CN1530442A

CN1530442A - 微生物木糖葡聚糖内切转糖基酶(xet)

Info

Publication number: CN1530442A
Application number: CNA2004100016523A
Authority: CN
Inventors: R��I��ɭ; R·I·尼尔森
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1997-02-26
Filing date: 1998-02-26
Publication date: 2004-09-22
Anticipated expiration: 2018-02-26
Also published as: EP1005536B1; CN1300309C; DE69827500T2; JP4472787B2; EP1005536A1; CN1156570C; DE69827500D1; JP2002514917A; US6448056B1; AU6205198A; CN1248287A; WO1998038288A1; ATE282086T1

Abstract

通过筛选分析，发现了大批在系统发生上比较分散的微生物能产生XET活性。因此，本发明涉及一种能够通过培养表达XET的一种微生物而生产的木糖葡聚糖内切转糖基酶制剂。

Description

微生物木糖葡聚糖内切转糖基酶(XET)

发明领域

本发明涉及微生物木糖葡聚糖内切转糖基酶(xyloglucanendotransglycosylase，XET)，其生产方法和用途。

发明背景

木糖葡聚糖内切转糖基酶(XET)是一种已知来自于植物的酶。就我们所知，还没有报导过来源于微生物的XET。

Stephen C.Fry等在生物化学杂志(1992年，282，821-828页)中暗示XET负责切割和再连接微丝间(intermicrofibrillar)木糖葡聚糖链，因此XET能导致植物细胞膨胀所需要的细胞壁松弛。

XET已被提议用于调控植物形态(参见EP562836中21、27-28页)。

人们相信XET存在于所有植物，特别是所有的陆生植物中。已从双子叶植物、单子叶植物，具体说是禾本科单子叶植物和百合科单子叶植物，以及苔类和藓类植物中提取到了XET(文献可参考生物化学杂志(1992)282，823页)。

在共同未决的专利申请PCT/DK96/00538(WO97/23683)中，我们已指出，用XET酶处理后，纤维素材料可以获得改善的强度特性和/或提高的保形性能和/或更好的抗皱性能。

XET酶有一些很有趣的应用，因此本发明的一个目的是提供可用于诸如以上用途的微生物来源的木糖葡聚糖内切转糖基酶。微生物来源的木糖葡聚糖内切转糖基酶应该具有易于大量生产的优势。

发明概述

通过筛选分析发现了大批在系统发生上比较分散的微生物能产生XET活性。

因此，本发明涉及一种能够由培养表达XET的微生物而得到的木糖葡聚糖内切转糖基酶制剂；具体说本发明涉及：

一种木糖葡聚糖内切转糖基酶的生产方法，它包括：

a)在适宜的营养培养基中，有利于XET酶产生的条件下，培养表达微生物XET的微生物，以及

b)随后从营养培养基中纯化XET酶。

另外，本发明还涉及本发明的XET制剂用于处理纤维素材料的用途，同时涉及微生物XET制剂。

附图简述

结合以下附图进一步阐述本发明，其中

图1显示根据实施例5得到的Dichotomocladium hesseltinei，Tiarosporella phaseolina和淡黑假黑盘菌(Pseudoplectanianigrella)的XET活性的pH曲线(△：Tiarosporella phaseolina；□：淡黑假黑盘菌；◆：Dichotomocladium hesseltinei)。

图2显示根据实施例5得到的木糖葡聚糖酶活性的pH曲线(△：Tiarosporella phaseolina；□：淡黑假黑盘菌；◆：Dichotomocladium hesseltinei)。

发明详述

本发明涉及一种能够由微生物培养而得到的木糖葡聚糖内切转糖基酶制剂。

在本申请中表明XET可由真菌和细菌产生，预计酵母也能产生XET。

可用“XET试纸”鉴定产XET的微生物。这种“XET试纸”在共同未决的专利申请PCT/GB96/02351(WO97/11193)中有述；它是在标记了的寡糖中浸泡过的涂覆木糖葡聚糖的试纸。

通过以下方法制备标记的寡糖、浸透了木糖葡聚糖的试纸，并进行点印迹检测XET活性。

标记寡糖的制备

将还原性寡糖4-O-[4-O-[4-O-[6-O-α-D-吡喃木糖-β-D-吡喃葡萄糖]-6-O-(2-O-β-D-吡喃半乳糖)-α-D-吡喃木糖-β-D-吡喃葡萄糖]-6-O-(2-O-β-D-吡喃半乳糖)-α-D-吡喃木糖-β-D-吡喃葡萄糖]-D-葡萄糖(‘XLLG’)(1克)溶于25ml含1克氰氢硼化钠(NaCNBH₃)的碳酸氢铵饱和水溶液中，25℃置暗处，保持7天进行还原性胺化。干燥除去碳酸氢铵，纯化XLLG的(水合茚三酮反应性)胺化衍生物(例如通过凝胶过滤层析或阳离子交换层析)。产物应是寡糖基-1-氨基-1-脱氧多羟基醇(deoxyalditol)，即XLLG的还原性末端D-葡萄糖部分被1-氨基-1-脱氧-D-葡糖醇取代了的衍生物。

将寡糖基-1-氨基-1-脱氧多羟基醇(50mg)溶于3ml 3％硼砂(四硼酸二钠；pH＝9.0-9.5)中，搅拌下逐渐加入0.75ml含有10mg丽丝胺若丹明磺酰氯(购自Molecular Probes Inc.，USA)的干二甲基甲酰胺(DMF)新鲜配制的溶液，混合溶液置暗处过夜。再加入0.75ml含10mg丽丝胺若丹明磺酰氯的DMF，混合溶液再放置8小时。经凝胶过滤层析，然后在C18-硅胶柱子上进行反相层析，纯化鲜粉色的寡糖基-1-氨基-1-脱氧多羟基醇-丽丝胺若丹明偶联物(XLLGol-SR)。用水清洗后一个柱子后，采用甲醇梯度，在大约50％甲醇中洗脱下XLLGol-SR。

制备浸透木糖葡聚糖的试纸

用1％木糖葡聚糖水溶液湿润Whatman 1号滤纸，将滤纸干燥。将XLLGo1-SR制剂稀释在足量的75％丙酮水溶液中，使580nm处的光吸收值(A₅₈₀)为0.2；然后将涂覆了木糖葡聚糖的Whatman 1号滤纸浸在该溶液中，并再次干燥；产品称为XET试纸。用非水性粘合剂将适当大小的XET试纸片(例如72×108mm)粘在非吸收性介质(如透明醋酸纤维素纸)上。

XET活性的点印迹检测

i)将待进行XET活性检测的液滴用吸液管点在一张XET试纸的标记位置上。如果斑点是4μl，样品之间的距离可以是9mm(圆心到圆心，即象在标准的96孔检测盘中的式样)。

ii)然后迅速(在斑点干燥以前)将XET试纸夹在两张塑料(例如象空中投影仪中所用的醋酸纤维素胶片)之间，进行保温(例如20℃，1小时)。

iii)将保温过的XET试纸及其塑料底衬放置(试纸侧朝下)在含有150ml溶剂(例如现配的乙醇/蚁酸/水(体积比1∶1∶1))的盘子中，溶剂能将未反应的XLLGol-SR从试纸上除去，由于XET催化的转糖基作用而结合至木糖葡聚糖的XLLGol-SR则不会被除去。这时可将试纸与塑料底衬分离。

iv)将试纸在流水中漂洗5分钟，然后在大约100ml丙酮中洗5分钟，再彻底干燥。如果需要，可以在80℃烤箱中烤5分钟，以加快干燥处理。

v)然后在短波长紫外灯(例如，254nm发射光；佩带适当的眼睛和皮肤保护装置)下检查试纸。粉色(橙色荧光)斑点指示有活性XET，可以用扫描荧光分光计进行定量测定。

XET酶

我们已经发现，具有XET活性的微生物酶可以是转糖基酶(意味着它们缺少水解活性或只有很低的水解活性)，或者它们能同时催化木糖葡聚糖的转糖基作用和水解。

从植物中得到的同时具有转糖基活性和水解活性的XET酶也有描述(参见植物生理学植物分子生物学年度综述，1995，46：509页)。

系统分类

本文所用的系统分类主要根据NIH数据库(Entrez，versionspring 1996)中使用的系统(可从全球通网络( http：//www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin/ef/entrezTAX)得到)。

对于Entrez数据库未收录的微生物分类，使用了以下常用并在世界范围内接受的参考书：

对子囊菌纲(Ascomycetes)，参考Eriksson，O.E.&Hawksworth，D.L.：Systema Ascomycetum，12卷(1993)。

对担子菌纲(Basidiomycetes)，参考Julich，W.：Higher Taxaof Basidiomycetes，Bibliotheca Mycologia，85，485页(1981).

对接合菌纲(Zygomycetes)，参考O’Donnell，K.：Zygomycetesin culture，University of Georgia，US，257页(1979).

常用真菌参考书：

Hawksworth，D.L.，Kirk，P.M.Sutton，B.C.和Pegler，D.N.：真菌词典，国际真菌学会，616页(1995)；

Von Arx，J.A.：培养中会形成孢子的各个真菌属(The generaof fungi sporulating in culture)，424页(1981).

