTTCAGG AACTCAACCA TCTCCTTGTC TTTATTGTCT   600

GAGAATGCTT TATCTGACTC TTATTAATCC TTTGAGAAAC CAAAAATGGG GTGGATTGAG   660

ACTTGGACTC GCTTTGTGCA TTTGCTCCTT CTGTTCGATC ATTATTGAGC AATGTCATAC   720

AAACATTCAA TGACAAGCAA CATCAAACTA GGAGACAGAT TAAGCAAGCA GATGATTTAT   780

AAAGGGCTAC TCTGCTCATT GATTTACATG CTTTAGCATC ATGAATTGTG TTGCTTCCAT   840

TCCAAAATAG ATGTCTTTTT CTCTTTCCAC TTGCCTCTTT CTTTTTTTGG CTATTCAGCA   900

TAATGCAAGA GTAGCTATTC CTCAACCCAT CAGTAATAAG TGAATGGCAC GGTAGCATTG   960

TGTTTGTATG TTTTCTATCT GCGTTTTGAT TTTCGAATCT CATCTTTAGG ATAGTATCTT  1020

GAGATTGTAT TGATTTTGCC TGATACACTT TTGTTTTTGT GAATATGAGC TTCAGGGAAG  1080

TGATCTGTTT AAGTACAATT GAAATAAAGT GATAGTCTTT GAGGTTTGGT ATATGGCTTT  1140

CTAAAGCATG GACAGAGCCA TGACAAAAAA AAGGGCGGTA TAAAGCCTCA GATAACTCCC  1200

TCTCTTGCAC TCTGACAAAT GTAGTACAGG CTTATTGCCA ATGGAATGAC TCAATAGATG  1260

GCTAAATGTG AAGAAAAACG TATTGGAAAA GCCTACAAAA CTTTCCTTAA TAAACATCAT  1320

GGCCATCTTT TTTGAAAGAT TTCAAAGACT AGGTTAAAAA TACCATTACT ATCATCTTGC  1380

TTCTAGTCCT CTGACTATTT CTTTGTTTTC AACAACACGT GTAGGAAGGA CAAGAAAGAT  1440

GTAAGCGACA GAATAGCTTA GTTTTACTAT ACTCTACTTC TTTTTTTTTT GTAGTTTTCC  1500

ATCTTCCTTG CTTTGAAGAT AGACAATTTT ACTCACACAA TTTCTTTTTC GTTAAAGCTG  1560

ATAGCTTGAA TATCATCATA TCAAACAGAA GACATATATC GCTAAATAGT ACTTGCTATA  1620

ACAGAGAAAG CGATCCATGT GCAACTCTGA TGCTTATCGC CGTAGACGAC TTTCCTTAAA  1680

AAAAACTGAC AAACACCGTA GAATGTGACA CATACACACA ACAATACTGT TGCTCAAAAC  1740

TTTAACTAAT AGTTAAAGTA CAATGAAAAT ATATTGCAGT CTAGAATGAT AACAATTTTG  1800

CTTTAACGAT GTGGTGCAGT CTTAATTCAA AGCTCAAAGA AAAGAAAAAG AATTTGCTAG  1860

CTATCATGAG CTAAATCTCT GTTTTTCTTG AAACAATCTT ACAAAGAAAA GCTATATTGC  1920

TTGACAAAGG GCAAATCCAC CGAGATTCTT TTACTGCATG CCCGAATAAA AAGGGAGAGG  1980

AAGAGGAGTA TGTTACACTT GAATGTATTT TTGAGGAAGC ATCCGCATTA ATTTGGTGTT  2040

ATAAACACTG AGTAATCATG TTATTTGAAG ACTGAACCTT TACCAAAAAG GTCTTGTAGA  2100

TCGCTTGTTG CAATTGAGAT GGGTTAAAAA TAAGTCTAAA GTTAAGATAA GCACAATGAA  2160

AAGAACGTTT TTATTTTCTA TCAGGCAAAG TAAAACCACT TTTCTAGATG TGGCAATAAG  2220

CAATCAAGCC AAAGGGAGAA AAAAGCTTAT CAAAGCTATG GCTTTCAAGA GAATAGTAAT  2280

TTAGGTACTA CACAAAGCCA CTGTTTATGC TTCTTTGCAA TATCAACAAA GAGACATTGT  2340

GTCTGTTGAA ATGTTTTGTT TGACATGTTT AATCAGATCA AGTGAGGATG CTTTACTCTT  2400

TGGTTTAGTA AAAGAAACAC ACCAGCAACT CCGGTGAATG TTATGATTAT GACGTTTCAA  2460

ACGAAAAATC TCTATTTTCG TTTTAAGGTT AGTCCTTTTA GAATACCGTT TTTTTTTTTA  2520

CCATTTCATT GTCTTGAAAA CCCTCCCAAG CTAATGATTA TTTTCTTTTT TTACGCAAGA  2580

CTCGTATCAC TCACCTACCT TACAGACGTG TTTTGCTTTT TTGGATAATG CTGTGCTTGA  2640

TCTATGTATG GCTCCTTTGC CTTATTTTTA AAAAGAAATG TTTGCTAGGA TTGATTTTTA  2700

ATGGTTACTC TCAATCAAAT ACCACATTTA GTAGAAACAA AATTTGTGCA TATCATAATA  2760

AAACTAAATT CGATTATTTT TTCTAAAATC AGGATAATTT GTTTTTCCAA TATTTGTTTG  2820

TAGAATTGTC TGTCCTACCA AACAATTCAG TTTTCTATTT GCGTCGAGTC ATTTATTTTG  2880

GGTTTCTTTG TTTGAGCTGA TTCTGATACA CATGTGAATT GTCTTTTTAG ACACTATTCT  2940

AGAATTCATT CCATTCGAAA GGATCAACAT ACACCAATTT AATGACGTGC TAGATAATGG  3000

ATACAAATAT ACGCACAAAA AAAGAAAGAA TTCTATGATC AAAGAGAACG CAGACACAGA  3060

GTGATACATT TAAATGGTTA AGTTCATATG ATGTTAAAAT GGTAGCTTTA TTATTGAACT  3120

AAATGCGAAT ATCGTTGCTG TTTTGTCCTT GGAAAACGTT AGGTAAAAGT TGGTTAATGA  3180

AAGAAGCAGG AGTTGTAGTA TCATCTCTTG GGAAGAAATA GAAAAAGAGG AAAGTAACAA  3240

AGTAACAAGC AAGACAATAA TAGATCCAAT GGCTTTCGGT CTTACGAGTT TGTTCAGGAG  3300

CATACTTCTT TTGGCTATCT TGTAACTTTC TTGGTAAGGG ATTCTGGCCA AAGCTTTTAC  3360

AGACTTGGTC GGAAGTAAGC TTACTTCCAG CAAGAACGAT AGGAACACCA GTACCTGGAT  3420

GTGTACTACA AAGAAAAGAG AAATGAGTAC GTGCGTTATT AAAAAAAAGA AAAAAAGAGG  3480

GCAAAAGTAT TACCTAGCTC CGACAAAGAA AAGATTATCA TAACGGTTTG TGGAATCCTT  3540

GGTACTAGGT CTGAACCAGA GAACTTGGAA CACATCATGA GAAAGACCAA GAATAGAACC  3600

TCTCCAAAGG TTAAACTTGC TTTGCCAAAC ACTAGGATCA TTCACTTCTT CATGTTCAAT  3660

CAAATTAGCA AAGTTGTTTA CTCCCAAACG ACGTTCGATA ACTTCCAGAA CCATCTTGCG  3720

TGCACGGTTT ACCAACTCAG GATAATTTTC TTCAGCACTG TTTCCTGTCT TACTCTTCAT  3780

