CN1259166A

CN1259166A - Dna序列,这些dna序列的表达,这些dna序列所编码的嗜热漆酶,及其应用

Info

Publication number: CN1259166A
Application number: CN98805778A
Authority: CN
Inventors: 鲁珀特·普法勒; 京特·维希
Original assignee: Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Current assignee: Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2000-07-05
Also published as: AU8624698A; WO1998055628A2; DE19724039A1; KR20010013482A; BR9815544A; AU725639B2; NO995948L; ID23856A; CA2292723A1; WO1998055628A3; JP2000513588A; NO995948D0; EP0994950A2; NZ501312A; PL337465A1

Abstract

本发明涉及编码具有漆酶活性的蛋白质且含有DNA序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2之一的DNA序列。本发明进而涉及这些DNA序列的表达,这些DNA序列编码的嗜热漆酶,及其在纸浆的去木质化、高分子量聚集物的解聚、废纸的去墨渍、废水尤其是纸浆漂白后含木质素的废水中的芳香化合物的聚合、染料的氧化、或者染料的活化以形成颜料中的应用以及其在有机合成上用于芳香化合物的偶联反应或者芳香侧链的氧化作用中的应用。

Description

DNA序列，这些DNA序列的表达，这些DNA序列所编码的嗜热漆酶，及其应用

本发明涉及编码具有漆酶活性的蛋白的DNA序列，这些DNA序列的表达，这些DNA序列所编码的嗜热漆酶，及其应用。

在工业应用上具有很高价值的一类酶是漆酶(对羟基苯酚氧化酶，EC1.10.3.2.)。漆酶这类蛋白质属于被称作“绿铜蛋白”的家族，通常含有四个铜离子，位于标为1型至3型的三个铜中心。漆酶通常以分泌的蛋白和可能含有的糖基化含量(10％至45％的分子量)来加以区别。对于它所氧化的芳香化合物，漆酶具有很广的底物特异性。在这种氧化中产生的电子用于还原氧，产生水。特别地存在于白腐真菌中的漆酶的功能是能够降解木质素，这也就是在纸张制造中使用漆酶进行纸浆去木质化而具有应用价值的原由。

除了可以解聚象木质素这样的大分子化合物，漆酶还可以催化特别是芳香化合物的聚合。例如与植物中的漆酶相关的植物木质素的生物合成。故漆酶可能的工业应用通常也包括用于各种类型的聚合反应，例如用于废水处理。漆酶在有机化学合成中的应用也是已知的，例如芳香族化合物的偶联反应和侧链氧化。然而，对于这许多的潜在应用，一个不利的方面是大多数已知漆酶是常温型的，就是说它们具有低温最适性以及有限的热稳定性。

漆酶的工业应用的一个前提条件是它们能够以可接受的成本来制备，通常只有通过使用以重组技术制备的酶才能使之成为可能。有许多原核和真核的表达系统可用于蛋白质的生产，原核表达系统的代表有大肠杆菌和枯草杆菌，而广泛使用的真核表达系统是哺乳动物细胞和昆虫细胞的细胞培养系统，以及真核微生物如酵母或丝状真菌。

WO 96/00290公开了五种来自丝状真菌Polyporu pinsitus的漆酶基因，该真菌属于担子菌纲的亚纲。这些漆酶基因之一(LCC1)通过重组技术制备。虽然该酶的嗜热性没有进一步研究，但其所述的LCC1用于染发目的显示该酶具有常温的特性。

在WO 95/33837中，描述了从Deuteromycetes的亚纲的丝状真菌Scytalidium thermophilum中制备出带有嗜热特性的重组漆酶。不知道该酶是否能够用于纸浆的漂白。

迄今，还未描述有从担子菌纲的亚纲的丝状真菌中以重组蛋白来制备嗜热型漆酶的方法。

CA：AN 96-203142公开了一个嗜热型漆酶的多种特性。但没有公开该蛋白质的DNA或者蛋白质序列。

本发明涉及一个编码具有漆酶活性的蛋白质的DNA序列，此DNA含有DNA序列SEQ ID NO：1的第76位直至且包括第1572位或者SEQ ID NO：2的第76位直至且包括第1572位的序列，或者与所说序列具有80％以上的同源性的序列。

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的第1位至第75位编码该蛋白分泌所需的信号肽序列。此信号序列可以被任何其他的蛋白分泌的信号序列所替换。

该新的DNA序列可以通过例如克隆的方法从担子菌纲菌株Trametes versicolor TV-1(保藏于DSMZ，德意志微生物保藏中心，D-38124 Braunschweig，保藏号DMS 11523)中获得。为此，以已知的方法从Trametes versicolor TV-1建立一个基因文库，它可以是cDNA文库或是基因组文库。

为了在基因文库中分离该新的DNA序列，要使用含有漆酶特异DNA序列的DNA探针。此类探针可以例如利用DNA引物经PCR从Trametes versicolor TV-1基因组DNA获得。

所用的引物为简并的DNA片段，长度优选为14至27bp，其序列通过比较已知的漆酶基因序列而确定。

适于作为引物的DNA片段最好是通过熟知的DNA片段的寡核苷酸合成来获得。

新的漆酶基因可按照例如实施例1至5的方法分离。

按照所示实施例的方法分离出的一个漆酶基因，可以通过熟练技术人员所知的技术，例如定点诱变，在其序列的任何所需位置进行修饰。因而，本发明也涵盖了一个编码具有漆酶活性的蛋白的DNA序列，其所含有的序列与DNA序列SEQ ID NO：1从第76位直至且包括第1572位或者DNA序列SEQ ID NO：2从第76位直至且包括第1572位的序列具有80％以上的同源性。

为了表达此新的DNA，利用熟知的方法将其克隆至一个表达载体上，再将含有漆酶基因的表达载体导入一微生物中并在微生物中表达。

表达载体可以是一个整合到宿主基因组中去并和宿主一起复制的DNA结构。或者，表达载体是一个自主复制的DNA结构而不需要整合至宿主基因组中，例如，质粒、人工染色体、或者类似的染色体外遗传因子。

一个适当的表达载体应该优选地含有下列遗传元件：

一个启动漆酶基因在宿主中表达的启动子，这应该优选地是一个强启动子从而能确保较高的表达效率。启动子应优选地有功能地连接于漆酶基因的5′端。

适当的和优选的启动子选自以下一组：tac启动子、枯草杆菌蛋白酶启动子、GAL启动子、TAKA淀粉酶启动子、多角蛋白启动子、葡糖淀粉酶启动子、gapDH启动子和醇氧化酶启动子。

适合的和优选的启动子，用于在大肠杆菌中表达的是tac启动子、用于在枯草杆菌中表达的是枯草杆菌蛋白酶启动子、用于在啤酒糖酵母中表达的是GAL启动子、用于在黑曲霉中表达的是TAKA淀粉酶启动子、用于在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达的是多角蛋白启动子，或者，来自黑曲霉的葡糖淀粉酶启动子或来自巴斯德毕赤氏酵母的醇氧化酶启动子。

尤其合适的可用于该新嗜热漆酶表达的启动子是来自黑曲霉的葡糖淀粉酶启动子或来自巴斯德毕赤氏酵母的醇氧化酶启动子。

表达载体也应当优选地含有适合于宿主的转录终止信号，而在真核中还应含有聚腺苷化的信号，该信号应功能性地连接于漆酶基因的3′端。

表达的蛋白质应优选地被宿主分泌到培养基中。宿主的分泌通过N-端信号序列来介导。该信号序列是天然存在于漆酶基因中的，或者，是一个异源信号序列，其编码DNA在表达载体上功能地连接于漆酶基因的5’端。

下列分泌蛋白的信号序列是优选的：来自Klebsiella oxytoca的α-环糊精葡糖转移酶，来自啤酒糖酵母的α-因子，来自巴斯德毕赤氏酵母的酸性磷酸酶，来自黑曲霉的α-淀粉酶，来自黑曲霉或泡盛曲霉的葡糖淀粉酶，或者天然存在于漆酶基因中的信号序列。

尤其合适的是天然存在于漆酶基因中的信号序列，以及下列的异源信号序列：来自黑曲霉或者泡盛曲霉的葡糖淀粉酶的信号序列，来自啤酒糖酵母的α-因子的信号序列，或者巴斯德毕赤氏酵母的酸性磷酸酶的信号序列。

漆酶的分泌也可以通过融合蛋白的表达而完成，其中一个分泌蛋白的基因或者该蛋白的一个分泌片段的基因在表达载体中有功能地与漆酶基因相连接。这方面尤为优选的是，一种由来自黑曲霉的葡糖淀粉酶N-端片段和该嗜热漆酶组成的融合蛋白的表达。

对葡糖淀粉酶片段和该嗜热漆酶的连接点的选择更优选的是使得该连接点的氨基酸序列能够作为宿主细胞的分泌器的加工肽酶的识别位点，从而表达的融合蛋白可被体内切割并释放出该漆酶。