优选真菌

本发明的一个优选实施方案中，XET制剂是通过培养真菌，具体说是担子菌(Basidiomycota)，接合菌(Zygomycota)，子囊菌(Ascomycota)或有丝分裂孢子真菌(Mitosporic fugus)生产的。

优选的担子菌菌株是属于革盖菌目(Coriolales)，裂褶菌目(Schizophyllales)，韧革菌目(Stereales)或Xenasmatales各目的层菌纲(Hymenomycetes)菌株；具体说是属于革盖菌科(Coriolaceae)，伏革菌科(Corticiaceae)，裂褶菌科(Schizophyllaceae)，韧革菌科(Stereaceae)或Tubulicrinaceae各科的菌株。优选以下各属：栓菌属(Trametes)，伏革菌属(Corticium)，裂褶菌属(Schizophyllum)或Tubulicrinis。优选的种是：毛栓菌(Trametes hirsuta)、玫瑰色伏革菌(Corticium roseum)、裂褶菌属之种、毛韧革菌(Stereumhirsutum)或Tubulicrinis subulatus。

优选的子囊菌菌株是属于腔菌纲(Loculoascomycetes)，盘菌纲(Discomycetes)，核菌纲(Pyrenomycetes)或不整囊菌纲(Plectmycetes)的菌株，优选属于座囊菌目(Dothideales)，斑痣盘菌目(Rhytismatales)，盘菌目(Pezizales)，锤舌菌目(Leotiales)，炭角菌目(Xylariales)，肉座菌目(Hypocreales)，海壳目(Halosphaeriales)，黑痣菌目(Phyllachorales)，腐皮壳菌目(Diaporthales)和散囊菌目(Eurotiales)各目的菌株。

优选的菌株是属于葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)，小穴壳菌科(Dothioraceae)，球腔菌科(Mycosphaerellaceae)，毛筒壳科(Tubeuffiaceae)，格孢腔菌科(Pleosporeceae)，小球腔菌科(Leptosphaeriaceae)，斑痣盘菌科(Rhytismataceae)，肉盘菌科(Sarcosomataceae)，火丝菌科(Pyronemataceae)，粪盘菌科(Ascobolaceae)，核盘菌科(Sclerotiniaceae)，圆孔壳科(Amphisphaeriaceae)，炭角菌科(Xylariaceae)，肉座菌科(Hypocreaceae)，海壳科(Halosphaeriaceae)，黑痣菌科(Phyllachoraceae)，黑腐皮壳科(Valsaceae)，黑盘孢科(Melanconidaceae)，和发菌科(Trichocomataceae)各科的菌株；特别是属于二孢属(Diplodia)，Plowrightia，叶点霉属(Phyllosticta)，壳针孢属(Septoria)，毛筒壳属(Tubeufia)，链格孢属(Alternaria)，盾壳霉属(Coniothyrium)，茎点霉属(Phoma)，Embellisia，Tiarosporella，Galiella，假黑盘菌属(Pseudoplectania)，火丝菌属(Pyronema)，珠头霉属(Oedocephalum)，葡萄孢属(Botrytis)，外壳孢属(Aposphaeria)，盘多毛孢属(Pestalotia)，多毛菌属(Pestalotiopsis)，孔座壳属(Poronia)，Nodulisporium，炭角菌属(Xylaria)，镰孢属(Fusarium)，轮枝孢属(Verticillium)，周刺座霉属(Volutella)，Chaetapiospora，Lulwothia，刺盘孢属(Colletotrichum)，壳囊孢属(Cytospora)，座盘孢属(Discula)，拟茎点霉属(Phomopsis)，棒盘孢属(Coryneum)，Seimatosporium，曲霉属(Aspergillus)，散囊菌属(Eurotium)，正青霉属(Eupenicillium)，青霉属(Penicillium)，Petromyces和踝节菌属(Talaromyces)各属的菌株。

优选的种是棉色二孢(Diplodia gossypina)Plowrightiaribesia；叶点霉属之种；壳针孢属之种Tubeufiaamazonensis.；链格孢属之种；Embellisia hyacinthi；新茎点霉(Phoma neoloba)；热带茎点霉(Phoma tropica)；盾壳霉属之种；橄榄色盾壳霉(Coniothyrium olivaceoum)；当克盾壳霉(Coniothyrium dunckii)；Tiarosporella sp.；Tiarosporellaphaseolina；Galiella celebica；淡黑假黑盘菌(Pseudoplectanianigrella)；砖火丝菌(Pyronema domesticum)；珠头霉属之种；灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)；外壳孢属之种；盘多毛孢属之种；多毛菌属之种；点孔座壳(Poronia punctata)；炭角菌属之种；Nodulisporium sp.；腐皮镰孢(Fusarium solani)；轮枝孢属之种；巴西周刺座霉(Volutella buxi)；Chaetapiosporarhododendri；Lulworthia uniseptata；棘孢刺盘孢(Colletotrichum aculatum)；Colletotrichum crassipes；壳囊孢属之种；座盘孢属之种(Discula sp.)；Phomopsis ilicis；Phomopsis cirsii；栗棒盘孢(Coryneum castaneicola)；Seimatosporium lichenicola；塔木里氏曲霉(Aspergillustamarii)；Eurotium chevalieri；爪哇正青霉(Eupenicilliumjavanicum)；胶囊青霉(Penicillium capsulatum)；奥尔森氏青霉(Penicillium olsonii)；嗜松青霉(Penicillium pinophilum)；娄格法尔特氏青霉(Penicillium roqueforti)；意大利青霉(Penicillium italicum)；变灰青霉(Penicillium canescens)；疣孢青霉(Penicillium verruculosum)；Petromyces alliaceus和黄色踝节菌(Talaromyces flavus)各种的菌株.

有用的接合菌菌株是属于毛霉目(Mucorales)的菌株，优选属于丝枝霉科(Chaetocladiaceae)和毛霉科(Mucoraceae)的菌株。

优选的菌株属于Dichotomocladium，放射毛霉属(Actinomucor)，球托霉属(Gongronella)，Sporodiniella和毛霉属(Mucor)，具体是Dichotomocladium hesseltinei、雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)、卵形孢球托霉(Gongronella butleri)、Sporodiniella umbellata和米赫毛霉minor变种(Mucor mieheivar minor)等种。

分类不确定的菌株的例子是Vialaea insculpta。

属于有丝分裂孢子真菌菌株的例子是Acrodontiumcrateriforme、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、Circinotrichum sp.、Cryptocline sp.、Ellisiopsis sp.、黑色附球菌(Epicoccum nigrum)、粘帚霉属之种(Gliocladium sp.)、Helicorhoidion irregulare.、壳蠕孢属各种(Hendersonia spp.)、Mariannaea sp.、Microsphaeropsis sp.、柱隔孢属之种(Ramulariasp.)、Sarcopodium sp.、Spadicoides sto.、Speiropsispedatospora.、Sporotrichum exile.、杆霉属之种(Stilbellasp.)、单端孢属之种(Trichothecium sp.)、Trimmatostromaabietes.、Tubakia dryina.、Wiesneriomyces sp.和美索尼氏接柄孢(Zygosporium masonii)。

优选的细菌

本发明另一方面涉及一种可通过培养细菌产生的新型XET制剂。

优选的细菌是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。

产XET的革兰氏阳性细菌的例子有属于芽孢杆菌属的菌株。

优选的菌株

已发现以下菌株是XET阳性的：

1.Dichotomocladium hesseltinei。菌株保藏号：CBS164.61；分类：接合菌，毛霉目，丝枝霉科。

2.雅致放射毛霉。菌株保藏号：CBS154.86；分类：接合菌，毛霉目，丝枝霉科。

3.米赫毛霉minor变种。菌株保藏号：ATCC36018；分类：接合菌，毛霉目，毛霉科。

4.卵形孢球托霉。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于1997年1月28日将一株卵形孢球托霉保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏号：CBS448.97；分类：接合菌，毛霉目，丝枝霉科。

5.Sporodiniella umbellata。菌株保藏号：CBS195.77分类；接合菌，毛霉目，毛霉科。

6.叶点霉属之种。分离自中国的一株Pithecolobium sp.，分类：子囊菌，腔菌纲，座囊菌目(Dothidiales)，球腔菌科(Mycosphaellaceae)。

7.壳针孢属之种。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于1995年12月22日将一株壳针孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)。保藏号：CBS831.95；分类：子囊菌，腔菌纲，座囊菌目，球腔菌科。

8.棉色二孢。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于1996年3月12日将一株棉色二孢保藏在Centraalvureauvoor Schimmelcultures(CBS)。保藏号：CBS274.96；分类：子囊菌，腔菌纲(Loculoascomycetes)，座囊菌目，葡萄座腔菌科(Botrysphaeriaceae)。

9.Plowrightia ribesia。分离自丹麦Ribes sp.，分类：子囊菌，腔菌纲，座囊菌目，小穴壳菌科(Dothioraceae)。

10.Tubeufia amazonensis。菌种保藏号：ACTT42524；分类：子囊菌，腔菌纲，座囊菌目，毛筒壳科。

11.链格孢属之种。分类：子囊菌，腔菌纲(Loculoascomycetes)，座囊菌目，格孢腔菌科。

12.Embellisia hyacinthi。菌种保藏号：IMI211561；分类：子囊菌，腔菌纲，座囊菌目，格孢腔菌科。

13.新茎点霉。分类：子囊菌，腔菌纲，座囊菌目，格孢腔菌科。

14.热带茎点霉。菌种保藏号：CBS537.66；分类：子囊菌，腔菌纲，座囊菌目，格孢腔菌科。

15.盾壳霉属之种。分类：子囊菌，腔菌纲，座囊菌目，小球腔菌科。

16.橄榄色盾壳霉。菌种保藏号：CBS304.68。分类：子囊菌，腔菌纲，座囊菌目，小球腔菌科。

17.当克盾壳霉。分类：子囊菌，腔菌纲，座囊菌目，小球腔菌科。

18.Tiarosporella phaseolina。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于1997年1月28日将一株Tiarosporellaphaseolina保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏号：CBS446.97；分类：子囊菌，盘菌纲(Discomycetes)，斑痣盘菌目，斑痣盘菌科。

19.Tiarosporella sp.。分类：子囊菌，盘菌纲(Discomycetes)，斑痣盘菌目，斑痣盘菌科。

20.Galiella celebica。分离自在日本采集的样品，分类：子囊菌，盘菌纲(Discomycetes)，盘菌目(Pezizales)，肉盘菌科。

21.淡黑假黑盘菌。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于1997年1月28日将一株淡黑假黑盘菌保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏号：CBS444.97；分类：子囊菌，盘菌纲(Discomycetes)，盘菌目(Pezizales)，肉盘菌科。

22.砖火丝菌。分离自挪威的样品。分类：子囊菌，盘菌纲(Discomycetes)，盘菌目(Pezizales)，火丝菌科。

23.珠头霉属之种。分类：子囊菌，盘菌纲(Discomycetes)，盘菌目(Pezizales)，粪盘菌科。

24.灰色葡萄孢。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于1997年1月28日将一株灰色葡萄孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏号：CBS447.97，分类：子囊菌，盘菌纲(Discomycetes)，锤舌菌目(Leotiales)，核盘菌科。