ATGGCCAATT GGAACCAACA CAATAATGGA GTCCTTGTTG GGAGGTGCGG CAGATTCATC  3840

AATTCGAGAT GGAACGTTGA CATAGAATGA AGCTTCAGAG GGCAAACCGA AGTCGTTGAA  3900

AATCTCATCA AAACTTTCCT TGTAGGCTTC AGCCAAGAAG ATATTGTGTA CGTCTAATTG  3960

AGGCACCTTT GTTGACATGG ACCAATAAAA CGAAATAGAT GATGAAGTGA GTTTCTTTGA  4020

GGCTAATGTC TTCTTTGTCC AATTGCAAGG AGGTAACAGA TGGTGATAAG CATAAACAAG  4080

ATCCGCATTA CATACGACTG CATCGGCTTC AATGACTTCT CCGCTTTCCA AAGTGACACC  4140

GGTTACACGC TTGTCTTTAT CGACAGTGTT AATTTTAGCA ACAGGCGATT GATATCTGAA  4200

TTCAGCACCG TACTTTTTGG AGGCGATAGA CTCAAGCTTC TGAACAACCA TGTTGAAACC  4260

ACCACGAGGA TACCAGATAC CTTCAGCAAA CTCGGTGTAT TGTAACAAAC TGTAAACTGC  4320

TGGAGCATCA TAAGGCGACA TACTATATTC CAAAAATAGA AAATAGAACA ATGAATATCA  4380

AAATTCCTTT CACTTGCCCT TTTTCACATT TCTCTTTTCC CACCCCCGAC CGGTCTCACT  4440

CATTTTTTTT TCATCCCACA CCACGCGTTG TATGTGTACT TACCCCATAT ACATTGTTTG  4500

AAAAGTAAAA GCCATACGCA TTTTCTTGGT TTGGAAATAT TTACTGGCTC GGTCATAGAT  4560

CTTACCAAAC AAGTGCAAGC GAAAGATTTC AGGCACATAC TGAAGACGAA TCAAATCCCA  4620

AATGGTTTCA AAGTTGCGCT TGATAGCAAT AAATGTACCT TGTTCATAAT GGACATGTGT  4680

TTCCTTCATG AAATCCAAGA ATCTACCAAA TCCAAGGGGA CCCTCAATAC GGTCCAATTC  4740

GCCCTTCATC TTGGTTAAAT CGGAAGAGAG TTGTACGGCA TCACCGTCGT CAAAATGAAC  4800

CTTATAGTTA TTGTCACAGC GAAGCAAATC CAAATGATCA CCAATACGTT CATCCAAATC  4860

AGCAAATGCA TCTTCAAAAA GCTTAGGCAT CAAATAGAGT GAGGGACCCT GATCAAAGCG  4920

ATGACCATCG TGATGAATGA ATGAACAACG GCCACCGGAA AAGTCGTTCT TTTCAACAAC  4980

AGTAACTCGA AAACCTTCAC GAGCAAGACG AGCAGCAGTA GCAGTTCCGC CAATACCGGC  5040

ACCAATGACA ACAATATGCT TCTTTTGATC AGACATGAGA TTAAAATAGA TAAGGAAAAG  5100

AAAGTGAAAA GAAATTCGGA AGCATGGCAC ATTCTTCTTT TTATAAATAC ATGCCTGACT  5160

TTCTTTTTCC ATCGATATGA TATATGCATA TGATAGATAT ACAAGCAATC TTCTTCAAGG  5220

AGTTTGAAAT TTTGTCCTCC AGGAGCAAAA AAAAGTTTTT TTTTATACAT GTTTGTACAC  5280

AAGAATAGTT ACCAATTTGC TTTGGTCTTA CGTGCTGCAA GTTTATATCG TTTTCAATTT  5340

CTTTGTCTTT ACATTTTCTT TGTCCTTTAT CTTTCCTCAT TTAGTCTTTG GGAGAATTAG  5400

GAAAAGGGAG CGGAAAGGTA AGAAATGCTT GCGTATTTTA CTAATTCGGC AAACATCCAA  5460

TTTGGCAAAC AGCAGCCTGT GCAACGCTCT CGAGATGACA GTATCTTTGA TTACACTCTA  5520

AATCTCGATG ACCCGACCAA AAAGAGCGAA CAAAGAAATA ATCTTGTGCA TTCGAATATG  5580

ATGGAAGATT TTTTCCCCCT TATTCTAAAT GTTGACATAG CGTGTATGTT ATATAAACAA  5640

AAAGAAATTG TACAAACTTT CTTTTCTTCT CTTTTTATTT TATCTCT ATG TCA ATA    5696

                                                    Met Ser Ile

                                                    1

CTC ACT TAT CTG GAA TTT CAT CTC TAC TAT ACA CTA CCT GTC CTT GCG    5744

Leu Thr Tyr Leu Glu Phe His Leu Tyr Tyr Thr Leu Pro Val Leu Ala

    5                   10                  15

GCA TTG TGT TGG CTG CTA AAG CCG TTT CAC TCA CAG CAA GAC AAT CTC    5792

Ala Leu Cys Trp Leu Leu Lys Pro Phe His Ser Gln Gln Asp Asn Leu

20                  25                  30                   35

AAG TAT AAA TTT TTA ATG TTG ATG GCC GCC TCT ACC GCA TCG ATT TGG    5840

Lys Tyr Lys Phe Leu Met Leu Met Ala Ala Ser Thr Ala Ser Ile Trp

                40                  45                  50

GAC AAT TAT ATC GTT TAT CAT CGC GCT TGG TGG TAC TGT CCT ACT TGT    5888

Asp Asn Tyr Ile Val Tyr His Arg Ala Trp Trp Tyr Cys Pro Thr Cys

            55                  60                  65

GTT GTG GCT GTC ATT GGC TAT GTA CCT CTA GAA GAA TAC ATG TTC TTT    5936

Val Val Ala Val Ile Gly Tyr Val Pro Leu Glu Glu Tyr Met Phe Phe

        70                  75                  80

ATC ATC ATG ACT TTA ATG ACT GTC GCG TTC TCA AAC TTT GTT ATG CGT    5984

Ile Ile Met Thr Leu Met Thr Val Ala Phe Ser Asn Phe Val Met Arg

    85                  90                  95

TGG CAC TTG CAT ACT TTC TTT ATT AGA CCC AAC ACT TCT TGG AAG CAA    6032

Trp His Leu His Thr Phe Phe Ile Arg Pro Asn Thr Ser Trp Lys Gln

100                 105                 110                 115

ACA CTA TTA GTA CGC CTT GTG CCT GTT TCA GCT TTA TTG GCA ATC ACT    6080

Thr Leu Leu Val Arg Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Leu Ala Ile Thr