表达载体优选地还含有一个选择标记的基因。该基因编码的选择标记可以给宿主带来一种抗生素抗性或者对宿主的一种缺陷有互补。

优选的选择标记是可带来如下抗生素抗性的基因，如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、潮霉素、zeocin或bialaphos。优选的可对生长缺陷互补的选择标记基因如amdS，pyrG，trpC，His4，niaD，argB，或者hygB。

尤其合适的选择标记是amdS和pyrG基因和His4基因和抗生素zeocin的抗性基因。

此外，选择标记基因可以在一个DNA分子上与漆酶基因一同存在，或者两个基因分别存在于不同的DNA分子上。后一种情况下，宿主应被两种DNA分子一同共转化。

因而本发明也涉及含有该新的DNA序列的表达载体。

合适的和优选的用于表达此新表达载体的微生物是，细菌来源的如大肠杆菌或枯草杆菌，真核来源的如糖酵母或毕赤氏酵母属的酵母，或者丝状真菌如曲霉属，木霉属，链孢霉属或裂褶菌属，或者真核细胞培养物例如杆状病毒感染的昆虫细胞。

尤其合适的是曲霉属丝状真菌如黑曲霉或泡盛曲霉或者酵母类的啤酒糖酵母或巴斯德毕赤氏酵母。

由此新的DNA所编码的蛋白具有以下的生化特性：

该蛋白具有漆酶的酶学活性，该酶活性的最适pH位于酸性范围且最大为pH2.0，最高活性的一半酶活性位于pH4.0。该酶在45℃及pH4.5至6.0下的稳定性在2小时内保持100％。

该酶在45℃及pH3.0下的稳定性在1小时的时间中为50％。pH4.5的条件下最适温度为70℃。该酶的活性在65-70℃时仍有其最高活性的80％。在50-80℃时酶的活性仍具有其最高活性的50％。在pH4.5且高达55℃温度条件下，在长达两个小时的时间内该酶的稳定性仍为90％。而在pH4.5且温度65℃条件下，在长达一个小时的时间内该酶的稳定性为50％。

此新的蛋白含有SEQ ID NO：3的蛋白质序列。

此新的蛋白的制备优选地通过在上述的微生物中表达新的DNA序列的方法而进行。

该DNA的表达优选地利用上述的一种表达载体在微生物中进行。

本发明因而也涉及含有新的DNA序列或者新的表达载体的微生物。

尤为优选的是，结合应用微生物以及也能从微生物分泌蛋白的表达系统。这种优选的结合应用的例子是：

利用葡糖淀粉酶启动子在黑曲霉或泡盛曲霉中表达该新的DNA序列。在这个表达系统中使用的分泌信号优选地是：嗜热漆酶本身的信号序列或者是葡糖淀粉酶-漆酶融合蛋白的葡糖淀粉酶部分的信号序列。

利用醇氧化酶启动子在巴斯德毕赤氏酵母中表达该新的DNA序列。在这个表达系统中使用的分泌信号优选地是：嗜热漆酶本身的信号序列或者是来自啤酒糖酵母的α-因子的信号序列或者是来自巴斯德毕赤氏酵母的酸性磷酸酶的信号序列。

该新的蛋白适合于已知的所有的漆酶应用。尤其适合于纸浆的去木质化和高分子量聚集物的解聚。漆酶可进一步用于废纸的去墨渍，用于废水处理中的芳香化合物的聚合，特别是纸浆漂白后含木质素的废水的处理，或者可广泛应用于受污染土壤的解毒。更进一步的应用方面涉及与前体组分及反应使染料氧化以及使染料活化而形成颜料。在有机合成方面的应用包括芳香化合物的偶联反应以及芳香取代基的氧化，例如苯甲醇氧化形成相应的醛类而防止进一步氧化成羧酸。在上述的应用当中，漆酶可以单独应用于相关的反应，也可以结合一种促进反应的介体。这样的介体例如是ABTS或N-羟基苯并三唑。

本发明因而也涉及将该新的蛋白质应用于纸浆的去木质化、高分子量聚集物的解聚、废纸的去墨渍、废水尤其是纸浆漂白后含木质素的废水中的芳香化合物的聚合、染料的氧化或者染料的活化以形成颜料、在有机合成方面应用于芳香化合物的偶联反应以及芳香侧链的氧化。

上述的应用可以通过单独使用漆酶，也可以结合一种促进反应的介体来进行。

图1示出DNA载体pANlac1S的结构。

图2示出DNA载体pANlac2S的结构。

图3示出DNA载体pL512的结构。

图4示出DNA载体pL532的结构。

图5示出新漆酶的活性与pH的相关性。

图6示出新漆酶的pH稳定性。

图7示出新漆酶的活性与温度的相关性。

图8示出新漆酶的温度稳定性。

以下的实施例用于进一步解释本发明。在实施例中对DNA或RNA的处理所使用的标准方法，例如用限制内切酶，DNA聚合酶，反转录酶的处理等，以及标准的方法，例如细菌的转化，Sounthern和northern杂交分析，DNA测序，放射性标记，扫描和PCR技术，除非另有说明，均按照所用试剂盒的制造商推荐的方法进行，如果没有制造商的说明，则按照本领域所熟知的标准教科书进行。实施例1：来自Trametes versicolor TV-1的cDNA文库的构建

使用Trametes versicolor TV-1菌株。Trametes versicolor的菌丝首先通过在麦芽琼脂平板(3％麦芽抽提物，0.3％大豆粉的蛋白胨，1.5％的琼脂，pH5.0)于28℃培养7天而获得。从麦芽琼脂平板中取三块菌丝捣碎并用以接种500ml三角瓶中的100ml无菌麦芽抽提物培养基(3％麦芽抽提物，0.3％大豆粉的蛋白胨，pH5.0)。在28℃以100rpm摇动培养7天。菌丝悬浮液通过瓷器漏斗的抽滤而制备，用0.9％的盐溶液洗涤，将菌丝在液氮中冷冻并用研钵磨碎。用RNeasy试剂盒(Qiagen)分离RNA。200mg的菌丝可产生100μg的RNA。

600μg的RNA用于提取mRNA，这通过在oligo-dT Sepharose(mRNA分离试剂盒，Pharmacia)上的层析完成。产生的mRNA有26μg。7.25μg的分离的mRNA用于合成cDNA，这里使用了Stratagene的一种cDNA合成试剂盒。分级分离后，cDNA通过琼脂糖凝胶电泳分成0.8-2.1kb大小和2.5-5kb大小的两种组分，这两种组分cDNA都从琼脂糖中分离出来(Qiagen凝胶抽提试剂盒)用于构建cDNA文库。cDNA文库建于λ噬菌体(Stratagene，ZAP快速克隆系统)，从0.8-2.1kb的组分中获得4×10⁵噬菌体/μg载体DNA，从2.1-5kb的组分中获得1×10⁵噬菌体/μg载体DNA，得到的噬菌体通过感染大肠杆菌菌株XL-1 Blue MRF′(Statagene)进行扩增。实施例2：来自Trametes versicolor的染色体基因文库的构建

Trametes versicolor TV-1菌丝的制备如实施例1中所述。菌丝经瓷器漏斗抽滤并用0.9％的盐溶液洗涤，然后在液氮中冷冻，用研钵磨碎并分成1g的小份。每个1g的小份磨碎菌丝装入一个无菌样品管中并立刻混入5ml抽提溶液(0.1M Tris-HCl，pH8.0，0.1M EDTA，0.25MNaCl，0.6mg/ml蛋白酶K)和0.5ml 10％(w/v)的月桂酰肌氨酸钠溶液。于50℃保温至少2小时之后，混入0.85ml 5M NaCl和0.7ml在0.7MNaCl中的10％(w/v)CTAB溶液并于65℃保温30分钟。加入7ml的氯仿/异戊醇(24∶1)混合物之后，振荡并通过离心将两相分离。移出水相并加入0.6倍体积的异丙醇沉淀染色体DNA。沉淀的DNA接下来在柱(Qiagen Genomic Tip)上纯化。以此方法从16g菌丝中可分离0.5mg的染色体DNA。

为了构建染色体基因文库，用EcoRI将90μg来自Trametesversicolor TV-1的DNA完全酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳分离。染色体DNA片段分离成2-4kb和4-10kb大小两种组分，并将每种组分分别克隆到λ噬菌体(Stratagene，ZAP快速克隆系统)中。从2-4kb的组分中获得1×10⁵噬菌体/μg载体DNA。从4-10kb的组分中获得5.4×10⁴噬菌体/μg载体DNA。得到的噬菌体通过感染大肠杆菌菌株XL-1 Blue MRF′(Statagene)进行扩增。实施例3：从Trametes versicolor基因组DNA中制备漆酶特异性DNA探针

用于分离漆酶基因的DNA探针通过以通用引物从T.versicolor的基因组中PCR扩增的方法制备。根据已知的漆酶基因序列的对比来构建简并引物。对于登记在EMBL基因数据库中的漆酶基因的氨基酸序列进行了比较，它们来自粗糙链孢霉，毛革盖菌，辐射射脉菌，双孢蘑菇和担子菌纲的亚纲中的一种未详细鉴定的丝状真菌。通过序列的比较，可确定4个长度为5-7个氨基酸的肽段在所有的漆酶基因中完全保守。考虑到简并密码子，将这些肽段翻译回DNA从而制备出简并引物。这些简并引物的序列如下：