25.外壳孢属之种。分类：子囊菌，盘菌纲(Discomycetes)，锤舌菌目，核盘菌科。

26.盘多毛孢属之种。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于1997年1月28日将一株盘多毛孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏号：CBS445.97。分类：子囊菌，核菌纲，炭角菌目，圆孔壳科。

27.多毛菌属之种。分类：子囊菌，核菌纲，炭角菌目，圆孔壳科。

28.点孔座壳。分离自瑞典的样品，分类：子囊菌，核菌纲，炭角菌目，炭角菌科。

29.炭角菌属之种。分离自生长在Mona，Jamaica的棕榈Sabaljamaicensis叶子。分类：子囊菌，核菌纲，炭角菌目，炭角菌科。

30.Nodulisporium sp。分类：子囊菌，核菌纲，炭角菌目，炭角菌科。

31.腐皮镰孢。分离自印度玉米粒样品，分类：子囊菌，核菌纲，肉座菌目，肉座菌科。

32.轮枝孢属之种。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于1995年12月22日将一株轮枝孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏号：CBS830.95；分类：子囊菌，核菌纲，肉座菌目，肉座菌科。

33.巴西周刺座霉。菌株保藏号：IMI049467，分类：子囊菌，核菌纲，肉座菌目，肉座菌科。

34.Chaetapiospora rhododendri。分类：子囊菌，核菌纲，炭角菌目，炭角菌科，亚赤壳科(Hyponectriaceae)。

35.Lulworthia uniseptata。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于1997年1月28日将一株壳囊孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏号：CBS442.97，分类：子囊菌，核菌纲，海壳目，海壳科。

36.棘孢刺盘孢。分类：子囊菌，核菌纲，黑痣菌目，黑痣菌科。

37.Colletotrichum crassipes。分类：子囊菌，核菌纲，黑痣菌目，黑痣菌科。

38.壳囊孢属各种。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于1997年1月23日将一株壳囊孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏号：CBS424.97，分类：子囊菌，核菌纲，腐皮壳菌目，黑腐皮壳科。

39.壳囊孢属之种。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于1997年1月23日将一株壳囊孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏号：CBS425.97，分类：子囊菌，核菌纲，腐皮壳菌目，黑腐皮壳科。

40.座盘孢属之种。分类：子囊菌，核菌纲，腐皮壳菌目，黑腐皮壳科。

41.Phomopsis ilicis。分类：子囊菌，核菌纲，腐皮壳菌目，黑腐皮壳科。

42.Phomopsis cirsii。分类：子囊菌，核菌纲，腐皮壳菌目，黑腐皮壳科。

43.栗棒盘孢。分类：子囊菌，核菌纲，腐皮壳菌目，黑盘孢科。

44.Seimatosporium lichenicola。分类：子囊菌，核菌纲，腐皮壳菌目，黑盘孢科。

45.塔木里氏曲霉。菌株保藏号：CBS821.72，分类：子囊菌，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科。

46.Eurotium chevalieri。菌株保藏号：CBS472.91，分类：子囊菌，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科。

47.胶囊青霉。菌株保藏号：CBS273.86，分类：子囊菌，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科。

48.奥尔森氏青霉。菌株保藏号：CBS523.89。分类：子囊菌，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科。

49.嗜松青霉。菌株保藏号：CBS440.89。分类：子囊菌，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科。

50.娄格法尔特氏青霉。菌株保藏号：CBS167.91。分类：子囊菌，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科。

51.意大利青霉。菌株保藏号：IMI078681。分类：子囊菌，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科。

52.变灰青霉。菌株保藏号：CBS579.70，分离自埃及的一个盐矿。分类：子囊菌，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科。

53.爪哇正青霉。菌株保藏号：CBS448.74。分类：子囊菌，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科。

54.疣孢青霉。菌株保藏号：CBS563.92。分类：子囊菌，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科。

55.黄色踝节菌。菌株保藏号：ATCC52201。分类：子囊菌，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科。

56.Petromyces alliaceus。菌株保藏号：CBS511.69。分类：子囊菌，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科。

57.毛栓菌(Trametes hirsuta)。分离自在丹麦采集的样品，分类：担子菌，层菌纲，革盖菌目，革盖菌科。

58.裂褶菌属之种。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于1997年1月28日将一株裂褶菌保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏号：CBS443.97。分类：担子菌，层菌纲，裂褶菌目，裂褶菌科。

59.玫瑰色伏革菌。分离自在丹麦采集的样品，分类：担子菌，层菌纲，盘革菌目(Aleurodiscales)，伏革菌科(Cortiaceae)。

60.Tubulicrinis subulatus。分离自在丹麦采集的样品，分类：担子菌，层菌纲，Xenasmatales，Tubulicrinaceae。

61.毛韧革菌。分离自在丹麦采集的样品，分类：担子菌，层菌纲，韧革菌目，韧革菌科。

62.Acrodontium crateriforme。分类：有丝分裂孢子真菌。

63.出芽短梗霉。分类：有丝分裂孢子真菌。

64.Circinotrichum sp.。分类：有丝分裂孢子真菌。

65.Cryptocline sp.。分类：有丝分裂孢子真菌。

66.Ellisiopsis sp.。分类：有丝分裂孢子真菌。

67.黑色附球菌。分类：有丝分裂孢子真菌。

68.粘帚霉属之种。分类：有丝分裂孢子真菌。

69.Helicorhoidion irregulare。分类：有丝分裂孢子真菌。

70.壳蠕孢属之种。分类：有丝分裂孢子真菌。

71.Mariannaea sp.。分类：有丝分裂孢子真菌。

72.Microsphaeropsis sp.。分类：有丝分裂孢子真菌。

73.柱隔孢属之种。分类：分类：有丝分裂孢子真菌。

74.Sarcopodium sp.。分类：有丝分裂孢子真菌。

75.Spadicoides sto。保藏号：IMI203428，分类：有丝分裂孢子真菌。

76.Speiropsis pedatospora。分类：有丝分裂孢子真菌。

77.Sporotrichum exile。保藏号：CBS350.47，分类：有丝分裂孢子真菌。

78.杆霉属之种。分类：有丝分裂孢子真菌。

79.单端孢属之种。分类：有丝分裂孢子真菌。

80.Trimmatostroma abietes。分类：有丝分裂孢子真菌。

81.Tubakia dryina。分类：有丝分裂孢子真菌。

82.Wiesneriomyces sp.。分类：有丝分裂孢子真菌。

83.美索尼氏接柄孢。分类：有丝分裂孢子真菌。

84.Vialaea insculpta。分类：未定。

85.嗜碱芽孢杆菌。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于1997年2月12日将一株嗜碱芽孢杆菌保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，保藏号DSM11404。

生产XET

可以通过在含有合适碳氮源的营养培养基(这种培养基是本领域已知的)上有氧培养上述微生物菌株生产本发明的XET酶。

或者，可以通过对含有来自上述菌株之一的适当遗传信息的转化宿主微生物进行有氧培养来生产本发明的XET酶。因此，本发明还涉及木糖葡聚糖内切转糖基酶(XET)的生产方法，该方法包括

a)在适宜的营养培养基中，有利于XET酶产生的条件下，培养表达微生物XET的转化宿主微生物，以及

b)随后从营养培养基中纯化XET酶。

可以用本领域已知方法制备和培养这种转化子。

克隆编码XET的DNA序列

可以用本领域的各种公知方法，从任何能产生所述XET的微生物中分离编码本发明XET酶的DNA序列。

首先，用能产生待研究的XET的生物体之染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果该XET的氨基酸序列是已知的，则可以合成出同源的标记寡核苷酸探针，用它从制备自所述微生物的基因组文库或cDNA文库中鉴定出XET编码克隆。或者，可以用含有已知XET基因的同源序列的标记寡核苷酸探针作为探针，使用低严谨度的杂交和清洗条件，鉴定XET编码克隆。

还有另一种XET编码克隆的鉴定方法，包括将基因组DNA或cDNA片段插入表达载体(例如质粒)中，用得到的DNA文库转化XET阴性宿主生物体，然后将转化细胞铺到琼脂平板上，利用上面描述的方法鉴定出表达XET的克隆。

或者，可以用已确立的标准方法合成制备编码该酶的DNA序列，例如，S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(四面体通讯22，1981，1859-1869页)描述的磷酸胺(phosphoamidite)法，或Matthes等(EMBO杂志3，1984，801-805页)描述的方法。在磷酸胺法中，寡核苷酸被合成(例如用自动DNA仪)、纯化、退火、连接并克隆到合适的载体中。

最后，DNA序列可以是按照标准技术，通过将合成的、基因组或cDNA来源的片段(确切地说，诸片段对应于整个DNA序列的不同部分)连接起来而制备的基因组和合成混合来源的、合成和cDNA混合来源的、或者基因组和cDNA混合来源的。正如US4683202或R.K.Saiki等(科学239，1988，487-491页)描述的，还可以用特异引物通过聚合酶链式反应(PCR)制备DNA序列。

表达XET

根据本发明，可以用通常包括调控序列(编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选的抑制基因或者各种激活子基因)的表达载体，将通过上述方法或本领域已知的任何可替代方法产生的XET编码DNA序列表达为酶的形式。

携带编码本发明XET酶的DNA序列的重组表达载体可以是任何能够方便地进行重组DNA操作的载体，载体的选择经常取决于它将要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制的载体(即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制的载体)，例如质粒，噬菌体或染色体外成分，微小染色体或者人工染色体。或者，载体可以是这样一种类型，当它被导入宿主细胞时，载体会整合到宿主细胞基因组，并与它所整合的染色体一起复制。

在载体中，DNA序列应与合适的启动子序列可操纵地连接。启动子可以是在所选宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，并可以来源于编码宿主细胞同源或异源蛋白质的基因。适用于指导本发明XET编码DNA序列转录的启动子(特别是在细菌宿主中)的实例有大肠杆菌lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因dagA启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖原淀粉酶基因(amyM)的启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子。为了在真菌宿主中转录，适用启动子的例子有来源于编码米曲霉TATA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑色曲霉中性α-淀粉酶，黑色曲霉酸稳定的α-淀粉酶，黑色曲霉葡糖淀粉酶，Rhizomucor miehei脂酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶或者构巢曲霉乙酰胺酶等的基因的启动子。