                120                 125                 130

TAT CAT GCT TGG GTATGCAAAA TAAACAAACA CTAAAAAAAA ATAATAGCGA        6132

Tyr His Ala Trp

            135

TAATTATTTT ACTCATTTTT CTTTTTTTAG CAC TTG ACA CTG CCA AAT AAA TCT   6186

                                His Leu Thr Leu Pro Asn Lys Ser

                                                140

TCA TTT TAT GGT TCA TGC ATC CTT TGG TAT GCT TGT CCT GTG TTG GCT   6234

Ser Phe Tyr Gly Ser Cys Ile Leu Trp Tyr Ala Cys Pro Val Leu Ala

    145                 150                 155

ATT CTT TGG CTG GGT GCT GGT GAA TAT ATC TTG CGT CGA CCT GTG GCT   6282

Ile Leu Trp Leu Gly Ala Gly Glu Tyr Ile Leu Arg Arg Pro Val Ala

160                 165                 170                 175

GTC CTT TTG TCT ATT GTT ATC CCT AGT GTA TAC CTA TGT TGG GCT GAT   6330

Val Leu Leu Ser Ile Val Ile Pro Ser Val Tyr Leu Cys Trp Ala Asp

                180                 185                 190

ATC GTC GCT ATT AGT GCT GGC ACA TGG CAT ATT TCT CTT AGA ACA AGC   6378

Ile Val Ala Ile Ser Ala Gly Thr Trp His Ile Ser Leu Arg Thr Ser

            195                 200                 205

ACT GGC AAA ATG GTA GTA CCC GAT TTA CCT GTA GAA GAA TGC CTG TTT   6426

Thr Gly Lys Met Val Val Pro Asp Leu Pro Val Glu Glu Cys Leu Phe

        210                 215                 220

TTT ACT TTG ATC AAC ACA GTC TTG GTT TTT GCT ACC TGT GCT ATA GAC   6474

Phe Thr Leu Ile Asn Thr Val Leu Val Phe Ala Thr Cys Ala Ile Asp

    225                 230                 235

CGC GCT CAG GCC ATC CTC CAT CTG TAC AAA TCA TCT GTT CAA AAT CAA   6522

Arg Ala Gln Ala Ile Leu His Leu Tyr Lys Ser Ser Val Gln Asn Gln

240                 245                 250                 255

AAC CCT AAA CAA GCC ATT TCC CTT TTC CAG CAT GTC AAA GAG CTA GCA   6570

Asn Pro Lys Gln Ala Ile Ser Leu Phe Gln His Val Lys Glu Leu Ala

                260                 265                 270

TGG GCC TTC TGT CTT CCT GAC CAA ATG CTC AAC AAT GAA TTG TTT GAT   6618

Trp Ala Phe Cys Leu Pro Asp Gln Met Leu Asn Asn Glu Leu Phe Asp

            275                 280                 285

GAT CTT ACT ATC AGC TGG GAT ATT TTA CGT AAA GCC TCA AAG TCA TTC   6666

Asp Leu Thr Ile Ser Trp Asp Ile Leu Arg Lys Ala Ser Lys Ser Phe

        290                 295                 300

TAT ACT GCA TCT GCC GTT TTT CCA AGT TAT GTA CGT CAA GAC TTG GGT   6714

Tyr Thr Ala Ser Ala Val Phe Pro Ser Tyr Val Arg Gln Asp Leu Gly

    305                 310                 315

GTT CTC TAT GCT TTC TGC AGA GCT ACC GAT GAC CTG TGC GAT GAT GAA   6762

Val Leu Tyr Ala Phe Cys Arg Ala Thr Asp Asp Leu Cys Asp Asp Glu

320                 325                 330                 335

TCC AAA TCT GTT CAA GAA AGA AGA GAC CAA TTA GAT CTT ACT CGA CAA   6810

Ser Lys Ser Val Gln Glu Arg Arg Asp Gln Leu Asp Leu Thr Arg Gln

                340                 345                 350

TTT GTT CGT GAT CTC TTT AGC CAA AAG ACC AGT GCG CCT ATT GTG ATT   6858

Phe Val Arg Asp Leu Phe Ser Gln Lys Thr Ser Ala Pro Ile Val Ile

            355                 360                 365

GAT TGG GAA TTG TAT CAA AAC CAA CTT CCT GCT TCT TGT ATA TCA GCC   6906

Asp Trp Glu Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Pro Ala Ser Cys Ile Ser Ala

