CN1639320A

CN1639320A - 冷休克诱导的异源多肽的表达和生产

Info

Publication number: CN1639320A
Application number: CNA038049171A
Authority: CN
Inventors: M·恩诺耶; S·普哈德塔雷; B·夏; G·晴; H·柯
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2002-03-01
Filing date: 2003-02-25
Publication date: 2005-07-13
Anticipated expiration: 2023-02-25
Also published as: JP2005518804A; JP4249031B2; US20050272924A1; WO2003074657A3; EP1478733A4; CN100385004C; KR20040086424A; CA2477856A1; AU2003216384A8; AU2003216384A1; TW200401029A; WO2003074657A2; EP1478733A2; US7605000B2

Abstract

本发明涉及DNA分子或载体以及含有这种DNA分子或载体的宿主细胞，该DNA分子或载体可在宿主细胞内引起冷休克反应的条件下用于生产异源多肽。该DNA分子和载体包括编码异源多肽的核苷酸序列以及启动子和指导其表达的冷休克诱导基因的5’－UTR。另外，在冷休克诱导条件下增强翻译的富含AT的序列位于异源多肽的编码序列中或者位于在编码序列以及冷休克诱导启动子和5’－UTR之间插入的另外的元件中。

Description

冷休克诱导的异源多肽的表达和生产

发明背景

发明领域

本发明涉及用于冷休克诱导的异源多肽表达和生产的DNA分子、载体、宿主和方法。

相关技术的描述

当将在37℃生长的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞转移到低温如15℃时，在称为顺应期的生长延滞期期间瞬间诱导出一系列非常高水平的称为冷激蛋白的蛋白质(Jones等，1987)。这些冷休克特异性蛋白包括：CspA、CspB、CspG、CspI、CspdA、RbfA、NusA以及PNP(综述见Phadtare等，1999，2000和2002；Yamanaka等，1998)。在它们中，已经鉴定出CspA是主要的冷激蛋白，由70个氨基酸残基构成。

大肠杆菌(E.coli)的CspA家族由九个同源蛋白构成，从CspA到CspI，但是它们中仅CspA、CspB、CspG和CspI是冷休克诱导的。有趣地是，cspA基因在正常的和低生长温度时都是非必需的(Bae等，1997)。由于在细胞冷适应期间CspA家族的成员在功能上相互重叠，因此似乎没有一种CspA同源物单独负责冷休克适应(Xia等，2001)。实际上，一种ΔcspAΔcspBΔcspG三缺失菌株仍然存活，而ΔcspAΔcspBΔcspGΔcspE四缺失菌株在低温下不能形成菌落。有趣地是，已经显示除CspD外该九种CspA同源物的任何一个单基因能够补充四缺失菌株的冷敏感性(Xia等，2001)。已经显示CspA不同于CspB、CspG和CspI被调节(Etchegaray等，1996和Wang等，1999)。在24℃和10℃之间观察到高水平的CspA生产，而仅在温度改变到20℃以下后才产生CspB和CspG，最大诱导在15℃。在10-15℃之间诱导CspI。也已经显示在完全阻断蛋白合成的低温条件下诱导CspA、CspB和CspG(Etchegaray等，1999)。

cspA的表达以一种复杂的方式被调节，即在转录水平、mRNA稳定性和翻译效率上被调节(综述见Phadtare等，2000和Yamanake等，1998)。cspA基因具有由159个碱基构成的异常长的5’非翻译区(5’-UTR)。cspA 5’-UTR的缺失分析显示这个区域负责其在37℃的极不稳定性(半衰期少于12秒)，并对低温时mRNA的稳定有积极的影响(Jiang等，1996和Mitta等，1997)。在冷休克后即刻显著地稳定cspA mRNA(半衰期超过20分钟)。这种稳定是短暂的，一旦细胞适应了低温就丧失。这反过来调节cspA的表达。

由于cspA的诱导不需要特异性的转录因子，因此cspA的冷休克诱导完全不同于热休克诱导。有趣地是，cspA启动子在37℃有活性，但是由于cspA mRNA在这个温度极不稳定，因此CspA大量减少。因此，cspA mRNA的5’-UTR在其冷休克诱导中起决定性的作用。最近，已经显示在37℃早期指数生长期期间产生CspA，其mRNA在中期到晚期指数生长期间变得不稳定(Yamanake等，2001和Brandi等，1999)。在几个冷休克mRNA中cspA mRNA的5’-UTR区含有保守的“冷盒”序列。这个区域形成了稳定的茎-环结构，随后是富含AU的序列(Fang等，1998)。本发明者的实验室证明由于茎-环结构的缺失显著地使mRNA不稳定并且减少了大约50％冷休克诱导的cspA mRNA量，因此在冷休克后这个区域对于正常的cspA mRNA诱导是必需的。然而，富含AU的序列轻微地使mRNA不稳定。茎的完整对稳定功能是必需的，而环序列的完整是次要的(Xia等，2001)。

缺乏起始密码子(AUG)和编码序列两者的突变体cspA mRNA的过度表达导致低温时严重的生长抑制并伴随染色体cspA表达的抑制。此外，过量表达的RNA稳定地与30S和70S核糖体相联系。本发明人实验室的结果说明5’-UTR本身在低温时具有对核糖体显著的亲和力。5’-UTR在15℃时的过量生产导致延迟诱导冷休克反应，并且不仅CspA而且CspB和CspG的合成被延长(Fang等，1998和Jiang等，1996)。通过5’-UTR和CspA一起的共生产抑制了这些影响。已经显示紧邻cspA启动子-35区的上游富含AT的序列作为正元件增强cspA转录。正元件的缺失导致cspA启动子活性的降低(Goldenberg等，1997和Mitta等，1997)。另一个有助于更高启动子活性的重要因素是紧邻-10区的上游存在TGn基序(Kumar等，1993)。据报道这个基序与-10区一起构成扩大的-10区，在这个区域存在时-35区是非必需的。