本发明的表达载体还可以包含合适的转录终止子，在真核细胞中，还可以包含与编码本发明XET酶的DNA序列可操纵连接的多聚腺苷酸化序列。终止序列和多聚腺苷酸化序列可以适当地从启动子相同来源得到。

载体另外可以包含能使载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。这种序列的例子是质粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1以及pIJ702的复制起点。

载体还可以包含选择标记，例如其产物能补偿宿主细胞缺陷的基因(如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因)，或者赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。另外，载体可以包含曲霉选择标记(如amdS，argB，niaD和产生潮霉素抗性的标记sc)，或者通过共转化来实现选择(例如，WO91/17243所描述的)。

尽管胞内表达在一些方面具有优势(例如，当用某些细菌作宿主细胞时)，但通常优选胞外表达。

构建编码XET酶并含有启动子、终止子和其它元件的本发明载体的适用步骤对本领域技术人员是众所周知的(参考，例如Sambrook等，分子克隆：实验指南，第二版，Cold Spring Harbor，1989)。

包含以上定义的本发明DNA构建体或表达载体的本发明细胞是重组生产本发明XET的优选宿主细胞。可以通过将DNA构建体(以单拷贝或多拷贝)整合到宿主染色体内，用本发明编码XET的DNA构建体方便地转化细胞。通常认为发生这种整合比较有利，因为这样DNA序列便更可能稳定地保留在细胞内。可以按照常规方法(例如同源或异源重组)将DNA构建体整合到宿主染色体内。或者，可以用以上描述的与不同类型宿主细胞相联系的表达载体转化细胞。

本发明的细胞可以是高等生物体细胞，例如哺乳动物或昆虫细胞，但优选微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。

合适的细菌的例子是革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌；或浅青紫链霉菌，或鼠灰链霉菌；或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。细菌的转化可以通过原生质体转化或依照已知方式用感受态细胞进行。

酵母细胞可以从酵母属或裂殖酵母属(例如酿酒酵母)中选择。丝状真菌以属于曲霉属之种为好(例如米曲霉或黑曲霉)。转化真菌细胞可以通过已知方式(包括原生质体形成和原生质体转化及随后细胞壁再生的过程)进行。适用于曲霉属宿主细胞转化的步骤在EP238023中有描述。

本发明还有一个方面涉及本发明XET酶的生产方法，该方法包括在利于产生XET的条件下培养上述宿主细胞，并从细胞中和/或培养基中回收XET。

用于培养细胞的培养基可以是任何适于所用宿主细胞生长并表达本发明XET的常规培养基。合适的培养基可以购买到或者可以根据公开配方(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录描述的)制备。

可以通过众所周知的操作从培养基中方便地纯化宿主细胞分泌出来的XET，包括通过离心或过滤分离培养基中的细胞，盐析沉淀培养基中的蛋白质成分(例如用硫酸铵)，随后利用层析操作(如离子交换层析、亲和层析等)。

工业应用

根据本发明，用XET酶处理后，纤维素材料可以获得改善的强度特性和/或提高的保形性能和/或更好的抗皱性能。XET酶能将以氢键结合到纤维素纤维上的木糖葡聚糖分子重排并连接，从而获得上述性能。

为了增强XET酶的效能，在某些情况下，将木糖葡聚糖加入纤维素材料中的做法是有益的，这样酶可以将更多纤维素材料连接在一起。

可以在水中用XET酶处理纤维素材料，或者在有某些成分(如缓冲液和/或润湿剂和/或稳定剂和/或聚合物和/或降低水活度的有机成分(如DMSO))的水中进行。

合适的缓冲液可以是磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、己二酸盐，三乙醇胺，单乙醇胺，二乙醇胺，碳酸盐(特别是碱金属或碱土金属碳酸盐，具体说是碳酸钠或碳酸钾，或铵和HCl盐)，二胺，特别是二氨基乙烷，咪唑，Tris或氨基酸缓冲液。

润湿剂用于提高纤维素材料的湿度。润湿剂优选非离子表面活性剂类型。

稳定剂可以是能稳定XET酶的一种试剂。

根据本发明，XET在水性介质中的浓度可以在0.01-1000μg酶蛋白/g纤维素材料，优选0.05-100μg酶蛋白/g纤维素材料。

通常要将反应介质(含有纤维素材料和XET酶)保温至少几分钟。从1分钟到20小时的保温时间通常都是合适的，具体地说，常常优选保温时间为30分钟到10小时。

本发明方法中的反应介质温度在10-90℃的范围内比较合适，具体说对所述XET酶以15-70℃为宜。

通过以下非限定性实施例进一步阐述本发明。

实施例1：筛选XET阳性菌株

培养基

PD琼脂：39g马铃薯葡萄糖琼脂，DIFCO 0013；加入去离子水至1000ml，121℃高压蒸气灭菌15-20分钟。

YPG琼脂：4g酵母提取物(DIFCO 0127)，1g KH₂PO₄(Merck4873)，0.5g MgSO₄·7H₂O(Merck5886)，15g葡萄糖(Roquette101-0441)，20g琼脂(Merck1614)，去离子水补至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌15-20分钟。

MEA：20g麦芽浸膏粉(DIFCO0186)，1g蛋白胨(DIFCO0118)，20g葡萄糖(Roquette France 1010441)，20g琼脂(Merck1614)，去离子水补至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌15分钟。

培养基A(每瓶)：30g麦麸，45ml下述溶液：10g rofec(Roquette101-0441)，10g NH₄NO₃(Merck1187)，10g KH₂PO₄(Merck 4873)，40gSolcafloc(Dicacel，购自Dicalite-Europe-Nord，9000Gent，Belgium)，0.75g MgSO₄·7H₂O(Merck 5886)，15g CaCO₃，自来水补至1000ml，pH调至6.5，121℃高压蒸汽灭菌40分钟。

培养基B：20g大豆饼，5g maltodex01(Roquette101-7845)，15g麦麸，3g蛋白胨(DIFCO0118)，10g微晶纤维素(Merck2331)，0.2ml pluronic(PE-6100，101-3068)，1g橄榄油，去离子水补至1000ml。

取100ml装入带有两个挡板的500ml Erlenmeyer瓶中，121℃高压蒸汽灭菌40分钟。

培养基C：100g蔗糖，40g大豆饼，10g Na₂HPO₄·12H₂O(Merck6579)，0.1ml pluronic(PE-6100，101-3068)，自来水补至1000ml。装有100ml培养基的带两个挡板的Erlenmeyer瓶中加入0.5g CaCO₃。121℃高压蒸汽灭菌40分钟。临用前，每100ml培养基加10ml 1M NaHCO₃(pH9)。

发酵步骤

将真菌菌株保存在琼脂培养皿(9cm)中，或者PDA、YPG、MEA斜面(参见培养基列表)上。每个琼脂斜面用10ml无菌蒸馏水洗，每个摇瓶接种3ml。

真菌菌株在摇瓶中于如下生长条件下培养：

培养基：A和B(参见培养基列表)。

温度：26℃

RPM：A：静止

B：125-200

培养时间：A：6到30天

B：2-21天

细菌分离物保存在TY琼脂(pH9)斜面上，TY琼脂包含：

20g胰蛋白胨，5g酵母提取物，0.7ml 1％FeCl₂·4H₂O溶液，0.1ml1％MnCl₂·4H₂O溶液，1.5ml 1％MgSO₄·7H₂O溶液，20g琼脂，去离子水补至1000ml。121℃高压蒸汽灭菌20分钟。倾注平板前，向100ml琼脂中加入10ml无菌1M NaHCO₃(pH9)。