A：5’-TGGCAYGGNTTYTTYCA-3’(SEQ ID NO：4)

B：5’-TCDATRTGRCARTG-3’(SEQ ID NO：5)

C：5’-ATTCAGGGATCCTGGTAYCAYWSNCAY-3’(SEQ IDNO：6)

D：5’-ATACGAGGATCCRTGNCCRTGNARRTG-3’(SEQ IDNO：7)

引物C和D在5′端含有一个BamHI酶切位点(划线部分)，并带有合适的简并漆酶序列。

来自T. versicolor的基因组DNA按照实施例2所述的方法从摇瓶培养的菌丝中提取。PCR扩增按照本领域熟练技术人员熟知的方法进行。第一轮PCR中，在100μl的PCR体系中使用200ng的T.versicolor染色体DNA，以及1.25U的Taq聚合酶，1.25mMMgCl₂，0.2mM的各4种dNTP和各100pmol的引物A和B。所需PCR产物的特异扩增的其他条件是：94℃5分钟后，7个循环的94℃0.5分钟，40℃1分钟和60℃2.5分钟，然后30个循环的94℃0.5分钟，50℃1分钟和72℃2.5分钟。取第一轮PCR反应的1ul用于第二轮PCR，其中还含有1.25U的Taq聚合酶，1.25mM MgCl₂，0.2mM的各4种dNTP和各100pmol的引物C和D。所需PCR产物的特异扩增的其他条件是：94℃5分钟后，7个循环的94℃0.5分钟，40℃1分钟和60℃2.5分钟，然后30个循环的94℃0.5分钟，50℃1分钟和72℃2.5分钟。得到约1.1kb的PCR产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，用限制酶BamHI酶切，克隆入BamHI酶切的pUC18载体并转化进E.coli.。从转化的E.coli培养物中分离质粒。用5′端和3′端的DNA序列分析确认该克隆的DNA片段为漆酶基因的片段。

为了制备DNA探针用于筛选漆酶基因，将漆酶特异的PCR片段以BamHI处理，经琼脂糖凝胶电泳分离并用α-[³²P]-dATP标记(随机引物试剂盒，Boehringer Mannheim)。游离的放射性通过SephadexG25(Pharmacia)上的层析除去。放射性标记的DNA探针的比活性为1×10⁷cpm/μgDNA。实施例4：来自Trametes versicolor TV-1的漆酶的cDNA基因的分离

使用如实施例1中所述的Trametes versicolor TV-1的cDNA基因文库。漆酶cDNA基因的筛选按照本领域的方法进行。在第一轮筛选中，首先将大肠杆菌XL-1 Blue MRF′细胞在10个培养皿中培养，然后每个培养皿以50000个cDNA文库噬菌体感染(0.8-2.1kb组分，见实施例1)。37℃培养过夜后，新形成的噬菌体转移至尼龙膜(Stratagene)上。再按照制造商的说明书将滤膜与放射性标记的漆酶特异性探针(见实施例3)杂交，杂交温度为45℃，杂交缓冲液含有50％的甲酰胺。挑出阳性克隆并经重复筛选过程进行纯化。经三轮的分离后，在筛选中分离出20个强杂交噬菌体克隆并按照制造商的方法(Stratagene)通过体内剪切重新克隆入pBK CMV载体(Stratagene)中。通过限制性内切酶消化以及DNA测序分析，确定在DNA水平上基本相同的2个漆酶基因已得到分离。这2个克隆的完全测序表明它们是漆酶的等位基因，具有相同的氨基酸序列。这2个漆酶cDNA基因被称为Lac5.5和Lac5.6。相应地，带有这两个漆酶cDNA基因的质粒被称为pLac5.5和pLac5.6。实施例5：来自Trametes versicolor TV-1的漆酶的染色体基因的分离

在如实施例2所述的Trametes versicolor TV-1的染色体基因文库(2-10kb部分，见实施例2)中筛选染色体漆酶基因，方法类似于实施例4中所述的筛选cDNA克隆。实施例3中所用的放射性标记的漆酶特异性探针被再次使用。杂交温度为45℃，杂交缓冲液含有50％的甲酰胺。在筛选中，分离出3个强杂交噬菌体克隆并按照制造商的方法(Stratagene)通过体内剪切重新克隆入pBK CMV载体(Stratagene)中。限制性内切酶分析得出的结论是所有这3个克隆是相同的，长度约为7kb。DNA测序分析表明所有这3个克隆代表着Lac5.6漆酶染色体基因。对一个克隆的编码区及两侧大约1kb的5′和3′区进行了测序(SEQ ID NO：8)。实施例6：用于在曲霉中表达漆酶Lac5.5的DNA构建体的制备

Trametes versicolor漆酶Lac5.5的cDNA有功能地与特异于曲霉属的丝状真菌的表达信号连接。使用了下列来自曲霉的基因表达元件。

a)来自黑曲霉的葡糖淀粉酶基因(glaA)的启动子(J.C.Verdoes，P.J.Punt，J.M.Schrickx，H.W.van Verseveld，A.H.Stouthamer和C.A.M.J.Jvan den Hondel，转基因研究2(1993)，84-92)

b)glaA启动子后接一个编码信号序列和成熟葡糖淀粉酶的片段的DNA片段。与之相连的是编码KEX2蛋白酶的切割位点的DNA序列(M.P.Broekhuijsen，I.E.Mattern，R.Contreras，J.R.Kinghorn，C.A.M.J.J van den Hondel(1993)，生物技术杂志.31，135-145)。

c)来自构巢曲霉的trpC基因的转录终止子(E.J.Mullaney，J.E.Hamer，M.M.Yelton和W.E.Timberlake(1985)，Mol.Gen.Gene.199，37-45)。

但是，对于Lac5.5的cDNA与曲霉表达信号的功能性连接，首先需要的是对Lac5.5的cDNA基因的5′和3′区进行修饰。A：漆酶Lac5.5cDNA与glaA启动子的连接：

为了进一步的操作，Lac5.5的cDNA基因被重新克隆进pUC19载体中。为此，将Lac5.5 cDNA基因以1.9kb的EcoRI-XbaI片段从实施例1中获得的pBK CMV载体上分离出，并亚克隆到预先以EcoRI-XbaI切开的pUC19载体上。得到的4.6kb的质粒称为pLac5。

为了修饰Lac5.5 cDNA基因的起始密码子ATG，使用了引物E和F。引物E：5’-CCGGAATTCATGACTGGGCTGCGTCTCCTTCCTTCCTTC-3’(SEQ ID NO：9)引物F：5’-GAGAGGCCCGGGAGCCTGG-3’(SEQ ID NO：10)

引物E中划线部分表示一个BspHI切点，引物F中的划线部分表示一个SmaI或XmaI切点。

为了修饰Lac5.5 cDNA基因的3′区，使用了引物G和H。引物G：5’-GCTGAATTCGAAGACATCCCCGACACCAAGG-3’(SEQ ID NO：11)引物H：5’-TGCTCTAGAAAGCTTAAGTTCACTGGTCGTCAGCGTCGAGGG-3’(SEQ ID NO：12)

引物G中划线部分表示一个BbsI切点，引物H中的划线部分表示一个AflII切点。

通过PCR利用引物E和F在Lac5.5cDNA基因的5′区扩增出一个188bp大小的片段。通过PCR利用引物G和H在Lac5.5cDNA基因的3′区扩增出一个110bp大小的片段。在100μl的PCR混合物中，含有10ng的Lac5.5cDNA(在pBK CMV载体上)，0.5U的Tth聚合酶，1.25mM MgCl₂，0.2mM的各4种dNTP和各140pmol的引物对E和F或者引物对G和H。PCR以如下条件进行：94℃5分钟后，30个循环的94℃1分钟，50℃2分钟和72℃1分钟，最后是72℃7分钟。

引物E和F的PCR片段产物先用EcoRI和XmaI切割，然后经凝胶电泳纯化后克隆到预先被EcoRI和XmaI切割的pLac5上。结果得到载体pLac51，其ATG翻译起始密码子上引入了一个BspHI切点。

引物G和H的PCR片段产物先用EcoRI和XbaI切割，然后经凝胶电泳纯化后克隆到预先被EcoRI和XbaI切割的pUC19上。用BbsI和XbaI在得到的质粒pLT5上切下插入的约100bp大小的插入片段。该BbsI-XbaI片段最后克隆入预先经BbsI和XbaI切割的载体pLac51。得到载体pLac513，其上的漆酶cDNA基因的3′末端含有一个新的AflII切点。