        370                 375                 380

TTT AGA GCC TTT ACT CGC CTT CGC CAT GTC CTT GAA GTA GAC CCT GTA   6954

Phe Arg Ala Phe Thr Arg Leu Arg His Val Leu Glu Val Asp Pro Val

    385                 390                 395

GAA GAA CTA TTA GAT GGT TAC AAA TGG GAT CTT GAG CGT CGT CCT ATC   7002

Glu Glu Leu Leu Asp Gly Tyr Lys Trp Asp Leu Glu Arg Arg Pro Ile

400                 405                 410                 415

CTT GAT GAA CAA GAC TTG GAG GCA TAC TCT GCT TGT GTG GCC AGT AGT   7050

Leu Asp Glu Gln Asp Leu Glu Ala Tyr Ser Ala Cys Val Ala Ser Ser

                420                 425                 430

GTG GGT GAA ATG TGC ACA CGT GTG ATT CTT GCT CAA GAC CAA AAG GAA   7098

Val Gly Glu Met Cys Thr Arg Val Ile Leu Ala Gln Asp Gln Lys Glu

            435                 440                 445

AAT GAT GCT TGG ATA ATT GAC CGT GCA CGT GAG ATG GGG CTG GTG CTA   7146

Asn Asp Ala Trp Ile Ile Asp Arg Ala Arg Glu Met Gly Leu Val Leu

        450                 455                 460

CAA TAC GTT AAC ATT GCT CGA GAC ATT GTG ACT GAT AGC GAG ACT CTG   7194

Gln Tyr Val Asn Ile Ala Arg Asp Ile Val Thr Asp Ser Glu Thr Leu

    465                 470                 475

GGT CGA TGT TAT CTG CCT CAA CAA TGG CTT AGA AAA GAA GAA ACA GAA   7242

Gly Arg Cys Tyr Leu Pro Gln Gln Trp Leu Arg Lys Glu Glu Thr Glu

480                 485                 490                 495

CAA ATA CAG CAA GGC AAC GCC CGT AGC CTA GGT GAT CAA AGA CTG TTG   7290

Gln Ile Gln Gln Gly Asn Ala Arg Ser Leu Gly Asp Gln Arg Leu Leu

                500                 505                 510

GGC TTG TCT CTG AAG CTT GTA GGA AAG GCA GAC GCT ATC ATG GTG AGA   7338

Gly Leu Ser Leu Lys Leu Val Gly Lys Ala Asp Ala Ile Met Val Arg

            515                 520                 525

GCT AAG AAG GGC ATT GAC AAG TTG CCG GCA AAC TGT CAA GGC GGT GTA   7386

Ala Lys Lys Gly Ile Asp Lys Leu Pro Ala Asn Cys Gln Gly Gly Val

        530                 535                 540

CGA GCT GCT TGC CAA GTA TAT GCT GCA ATT GGA TCT GTA CTC AAG CAG   7434

Arg Ala Ala Cys Gln Val Tyr Ala Ala Ile Gly Ser Val Leu Lys Gln

    545                 550                 555

CAG AAG ACA ACA TAT CCT ACA AGA GCT CAT CTA AAA GGA AGC GAA CGT   7482

Gln Lys Thr Thr Tyr Pro Thr Arg Ala His Leu Lys Gly Ser Glu Arg

560                 565                 570                 575

GCC AAG ATT GCT CTG TTG AGT GTA TAC AAC CTC TAT CAA TCT GAA GAC   7530

Ala Lys Ile Ala Leu Leu Ser Val Tyr Asn Leu Tyr Gln Ser Glu Asp

                580                 585                 590

AAG CCT GTG GCT CTC CGT CAA GCT AGA AAG ATT AAG AGT TTT TTT GTT   7578

Lys Pro Val Ala Leu Arg Gln Ala Arg Lys Ile Lys Ser Phe Phe Val

            595                 600                 605

GAT TAG TGAATTTTTG TTTTATTTAT GTCTGATAGT TCAATAAAGA GACAACACAT    7634

Asp

ACAATATAAA ATCATTGTCT TTAAATGTTA ATTTAGTAGA GTGTAAAGCC TGCATTTTTT 7694

TTGTACGCAT AAACAATGAG TTCACCCCGC TTCTGGTTTT TAAATAATTA TGTCAAACTA 7754

GGGAAAATTC TTTTTTTTCT CTTCGTTCTT TTTTTGGCTT GTTGTGGAGT CACAGGCTTG 7814

TCTTCAGATT GATAGAGGTT GTATACACTC AACAGAGCAA TCTTGGCACG TTCGCTTCCT  7874

TTTAGATGAG CTCTTGTAGG ATATGTTGTC TTCTGCTGCT TGAGTACAGA TCCAATTGCA  7934

GCATATACTT GGCAAGCAGC TCGTACACCG CCTTGACAGT TTGCCGGCAA CTTGTCAATG  7994

CCCTTCTTAG CTCTCACCAT GATAGCGTCT GCCTTTCCTA CAAGCTTCAG AGACAAGCCC  8054

AACAGTCTTT GATCACCTAG GCTACGGGCG TTGCCTTGCT GTATTTGTTC TGTTTCTTCT  8114

TTTCTAAGCC ATTGTTGAGG CAGATAACAT CGACCCAACA TCCTCGAGCC ATACTACAGC  8174

ATAAAAGGAT ACGTTTTCTT TAACAGAAAT TTACCCTTTT GTTATCAGCA CATACAAAAA  8234

AAAAGAAATT TAAGATGAGT AGGACTTCCA TTCTCTCAAA AATTTTATTC AATCCATAAA  8294

TGAATTATTT TTGGACAAAA AAGAAAGATT ATGCCTGATT TTCTCTATTT TTTTTTTTTT  8354

TACAACTCCA CCAATACTTT CTAGAGACAC ATTTGAGCGA TGTGACAGTC GGACTCGAGA  8414

AGTACAAGAA GGTACAGAAA TAGCAGCTGA GCGTATGATT GGGTCCCAAG GTTCTTCTCG  8474

ACTTTCTCTC TTACCCTGGA ACAGAGAGAA AAAAAAAATA TTTCGTCTTT TTTGGATAAT  8434

ATTATAAAAA AGGGAATTTA GTAAAGAAAA CGGTTGTTTC CTTTTCTTTT TTTTTTTCCT  8494

TCTCCACTAC ATGAATAAAC ATCGCCACCC AAATTTACCT TCCATATCTA CTCTACTTAC  8554

TGGACCACCT TCTCCGCCAC CTCCCATTAT TGTGATAGAT GAGGAACATT CTCCCAGTTG  8614

TTCACCTAAC AAATACCACT TGTCTCCTGT CTTATCACCT ATTGATTCAT ATGCTTCATC  8674

ACCAAACTCG AG                                                      8786

<210>SEQ ID NO：2

<211>8786

<212>DNA

<213>三孢布拉霉

<220>CDS

<221>carB 3711...5665

<220>外显子3711...4303

<220>外显子4445...5293

<220>外显子5362...5665

<223>直接来源：质粒pALBT9(CECT 5982)和pALBT52(CECT 5981)。

<223>β-胡萝卜素生物合成基因。

<400>

CTCGAGTTTG GTGATGAAGC ATATGAATCA ATAGGTGATA AGACAGGAGA CAAGTGGTAT   60

TTGTTAGGTG AACAACTGGG AGAATGTTCC TCATCTATCA CAATAATGGG AGGTGGCGGA  120

GAAGGTGGTC CAGTAAGTAG AGTAGATATG GAAGGTAAAT TTGGGTGGCG ATGTTTATTC  180

ATGTAGTGGA GAAGGAAAAA AAAAAAGAAA AGGAAACAAC CGTTTTCTTT ACTAAATTCC  240

CTTTTTTATA ATATTATCCA AAAAAGACGA AATATTTTTT TTTTCTCTCT GTTCCAGGGT  300

AAGAGAGAAA GTCGAGAAGA ACCTTGGGAC CCAATCATAC GCTCAGCTGC TATTTCTGTA  360

CCTTCTTGTA CTTCTCGAGT CCGACTGTCA CATCGCTCAA ATGTGTCTCT AGAAAGTATT  420

GGTGGAGTTG TAAAAAAAAA AAAAATAGAG AAAATCAGGC ATAATCTTTC TTTTTTGTCC  480

AAAAATAATT CATTTATGGA TTGAATAAAA TTTTTGAGAG AATGGAAGTC CTACTCATCT  540

TAAATTTCTT TTTTTTTGTA TGTGCTGATA ACAAAAGGGT AAATTTCTGT TAAAGAAAAC  600

GTATCCTTTT ATGCTGTAGT ATGGCTCGAG GATGTTGGGT CGATGTTATC TGCCTCAACA   660

ATGGCTTAGA AAAGAAGAAA CAGAACAAAT ACAGCAAGGC AACGCCCGTA GCCTAGGTGA   720

TCAAAGACTG TTGGGCTTGT CTCTGAAGCT TGTAGGAAAG GCAGACGCTA TCATGGTGAG   780

AGCTAAGAAG GGCATTGACA AGTTGCCGGC AAACTGTCAA GGCGGTGTAC GAGCTGCTTG   840

CCAAGTATAT GCTGCAATTG GATCTGTACT CAAGCAGCAG AAGACAACAT ATCCTACAAG   900

AGCTCATCTA AAAGGAAGCG AACGTGCCAA GATTGCTCTG TTGAGTGTAT ACAACCTCTA   960

TCAATCTGAA GACAAGCCTG TGACTCCACA ACAAGCCAAA AAAAGAACGA AGAGAAAAAA  1020

AAGAATTTTC CCTAGTTTGA CATAATTATT TAAAAACCAG AAGCGGGGTG AACTCATTGT  1080