斜面于30℃保温4天，每个琼脂斜面用10ml无菌水洗下，每个摇瓶接种3ml。

细菌在含有培养基C的摇瓶中，于30℃、300rpm培养4天。

活性检测：

将B和C中获得的培养液于10000rpm离心10分钟。检测上清的XET活性。

向每个含有麦麸及已充分生长的培养物的摇瓶中加入200ml自来水，于200rpm振荡2小时。然后离心培养液，上清用于检测XET活性。

XET分析

用前面描述的点印迹方法分析样品。

结果

用前面描述的方法，发现1种芽孢杆菌和几种属于不同分类群的真菌是阳性的。结果示于下表。

嗜碱芽孢杆菌在培养基C(pH9)(见培养基列表)中于30℃、300rpm生长4天后呈阳性。

真菌分离物培养基A 养基B

雅致放射毛霉 + -

Dichotomocladium hesseltinei + +

卵形孢球托霉未作 +

米赫毛霉minor变种 + +

Sporodiniella umbellata - +

链格孢属之种 + -

外壳孢属之种未作 +

塔木里氏曲霉 + +

灰色葡萄孢 + +

Chaetapiospora rhododendri - +

棘孢刺盘孢 + -

Colletotrichum crassipes + -

当克盾壳霉 + +

橄榄色盾壳霉 + -

盾壳霉属各种 - +

栗棒盘孢 - +

壳囊孢属之种 + +

棉色二孢 + +

座盘孢属之种 + +

Embellisia hyacinthi + -

爪哇正青霉 + -

Eurotium chevalieri - +

腐皮镰孢 + -

Galiella celebica + +

Lulworthia uniseptata + +

Nodulisporium sp. + -

珠头霉属之种 - +

变灰青霉 + -

胶囊青霉 + -

意大利青霉未作 +

奥尔森氏青霉 + -

嗜松青霉 + 未作

娄格法尔特氏青霉 + +

疣孢青霉 + +

盘多毛孢属之种未作 +

多毛菌属之种 + +

Petromyces alliaceus + +

新茎点霉 + -

热带茎点霉 + +

Phomopsis cirsii - +

Phomopsis ilicis + +

叶点霉属之种 + -

Plowrightia ribesia + +

点孔座壳 + +

淡黑假黑盘菌 + +

砖火丝菌 + +

柱隔孢属之种 + -

Seimatosporium lichenicola + -

壳针孢属之种 + 未作

黄色踝节菌 + +

Tubeufia amazonensis + -

Tiarosporella phaseolina + +

Tiarosporella sp. - +

轮枝孢属之种 + +

巴西周刺座霉 + -

炭角菌属之种 + +

玫瑰色伏革菌 + +

裂褶菌属之种 + +

毛韧革菌 + +

毛栓菌 + +

Tubulicrinis subulatus + +

Acrodontium crateriforme + -

出芽短梗霉 + -

Circinotrichum sp. - +

Cryptocline sp. + -

Ellisiopsis sp. + -

黑色附球菌 - +

粘帚霉属之种 + -

Helicorhoidion irregulare + +

壳蠕孢属各种 + +

Mariannaea sp. + -

Microsphaeropsis sp. + -

柱隔孢属之种 + -

Sarcopodium sp. + -

Spadicoides sp. - +

Speiropsis pedatospora + -

Sporotrichum exile + +

杆霉属之种 + -

单端孢属之种 + +

Trimmatostroma abietes + +

Tubakia dryina + +

Wiesneriomyces sp. + -

美索尼氏接柄孢 + +

Vialaea + 未作

+阳性，-阴性

实施例2：Dichotomocladium hesseltinei XET的纯化和鉴定

在15个PDA琼脂斜面接种Dichotomocladium hesseltinei(CBS164.61)，于26℃培养7天。用含有0.1％Tween80的约250ml无菌蒸馏水洗下菌体，用来接种80个含有培养基B(2-3ml/瓶)的摇瓶。摇瓶于26℃，200rpm振荡培养5天，到时后，4000rpm离心培养液15分钟。

用以下方法纯化含有木糖葡聚糖内切转糖基酶(XET)的上清液：

向经滤布过滤的培养液中加入助滤剂，将该溶液进一步用蔡氏深度滤盘过滤得到澄清溶液。调节滤液的pH至pH8.0，用去离子水稀释滤液达到与20mM Tris/HCl(pH8.0)相同的导电率。

将XET酶上样到用20mM Tris/HCl(pH8.0)平衡过的Q-SepharoseFF柱子中，采用线性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脱酶。XET活性物洗脱得到单个峰。汇集的XET经SephadexG25柱子换入20mM Tris/HCl(pH8.0)缓冲液中，再在经20mM Tris/HCl(pH8)平衡过的Q-SepharoseFF柱子层析。用线性增加的NaCl梯度(0→0.2M)洗脱柱子。汇集含XET的流分，加入(NH₄)₂SO₄至终浓度为1.4M。在1.4M(NH₄)₂SO₄，10mM琥珀酸(pH7.0)中平衡PhenylToyopearl 650S柱子，将XET酶上样到这个柱子中，用线性降低的(NH₄)₂SO₄梯度(1.4→0M)洗脱。汇集含XET的流分，在带有再生纤维素膜(截留分子量10kDa)的超滤池上进行浓缩。将浓缩的酶上样到在100mM H₃BO₃、10mM二甲基戊二酸、2mM CaCl₂(pH7.0)中平衡过的Superdex200体积排阻层析柱子中。通过SDS-PAGE分析从Superdex200柱子洗脱下来的流分，汇集各纯XET流分。

Dichotomocladium hesseltinei XET在SDS-PAGE上迁移形成Mr＝24kDa的一条带。作SDS-PAGE并电印迹到PVDF膜上后，测定24kDa组分的N-末端氨基酸序列。推断出如下N-末端氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：

Ala-Glu-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Thr-Gln-Thr-Val-Gly-Asn-Tyr-Ile-Val-Tyr-Asn-Asn-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ala.

本发明还涉及含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的微生物XET酶，或与SEQ ID NO.1氨基酸序列至少80％同源、优选至少85％同源、更优选至少90％同源，还要更优选至少95％同源，特别是至少98％同源的XET。

如果通过已知的算法(例如Lipman和Pearson在科学227(1985，1435页)中描述的那种算法)将多肽与亲本XET的相应氨基酸序列进行比较后显示有X％相同，则认为它们之间的同源性为X％。

另外，对Dichotomocladium hesseltinei XET进行质谱分析得到其分子量为23006Da。

实施例3：Tiarosporella phaseolina XET的纯化和鉴定

在15个PDA琼脂斜面上接种Tiarosporella phaseolina(CBS446.97)，于26℃培养7天。用含有0.1％Tween80的约250ml无菌蒸馏水洗斜面，用来接种80个含有培养基B(2-3ml/瓶)的摇瓶。摇瓶于26℃，200rpm振荡培养7天，到时后，于4000rpm离心培养液15分钟。

向经滤布过滤的培养液中加入助滤剂，将该溶液进一步用蔡氏深度滤盘过滤得到澄清溶液。滤液在截留分子量为3Kda的聚醚砜(polyethersulfone)膜上超滤浓缩，随后用蒸馏水透析以降低导电率。将浓缩酶的pH调节至pH5.0。浓缩酶的导电率为1.7mS/cm。

将XET酶上样到在20mM CH₃COOH/NaOH(pH5.0)中平衡过的S-Sepharose FF柱子中，用线性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脱酶。XET活性成分以单一峰形式洗脱下来。汇集的XET经透析转换缓冲液至20mM CH₃COOH/NaOH(pH4.0)。将透析过的酶上样到在20mMCH₃COOH/NaOH(pH4.0)中平衡过的SOURCE 30S柱子中。柱子洗后，用线性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脱XET活性成分。汇集有XET活性的流分，对20mM Tris/HCl(pH8)进行透析。透析过的酶上样到在20mM Tris/HCl(pH8)中平衡过的SOURCE 30Q柱子中。柱子洗后，用线性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脱XET活性成分。汇集有XET活性的流分，在带有再生纤维素膜(截留分子量10kDa)的超滤池上进行浓缩。将浓缩过的酶上样到在100mM H₃BO₃、10mM二甲基戊二酸、2mM CaCl₂(pH7.0)中平衡过的Superdex200体积排阻柱子中。通过SDS-PAGE分析从Superdex200柱子中洗脱下的流分，汇集纯XET流分。

Tiarosporella phaseolina XET在SDS-PAGE上迁移形成Mr＝24kDa的一条带。作SDS-PAGE并电印迹到PVDF膜上后，测定该24kDa组分的N-端氨基酸序列。推断出如下N-端氨基酸序列(SEQ IDNO：2)：

Xaa-Asp-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Asn-Val-Lys-Asn-Gly-Pro-Tyr-Thr-Leu-Tyr-Asn-Asn-Leu-Gly-Gly-Lys

本发明还涉及含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的微生物XET酶或与SEQ ID NO.2氨基酸序列至少80％同源、优选至少85％同源、更优选至少90％同源、还要更优选至少95％同源、特别是至少98％同源的XET。

实施例4：淡黑假黑盘菌XET的纯化和鉴定

在15个PDA琼脂斜面上接种淡黑假黑盘菌(CBS444.97)，于26℃培养7天。用含有0.1％Tween80的约250ml无菌蒸馏水洗斜面，用来接种80个含有培养基B(2-3ml/瓶)的摇瓶。摇瓶于26℃，200rpm振荡培养7天，到时后，于4000rpm离心培养液15分钟。

向经滤布过滤的培养液中加入助滤剂，将该溶液进一步用蔡氏深度滤盘过滤得到澄清溶液。将滤液调节至pH5.0，并用去离子水稀释滤液，使其与20mM CH₃COOH/NaOH(pH5.0)导电率相同。

将XET酶上样到在20mM CH₃COOH/NaOH(pH5.0)中平衡过的S-Sepharose FF柱子中，以线性增加的NaCl梯度(0→0.25M)洗脱该酶。XET活性成分以单一峰形式洗脱下来。收集的XET经SephadexG25柱子转换缓冲液至20mM Hepes/NaOH(pH7.0)中，上样到在20mM Hepes/NaOH(pH7.0)平衡过的S-Sepharose FF柱子中。以线性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脱柱子。汇集有XET活性的流分，经透析转换缓冲液至20mM CH₃COOH/NaOH(pH5.0)中。将SOURCE15S柱子在20mM CH₃COOH/NaOH(pH5.0)中平衡，上样透析过的酶。柱子洗后，以线性增加的NaCl梯度(0→0.2M)洗脱XET酶。汇集含XET的流分，在带有再生纤维素膜(截留分子量10kDa)的超滤池上进行浓缩。将经过浓缩的酶上样到在20mM CH₃COOH/NaOH、100mMNaCl(pH5.0)中平衡过的Superdex200体积排阻柱子中。通过SDS-PAGE分析从Superdex200柱子洗脱下的流分，汇集纯XET级分。

淡黑假黑盘菌XET在SDS-PAGE上迁移形成Mr＝58kDa的一条带。作SDS-PAGE并电印迹到PVDF膜上后，发现该58kDa组分具有中断的N-末端。

将高度纯化的淡黑假黑盘菌XET制剂还原并烷基化。然后用Lys-C降解酶样品。在SMART系统中，用TFA/AN在长Vydac C18上经RP-HPLC分离肽，并在TFA/异丙醇中重新纯化。通过Edman降解分析选出的肽。

表1列出了所得8种肽的序列。发现两种肽与葡聚糖酶样和木聚糖酶样酶同源，但大多未显示出与已知序列有任何同源性或只有不相关的同源性。

表1淡黑假黑盘菌XET的Lys-C肽的序列

肽	序号	序列	同源性说明
肽	序号	序列	同源性说明	XET赖氨酰070198-2fr5	3777	WNDPVVK	与枯草芽孢杆菌溶解蛋白质同源
XET赖氨酰080198-4fr3	3778	(S/Y)RFNAPALIGE[WQ]	未发现	XET赖氨酰070198-2fr5	3777	WNDPVVK	与枯草芽孢杆菌溶解蛋白质同源
XET赖氨酰080198-4fr3	3778	(S/Y)RFNAPALIGE[WQ]	未发现	XET赖氨酰090198-1fr6	3779	LIFE	极小
XET赖氨酰070198-1fr5	P379	EDGSYLKYAK	无关同源性	XET赖氨酰090198-1fr6	3779	LIFE	极小
XET赖氨酰070198-1fr5	P379	EDGSYLKYAK	无关同源性	XET赖氨酰070198-1fr3	P380	EWGTTGKFNK	与内切葡聚糖酶同源
XET赖氨酰080198-1fr1	P381	KVTAVEAWK	与xynl-asptu.内切木聚糖酶有弱同源性	XET赖氨酰070198-1fr3	P380	EWGTTGKFNK	与内切葡聚糖酶同源
XET赖氨酰080198-1fr1	P381	KVTAVEAWK	与xynl-asptu.内切木聚糖酶有弱同源性	XET赖氨酰080198-2fr1	P382	XFYQIANS(Q/I)	未发现
XET赖氨酰080198-3fr1	P383	AALXXVMK	未发现	XET赖氨酰080198-2fr1	P382	XFYQIANS(Q/I)	未发现