通过对质粒pLac513作BbsHI的部分消化，可分离出5′和3′区域被修饰的Trametes versicolor漆酶Lac5.5的cDNA基因。结果得到一个2.6kb的含有Lac5.5cDNA基因的编码区，以及约1.1kb的pUC19载体片段的片段。该片段第二步用AflII酶切，分离得到1.5kb大小的Lac5.5cDNA片段。此片段与7.4kb大小的来自载体pAN52-12的AflII-NcoI片段连接，该7.4kb片段含有一个4.0kb来自黑曲霉glaA启动子的片段，一个0.7kb来自构巢曲霉trpC转录终止子的片段以及2.7kb大小的pUC18载体片段。得到的8.8kb大小载体被称为pANlac1。在pANlac1上，glaA启动子区域通过NcoI-BspHI连接点功能性地与漆酶cDNA基因的翻译起始密码子ATG相连接。B：通过以葡糖淀粉酶片段替换N-端信号序列将漆酶Lac5.5cDNA与glaA启动子相连

为了修饰cDNA基因编码成熟漆酶Lac5.5N端的区域，使用了引物I和F。引物I：5’CCGGAATTCGATATCCAAGCGCGGGATCGGGCCTGTGCTCGAC-3’(SEQ ID NO：13)

引物I中划线部分表示一个EcoRV切点。

为了修饰Lac5.5cDNA基因的3′区域，使用了引物G和H(见本实施例的A部分)。

通过PCR利用引物I和F在Lac5.5cDNA基因的5′区域扩增出一个110bp大小的片段。通过PCR利用引物G和H在Lac5.5cDNA基因的3′区域扩增出一个110bp大小的片段。PCR的操作如本实施例中A部分所述。

引物I和F的PCR DNA片段产物用EcoRI和XmaI切割，然后经凝胶电泳纯化后克隆到预先被EcoRI和XmaI切割的pLac5上。结果得到载体pLac52，该质粒中在成熟漆酶蛋白的第一个氨基酸密码子之前的5’区域插入了一个EcoRV位点及编码氨基酸序列Ile Ser LysArg(SEQ ID NO：14)的密码子，此序列是KEX2蛋白酶的一个识别位点。载体pLac52上漆酶cDNA基因3′区域的修饰如同对载体pLac51所述的处理一样。将来自引物G和H的PCR产物的约100bp大小的插入片段用BbsI和XbaI从质粒pLT5上切下并分离出。该BbsI-XbaI片段最后克隆入预先经BbsI和XbaI切割的载体pLac52中。得到载体pLac523，其上的漆酶cDNA基因的3′末端含有一个新的AflII切点。

以EcoRV和AflII酶切质粒pLac523，可得到带有经修饰的5′和3′区域的来自Trametes versicolor的漆酶Lac5.5的cDNA基因，经琼脂糖凝胶电泳分离出所得的1.5kb大小的Lac5.5cDNA片段。该片段连接到经AflII-EcoRV酶切的9.3kb大小的载体pAN56-9片段上。载体pAN56-9含有一个4.0kb大小的黑曲霉的glaA启动子片段，后面跟有一个2.0kb大小的编码黑曲霉glaA葡糖淀粉酶片段的片段，一段编码KEX2切点4个氨基酸的DNA短序列，一个0.7kb大小的构巢曲霉trpC转录终止子片段，和一个2.7kb大小的pUC18载体片段。EcoRV和AflII切点位于KEX2切点的3′端。转化E.coli后得到一个10.8kb的载体，被称为pANlac2。在pANlac2中，成熟漆酶Lac5.5的cDNA基因的编码区与葡糖淀粉酶基因的编码区相连，这样在表达时，首先产生出一个由带信号序列的葡糖淀粉酶片段，KEX2蛋白酶的识别序列和完整的漆酶Lac5.5组成的融合蛋白。分泌时，该融合蛋白被KEX2蛋白酶切割，成熟的漆酶被分泌到培养物上清中。C：amdS和pyrG选择标记掺入到载体pANlac1和pANlac2中

取pANlac1和pANlac2载体各5μg用NotI消化过夜使之线性化，接下来用牛肠碱性磷酸酶处理，苯酚/氯仿抽提并以乙醇沉淀。选择标记amdS(乙酰胺酶)和pyrG(乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶)的基因由质粒pAN52-11提供，其可从该质粒上通过NotI消化作为6.4kb大小的片段被分离。取经线性化和磷酸酶处理的载体pANlac1和pANlac2各0.2μg，与0.6μg分离得到的NotI片段连接，并以之转化大肠杆菌JM109。从转化的氨苄青霉素抗性的菌落中制备质粒DNA，并用NotI酶切通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。所分析的8个来自载体pANlac1的转化克隆中有6个克隆以及7个来自载体pANlac2的转化克隆中有5个克隆含有该6.4kb的基因的NotI片段。配有选择标记基因的载体被称为pANlac1S(大小为15.3kb，图1)和pANlac2S(大小17.2kb，图2)。得到的6个pANlac1S克隆中有3个克隆含有的NotI片段具有如图1所示的所需方向。得到的5个pANlac2S克隆中有1个克隆含有的NotI片段具有如图2所示的所需方向。实施例7：曲霉的转化

转化中使用了菌株黑曲霉AB1.13(pyrG-)(W.van Hartingsveldt，I.E.Mattern，C.M.J.van Zeijl，P.H.Pouwels和C.A.M.J.J.van den Hondel(1987)Mol.Gen.Genet.206，71-75)和泡盛曲霉(菌株ATCC11358)。曲霉的转化按照本领域的技术进行(P.J.Punt和C.A.J.J.van denHondel(1992)，酶学方法，216，447-457)。

以Novozym 234处理菌丝而获得曲霉的原生质体。在一个无菌Erlenmeyer烧瓶中，将来自一个摇瓶的菌丝用15ml新鲜配制的经过滤除菌的裂解酶混合物Novozym234(Novo Nordisk)在OM培养基(0.27MCaCl₂，0.6MNaCl)中的溶液悬浮。重悬于酶溶液中的菌丝在30℃下以低速(80rpm)摇动培养1至3小时。培养过程中用显微镜观察原生质体的形成，通常1个小时后即可看到能自由移动的原生质体。获得了大量的自由移动的原生质体后，可在玻璃滤器中用Miracloth(Calbiochem)过滤将其与残留的菌丝分离开，并用STC培养基(1.2M山梨醇，50mM CaCl₂，35mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.5)小心洗涤。在一个无菌的样品管中将悬浮液离心(2000rpm，4℃，10分钟)分离原生质体并用STC培养基洗涤2次。在显微镜下以记数皿确定原生质体的浓度。将原生质体的浓度调节至1×10⁸原生质体/ml以用于原生质体的再生或转化。

以质粒pANLac1S和pANLac2S转化黑曲霉和泡盛曲霉的原生质体。两种质粒都含有作为选择标记的pyrG基因(编码乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)和amdS基因(编码乙酰胺酶)。在一个体积为12ml的保温管中，将0.1ml的原生质体的液体与10μg的质粒DNA混合，冰育25分钟。然后缓慢加入1.25ml的60％PEG4000溶液(60％PEG4000，50mM CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH7.5)，与转化混合物相混匀。20℃温育20分钟之后，以STC培养基加满反应管，混匀，4℃离心10分钟。沉淀重新悬浮，涂布于以山梨醇渗透压平衡的选择培养基平板上。平板在30℃培养7天后查看菌落生长状况。在几个实验中，对于黑曲霉的转化效率为1-5个转化子/μg的质粒DNA，对于泡盛曲霉的转化效率为0.1-0.5个转化子/μg质粒DNA。

将转化子转入含有乙酰胺的选择培养基平板上纯化。通过在含有丙烯酰胺的选择培养基上涂板，鉴定出带有高拷贝数的转化子。与乙酰胺相比，丙烯酰胺对于由amdS基因编码的乙酰胺酶是一个较弱的底物，只有带有高拷贝数的转化子才能帮助生长。为了鉴定出具有漆酶功能性表达的转化子，先将转化子涂布在含有glaA启动子表达的诱导物麦芽糊精的平板上，28℃生长2天后覆盖ABTS琼脂(0.1％ABTS，1％琼脂糖，在McIllvaine缓冲液中，pH4.5)，表达漆酶的转化子呈现绿色的菌晕。从在丙烯酰胺培养基上生长良好同时又在ABTS活性试验中呈阳性反应的转化子中制备孢子悬液。实施例8：Trametes versicolor漆酶Lac5.5在曲霉中的表达

在摇瓶水平上对漆酶Lac5.5在曲霉中的表达进行了研究。使用了下列的培养基：5％(w/v)的麦芽糊精溶液高压灭菌20分钟，然后向500ml的这种基本培养基中加入1ml 1M MgSO₄，0.5ml 1000×微量元素溶液，10ml 50×Asp A溶液和5ml 10％(w/v)酪蛋白氨基酸。1000×微量元素溶液含有如下成分：在80mlH₂O中溶解有2.2g ZnSO₄×7H₂O，1.1g H₃BO₃，0.5g MnCl₂×4H₂O，0.5g FeSO₄×7H₂O，0.17g CoCl₂×5H₂O，0.16g CuSO₄×5H₂O，0.15gNa₂MoO₄×2H₂O和5g EDTA。50×AspA溶液含有如下成分：在500mlH₂O中溶解有150g NaNO₃，13gKCl，38g KH₂PO₄，以10M KOH调节至pH5.5。还在培养基中加入CuSO₄×5H₂O至终浓度为0.5mM。