TTATGCGTAC AAAAAAAATG CAGGCTTTAC ACTCTACTAA ATTAACATTT AAAGACAATG  1140

ATTTTATATT GTATGTGTTG TCTCTTTATT GAACTATCAG ACATAAATAA AACAAAAATT  1200

CACTAATCAA CAAAAAAACT CTTAATCTTT CTAGCTTGAC GGAGAGCCAC AGGCTTGTCT  1260

TCAGATTGAT AGAGGTTGTA TACACTCAAC AGAGCAATCT TGGCACGTTC GCTTCCTTTT  1320

AGATGAGCTC TTGTAGGATA TGTTGTCTTC TGCTGCTTGA GTACAGATCC AATTGCAGCA  1380

TATACTTGGC AAGCAGCTCG TACACCGCCT TGACAGTTTG CCGGCAACTT GTCAATGCCC  1440

TTCTTAGCTC TCACCATGAT AGCGTCTGCC TTTCCTACAA GCTTCAGAGA CAAGCCCAAC  1500

AGTCTTTGAT CACCTAGGCT ACGGGCGTTG CCTTGCTGTA TTTGTTCTGT TTCTTCTTTT  1560

CTAAGCCATT GTTGAGGCAG ATAACATCGA CCCAGAGTCT CGCTATCAGT CACAATGTCT  1620

CGAGCAATGT TAACGTATTG TAGCACCAGC CCCATCTCAC GTGCACGGTC AATTATCCAA  1680

GCATCATTTT CCTTTTGGTC TTGAGCAAGA ATCACACGTG TGCACATTTC ACCCACACTA  1740

CTGGCCACAC AAGCAGAGTA TGCCTCCAAG TCTTGTTCAT CAAGGATAGG ACGACGCTCA  1800

AGATCCCATT TGTAACCATC TAATAGTTCT TCTACAGGGT CTACTTCAAG GACATGGCGA  1860

AGGCGAGTAA AGGCTCTAAA GGCTGATATA CAAGAAGCAG GAAGTTGGTT TTGATACAAT  1920

TCCCAATCAA TCACAATAGG CGCACTGGTC TTTTGGCTAA AGAGATCACG AACAAATTGT  1980

CGAGTAAGAT CTAATTGGTC TCTTCTTTCT TGAACAGATT TGGATTCATC ATCGCACAGG  2040

TCATCGGTAG CTCTGCAGAA AGCATAGAGA ACACCCAAGT CTTGACGTAC ATAACTTGGA  2100

AAAACGGCAG ATGCAGTATA GAATGACTTT GAGGCTTTAC GTAAAATATC CCAGCTGATA  2160

GTAAGATCAT CAAACAATTC ATTGTTGAGC ATTTGGTCAG GAAGACAGAA GGCCCATGCT  2220

AGCTCTTTGA CATGCTGGAA AAGGGAAATG GCTTGTTTAG GGTTTTGATT TTGAACAGAT  2280

GATTTGTACA GATGGAGGAT GGCCTGAGCG CGGTCTATAG CACAGGTAGC AAAAACCAAG  2340

ACTGTGTTGA TCAAAGTAAA AAACAGGCAT TCTTCTACAG GTAAATCGGG TACTACCATT  2400

TTGCCAGTGC TTGTTCTAAG AGAAATATGC CATGTGCCAG CACTAATAGC GACGATATCA  2460

GCCCAACATA GGTATACACT AGGGATAACA ATAGACAAAA GGACAGCCAC AGGTCGACGC  2520

AAGATATATT CACCAGCACC CAGCCAAAGA ATAGCCAACA CAGGACAAGC ATACCAAAGG  2580

ATGCATGAAC CATAAAATGA AGATTTATTT GGCAGTGTCA AGTGCTAAAA AAAGAAAAAT  2640

GAGTAAAATA ATTATCGCTA TTATTTTTTT TTAGTGTTTG TTTATTTTGC ATACCCAAGC  2700

ATGATAAGTG ATTGCCAATA AAGCTGAAAC AGGCACAAGG CGTACTAATA GTGTTTGCTT  2760

CCAAGAAGTG TTGGGTCTAA TAAAGAAAGT ATGCAAGTGC CAACGCATAA CAAAGTTTGA  2820

GAACGCGACA GTCATTAAAG TCATGATGAT AAAGAACATG TATTCTTCTA GAGGTACATA  2880

GCCAATGACA GCCACAACAC AAGTAGGACA GTACCACCAA GCGCGATGAT AAACGATATA  2940

ATTGTCCCAA ATCGATGCGG TAGAGGCGGC CATCAACATT AAAAATTTAT ACTTGAGATT  3000

GTCTTGCTGT GAGTGAAACG GCTTTAGCAG CCAACACAAT GCCGCAAGGA CAGGTAGTGT  3060

ATAGTAGAGA TGAAATTCCA GATAAGTGAG TATTGACATA GAGATAAAAT AAAAAGAGAA  3120

GAAAAGAAAG TTTGTACAAT TTCTTTTTGT TTATATAACA TACACGCTAT GTCAACATTT  3180

AGAATAAGGG GGAAAAAATC TTCCATCATA TTCGAATGCA CAAGATTATT TCTTTGTTCG  3240

CTCTTTTTGG TCGGGTCATC GAGATTTAGA GTGTAATCAA AGATACTGTC ATCTCGAGAG  3300

CGTTGCACAG GCTGCTGTTT GCCAAATTGG ATGTTTGCCG AATTAGTAAA ATACGCAAGC  3360

ATTTCTTACC TTTCCGCTCC CTTTTCCTAA TTCTCCCAAA GACTAAATGA GGAAAGATAA  3420

AGGACAAAGA AAATGTAAAG ACAAAGAAAT TGAAAACGAT ATAAACTTGC AGCACGTAAG  3480

ACCAAAGCAA ATTGGTAACT ATTCTTGTGT ACAAACATGT ATAAAAAAAA ACTTTTTTTT  3540

GCTCCTGGAG GACAAAATTT CAAACTCCTT GAAGAAGATT GCTTGTATAT CTATCATATG 3600

CATATATCAT ATCGATGGAA AAAGAAAGTC AGGCATGTAT TTATAAAAAG AAGAATGTGC 3660

CATGCTTCCG AATTTCTTTT CACTTTCTTT TCCTTATCTA TTTTAATCTC  ATG TCT   3716

                                                        Met Ser

                                                        1

GAT CAA AAG AAG CAT ATT GTT GTC ATT GGT GCC GGT ATT GGC GGA ACT   3764

Asp Gln Lys Lys His Ile Val Val Ile Gly Ala Gly Ile Gly Gly Thr

        5                   10                  15

GCT ACT GCT GCT CGT CTT GCT CGT GAA GGT TTT CGA GTT ACT GTT GTT   3812

Ala Thr Ala Ala Arg Leu Ala Arg Glu Gly Phe Arg Val Thr Val Val

    20                  25                  30

GAA AAG AAC GAC TTT TCC GGT GGC CGT TGT TCA TTC ATT CAT CAC GAT   3860

Glu Lys Asn Asp Phe Ser Gly Gly Arg Cys Ser Phe Ile His His Asp

35                  40                  45                  50

GGT CAT CGC TTT GAT CAG GGT CCC TCA CTC TAT TTG ATG CCT AAG CTT   3908

Gly His Arg Phe Asp Gln Gly Pro Ser Leu Tyr Leu Met Pro Lys Leu

                55                  60                  65

TTT GAA GAT GCA TTT GCT GAT TTG GAT GAA CGT ATT GGT GAT CAT TTG   3956

Phe Glu Asp Ala Phe Ala Asp Leu Asp Glu Arg Ile Gly Asp His Leu

            70                  75                  80

GAT TTG CTT CGC TGT GAC AAT AAC TAT AAG GTT CAT TTT GAC GAC GGT   4004

Asp Leu Leu Arg Cys Asp Asn Asn Tyr Lys Val His Phe Asp Asp Gly

        85                  90                  95

GAT GCC GTA CAA CTC TCT TCC GAT TTA ACC AAG ATG AAG GGC GAA TTG   4052

Asp Ala Val Gln Leu Ser Ser Asp Leu Thr Lys Met Lys Gly Glu Leu

    100                 105                 110

GAC CGT ATT GAG GGT CCC CTT GGA TTT GGT AGA TTC TTG GAT TTC ATG   4100

Asp Arg Ile Glu Gly Pro Leu Gly Phe Gly Arg Phe Leu Asp Phe Met

115                 120                 125                 130

AAG GAA ACA CAT GTC CAT TAT GAA CAA GGT ACA TTT ATT GCT ATC AAG   4148

Lys Glu Thr His Val His Tyr Glu Gln Gly Thr Phe Ile Ala Ile Lys

                135                 140                 145

CGC AAC TTT GAA ACC ATT TGG GAT TTG ATT CGT CTT CAG TAT GTG CCT   4196

Arg Asn Phe Glu Thr Ile Trp Asp Leu Ile Arg Leu Gln Tyr Val Pro

            150                 155                 160

GAA ATC TTT CGC TTG CAC TTG TTT GGT AAG ATC TAT GAC CGA GCC AGT   4244

Glu Ile Phe Arg Leu His Leu Phe Gly Lys Ile Tyr Asp Arg Ala Ser

        165                 170                 175

AAA TAT TTC CAA ACC AAG AAA ATG CGT ATG GCT TTT ACT TTT CAA ACA   4292

Lys Tyr Phe Gln Thr Lys Lys Met Arg Met Ala Phe Thr Phe Gln Thr

    180                 185             190

ATG TAT ATG GG GTAAGTACAC ATACAACGCG TGGTGTGGGA TGAAAAAAAA        4343

Met Tyr Met Gly

195

ATGAGTGAGA CCGGTCGGGG GTGGGAAAAG AGAAATGTGA AAAAGGGCAA GTGAAAGGAA 4403

TTTTGATATT CATTGTTCTA TTTTCTATTT TTGGAATATA G T ATG TCG CCT TAT   4457