实施例5：Dichotomocladium hesseltinei，Tiarosporellaphaseolina，淡黑假黑盘菌XET及木糖葡聚糖酶的pH曲线

检验Dichotomocladium hesseltinei，Tiarosporellaphaseolina和淡黑假黑盘菌的木糖葡聚糖内切转糖基酶的pH曲线。用pH3.0到11.0的缓冲液稀释纯酶，使最终稀释液中的蛋白质浓度相同(即A₂₈₀＝0.004)。用XET点印迹检测(前面已描述)分析样品中的XET。目测荧光斑点，评定为0-10级。因此图1中所用单位是不定单位。

从图1中可看到，在pH3到pH11范围内，特别是pH4到pH9 XET都有活性。

检测具有XET活性的所有分离物的木糖葡聚糖酶活性。两种酶的比活在各分离物中是不同的。为了作出XET的pH活性曲线，将酶在相同的缓冲液中稀释至相同的蛋白质终浓度，并检测木糖葡聚糖酶活性。检测中使用AZCL木糖葡聚糖。所用的木糖葡聚糖方法如下：

底物：悬浮于脱盐水中的0.4％AZCL-木糖葡聚糖。

缓冲液：100mM H₃BO₃，10mM二甲基戊二酸，2mM CaCl₂(pH7)

分析：

-将Eppendorf恒温器旋到40℃。

-将500μl 0.4％AZCL-木糖葡聚糖与500μl缓冲液混合，置冰上。

-加入20μl酶，在Eppendorf恒温器中保温，直到产生合适的颜色。

-再将样品放回冰浴以防止样品在0℃离心时进一步反应。

-将200μl样品转入微量滴定板中，于650nm测量蓝色。

结果示于图2。

实施例6：来自Tiarosporella phaseolina(CBS编号446.97)的木糖葡聚糖内切转糖基酶(XET)的克隆和表达

保藏微生物：

Tiarosporella phaseolina CBS编号446.97。

其它菌株：

酵母菌株：所用酿酒酵母为W3124(van den Hazel，H.B；Kielland-Brandt，M.C；Winter J.R；欧洲生物化学杂志207，277-283，1992；(MATa；ura3-52；leu2-3，112；his3-D200；pep4-1137；prc1∷HIS3；prb1∷LEU2；cir+))。大肠杆菌菌株：DH10B(Life Technologies)

质粒：

曲霉表达载体pHD414是质粒p775(EP238023有描述)的一个衍生物。pHD414的构建在WO93/11249中有进一步描述。

pYES2.0(Invitrogen)

培养基：

YPD：

10g酵母提取物，20g蛋白胨，加水至900ml。高压蒸汽灭菌，加入100ml 20％葡萄糖(过滤除菌)。

YPM：

10g酵母提取物，20g蛋白胨，加水至900ml。高压蒸汽灭菌，加入100ml 20％麦芽糖糊精(过滤除菌)。

10×Basal盐：

75g酵母氮碱，113g琥珀酸，68g NaOH，加水至1000ml，过滤除菌。

SC-URA：

100ml 10×Basal盐，28ml无维生素的20％酪蛋白氨基酸，10ml1％色氨酸，加水至900ml。高压蒸汽灭菌后，加入3.6ml 5％苏氨酸和100ml 20％葡萄糖或20％半乳糖。

SC-琼脂：

SC-URA，加入20g/l琼脂。

AZCL木糖葡聚糖(Megazyme，Australia)

在酵母中克隆表达

按照本文中引作参考文献的H.Dalboege等(H.Dalboege等，分子与普通遗传学1994，243：253-260；WO93/11249；WO94/14953)所述进行酵母中的克隆表达.总RNA的提取、cDNA合成、绿豆核酸酶处理、用T4 DNA聚合酶形成平末端以及构建文库等各个步骤均按照上述文献进行。

发酵Tiarosporella phaseolina(CBS编号446.97)以分离 mRNA

从平板上将Tiarosporella phaseolina(CBS编号446.97)生长完全的菌丝体接种到含有100ml培养基B(参见培养基)的摇瓶中。培养液于26℃，200rpm培养7天，所得培养液经miracloth过滤，将菌丝体冷冻在液氮中。

按照H.Dalboege等(分子与普通遗传学1994，243：253-260；WO93/11249；WO94/14953)所述从该培养物的菌丝体中分离mRNA。

总RNA的提取是用硫氰酸胍处理，再经5.7M CsCl超速离心进行的，按照WO94/14953描述的步骤经Oligo(dT)-纤维素亲和层析分离poly(A)⁺RNA。

cDNA合成

用RNaseH方法(Gubler和Hoffman(1983)，基因25：263-269，Sambrook等，(1989)分子克隆：实验指南，Cold Spring Harborlab.Cold Spring Harbor，NY)，从5mg poly(A)⁺RNA合成双链cDNA。将poly(A)⁺RNA(在5μl DEPC处理过的水中含有5μg)在预先硅化过的无RNase的Eppendorph管中于70℃加热8分钟，在冰上骤冷，并与含有1mM dATP、dGTP、dTTP和0.5mM 5-甲基-dCTP(Pharmacia)、40单位人胎盘核糖核酸酶抑制剂(RNasin，Promega)、1.45μg Oligo(dT)₁₈-NotI引物(Pharmacia)和1000单位SuperScript II RNaseH反转录酶(Bethesda ResearchLaboratories)的反转录酶缓冲液(50mM Tris-Cl(pH8.3)、75mMKCl、3mM MgCl₂、10mM DTT，Bethesda Research Laboratories)合并至终体积50μl。将反应混合物置于45℃保温1小时合成第一链cDNA。合成完成后，按照厂商说明用MicroSpin S-400 HR(Pharmacia)离心柱凝胶过滤mRNA：cDNA杂合混合物。

凝胶过滤后，将杂合物稀释到含有200μl各种dNTP，60单位大肠杆菌DNA聚合酶I(Pharmacia)，5.25单位RNaseH(Promega)以及15单位大肠杆菌DNA连接酶(Boehringer Mannheim)的250μl第二链缓冲液(20mM Tris-Cl，pH7.4，90mM KCl，4.6mM MgCl₂，10mM(NH₄)₂SO₄，0.16mM bNAD⁺)中。将反应管置于16℃保温2小时，再在25℃保温15分钟，以合成第二链cDNA。加入EDTA至终浓度为20mM以终止反应，随后进行酚/氯仿抽提。

绿豆核酸酶处理：

通过加入2体积96％EtOH，0.2体积10M NH₄Ac，于-20℃沉淀双链cDNA 12小时，再经离心回收，在70％EtOH中洗涤，干燥并重悬于30μl含有25单位绿豆核酸酶(Pharmacia)的绿豆核酸酶缓冲液(30mM NaAc(pH4.6)、300mM NaCl、1mM ZnSO₄、0.35mM DTT、2％甘油)中。反应于30℃保温30分钟以剪切单链发夹DNA，随后，加入70μl 10mM Tris-Cl(pH7.5)、1mM EDTA，进行酚抽提，用2体积96％EtOH、0.1体积3M NaAc(pH5.2)在冰上放置30分钟进行沉淀。

用T4 DNA聚合酶形成平末端

离心回收双链cDNA，将反应混合物置于16℃保温1小时，使在30ml含有0.5mM各种dNTP和5单位T4 DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)的T4 DNA聚合酶缓冲液(20mM Tris-乙酸盐，pH7.9，10mMMgAc，50mM KAc，1mM DTT)中产生平末端。加入EDTA至终浓度20mM以终止反应，随后进行酚/氯仿抽提，加入2体积96％EtOH、0.1体积3M NaAc(pH5.2)，在-20℃沉淀12小时。

衔接子连接，NotI消化和大小选择

填平反应完成后，离心回收cDNA，在70％EtOH中洗涤，进行干燥。将cDNA沉淀重悬于25μl含有2.5μg非回文性BstXI衔接子(Invitrogen)和30单位T4连接酶(Promega)的连接缓冲液(30mMTris-Cl，pH7.8，10mM MgCl₂，10mM DTT，0.5mM ATP)中，于16℃保温12小时。65℃加热20分钟C终止反应，然后置冰上冷却5分钟。通过加入20μl水，5μl 10×NotI限制酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和50单位NotI(New England Biolabs)，随后于37℃保温2.5小时，从而用NotI限制酶消化连接好的cDNA。65℃加热10分钟终止反应。通过在0.8％SeaPlaque GTG低熔点琼脂糖凝胶(FMC)上于1×TBE中进行凝胶电泳，对cDNA进行大小分级分离，从而分离出未连接的衔接子和小cDNA。选择出分子量0.7kb以上的cDNA，并按照厂商说明用β-琼脂糖酶(New England Biolabs)从凝胶中将其释放出来，通过加入2体积96％EtOH和0.1体积3M NaAc(pH5.2)在-20℃放置12小时使cDNA沉淀。