在表达实验中，以1×10⁶孢子/ml接种一个300ml的Erlenmeyer摇瓶内的50ml培养基。30℃下300rpm摇动培养。一周中每天取样品，确定培养上清中的漆酶活性。在60至100小时呈现出最大的漆酶活性，0.5-2.5U/ml。通过在pH4.5，37℃条件下，于McIllvaine缓冲液中与底物0.1mM ABTS的反应比色来确定漆酶活性。通过对0.2MNa₂HP₄溶液滴定0.1M柠檬酸溶液至pH4.5制备McIllvaine缓冲液。测量420nm处吸收的增长(ABTS在420nm的吸收系数是3.6×10⁴1×mol^-1×cm^-1)。1U的漆酶活性定义为每分钟转化1μmol的ABTS底物。实施例9：Trametes versicolor漆酶Lac5.5在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

使用了从Invitrogen商业购得的一个表达系统，及相关的表达载体(pPIC3和pPIC9)和巴斯德毕赤氏酵母菌株(GS115和KM71)。巴斯德毕赤氏酵母菌株GS115和KM71是组氨酸营养缺陷型。表达载体含有来自巴斯德毕赤氏酵母的醇氧化酶基因AOX1的启动子和终止子。Trametes versicolor漆酶Lac5.5的cDNA克隆到这两个遗传调控元件之间。载体pPIC9含有位于AOX1启动子下游的编码啤酒糖酵母的α-因子蛋白的信号序列的DNA序列，后面跟有一段编码识别序列Glu-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala(SEQ ID NO：15)的DNA短序列。载体上含有用于在E.coli中选择的氨苄青霉素抗性基因。载体上含有用于在巴斯德毕赤氏酵母中选择的来自巴斯德毕赤氏酵母的HIS4基因。A：带有漆酶Lac5.5信号序列的漆酶Lac5.5表达载体的构建

利用载体pLac5.5和引物K和L扩增漆酶基因。引物K和L的序列如下：引物K：5’-ACTCGAGAATTCACCATGACTGGGCTGCGTCTTCTTCC-3’(SEQ ID NO：16)引物L：5’-ACTAGAGCGGGCCGCCTATCACTGGTCGTCAGCGTCGAGGGC-3’(SEQ ID NO：17)

引物K含有一个EcoRI的切点序列(划线部分)，其后为编码漆酶Lac5.5信号序列的前7位氨基酸的DNA序列。引物L含有一个NotI的切点序列(划线部分)，其后为反相互补方向的，翻译终止密码子及编码漆酶Lac5.5信号序列的最后7位氨基酸的DNA序列。

PCR扩增按照本领域熟练技术人员所熟知的方法进行。在50μl的PCR体系中使用20ng的pLac5.5DNA，并含有0.5U的Vent聚合酶，1mM MgCl₂，0.2mM的各4种dNTP和各100pmol的引物K和L。所需PCR产物的特异扩增的其他条件是：94℃5分钟后，25个循环的94℃1分钟，55℃1分钟和72℃2分钟。得到所预计的1.5kb大小的PCR片段。该PCR片段经琼脂糖凝胶电泳纯化，用限制酶EcoRI和NotI酶切，乙醇沉淀并溶解于H₂O中。载体pPIC3用限制酶EcoRI和NotI酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化，分离，用碱性磷酸酶处理。之后用苯酚/氯仿(3∶1)抽提，乙醇沉淀。PCR扩增制备的漆酶Lac5.5的DNA片段与这样制备的pPIC3载体连接，转化E.coli Top 10F′细胞(Invitrogen)。从氨苄青霉素抗性克隆中分离出质粒DNA，用限制酶EcoRI和NotI酶切鉴定克隆的1.5kb插入序列。在12个所分析的克隆中9个呈阳性。这样制备的载体被称为pL512(图3)。B：带有啤酒糖酵母的α-因子的信号序列的漆酶Lac5.5表达载体的构建

利用质粒pLac5.5和引物L和M扩增漆酶基因。引物M的序列如下：引物M：5’-ACTCGAGAATTCGGGATCGGGCCTGTGCTCGACCTCACG-3’(SEQ ID NO：18)

引物M含有一个EcoRI的切点序列(划线部分)，其后为编码加工过的漆酶Lac5.5的假定的N-端的前9个氨基酸的DNA序列。加工过的漆酶Lac5.5的假定的N-端是从与其他漆酶序列的比较中推导出来的。

编码加工过的漆酶Lac5.5的DNA片段，按照如本实施例A部分中所述的方法，通过载体pLac5.5和引物L和M的PCR扩增而制备。载体pPIC9用EcoRI和NotI酶切，如本实施例A部分所述的制备载体pPIC3那样制备，并与PCR扩增制备的漆酶Lac5.5的DNA片段连接，转化E.coli Top 10F′细胞(Invitrogen)。从氨苄青霉素抗性克隆中分离出质粒DNA，用限制酶EcoRI和NotI酶切鉴定克隆的1.5kb的插入序列。在12个所分析的克隆中3个呈阳性。这样制备的载体被称为pL532(图4)。C：巴斯德毕赤氏酵母的转化

首先在5ml YPD培养基(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％右旋糖)中于30℃培养巴斯德毕赤氏酵母菌株GS115和KM71过夜。取0.2ml该预培养物接种到两个主培养基，每个为250ml的YPD培养基，再于30℃过夜培养至光密度(OD600nm)为1.3-1.5。然后将250ml的主培养物离心(1500×g5分钟)沉淀酵母细胞，用200ml H₂O洗涤两次，10ml 1M山梨醇洗涤1次，最后加入0.5ml 1M山梨醇。

用StuI或NsiI酶切，使载体pL512或pL532的质粒DNA线性化，乙醇沉淀并用水溶解至1μgDNA/μl的浓度。转化混合物中含有80μl巴斯德毕赤氏酵母细胞和10μg线性载体DNA。转化通过1500V，25μF和200Ohm的电穿孔(BioRad Gene Pulser)进行，放电时间约4.2ms。在转化混合物中加入1ml 1M山梨醇，冰育30分钟，然后取0.3ml液体涂板于不含组氨酸的MD培养板(1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％右旋糖，1.5％琼脂)上。30℃培养3-5天后出现转化子，在MD培养基平板划线培养两次纯化转化子。在MM指示培养基平板上鉴定漆酶产物，MM指示培养基含有1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇，1.5％琼脂，1mM ABTS和0.1mM CuSO₄。诱导物甲醇放于培养皿的盖子中，并每天更新，以确保通过挥发向菌落提供甲醇。漆酶产物经30℃培养2-3天后呈现出绿色晕轮。E：摇瓶中的表达

向50ml BMGY培养基(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，0.1M磷酸钾，pH6.0，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油)中接种一个产漆酶的巴斯德毕赤氏酵母转化子，在摇床上以300rpm于28℃培养48小时。预培养的细胞经离心(1500g，10分钟)分离，再悬于10ml主培养基中(MMY，1％酵母抽提物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，3％甲醇)。MMY培养基补充以0.5mM硫酸铜，主培养物在摇床上以300rpm在室温下继续培养。每隔24小时用甲醇(0.3ml/10ml培养基)补充主培养物。24小时后开始产生重组漆酶Lac5.5。主培养开始后190小时时产率可高达4U/ml。实施例10：重组漆酶Lac5.5的分离

如实施例8中所述，通过培养转化的曲霉菌株获得重组漆酶Lac5.5。含有漆酶Lac5.5的培养物上清通过交叉流过滤浓缩。为此使用了具有30kD排阻限制的Sartocon微型过滤器(Sartorius)。然后将浓缩的漆酶Lac5.5冻干并溶解于20mM磷酸钠，pH6.0。浓缩的重组漆酶Lac5.5的活性是18.6U/ml。

经交叉流过滤浓缩的漆酶对20mM bistris-HCl，pH6.5透析，之后测量的电导为1.5mS/cm。透析后的漆酶在一个DEAE-Sepharose(Pharmacia)柱上进行层析，柱子用20mM bistris-HCl(上样缓冲液)，pH6.5平衡。在此条件下，漆酶结合于DEAE-Sepharose。经上样缓冲液中0-0.5M NaCl线性梯度的洗脱，在0.15M NaCl浓度时回收获得漆酶活性。将DEAE-Sepharose柱的漆酶收集组分与20％饱和度的硫酸铵和pH4.5的醋酸钠(终浓度为20mM)混合，用醋酸调节pH至4.5。这样制备的漆酶组分在phenyl-Sepharose(Pharmacia)柱上进行层析，柱子用上样缓冲液(20mM醋酸钠，20％饱和度的硫酸铵，pH4.5)平衡。在此条件下，漆酶结合于phenyl-Sepharose。经pH4.5的20mM醋酸钠缓冲液中20至0％饱和度的硫酸铵线性梯度的洗脱，在16％硫酸铵饱和度时回收获得漆酶活性。漆酶组分对20mMbistris-HCl，pH6.5透析，通过结合于DEAE-Sepharose及0.3M NaCl的分步洗脱进行浓缩。0.3M NaCl的结合和洗脱均在20mM bistris-HCl，pH6.5中进行。基于起始物质的漆酶活性的产率为20％。对分离的漆酶作N-末端氨基酸测序分析。由此确定的序列为：