                                                Met Ser Pro Tyr

                                                    200

GAT GCT CCA GCA GTT TAC AGT TTG TTA CAA TAC ACC GAG TTT GCT GAA   4505

Asp Ala Pro Ala Val Tyr Ser Leu Leu Gln Tyr Thr Glu Phe Ala Glu

        205                 210                 215

GGT ATC TGG TAT CCT CGT GGT GGT TTC AAC ATG GTT GTT CAG AAG CTT  4553

Gly Ile Trp Tyr Pro Arg Gly Gly Phe Asn Met Val Val Gln Lys Leu

    220                 225                 230

GAG TCT ATC GCC TCC AAA AAG TAC GGT GCT GAA TTC AGA TAT CAA TCG  4601

Glu Ser Ile Ala Ser Lys Lys Tyr Gly Ala Glu Phe Arg Tyr Gln Ser

235                 240                 245                 250

CCT GTT GCT AAA ATT AAC ACT GTC GAT AAA GAC AAG CGT GTA ACC GGT  4649

Pro Val Ala Lys Ile Asn Thr Val Asp Lys Asp Lys Arg Val Thr Gly

                255                 260                 265

GTC ACT TTG GAA AGC GGA GAA GTC ATT GAA GCC GAT GCA GTC GTA TGT  4697

Val Thr Leu Glu Ser Gly Glu Val Ile Glu Ala Asp Ala Val Val Cys

            270                 275                 280

AAT GCG GAT CTT GTT TAT GCT TAT CAC CAT CTG TTA CCT CCT TGC AAT  4745

Asn Ala Asp Leu Val Tyr Ala Tyr His His Leu Leu Pro Pro Cys Asn

        285                 290                 295

TGG ACA AAG AAG ACA TTA GCC TCA AAG AAA CTC ACT TCA TCA TCT ATT  4793

Trp Thr Lys Lys Thr Leu Ala Ser Lys Lys Leu Thr Ser Ser Ser Ile

    300                 305                 310

TCG TTT TAT TGG TCC ATG TCA ACA AAG GTG CCT CAA TTA GAC GTA CAC  4841

Ser Phe Tyr Trp Ser Met Ser Thr Lys Val Pro Gln Leu Asp Val His

315                 320                 325                 330

AAT ATC TTC TTG GCT GAA GCC TAC AAG GAA AGT TTT GAT GAG ATT TTC  4889

Asn Ile Phe Leu Ala Glu Ala Tyr Lys Glu Ser Phe Asp Glu Ile Phe

                335                 340                 345

AAC GAC TTC GGT TTG CCC TCT GAA GCT TCA TTC TAT GTC AAC GTT CCA  4937

Asn Asp Phe Gly Leu Pro Ser Glu Ala Ser Phe Tyr Val Asn Val Pro

            350                 355                 360

TCT CGA ATT GAT GAA TCT GCC GCA CCT CCC AAC AAG GAC TCC ATT ATT  4985

Ser Arg Ile Asp Glu Ser Ala Ala Pro Pro Asn Lys Asp Ser Ile Ile

        365                 370                 375

GTG TTG GTT CCA ATT GGC CAT ATG AAG AGT AAG ACA GGA AAC AGT GCT  5033

Val Leu Val Pro Ile Gly His Met Lys Ser Lys Thr Gly Asn Ser Ala

    380                 385                 390

GAA GAA AAT TAT CCT GAG TTG GTA AAC CGT GCA CGC AAG ATG GTT CTG  5081

Glu Glu Asn Tyr Pro Glu Leu Val Asn Arg Ala Arg Lys Met Val Leu

395                 400                 405                 410

GAA GTT ATC GAA CGT CGT TTG GGA GTA AAC AAC TTT GCT AAT TTG ATT  5129

Glu Val Ile Glu Arg Arg Leu Gly Val Asn Asn Phe Ala Asn Leu Ile

                415                 420                 425

GAA CAT GAA GAA GTG AAT GAT CCT AGT GTT TGG CAA AGC AAG TTT AAC  5177

Glu His Glu Glu Val Asn Asp Pro Ser Val Trp Gln Ser Lys Phe Asn

            430                 435                 440

CTT TGG AGA GGT TCT ATT CTT GGT CTT TCT CAT GAT GTG TTC CAA GTT  5225

Leu Trp Arg Gly Ser Ile Leu Gly Leu Ser His Asp Val Phe Gln Val

        445                 450                 455

CTC TGG TTC AGA CCT AGT ACC AAG GAT TCC ACA AAC CGT TAT GAT AAT  5273

Leu Trp Phe Arg Pro Ser Thr Lys Asp Ser Thr Asn Arg Tyr Asp Asn

    460                 465                 470

CTT TTC TTT GTC GGA GCT AG GTAATACTTT TGCCCTCTTT TTTTCTTTTT       5323

Leu Phe Phe Val Gly Ala Ser

475                 480

TTTAATAACG CACGTACTCA TTTCTCTTTT CTTTGTAG T ACA CAT CCA GGT ACT   5377

                                            Thr His Pro Gly Thr

                                                        485

GGT GTT CCT ATC GTT CTT GCT GGA AGT AAG CTT ACT TCC GAC CAA GTC   5425

Gly Val Pro Ile Val Leu Ala Gly Ser Lys Leu Thr Ser Asp Gln Val

            490                 495                 500

TGT AAA AGC TTT GGC CAG AAT CCC TTA CCA AGA AAG TTA CAA GAT AGC   5473

Cys Lys Ser Phe Gly Gln Asn Pro Leu Pro Arg Lys Leu Gln Asp Ser

        505             510                     515

CAA AAG AAG TAT GCT CCT GAA CAA ACT CGT AAG ACC GAA AGC CAT TGG   5521

Gln Lys Lys Tyr Ala Pro Glu Gln Thr Arg Lys Thr Glu Ser His Trp

    520             525                     530

ATC TAT TAT TGT CTT GCT TGT TAC TTT GTT ACT TTC CTC TTT TTC TAT   5569

Ile Tyr Tyr Cys Leu Ala Cys Tyr Phe Val Thr Phe Leu Phe Phe Tyr

535             540                     545                 550

TTC TTC CCA AGA GAT GAT ACT ACA ACT CCT GCT TCT TTC ATT AAC CAA   5617

Phe Phe Pro Arg Asp Asp Thr Thr Thr Pro Ala Ser Phe Ile Asn Gln

            555                     560                 565

CTT TTA CCT AAC GTT TTC CAA GGA CAA AAC AGC AAC GAT ATT CGC ATT   5665

Leu Leu Pro Asn Val Phe Gln Gly Gln Asn Ser Asn Asp Ile Arg Ile

        570                     575                 580

  TAGT  TCAATAATAA AGCTACCATT TTAACATCAT ATGAACTTAA CCATTTAAAT    5719

GTATCACTCT GTGTCTGCGT TCTCTTTGAT CATAGAATTC TTTCTTTTTT TGTGCGTATA 5779

TTTGTATCCA TTATCTAGCA CGTCATTAAA TTGGTGTATG TTGATCCTTT CGAATGGAAT 5839

GAATTCTAGA ATAGTGTCTA AAAAGACAAT TCACATGTGT ATCAGAATCA GCTCAAACAA 5899

AGAAACCCAA AATAAATGAC TCGACGCAAA TAGAAAACTG AATTGTTTGG TAGGACAGAC 5959

AATTCTACAA ACAAATATTG GAAAAACAAA TTATCCTGAT TTTAGAAAAA ATAATCGAAT 6019

TTAGTTTTAT TATGATATGC ACAAATTTTG TTTCTACTAA ATGTGGTATT TGATTGAGAG 6079

TAACCATTAA AAATCAATCC TAGCAAACAT TTCTTTTTAA AAATAAGGCA AAGGAGCCAT 6139

ACATAGATCA AGCACAGCAT TATCCAAAAA AGCAAAACAC GTCTGTAAGG TAGGTGAGTG 6199

ATACGAGTCT TGCGTAAAAA AAGAAAATAA TCATTAGCTT GGGAGGGTTT TCAAGACAAT 6259

GAAATGGTAA AAAAAAAAAC GGTATTCTAA AAGGACTAAC CTTAAAACGA AAATAGAGAT 6319

TTTTCGTTTG AAACGTCATA ATCATAACAT TCACCGGAGT TGCTGGTGTG TTTCTTTTAC 6379

TAAACCAAAG AGTAAAGCAT CCTCACTTGA TCTGATTAAA CATGTCAAAC AAAACATTTC 6439

AACAGACACA ATGTCTCTTT GTTGATATTG CAAAGAAGCA TAAACAGTGG CTTTGTGTAG 6499