构建文库：

离心回收定向的经大小选择过的cDNA，在70％EtOH中洗，干燥后重悬于30μl 10mM Tris-Cl(pH7.5)，1mM EDTA中。经过MicroSpin S-300 HR离心柱，按照厂商说明进行凝胶过滤，从而对cDNA进行脱盐。在含有5μl双链cDNA(反应管#1和#2)、15单位T4连接酶以及30ng(管#1)、40ng(管#2)和40ng(管#3，载体背景对照)BstXI-NotI切割的pYES2.0载体的10μl连接缓冲液(30mM Tris-Cl，pH7.8，10mM MgCl₂，10mM DTT，0.5mM ATP)中作三次检测连接。于16℃保温12小时进行连接反应，70℃加热20分钟，并向每个管加入10μl水。按照Sambrook等描述的方法(1989，分子克隆：实验指南，Cold Spring Harbor Lab.，ColdSpring Harbor NY)，通过电穿孔将每种连接混合物1μl导40μl电感受态大肠杆菌DH10B细胞(Bethesda ResearchLaboratories)中。利用最适条件，在大肠杆菌中建立文库，由各个群组成。将转化的大肠杆菌铺到琼脂平板(LB+氨苄青霉素)上，密度为37℃温育24小时后可形成15000-30000个菌落/板，这样制得了各个群。向平板中加入20ml LB+氨苄青霉素，使细胞悬浮其中。将细胞悬液在一个50ml试管中于37℃振荡1小时。按照厂商说明用QIAGEN质粒试剂盒从细胞中分离质粒DNA，保存在-20℃。

将来自每个群的1μl纯化质粒DNA样品(100ng/ml)经电穿孔(Becker和Guarante(1991)酶学方法194：182-187)转化酿酒酵母W3124，将转化子铺到含有2％葡萄糖的SC琼脂平板上，并于30℃温育。

鉴定阳性克隆

通过寻找木糖葡聚糖酶阳性菌落间接筛选菌落的XET表达情况。

琼脂平板生长3-5天后，将其影印到一组含有0.1％AZCL木糖葡聚糖的SC-URA琼脂(加有20％半乳糖)平板上。将这些平板于30℃培养3-7天。周围有蓝色圈的菌落确定为木糖葡聚糖酶阳性菌落。

将来自酶阳性菌落的细胞铺到琼脂平板上以分离出单菌落，挑选每个鉴定到的产木糖葡聚糖酶菌落的产酶单菌落。

检测所有木糖葡聚糖酶阳性克隆的XET，发现都是阳性。

分离cDNA基因以在曲霉中表达

将产XET的酵母菌落接种到50ml玻璃试管中的20ml YPD培养液中。试管于30℃振荡两天。于3000rpm离心10分钟收获细胞。

按照WO94/14953分离DNA，并将其溶于50ml水中。经标准操作将DNA转化到大肠杆菌中。用标准步骤从大肠杆菌中分离出质粒DNA，并进行限制酶分析。用限制酶BamHI和XbaI将cDNA插入片段切割下来，并连接到曲霉表达载体pHD414中，得到质粒pA2XG80。

用Applied Biosystems ABI PRISM^TM377 DNA测序仪，按照厂商说明，将经Qiagen纯化的pA2XG80(Qiagen，USA)质粒DNA中的cDNA插入片段测序，测序中使用Taq脱氧末端循环测序试剂盒(Perkin Elmer，USA)和合成寡核苷酸引物。

转化米曲霉或黑色曲霉

如此处引作参考文献的WO95/02043(16页，21行-17页，12行)所述制备原生质体。

将100μl原生质体悬液与10μl STC(1.2M山梨醇，10mMTris-HCl，pH＝7.5，10mM CaCl₂)中的5-25μg适当的DNA混合。将原生质体与p3SR2(携带构巢曲霉amdS基因的质粒)(ToveChristensen等，生物/技术，1419-1422页，6卷，1988年12月)混合。混合液置室温中25分钟。加入0.2ml 60％PEG4000(BDH29576)，10mM CaCl₂和10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，小心混匀(两次)，最后加入0.85ml同一溶液，小心混匀。混合液置室温25分钟，在2500g离心15分钟，将沉淀重悬于2ml 1.2M山梨醇中。再沉淀一次后，将原生质体铺在含有1.0M蔗糖(pH＝7.0)、10mM乙酰胺(作为氮源)以及20mM CsCl的基本平板(Cove，Biochem.Biophys.Acta 113(1966)：51-56)上，以抑制背景生长。于37℃温育4-7天后，挑出孢子，铺平板以形成单菌落。重复该过程，将第二次重分离后得到的单菌落的孢子作为明确的转化子保存起来。

检测米曲霉转化子

将每株米曲霉转化子接种在10ml YPM(参见下述)中进行增殖。于30℃培养2-5天后，除去上清。

用前面描述的XET点印迹检测方法鉴定XET活性。

下列序列(SEQ ID No：3)是pYES2.0中的XG80(得自Tiarosporella phaseolina的XET)的cDNA插入片段，其中包括克隆所用的BamHI和NotI识别位点：

GGATCCGAATTCCAACTATCCTGCCCTCCTTTCAAGCGAACACCATGAAGTTCTCCTCGGCTCT

GTTTCTGGCCGCTACG

GCGGTCTTGGCTTCCGCCGCGCCGCTTGAGCGCCGCGCCGACTTTTGTGGTCAATGGGACAACG

TGAAGAACGGACCTTA

CACTCTTTACAACAACCTGTGGGGAAAAGATGCTTCCGGAGCCTCCGGATCGCAATGCACCGGC

GTCGATAGCTTCAGCA

GCAACACCATCGCTTGGCACACATCCTGGTCCTGGTCCGGTGCTCAGTACAATGTCAAGTCTTA

CGCAAACGTGGTCGTC

GACATCACCTCTAAGAAACTCAGCGCCATCAGCAGCATTAACAGCATCTGGCGCTGGGCTTACA

CGGGTAGCAACATTGT

TGCCAATGTTGCCTACGATATCTTCACTTCATCCACTGTCGGTGGTAGCGAGGAATATGAAATC

ATGATATGGGTTGGTG

CTCTCGGTGGTGCTGGTCCGATCTCATCTACCGGCTCCCCTATTGCCACCGTTTCCCTTGCAGG

CTCCTCGTGGAAGCTC

TACAAAGGGCCCAACGGGCAGATGACCGTGTTCAGCTTCGTCGCCGAGTCCAACGTGAACAACT

TCAGCGGTGACCTTAA

CGCTTTCATCAAGTACCTCACCGGCAACCAGGGCCTTCCCGCCTCGCAATACATCAAGAGCATT

GGCGCTGGCACTGAGC

CGTTCACGGGTTCCAACGCCAAGCTGACCACTTCCTCCTACACTGTCAGCTTCAGATAACTGTG

AAGCTTTATGCTGCCC

TTATGCATCATCCTTGTACATAGTTATCACCAGGGGACTCTTGTAAATACGATTGCCTTATTAA

CCGCCTGCATCTGCTT

TCACACAATGGCATTTACCAATCAACAGTGCGCCTCGAATCCGTAAAAGGTGGCTTAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAA

AATTCCTGCGGCCGC.

下列序列(SEQ ID No：4)是XG80编码区的氨基酸序列：

MKFSSALFLAATAVLASAAPLERRADFCGQWDNVKNGPYTLYNNLWGKDASGASGSQCTGVDSF

SSNTIAWHTSWSWSGA

QYNVKSYANVVVDITSKKLSAISSINSIWRWAYTGSNIVANVAYDIFTSSTVGGSEEYEIMIWV

GALGGAGPISSTGSPI

ATVSLAGSSWKLYKGPNGQMTVFSFVAESNVNNFSGDLNAFIKYLTGNQGLPASQYIKSIGAGT

EPFTGSNAKLTTSSYT

VSFR.

本发明还涉及包含SEQ ID NO4所示氨基酸序列的微生物XET酶，或与SEQ ID NO4氨基酸序列至少80％同源、优选与至少85％同源、更优选至少90％同源、还要更优选至少95％同源、特别优选至少98％同源的XET。

如果通过已知算法(例如Lipman和Pearson在科学227(1985，1435页)中描述的那种算法)将多肽与亲本XET的相应氨基酸序列进行比较后发现有X％相同，则认为它们的同源性为X％。

Cl.XG80克隆于1998年2月24日保藏在DSMZ(保藏号DSM12032)。

序列表

(1)一般资料：

(i)申请人：

(A)姓名：Novo Nordisk A/S

(B)街道：Novo Alle

(C)城市：Bagsvaerd

(E)国家：丹麦

(F)邮政编码(ZIP)：DK-2880

(G)电话：45 4444 8888

(H)传真：45 4449 3256

(ii)发明题目：微生物木糖葡聚糖内切转糖基酶

(iii)序列数：4

(iv)计算机可读形式：

(A)培养基类型：软盘

(B)计算机：IBM PC可兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)

(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：27个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

Ala Glu Phe Cys Gly Gln Trp Asp Thr Gln Thr Val Gly Asn Tyr Ile

1 5 10 15

Val Tyr Asn Asn Leu Leu Gly Ala Gly Ser Ala

20 25

(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：24个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Xaa Asp Phe Cys Gly Gln Trp Asp Asn Val Lys Asn Gly Pro Tyr Thr

1 5 10 15

Leu Tyr Asn Asn Leu Gly Gly Lys

20

(2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：975个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