Gly Ile Gly Pro Val Leu Asp Leu Thr Ile Ser Arg Ala Val(SEQ IDNO：19)，它与cDNA序列以及同源比较而导出的成熟漆酶Lac5.5的N-末端相符合。实施例11重组漆酶Lac5.5的生物化学特性

对实施例8中所述的从曲霉中制备的重组漆酶Lac5.5的最适温度和pH及pH和温度稳定性进行了分析。在这些实验中，重组漆酶Lac5.5的缓冲液在Sephadex G25(Pharmacia，PD10柱)上先改变为McIllvaine缓冲液，pH4.5。A：最适pH

通过适当混合非缓冲的柠檬酸钠和磷酸钠溶液来制备图5所示的各种pH值的缓冲液。在37℃下的各种pH中确定重组漆酶Lac5.5的漆酶活性。如图5所表明的，漆酶Lac5.5具有的对于底物ABTS的最佳活性处在强酸范围。B：pH稳定性：

漆酶Lac5.5预先温育于pH3.0，4.5和6.0的McIllvaine缓冲液中(37℃)。经0，30，60和120分钟后分别取出等份样品，用pH4.5的McIllvaine缓冲液稀释，在37℃下确定漆酶活性。pH4.5和6.0的预处理对漆酶活性并无影响。在pH3.0下漆酶的半衰期为60至120分钟(图6)。C：最适温度：

在如图7所示的温度下对重组漆酶Lac5.5的漆酶活性进行了测定。通过在McIllvaine缓冲液，pH4.5中利用ABTS分析确定漆酶的活性。令人惊奇地，从中发现漆酶Lac5.5的最适温度为70℃。在50℃和80℃时测定的漆酶活性仍为最大活性的一半。D：温度稳定性：

漆酶Lac5.5预先温育于45℃，55℃和65℃，pH4.5的McIllvaine缓冲液中。经0，30，60和120分钟后分别取出等份样品，用pH4.5的McIllvaine缓冲液稀释，在37℃下确定漆酶活性。45℃的预处理对漆酶活性并无影响。经55℃预温育120分钟后的测定表明仍然具有80％的活性。在65℃下漆酶的半衰期为60分钟(图8)。序列表(1)一般信息：

(i)申请人：

(A)名称：电化学工业有限公司(国际)

(B)街道：Zielstattstrasse20

(C)城市：慕尼黑

(D)国家：德国

(F)邮政编码：D-81379

(G)电话：089 748440

(H)电传：089 74844350

(ii)发明名称：DNA序列，这些DNA序列的表达，这些DNA序列所编码的嗜热漆酶，及其应用

(iii)序列数目：19

(iv)计算机阅读格式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机类型：IBMPC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，

Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1572个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA至mRNA

(iii)假设：否

(iii)[sic]反义：否

(vi)原始来源：

(A)生物：Trametes versicolor

(B)菌株：TV-1

(vii)直接来源：

(B)克隆：pLac55

(xi)序列描述：SEQIDNO：1ATGACTGGGC TGCGTCTTCT TCCTTCCTTC GCGGCGTTGG CCGTGACCGT GTCTCTCGCG60CTCAACGCGT TGGCTGGGAT CGGGCCTGTG CTCGACCTCA CGATCTCCAA CGCGGTGGTG120TCGCCCGATG GCTTCTCTCG CGCGGCGGTC GTTGCGAACG ACCAGGCTCC CGGGCCTCTC180ATTACGGGCC AGATGGGCGA CCGTTTCCAG ATCAATGTGG TCAACAAGCT GTCGAACCAC240ACTATGCTCA AGTCGACCAG CATCCACTGG CACGGCTTCT TCCAGAAGGG TACGAACTGG300GCCGATGGCC CCGCGTTCGT GAACCAGTGC CCGATCGCGA CTGGTCACTC GTTCCTTTAC360GACTTCCAGG TCCCGGACCA GGCCGGGACG TTCTGGTACC ACAGCCATTT GTCTACCCAG420TACTGTGACG GGTTGAGAGG TCCTTTCGTC GTCTACGACC CGAACGACCC TCATGCCAGC480CTCTACGACG TGGACAACGA TGACACCGTC ATCACCCTCG CTGACTGGTA CCATACCGCT540GCCAAGCTTG GGCCGGCCTT CCCTCCTGGC TCTGATGCGA CGTTGATCAA TGGGCTCGGA600CGTACAGCGG CCACCCCCAA CGCGGATCTC GCTGTCATTA GTGTCACGCA CGGCAAGCGG660TACCGTTTCC GCCTGGTGTC GATGTCCTGC GACCCCGCGT ACACGTTCAG CATCGACGAC720CACTCGATGA CCATCATCGA GGCGGACTCA GTCAACACAA AGCCGCTCGA GGTCGACTCG780ATCCAGATCT TCGCCGGCCA GCGCTACTCG TTCGTGCTGG AGGCAAACCA GGACGTCGGC840AACTATTGGG TCCGCGCGGA CCCGCTGTTT GGCACGACGG GCTTCGATGG GGGTATCAAC900TCTGCGATCC TCCGGTACGA CACCGCGTCG CCGACCGAGC CGACCACGAC GCAGGCCACC960TCTACGAAGC CGTTGAAGGA GACGGACCTT GAGCCTCTCG CGTCGATGCC GGTGCCTGGC1020TCTGCTGTCT CGGGTGGTGT GGACAAGGCG ATTAACTTCG CTTTCAGCTT CAACGGGTCC1080AACTTCTTCA TCAACGGCGC GACCTTCCAG CCGCCCACCA CTCCCGTTCT GCTGCAGATC1140ATGAGCGGTG CCCAGGCTGC TAGCGACCTC CTCCCGTCCG GTGACGTCTA CGCCCTGCCG1200TCGGACTCGA CCATCGAGCT CTCGTTCCCC GCGACTACTG GTGCTCCCGG TGCCCCCCAC1260CCCTTCCACT TGCACGGTCA CACCTTCGCC GTTGTGCGCA GCGCGGGCAG CGCTGAGTAC1320AACTACGACA ACCCCATCTG GCGCGACGTC GTCAGCACTG GTACCCCTGC AGCGGGCGAT1380AACGTCACCA TTCGCTTCAG GACTGACAAC CCTGGCCCGT GGTTCCTCCA CTGCCACATC1440GACTTCCACT TGGAGGCCGG CTTCGCCGTG GTCATGGCTG AAGACATCCC CGACACCAAG1500GCCGACAACC CTGTTCCTCA GGCGTGGTCA GACCTTTGCC CCATCTACGA CGCCCTCGAC1560GCTGACGACC AG 1572(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1572个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA至mRNA

(iii)假设：否

(iii)[sic]反义：否

(vi)原始来源：

(A)生物：Trametes versicolor

(B)菌株：TV-1

(vii)直接来源：

(B)克隆：pLac56

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2ATGACTGGGC TGCGTCTTCT TCCTTCCTTC GCGGCGTTGG CCGTGACCGT GTCGCTCGCG60CTCAACGCGT TGGCCGGGAT CGGGCCCGTG CTCGACCTTA CGATCTCCAA TGCGGTTGTT120TCGCCCGATG GCTTCTCTCG CGCGGCGGTC GTCGCGAACG ACCAGGCTCC CGGGCCTCTC180ATCACGGGCC AGATGGGCGA CCGCTTCCAG ATCAATGTGG TCAACAAGCT GTCGAACCAC240ACCATGCTTA AATCGACCAG CATCCACTGG CACGGCTTCT TCCAGAAGGG CACGAACTGG300GCGGACGGCC CTGCGTTCGT GAACCAATGC CCGATTGCGA CGGGCCACTC GTTCCTTTAC360GACTTCCAGG TCCCGGACCA GGCCGGGACG TTCTGGTACC ACAGCCATCT GTCTACTCAG420TACTGCGATG GCTTGAGGGG TCCGTTCGTC GTCTACGACC CGAATGACCC TCATGCCAGT480CTCTACGATG TGGACAACGA TGACACCGTC ATCACCCTCG CCGATTGGTA CCATACTGCT540GCCAAGCTTG GGCCGGCCTT CCCTCCTGGC TCTGATGCGA CGTTGATCAA TGGGCTCGGA600CGTACAGCGG CCACCCCCAA CGCGGACCTC GCTGTCATCA GCGTCACGCA CGGCAAGCGG660TACCGTTTCC GCCTGGTGTC GATGTCCTGC GACCCCGCGT ACACCTTCAG CATCGACGAC720CACTCGATGA CCATCATCGA GGCGGACTCG GTCAACACGA AGCCGCTCGA GGTCGACTCG780ATCCAGATCT TCGCCGGCCA GCGCTACTCG TTCGTGCTGG AGGCAAACCA GGACGTCGGC840AACTATTGGG TCCGCGCGGA CCCGCTGTTT GGCACGACGG GCTTCGATGG GGGTATCAAC900TCTGCGATCC TCCGGTACGA CACCGCGTCG CCGACCGAGC CGACCACGAC GCAGGCCACC960TCTACGAAGC CGTTGAAGGA GACGGACCTT GAGCCTCTCG CGTCGATGCC GGTGCCTGGC1020TCTGCTGTGT CGGGTGGTGT GGACAAGGCG ATTAACTTCG CTTTCAGCTT CAACGGGTCC1080AACTTCTTCA TCAACGGCGC GACCTTCCAG CCGCCCACCA CTCCCGTTCT GCTGCAGATC1140ATGAGCGGTG CCCAGGCTGC TAGCGACCTC CTCCCGTCCG GTGACGTCTA CGCCCTGCCG1200TCGGACTCGA CCATCGAGCT CTCGTTCCCC GCGACTACTG GTGCTCCCGG TGCCCCCCAC1260CCCTTCCACT TGCACGGTCA CACCTTCGCC GTTGTGCGCA GCGCGGGCAG CGCTGAGTAC1320AACTACGACA ACCCCATCTG GCGCGACGTC GTCAGCACTG GTACCCCTGC AGCGGGCGAT1380AACGTCACCA TTCGCTTCAG GACTGACAAC CCTGGCCCGT GGTTCCTCCA CTGCCACATC1440GACTTCCACT TGGAGGCCGG CTTCGCCGTG GTCATGGCTG AAGACATCCC CGACACCAAG1500GCCGACAACC CTGTTCCTCA GGCGTGGTCA GACCTTTGCC CCATCTACGA CGCCCTCGAC1560GCTGACGACC AG 1572(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：524个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)假设：是