TACCTAAATT ACTATTCTCT TGAAAGCCAT AGCTTTGATA AGCTTTTTTC TCCCTTTGGC 6559

TTGATTGCTT ATTGCCACAT CTAGAAAAGT GGTTTTACTT TGCCTGATAG AAAATAAAAA 6619

CGTTCTTTTC ATTGTGCTTA TCTTAACTTT AGACTTATTT TTAACCCATC TCAATTGCAA 6679

CAAGCGATCT ACAAGACCTT TTTGGTAAAG GTTCAGTCTT CAAATAACAT GATTACTCAG 6739

TGTTTATAAC ACCAAATTAA TGCGGATGCT TCCTCAAAAA TACATTCAAG TGTAACATAC 6799

TCCTCTTCCT CTCCCTTTTT ATTCGGGCAT GCAGTAAAAG AATCTCGGTG GATTTGCCCT 6859

TTGTCAAGCA ATATAGCTTT TCTTTGTAAG ATTGTTTCAA GAAAAACAGA GATTTAGCTC 6919

ATGATAGCTA GCAAATTCTT TTTCTTTTCT TTGAGCTTTG AATTAAGACT GCACCACATC 6979

GTTAAAGCAA AATTGTTATC ATTCTAGACT GCAATATATT TTCATTGTAC TTTAACTATT 7039

AGTTAAAGTT TTGAGCAACA GTATTGTTGT GTGTATGTGT CACATTCTAC GGTGTTTGTC  7099

AGTTTTTTTT AAGGAAAGTC GTCTACGGCG ATAAGCATCA GAGTTGCACA TGGATCGCTT  7159

TCTCTGTTAT AGCAAGTACT ATTTAGCGAT ATATGTCTTC TGTTTGATAT GATGATATTC  7219

AAGCTATCAG CTTTAACGAA AAAGAAATTG TGTGAGTAAA ATTGTCTATC TTCAAAGCAA  7279

GGAAGATGGA AAACTACAAA AAAAAAAGAA GTAGAGTATA GTAAAACTAA GCTATTCTGT  7339

CGCTTACATC TTTCTTGTCC TTCCTACACG TGTTGTTGAA AACAAAGAAA TAGTCAGAGG  7399

ACTAGAAGCA AGATGATAGT AATGGTATTT TTAACCTAGT CTTTGAAATC TTTCAAAAAA  7459

GATGGCCATG ATGTTTATTA AGGAAAGTTT TGTAGGCTTT TCCAATACGT TTTTCTTCAC  7519

ATTTAGCCAT CTATTGAGTC ATTCCATTGG CAATAAGCCT GTACTACATT TGTCAGAGTG  7579

CAAGAGAGGG AGTTATCTGA GGCTTTATAC CGCCCTTTTT TTTGTCATGG CTCTGTCCAT  7639

GCTTTAGAAA GCCATATACC AAACCTCAAA GACTATCACT TTATTTCAAT TGTACTTAAA  7699

CAGATCACTT CCCTGAAGCT CATATTCACA AAAACAAAAG TGTATCAGGC AAAATCAATA  7759

CAATCTCAAG ATACTATCCT AAAGATGAGA TTCGAAAATC AAAACGCAGA TAGAAAACAT  7819

ACAAACACAA TGCTACCGTG CCATTCACTT ATTACTGATG GGTTGAGGAA TAGCTACTCT  7879

TGCATTATGC TGAATAGCCA AAAAAAGAAA GAGGCAAGTG GAAAGAGAAA AAGACATCTA  7939

TTTTGGAATG GAAGCAACAC AATTCATGAT GCTAAAGCAT GTAAATCAAT GAGCAGAGTA  7999

GCCCTTTATA AATCATCTGC TTGCTTAATC TGTCTCCTAG TTTGATGTTG CTTGTCATTG  8059

AATGTTTGTA TGACATTGCT CAATAATGAT CGAACAGAAG GAGCAAATGC ACAAAGCGAG  8119

TCCAAGTCTC AATCCACCCC ATTTTTGGTT TCTCAAAGGA TTAATAAGAG TCAGATAAAG  8179

CATTCTCAGA CAATAAAGAC AAGGAGATGG TTGAGTTCCT GAAAAGAAGA GACAGGATAA  8239

AATAGCCATA CAATTCTGAC TTTTGTATTA TGTAAGCGGT CTTTATTTTT TCAGAAAAAA  8299

AATCATGCTT TAAAATTAAC ATTGTCAAGA GAAAACAGCT ACAAATCGTT CAAGTTAAAA  8359

AAGATAGATG TCATATTCAA TACAGCAATT ATAAAAGTGC CTAAATGTAA AGCTTAAAAG  8419

AAGCTCAAGC AAAAAAAAAA GACTGTTGAT CGCCTAAAAG TAAGTCTCTC TTTTTTTTTA  8479

TTTTCTTTCT TTTAGAAGAA ATTTCGGGCT TTTTGGGTTT CTGCAAATAA CTTTTTATTT  8539

TTTATTTTTT ATTTTATTCA TTTGGCTTTC AGTGTACAAG GTCCCTTTTT ATTTTATTTT  8599

GTTATATCAA GGCATGAACA GTCCAAAAAG TATATTGAAG TTTAGGCCAG AAATAAATAC  8659

CACTGTATCA AAGCCTGCTG TTGTATCACC CACAAGGCCT ACAAGTGGCT CCAACTGGCT  8719

CAGTCGTATA CAATCCAAGC TTTATTCTCA ACAATTTATT AACAACAGTG ATGATACAAG  8779

TGAGCCC                                                            8786

<210>SEQ ID NO：3

<211>608

<212>多肽

<213>推断的

<223>Pm 69581Da

<223>序列类型：由三孢布拉霉的carRP基因编码的推断的氨基酸序列。

<400>

       Met Ser Ile Leu Thr Tyr Leu Glu Phe His Leu Tyr Tyr Thr

        1               5                   10

Leu Pro Val Leu Ala Ala Leu Cys Trp Leu Leu Lys Pro Phe His Ser

15                  20                  25                  30

Gln Gln Asp Asn Leu Lys Tyr Lys Phe Leu Met Leu Met Ala Ala Ser

                35                  40                  45

Thr Ala Ser Ile Trp Asp Asn Tyr Ile Val Tyr His Arg Ala Trp Trp

            50                  55                  60

Tyr Cys Pro Thr Cys Val Val Ala Val Ile Gly Tyr Val Pro Leu Glu

        65                  70                  75

Glu Tyr Met Phe Phe Ile Ile Met Thr Leu Met Thr Val Ala Phe Ser

    80                  85                  90

Asn Phe Val Met Arg Trp His Leu His Thr Phe Phe Ile Arg Pro Asn

95                  100                 105                 110

Thr Ser Trp Lys Gln Thr Leu Leu Val Arg Leu Val Pro Val Ser Ala

                115                 120                 125

Leu Leu Ala Ile Thr Tyr His Ala Trp His Leu Thr Leu Pro Asn Lys

            130                 135                 140

Ser Ser Phe Tyr Gly Ser Cys Ile Leu Trp Tyr Ala Cys Pro Val Leu

        145                 150                 155

Ala Ile Leu Trp Leu Gly Ala Gly Glu Tyr Ile Leu Arg Arg Pro Val

    160                 165                 170

Ala Val Leu Leu Ser Ile Val Ile Pro Ser Val Tyr Leu Cys Trp Ala

175                 180                 185                 190

Asp Ile Val Ala Ile Ser Ala Gly Thr Trp His Ile Ser Leu Arg Thr

                195                 200                 205

Ser Thr Gly Lys Met Val Val Pro Asp Leu Pro Val Glu Glu Cys Leu

            210                 215                 220

Phe Phe Thr Leu Ile Asn Thr Val Leu Val Phe Ala Thr Cys Ala Ile

        225                 230                 235

Asp Arg Ala Gln Ala Ile Leu His Leu Tyr Lys Ser Ser Val Gln Asn

    240                 245                 250

Gln Asn Pro Lys Gln Ala Ile Ser Leu Phe Gln His Val Lys Glu Leu

255                 260                 265                 270

Ala Trp Ala Phe Cys Leu Pro Asp Gln Met Leu Asn Asn Glu Leu Phe

                275                 280                 285

Asp Asp Leu Thr Ile Ser Trp Asp Ile Leu Arg Lys Ala Ser Lys Ser

            290                 295                 300

Phe Tyr Thr Ala Ser Ala Val Phe Pro Ser Tyr Val Arg Gln Asp Leu

        305                 310                 315

Gly Val Leu Tyr Ala Phe Cys Arg Ala Thr Asp Asp Leu Cys Asp Asp

    320                 325                 330

Glu Ser Lys Ser Val Gln Glu Arg Arg Asp Gln Leu Asp Leu Thr Arg

335                 340                 345                 350

Gln Phe Val Arg Asp Leu Phe Ser Gln Lys Thr Ser Ala Pro Ile Val

                355                 360                 365

Ile Asp Trp Glu Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Pro Ala Ser Cys Ile Ser