GGATCCGAAT TCCAACTATC CTGCCCTCCT TTCAAGCGAA CACCATGAAG TTCTCCTCGG 60

CTCTGTTTCT GGCCGCTACG GCGGTCTTGG CTTCCGCCGC GCCGCTTGAG CGCCGCGCCG 120

ACTTTTGTGG TCAATGGGAC AACGTGAAGA ACGGACCTTA CACTCTTTAC AACAACCTGT 180

GGGGAAAAGA TGCTTCCGGA GCCTCCGGAT CGCAATGCAC CGGCGTCGAT AGCTTCAGCA 240

GCAACACCAT CGCTTGGCAC ACATCCTGGT CCTGGTCCGG TGCTCAGTAC AATGTCAAGT 300

CTTACGCAAA CGTGGTCGTC GACATCACCT CTAAGAAACT CAGCGCCATC AGCAGCATTA 360

ACAGCATCTG GCGCTGGGCT TACACGGGTA GCAACATTGT TGCCAATGTT GCCTACGATA 420

TCTTCACTTC ATCCACTGTC GGTGGTAGCG AGGAATATGA AATCATGATA TGGGTTGGTG 480

CTCTCGGTGG TGCTGGTCCG ATCTCATCTA CCGGCTCCCC TATTGCCACC GTTTCCCTTG 540

CAGGCTCCTC GTGGAAGCTC TACAAAGGGC CCAACGGGCA GATGACCGTG TTCAGCTTCG 600

TCGCCGAGTC CAACGTGAAC AACTTCAGCG GTGACCTTAA CGCTTTCATC AAGTACCTCA 660

CCGGCAACCA GGGCCTTCCC GCCTCGCAAT ACATCAAGAG CATTGGCGCT GGCACTGAGC 720

CGTTCACGGG TTCCAACGCC AAGCTGACCA CTTCCTCCTA CACTGTCAGC TTCAGATAAC 780

TGTGAAGCTT TATGCTGCCC TTATGCATCA TCCTTGTACA TAGTTATCAC CAGGGGACTC 840

TTGTAAATAC GATTGCCTTA TTAACCGCCT GCATCTGCTT TCACACAATG GCATTTACCA 900

ATCAACAGTG CGCCTCGAAT CCGTAAAAGG TGGCTTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 960

AATTCCTGCG GCCGC 975

(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：244个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

Met Lys Phe Ser Ser Ala Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Val Leu Ala

1 5 10 15

Ser Ala Ala Pro Leu Glu Arg Arg Ala Asp Phe Cys Gly Gln Trp Asp

20 25 30

Asn Val Lys Asn Gly Pro Tyr Thr Leu Tyr Asn Asn Leu Trp Gly Lys

35 40 45

Asp Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ser Gln Cys Thr Gly Val Asp Ser Phe

50 55 60

Ser Ser Asn Thr Ile Ala Trp His Thr Ser Trp Ser Trp Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Tyr Asn Val Lys Ser Tyr Ala Asn Val Val Val Asp Ile Thr Ser

85 90 95

Lys Lys Leu Ser Ala Ile Ser Ser Ile Asn Ser Ile Trp Arg Trp Ala

100 105 110

Tyr Thr Gly Ser Asn Ile Val Ala Asn Val Ala Tyr Asp Ile Phe Thr

115 120 125

Ser Ser Thr Val Gly Gly Ser Glu Glu Tyr Glu Ile Met Ile Trp Val

130 135 140

Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Pro Ile Ser Ser Thr Gly Ser Pro Ile

145 150 155 160

Ala Thr Val Ser Leu Ala Gly Ser Ser Trp Lys Leu Tyr Lys Gly Pro

165 170 175

Asn Gly Gln Met Thr Val Phe Ser Phe Val Ala Glu Ser Asn Val Asn

180 185 190

Asn Phe Ser Gly Asp Leu Asn Ala Phe Ile Lys Tyr Leu Thr Gly Asn

195 200 205

Gln Gly Leu Pro Ala Ser Gln Tyr Ile Lys Ser Ile Gly Ala Gly Thr

210 215 220

Glu Pro Phe Thr Gly Ser Asn Ala Lys Leu Thr Thr Ser Ser Tyr Thr

225 230 235 240

Val Ser Phe Arg

Claims

1.一种木糖葡聚糖内切转糖基酶(XET)的生产方法，包括：

(a)在适宜的营养培养基中，有利于XET酶产生的条件下培养表达微生物XET的一种微生物，以及

(b)随后从培养基中回收XET酶。

2.根据权利要求1的方法，其中所述微生物是真菌或细菌。

3.根据权利要求2的方法，其中所述真菌是担子菌，接合菌，子囊菌或有丝分裂孢子真菌。

4.根据权利要求3的方法，其中所述真菌是革盖菌目、裂褶菌目、韧革菌目或Xenasmatales目的担子菌菌株。

5.根据权利要求4的方法，其中所述真菌是选自属于革盖菌科、伏革菌科、裂褶菌科、韧革菌科和Tubulicrinaceae各科菌株的担子菌。

6.根据权利要求4的方法，其中所述真菌是选自栓菌属、伏革菌属、裂褶菌属、韧革菌属(Stereum)或Tubulicrinis属菌株的担子菌。

7.根据权利要求6的方法，其中所述真菌是选自毛栓菌、玫瑰色伏革菌、裂褶菌属之种、毛韧革菌和Tubulicrinis subulatus种菌株的担子菌。

8.根据权利要求7的方法，其中所述真菌是裂褶菌属之种，保藏号CBS443.97。

9.根据权利要求3的方法，其中所述子囊菌是选自属于腔菌纲、盘菌纲、核菌纲和不整囊菌纲的菌株。

10.根据权利要求9的方法，其中所述子囊菌选自属于座囊菌目、斑痣盘菌目、盘菌目、锤舌菌目、炭角菌目、肉座菌目、海壳目、黑痣菌目、腐皮壳菌目和散囊菌目各目的菌株。

11.根据权利要求10的方法，其中所述子囊菌选自属于小球腔菌科、葡萄座腔菌科、小穴壳菌科、球腔菌科、毛筒壳科、斑痣盘菌科、肉盘菌科、火丝菌科、核盘菌科、圆孔壳科、Hyponectriaceae、炭角菌科、黑腐皮壳科、黑盘孢科、肉座菌科、海壳科、黑痣菌科和发菌科各科的菌株。

12.根据权利要求11的方法，其中所述子囊菌选自属于盾壳霉属、茎点霉属、二孢属、Plowrightia、叶点霉属、壳针孢属、毛筒壳属、链格孢属、Embellisia、Tiarosporella、Galiella、珠头霉属，假黑盘菌属、火丝菌属、葡萄孢属、外壳孢属、盘多毛孢属、多毛菌属、Chaetapiospora、孔座壳属、Nodulisporium、炭角菌属、壳囊孢属、座盘孢属、拟茎点霉属、棒盘孢属、Seimatosporium、镰孢属、轮枝孢属、周刺座霉属、Lulworthia、刺盘孢属、曲霉属、散囊菌属、正青霉属、青霉属、Petromyces和踝节菌属各属的菌株。

13.根据权利要求12的方法，其中所述子囊菌选自属于棉色二孢、Plowrightia ribesia、叶点霉属之种、壳针孢属之种、Tubeufia amazonensis、链格孢属之种、Embellisia hyacinthi、新茎点霉、热带茎点霉、盾壳霉属之种、橄榄色盾壳霉、当克盾壳霉、Tiarosporella sp.、Tiarosporella phaseolina、Galiellacelebica.、淡黑假黑盘菌、砖火丝菌、珠头霉属之种、灰色葡萄孢、外壳孢属之种、盘多毛孢属之种、多毛菌属之种、点孔座壳、炭角菌属之种、Nodulisporium sp.、腐皮镰孢、轮枝孢属之种、巴西周刺座霉、Chaetapiospora rhododendri、Lulworthiauniseptata、棘孢刺盘孢、Colletotrichum crassipes、壳囊孢属各种、座盘孢属之种、拟茎点霉属之种、Phomopsis cirsii、栗棒盘孢、Seimatosporium 7ichenicola、塔木里氏曲霉、Eurotiumche valieri、爪哇正青霉、胶囊青霉、奥尔森氏青霉、嗜松青霉、娄格法尔特氏青霉、意大利青霉、疣孢青霉、变灰青霉、Petromycesalliaceus和黄色踝节菌各种的菌株。

14.根据权利要求13的方法，其中所述子囊菌选自属于灰色葡萄孢保藏号CBS447.97、淡黑假黑盘菌保藏号CBS444.97、Tiarosporella phaseolina保藏号CBS446.97、盘多毛孢属之种保藏号CBS445.97和Lulworthia uniseptata保藏号CBS442.97等种的菌株。

15.根据权利要求3的方法，其中所述接合菌选自属于毛霉目的菌株。

16.根据权利要求15的方法，其中所述真菌是选自属于丝枝霉科和毛霉科菌株的接合菌。

17.根据权利要求16的方法，其中所述真菌是选自属于Dichotomocladium、放射毛霉属、球托霉属、Sporodiniella和毛霉属各属菌株的接合菌。

18.根据权利要求17的方法，其中所述真菌是选自属于Dichotomocladium hesseltinei、雅致放射毛霉、卵形孢球托霉、米赫毛霉minor变种和Sporodiniella umbellata各种内菌株的接合菌。

19.根据权利要求18的方法，其中所述真菌是卵形孢球托霉保藏号CBS448.97。

20.根据权利要求2的方法，其中所述真菌是有丝分裂孢子真菌。

21.根据权利要求1的方法，其中所述微生物是Vialaeainsculpta。

22.根据权利要求2的方法，其中所述细菌是革兰氏阳性细菌。

23.根据权利要求22的方法，其中所述革兰氏阳性细菌是芽孢杆菌。

24.根据权利要求23的方法，其中所述革兰氏阳性细菌是嗜碱芽孢杆菌保藏号DSM11404。

25.根据权利要求1到24中任何一项得到的XET制剂用于处理纤维素材料的用途。

26.根据权利要求25的用途，其中所述处理能使纤维素材料具有改善的强度和/或提高的保形性能和/或更好的抗皱性能。

27.根据权利要求25的用途，其中所述纤维素材料是纤维素织物或纸和纸浆产品。

28.一种木糖葡聚糖内切转糖基酶制剂，它能通过培养表达微生物XET的一种微生物产生。

29.根据权利要求28的制剂，其中所述XET具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，或者该XET具有与SEQ ID NO.1至少80％同源的氨基酸序列。

30.根据权利要求28的制剂，其中所述XET具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，或者该XET具有与SEQ ID NO.2至少80％同源的氨基酸序列。

31.根据权利要求28的制剂，其中所述XET具有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列，或者该XET具有与SEQ ID NO.4至少80％同源的氨基酸序列。

32.根据权利要求28的制剂，其中所述XET在pH3到11、尤其是pH 4到9有活性。

33.一种木糖葡聚糖内切转糖基酶(XET)的生产方法，包括：

(a)在适宜的营养培养基中，有利于XET酶产生的条件下，培养表达微生物XET的一种转化宿主微生物，以及

(b)随后从营养培养基中回收XET酶。