(vi)原始来源：

(A)生物：Trametes versicolor

(B)菌株：TV-1

(ix)特征：

(A)名称/关键：蛋白质

(B)位置：1..524

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3Met Thr Gly Leu Arg Leu Leu Pro Ser Phe Ala Ala Leu Ala Val Thr1 5 10 15Val Ser Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ala Gly Ile Gly Pro Val Leu Asp

20 25 30Leu Thr Ile Ser Asn Ala Val Val Ser Pro Asp Gly Phe Ser Arg Ala

35 40 45Ala Val Val Ala Asn Asp Gln Ala Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Gln50 55 60Met Gly Asp Arg Phe Gln Ile Asn Val Val Asn Lys Leu Ser Asn His65 70 75 80Thr Met Leu Lys Ser Thr Ser Ile His Trp His Gly Phe Phe Gln Lys

85 90 95Gly Thr Asn Trp Ala Asp Gly Pro Ala Phe Val Asn Gln Cys Pro Ile

100 105 110Ala Thr Gly His Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Gln Val Pro Asp Gln Ala

115 120 125Gly Thr Phe Trp Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly130 135 140Leu Arg Gly Pro Phe Val Val Tyr Asp Pro Asn Asp Pro His Ala Ser145 150 155 160Leu Tyr Asp Val Asp Asn Asp Asp Thr Val Ile Thr Leu Ala Asp Trp

165 170 175Tyr His Thr Ala Ala Lys Leu Gly Pro Ala Phe Pro Pro Gly Ser Asp

180 185 190Ala Thr Leu Ile Asn Gly Leu Gly Arg Thr Ala Ala Thr Pro Asn Ala

195 200 205Asp Leu Ala Val Ile Ser Val Thr His Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg210 215 220Leu Val Ser Met Ser Cys Asp Pro Ala Tyr Thr Phe Ser Ile Asp Asp225 230 235 240His Ser Met Thr Ile Ile Glu Ala Asp Ser Val Asn Thr Lys Pro Leu

245 250 255Glu Val Asp Ser Ile Gln Ile Phe Ala Gly Gln Arg Tyr Ser Phe Val

260 265 270Leu Glu Ala Asn Gln Asp Val Gly Asn Tyr Trp Val Arg Ala Asp Pro

275 280 285Leu Phe Gly Thr Thr Gly Phe Asp Gly Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu290 295 300Arg Tyr Asp Thr Ala Ser Pro Thr Glu Pro Thr Thr Thr Gln Ala Thr305 310 315 320Ser Thr Lys Pro Leu Lys Glu Thr Asp Leu Glu Pro Leu Ala Ser Met

325 330 335Pro Val Pro Gly Ser Ala Val Ser Gly Gly Val Asp Lys Ala Ile Asn

340 345 350Phe Ala Phe Ser Phe Asn Gly Ser Asn Phe Phe Ile Asn Gly Ala Thr

355 360 365Phe Gln Pro Pro Thr Thr Pro Val Leu Leu Gln Ile Met Ser Gly Ala370 375 380Gln Ala Ala Ser Asp Leu Leu Pro Ser Gly Asp Val Tyr Ala Leu Pro385 390 395 400Ser Asp Ser Thr Ile Glu Leu Ser Phe Pro Ala Thr Thr Gly Ala Pro

405 410 415Gly Ala Pro His Pro Phe His Leu His Gly His Thr Phe Ala Val Val

420 425 430Arg Ser Ala Gly Ser Ala Glu Tyr Asn Tyr Asp Asn Pro Ile Trp Arg

435 440 445Asp Val Val Ser Thr Gly Thr Pro Ala Ala Gly Asp Asn Val Thr Ile450 455 460Arg Phe Arg Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile465 470 475 480Asp Phe His Leu Glu Ala Gly Phe Ala Val Val Met Ala Glu Asp Ile

485 490 495Pro Asp Thr Lys Ala Asp Asn Pro Val Pro Gln Ala Trp Ser Asp Leu

500 505 510Cys Pro Ile Tyr Asp Ala Leu Asp Ala Asp Asp Gln

515 520(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：是

(iii)[sic]反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4TGGCAYGGNT TYTTYCA 17(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：14个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：是

(iii)[sic]反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5TCDATRTGRC ARTG 14(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：是

(iii)[sic]反义：否

(xi)序列描述：SEQ IDNO：6ATTCAGGGAT CCTGGTAYCA YWSNCAY 27(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：是

(iii)[sic]反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7ATACGAGGAT CCRTGNCCRT GNARRTG 27(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：3284个核苷酸