            370                 375                 380

Ala Phe Arg Ala Phe Thr Arg Leu Arg His Val Leu Glu Val Asp Pro

        385                 390                 395

Val Glu Glu Leu Leu Asp Gly Tyr Lys Trp Asp Leu Glu Arg Arg Pro

    400                 405                 410

Ile Leu Asp Glu Gln Asp Leu Glu Ala Tyr Ser Ala Cys Val Ala Ser

415                 420                 425                 430

Ser Val Gly Glu Met Cys Thr Arg Val Ile Leu Ala Gln Asp Gln Lys

                435                 440                 445

Glu Asn Asp Ala Trp Ile Ile Asp Arg Ala Arg Glu Met Gly Leu Val

            450                 455                 460

Leu Gln Tyr Val Asn Ile Ala Arg Asp Ile Val Thr Asp Ser Glu Thr

        465                 470                 475

Leu Gly Arg Cys Tyr Leu Pro Gln Gln Trp Leu Arg Lys Glu Glu Thr

    480                 485                 490

Glu Gln Ile Gln Gln Gly Asn Ala Arg Ser Leu Gly Asp Gln Arg Leu

495                 500                 505                 510

Leu Gly Leu Ser Leu Lys Leu Val Gly Lys Ala Asp Ala Ile Met Val

                515                 520                 525

Arg Ala Lys Lys Gly Ile Asp Lys Leu Pro Ala Asn Cys Gln Gly Gly

            530                 535                 540

Val Arg Ala Ala Cys Gln Val Tyr Ala Ala Ile Gly Ser Val Leu Lys

        545                 550                 555

Gln Gln Lys Thr Thr Tyr Pro Thr Arg Ala His Leu Lys Gly Ser Glu

    560                 565                 570

Arg Ala Lys Ile Ala Leu Leu Ser Val Tyr Asn Leu Tyr Gln Ser Glu

575                 580                 585                 590

Asp Lys Pro Val Ala Leu Arg Gln Ala Arg Lys Ile Lys Ser Phe Phe

                595                 600                 605

Val Asp

<210>SEQ ID NO：4

<211>582

<212>3

<213>3

<223>Pm 66426DA

<223>序列类型：由三孢布拉霉的carB基因编码的推断的氨基酸序列。

<400>

Met Ser Asp Gln Lys Lys His Ile Val Val Ile Gly Ala Gly Ile Gly

1               5                   10                  15

Gly Thr Ala Thr Ala Ala Arg Leu Ala Arg Glu Gly Phe Arg Val Thr

            20                  25                  30

Val Val Glu Lys Asn Asp Phe Ser Gly Gly Arg Cys Ser Phe Ile His

        35                  40                  45

His Asp Gly His Arg Phe Asp Gln Gly Pro Ser Leu Tyr Leu Met Pro

    50                  55                  60

Lys Leu Phe Glu Asp Ala Phe Ala Asp Leu Asp Glu Arg Ile Gly Asp

65                  70                  75                  80

His Leu Asp Leu Leu Arg Cys Asp Asn Asn Tyr Lys Val His Phe Asp

                85                  90                  95

Asp Gly Asp Ala Val Gln Leu Ser Ser Asp Leu Thr Lys Met Lys Gly

            100                 105                 110

Glu Leu Asp Arg Ile Glu Gly Pro Leu Gly Phe Gly Arg Phe Leu Asp

        115                 120                 125

Phe Met Lys Glu Thr His Val His Tyr Glu Gln Gly Thr Phe Ile Ala

    130                 135                 140

Ile Lys Arg Asn Phe Glu Thr Ile Trp Asp Leu Ile Arg Leu Gln Tyr

145                 150                 155                 160

Val Pro Glu Ile Phe Arg Leu His Leu Phe Gly Lys Ile Tyr Asp Arg

                165                 170                 175

Ala Ser Lys Tyr Phe Gln Thr Lys Lys Met Arg Met Ala Phe Thr Phe

            180                 185                 190

Gln Thr Met Tyr Met Gly Met Ser Pro Tyr Asp Ala Pro Ala Val Tyr

        195                 200                 205

Ser Leu Leu Gln Tyr Thr Glu Phe Ala Glu Gly Ile Trp Tyr Pro Arg

    210                 215                 220

Gly Gly Phe Asn Met Val Val Gln Lys Leu Glu Ser Ile Ala Ser Lys

225                 230                 235                 240

Lys Tyr Gly Ala Glu Phe Arg Tyr Gln Ser Pro Val Ala Lys Ile Asn

                245                 250                 255

Thr Val Asp Lys Asp Lys Arg Val Thr Gly Val Thr Leu Glu Ser Gly

            260                 265                 270

Glu Val Ile Glu Ala Asp Ala Val Val Cys Asn Ala Asp Leu Val Tyr

        275                 280                 285

Ala Tyr His His Leu Leu Pro Pro Cys Asn Trp Thr Lys Lys Thr Leu

    290                 295                 300

Ala Ser Lys Lys Leu Thr Ser Ser Ser Ile Ser Phe Tyr Trp Ser Met

305                 310                 315                 320

Ser Thr Lys Val Pro Gln Leu Asp Val His Asn Ile Phe Leu Ala Glu

                325                 330                 335

Ala Tyr Lys Glu Ser Phe Asp Glu Ile Phe Asn Asp Phe Gly Leu Pro

            340                 345                 350

Ser Glu Ala Ser Phe Tyr Val Asn Val Pro Ser Arg Ile Asp Glu Ser

        355                 360                 365

Ala Ala Pro Pro Asn Lys Asp Ser Ile Ile Val Leu Val Pro Ile Gly

    370                 375                 380

His Met Lys Ser Lys Thr Gly Asn Ser Ala Glu Glu Asn Tyr Pro Glu

385                 390                 395                 400

Leu Val Asn Arg Ala Arg Lys Met Val Leu Glu Val Ile Glu Arg Arg

                405                 410                 415

Leu Gly Val Asn Asn Phe Ala Asn Leu Ile Glu His Glu Glu Val Asn

            420                 425                 430

Asp Pro Ser Val Trp Gln Ser Lys Phe Asn Leu Trp Arg Gly Ser Ile

        435                 440                 445

Leu Gly Leu Ser His Asp Val Phe Gln Val Leu Trp Phe Arg Pro Ser

    450                 455                 460

Thr Lys Asp Ser Thr Asn Arg Tyr Asp Asn Leu Phe Phe Val Gly Ala

465                 470                 475                 480

Ser Thr His Pro Gly Thr Gly Val Pro Ile Val Leu Ala Gly Ser Lys

                485                 490                 495

Leu Thr Ser Asp Gln Val Cys Lys Ser Phe Gly Gln Asn Pro Leu Pro

            500                 505                 510

Arg Lys Leu Gln Asp Ser Gln Lys Lys Tyr Ala Pro Glu Gln Thr Arg

        515                 520                 525

Lys Thr Glu Ser His Trp Ile Tyr Tyr Cys Leu Ala Cys Tyr Phe Val

    530                 535                 540

Thr Phe Leu Phe Phe Tyr Phe Phe Pro Arg Asp Asp Thr Thr Thr Pro

545                 550                 555                 560

Ala Ser Phe Ile Asn Gln Leu Leu Pro Asn Val Phe Gln Gly Gln Asn

                565                 570                 575

Ser Asn Asp Ile Arg Ile

            580

<210>SEQ ID NO：5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>PCR引物

<400>

CGCGCCGACT GCCATTGACT             20

<210>SEQ ID NO.6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<223>PCR引物

<400>

CACGCACGCC GCCTTGACA              19

<210>SEQ ID NO：7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<223>在carB基因中插入切割位点NcoI的寡核苷酸

<400>

CTATTTTAAT CCCATGGCTG ATCAAAAG    28

<210>SEQ ID NO：8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<223>在carB基因中插入切割位点NcoI的寡核苷酸

<400>

CTTTTGATCA GCCATGGGAT TAAAATAG        28

<210>SEQ ID NO：9

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<223>在carRP基因中插入切割位点NcoI的寡核苷酸

<400>

CTTTTTATTT TATCTCCATG GCAATACTCA C    31

<210>SEQ ID NO：10

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<223>在carRP基因中插入切割位点NcoI的寡核苷酸

<400>

GTGAGTATTG CCATGGAGAT AAAATAAAAA G    31

-1-

Claims (18)

1.一种从三孢布拉霉中分离的、包含carRP和carB基因的DNA化合物，其由图1所示的限制酶图谱定义，并编码与β-胡萝卜素生物合成途径有关的酶。

2.确定为SEQ ID NO：1的DNA序列，其包括三孢布拉霉的carRP基因，编码酶番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶。

3.确定为SEQ ID NO：2的DNA序列，其包括三孢布拉霉的carB基因，编码酶八氢番茄红素脱氢酶。

4.核苷酸序列，其特征在于它们能够在限制条件下与权利要求1至3的DNA化合物杂交，并表达由carRP和carB基因编码的酶中的一种，除布拉克须霉，卷枝毛霉和粗糙脉孢霉的序列以外。

5.确定为SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其对应于由三孢布拉霉的carRP基因编码的双功能酶番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶。

6.确定为SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其对应于由三孢布拉霉的carB基因编码的酶八氢番茄红素脱氢酶。

7.载体，其携带在权利要求1至4中所述的DNA化合物或其片段，所述片段编码由各个全序列编码的酶中一种。

8.权利要求7中要求的载体，其在不同于基因本身的那些的表达信号的控制下表达所述carRP基因。

9.权利要求7中要求的载体，其在不同于基因本身的那些的表达信号的控制下表达所述carB基因。

10.权利要求8和9中要求的载体，其特征在于表达信号是从三孢布拉霉中获得的。

11.权利要求7至10中任何一项要求的载体，其特征在于它们由质粒组成。

12.权利要求11中要求的质粒，其特征在于它由包括carRP基因的pALBT9组成。

13.权利要求11中要求的质粒，其特征在于它由包括carB基因的pALBT52组成。

14.权利要求11中要求的质粒，其特征在于它由包括carRP和carB基因的pALBT83组成。

15.权利要求11中要求的质粒，其特征在于它由包括carRP基因的pALBT84组成。

16.权利要求11中要求的质粒，其特征在于它由包括carB基因的pALBT85组成。

17.权利要求11中要求的质粒，其特征在于它由包括ble^R基因的pALBT57组成，所述ble^R基因在carRP基因的启动子的控制下表达。

18.权利要求11中要求的质粒，其特征在于它由包括ble^R基因的pALBT58组成，所述ble^R基因在carB基因的启动子的控制下表达。