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假设：否

(iii)[sic]反义：否

(vi)原始来源：

(A)生物：Trametes versicolor

(B)菌株：TV-1

(vii)直接来源：

(B)克隆：plac56chr

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8TTGGAATGGG CCCGCCGGTG TCGATCGCAA ACAGGTGAGT TCAGTACTAG CCCATCAGCG60CAGCAGCATT TGCGGCGAAG AAGTGTCCGC CCCACGCTCA TCACCCAGCG CCCTTCTCGA120CATCGGAACC GCCGCAACAC AGGGAAGAGG CCATTTCGCC CATCCAAGGC TCGGGGATCT180TCTCACGACG CGAGGGCATT TCGCGCGAGC GTCGCAGCCG GTGCGCCGAG GCTGCATGAT240CTGTGCGGCT CCTGCGCGTA TGCCGCTCGG GTCGCCGAGA CACAGCGAGA CATCTGCAGC300CGGGGCGGCG CGCAACCAGC TCGGCTGTTT GGAGTGCGTC GATGCAACGC GTCGACGTCC360ATCGGGGACG GCGCGTGGCT TGGCACGCGT AGCACCGACG CGCACTATAA AGGCGATGCG420GCAGAGAAGA GGCGGAGCAC CACGTTCAGT CCCTTCCTTG GATTCCGGGC AGCTTACTCC480TTCTCGCCTC TCTCTGCCTC CTTTCCTTCG GGCTTCTACT CTTCTTTTCT ATTTCGCTTC540TGTTCGAGGG TAGAACACAG AACACTATGA CTGGGCTGCG TCTTCTTCCT TCCTTCGCGG600CGTTGGCCGT GACCGTGTCG CTCGCGCTCA ACGCGTTGGC CGGGATCGGG CCCGTGCTCG660ACCTTACGAT CTCCAATGCG GTTGTTTCGC CCGATGGCTT CTCTCGCGCG GCGGTCGTCG720CGAACGACCA GGCTCCCGGG CCTCTCATCA CGGGCCAGAT GGGCGACCGC TTCCAGATCA780ATGTGGTCAA CAAGCTGTCG AACCACACCA TGCTTAAATC GACCAGCATC GTGAGTATTC840AATCTGGGCG TGGGGGTACG GGCTGCACTG ACGCAAGTAC ACGCTTCGCA GCACTGGCAC900GGCTTCTTCC AGAAGGGCAC GAACTGGGCG GACGGCCCTG CGTTCGTGAA CCAATGCCCG960ATTGCGACGG GCCACTCGTT CCTTTACGAC TTCCAGGTCC CGGACCAGGC CGGTATGTGA1020TCACGGAAGG TGTGCACGAA CCCAGCACTG ACGGTCATGT AGGGACGTTC TGGTACCACA1080GCCATCTGTC TACTCAGTAC TGCGATGGCT TGAGGGGTCC GTTCGTCGTC TACGACCCGA1140ATGACCCTCA TGCCAGTCTC TACGATGTGG ACAACGGTAA GCAGTTCAGA TTGCGAATCC1200TTGGCGGTCT ATTGACATCC CGGCCAGATG ACACCGTCAT CACCCTCGCC GATTGGTACC1260ATACTGCTGC CAAGCTTGGG CCGGCCTTCC CGTAAGTTGG ATTGTCAGTC TGTCTGTTCT1320CTACTTACTA ATCACGGGCT GCAGTCCTGG CTCTGATGCG ACGTTGATCA ATGGGCTCGG1380ACGTACAGCG GCCACCCCCA ACGCGGACCT CGCTGTCATC AGCGTCACGC ACGGCAAGCG1440GTAAGAGCGG CTGTACCTTC CTCTTGCTCG CAGCTGCTCA AACTTTATGG TTTATAGGTA1500CCGTTTCCGC CTGGTGTCGA TGTCCTGCGA CCCCGCGTAC ACCTTCAGCA TCGACGACCA1560CTCGATGACC ATCATCGAGG CGGACTCGGT CAACACGAAG CCGCTCGAGG TCGACTCGAT1620CCAGATCTTC GCCGGCCAGC GCTACTCGTT CGTGCTGGAG GCAAACCAGG ACGTCGGCAA1680CTATTGGGTC CGCGCGGACC CGCTGTTTGG CACGACGGGC TTCGATGGGG GTATCAACTC1740TGCGATCCTC CGGTACGACA CCGCGTCGCC GACCGAGCCG ACCACGACGC AGGCCACCTC1800TACGAAGCCG TTGAAGGAGA CGGACCTTGA GCCTCTCGCG TCGATGCCGG TGGTAAGTCT1860GACTAGCACT TCATCTTTGA TGGTATGCTC ATGCAACTCT CCAGCCTGGC TCTGCTGTGT1920CGGGTGGTGT GGACAAGGCG ATTAACTTCG CTTTCAGCTT CGTACGTCCA ACTCACGATT1980TCCCCCTTGA GATTTATATT GATGGCTCCA TTGACGGCTC CTCATAGAAC GGGTCCAACT2040TCTTCATCAA CGGCGCGACC TTCCAGCCGC CCACCACTCC CGTTCTGCTG CAGATCATGA2100GCGGTGCCCA GGCTGCTAGC GACCTCCTCC CGTCCGGTGA CGTCTACGCC CTGCCGTCGG2160ACTCGACCAT CGAGCTCTCG TTCCCCGCGA CTACTGGTGC TCCCGGTGCC CCCCACCCCT2220TCCACTTGCA CGGTGTAAGT TGTCATCTCA ATGTTCCGTT TGGGCCCCGA TACTAACGGC2280TAGATAGCAC ACCTTCGCCG TTGTGCGCAG CGCGGGCAGC GCTGAGTACA ACTACGACAA2340CCCCATCTGG CGCGACGTCG TCAGCACTGG TACCCCTGCA GCGGGCGATA ACGTCACCAT2400TCGCTTCAGG GTGAGTTGCT ATCATTATCC CCTCCTGTGT AATCGGTCGC TGACAGTCCT2460GCAGACTGAC AACCCTGGCC CGTGGTTCCT CCACTGCCAC ATCGACTTCC ACTTGGAGGC2520CGGCTTCGCC GTGGTCATGG CTGAAGACAT CCCCGACACC AAGGCCGACA ACCCTGTTCC2580TCGTGAGTAT TACCCCCCAA TCCCGTCAAG GCGCGCACTA ACAGGGTATT GCTGCAGAGG2640CGTGGTCAGA CCTTTGCCCC ATCTACGACG CCCTCGACGC TGACGACCAG TGAACACGCC2700TCACGAGATC GTCAACCATT TCCTCAATCA TTGACTTACC GACTTGCTAT TTCTAACACG2760CTATTTGCGA ACCCCCGCTC TCCCCTCTCT CACACTACGG TCCCTTCGTG AACATGGACT2820TGCATGGACT TTGGATTGTA GAAAGTTTAC ACAGCTGTAT AGTCGAATTA TCCCCGTAAT2880GCATGGTAGT GCCGCTGGCC TTTACCTCAA TCATTGTTAT CATGATATGG CCATCATAAA2940CATCACTGAC ATCTACTAAT CTGCTGTTAG TTTTGGGACC TCAAGAAGAT AAACGCCCGT3000CTACCACGAT GTGACGCGCG CGATACGTGA ATGTGACTGA TCGCGTTCCA TTATTCAAAA3060CGCGTCGGCT GGCGGCCAGG CCAAGTTGCT CCTCTCTCTC CGACGACGAC CACCCCTGGC3120TCTCTTACCC ACCTTCTCTG CACCATGACG GCAGACTACA GACTACAGTC TCTCGACGAT3180CCGACGGCGG TCATCCAAGA GCTCTACCGC GCCCATCCAG ACCCGAACGG TTTCCCCCGC3240CTCGTTGCTG AGCACTTCCA AAAGCTCTTC GAGAACCGAA CATG 3284(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：是

(iii)[sic]反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9CCGGAATTCA TGACTGGGCT GCGTCTCCTT CCTTCCTTC 39(2)SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：是

(iii)[sic]反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10GAGAGGCCCG GGAGCCTGG 19(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：是

(iii)[sic]反义：否

(xi)序列描述：SEQ IDNO：11GCTGAATTCG AAGACATCCC CGACACCAAGG 31(2)SEQIDNO：12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：42个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：是

(iii)[sic]反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12TGCTCTAGAA AGCTTAAGTT CACTGGTCGT CAGCGTCGAG GG 42(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：43个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：是

(iii)[sic]反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13CCGGAATTCG ATATCCAAGC GCGGGATCGG GCCTGTGCTC GAC 43(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：4个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：是

(v)片段类型：内部

(vi)原始来源：

(A)生物：黑曲霉

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14Ile Ser Lys Arg1(2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：7个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：是

(v)片段类型：内部

(vi)原始来源：

(A)生物：啤酒糖酵母

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15

Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala

1 5(2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：38个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：是

(iii)[sic]反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16ACTCGAGAAT TCACCATGAC TGGGCTGCGT CTTCTTCC 38(2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：41个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：是

(iii)[sic]反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17ACTAGAGCGG CCGCCTATCA CTGGTCGTCA GCGTCGAGGG C 41(2)SEQ ID NO：18的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：是

(iii)[sic]反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18ACTCGAGAAT TCGGGATCGG GCCTGTGCTC GACCTCACG 39(2)SEQ IDNO：19的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：14个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：否

(v)片段类型：N末端

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19Gly Ile Gly Pro Val Leu Asp Leu Thr Ile Ser Aro Ala Val1 5 10

Claims

1.一种编码具有漆酶活性的蛋白质的DNA序列，其含有DNA序列SEQ ID NO：1的第76位直至且包括第1572位或者SEQ ID NO：2的第76位直至且包括第1572位的序列，或者与所说的DNA序列具有80％以上的同源性的DNA序列。

2.含有如权利要求1所述的DNA序列的表达载体。

3.如权利要求2中所述的表达载体，其上另外还含有：一个在宿主生物中调节漆酶基因表达的启动子，和适合于该宿主生物且功能性地连接在如权利要求1所述的DNA序列3′末端的转录终止信号。

4.如权利要求3所述的表达载体，其中的启动子选自tac启动子、枯草杆菌蛋白酶启动子、GAL启动子、TAKA淀粉酶启动子、多角蛋白启动子、葡糖淀粉酶启动子、GAPDH启动子和醇氧化酶启动子。

5.如权利要求3或4所述的表达载体，其中另外还含有一个N-末端信号序列。

6.如权利要求5所述的表达载体，其中的N-末端序列是存在于漆酶基因的天然信号序列，或者是选自下列一组分泌蛋白的信号序列：Klebsiella oxytoca的α-环糊精葡糖转移酶、枯草杆菌的枯草杆菌蛋白酶、啤酒糖酵母的α-因子、巴斯德毕赤氏酵母的酸性磷酸酶、黑曲霉的α-淀粉酶、或者黑曲霉或泡盛曲霉的葡糖淀粉酶。

7.如权利要求5所述的表达载体，其中一个分泌蛋白的基因或者一个蛋白的分泌片段的基因区段有功能地与该漆酶基因相连接。

8.含有如权利要求1所述的DNA序列或者如权利要求2至7任一项所述的表达载体的微生物菌株。

9.含有蛋白质序列SEQ ID NO：3的蛋白质。

10.如权利要求9所述的蛋白质在纸浆的去木质化、高分子量聚集物的解聚、废纸的去墨渍、废水尤其是纸浆漂白后含木质素的废水中的芳香化合物的聚合、染料的氧化、或者染料的活化以形成颜料中的应用及该蛋白质在有机合成中芳香化合物的偶联反应或者芳香侧链的氧化作用中的应用。