重要地是，也在翻译水平调节cspA的表达。在生长延滞期(适应期)期间冷激蛋白的优先合成暗示它们的mRNAs不像绝大多数其它细胞(非冷休克)的mRNAs，拥有能在低温无冷休克的核糖体因子如RbfA和CsdA时，形成翻译起始复合物的机制。本发明人实验室最近的数据显示在CspA的编码序列内有在低温时增强其翻译的元件。已经提出冷激蛋白如CspA、CspB、CspG、CspI、CsdA和RbfA的mRNAs在编码区中具有被称为下游盒(DB)的元件，其增强翻译起始(Mitta等，1997)。最初，提出该DB序列与16S rRNA的次末端茎中的区域互补，并且位于起始密码子下游的几个碱基。一直争论DB如何增强翻译起始(Etchegaray等，1999和O’Connor等，1999)以及最初提出的通过结合到16S rRNA上而便于形成翻译前起始复合体的机制可能不是精确的机制。

在大肠杆菌(E.coli)中观察到被称作“LACE”效应(截短的cspA表达的低温抗生素效应)的现象(Jiang等，1996和Xia等，2001)。当在低温下过量表达截短的cspA基因时，完全阻滞了细胞生长。这已经被证实是由于几乎所有的细胞核糖体被截短的cspA mRNA捕获所致。这种截短的mRNA仍然能够在低温时与未适应的核糖体形成前起始复合物。通过在克隆到pUC载体上cspA基因中的第2个(pA01S)或者第11个(pA10S)或者第31个(pA30S)密码子中掺入终止密码子，已经进行了核糖体被截短的cspA mRNA捕获的清楚证明(Xia等，2001)。在37℃，包含这些质粒的细胞完全正常，而一旦冷休克则细胞完全停止生长。它们在15℃不可能形成菌落，使用³⁵S-甲硫氨酸，没有蛋白被标记。当分析这些细胞的多聚核糖体分布图时，仅表达起始密码子(pA01S)的细胞仅仅含有单核糖体，没有任何多聚核糖体峰。含有pA10S的细胞显示二核糖体和单核糖体，含有pA30S的细胞再次显示三核糖体、二核糖体和单核糖体，无任何巨大的多聚核糖体峰。此外，显示多聚核糖体被截短的cspA mRNA接管，主要的细胞mRNA(1pp)被排除在多聚核糖体之外。这些结果清楚地说明在起始步骤中决定了cspA mRNA的强烈的能译性。在这个研究中，本发明人的实验室也证明在cspA mRNA的5’-UTR内的上游区在导致LACE效应的翻译起始复合物的形成中起着重要的作用(Xia等，2001)。

已经提出CspA和其同源物是RNA的伴侣蛋白，使mRNAs的二级结构不稳定(Bae等，2000；Jiang等，1997和Phadtare等，2001)。由于ΔcspAΔcspBΔcspGΔcspE四缺失菌株在低温下不能生长，而单个的csp基因能够补充冷敏感性(Xia等，2001)，因此认为RNA的伴侣蛋白的功能对低温下细胞mRNAs的有效翻译是关键的，其阻止稳定的二级结构的形成，该结构的形成抑制mRNA的翻译(Phadtare等，2001)。

已经证明含有cspA启动子的冷诱导的载体可用于有聚集倾向的蛋白如前S2-S’-β-半乳糖苷酶和TolAI-β-内酰胺酶的表达(Mujacic等，1999；Vasina等，1997和Vasina等，1996)。美国专利6,333,191 B1公开了cspA和cspB的启动子以及具有这样启动子的载体。

这里任何文献的引用不应认为是承认这类文献是相关的现有技术，或者认为是赋予本申请的任何权利要求专利权性的材料。对任何文献的内容或者数据的任何陈述是基于申请人在申请日时可获得的信息，并不构成对这种陈述正确性的承认。

发明概述

本发明提供能够在宿主细胞中引起冷休克反应的条件下在宿主细胞中表达异源多肽的DNA分子和载体。根据本发明该DNA分子含有编码异源多肽的核酸序列，该序列被可操作地连接到在引起冷休克反应的条件下在宿主细胞中指导表达和生产异源多肽的冷休克诱导的基因启动子和5’-非翻译区(5’-UTR)序列上。另外，或者编码异源多肽的核酸序列在起始密码子下游约第4到第7个密码子上具有富含AT的序列(自然发生的或者通过例如定点诱变产生)，或者在编码异源多肽的核苷酸序列以及冷休克诱导的启动子和5’-UTR序列之间插入翻译增强元件。这种翻译增强元件含有起始密码子以及在起始密码子下游约第4到第7个密码上富含AT的序列以与编码异源多肽的核苷酸序列形成翻译符合读框的融合。

本发明也提供用根据本发明的DNA分子和载体转化的宿主细胞以及使用这样的宿主细胞在冷休克诱导的条件下生产异源蛋白的方法，如用于全细胞或细胞裂解物的NMR光谱研究。

附图的简要描述

图1显示原型冷休克载体pCold结构的图示。

图2A和2B是显示在37℃(图2A)和15℃(图2B)线虫(C.elegans)蛋白表达的凝胶。在图2A中，显示在每个实例中使用(+)和没有使用(-)IPTG的蛋白表达。在图2B中，显示每个实例中在0、12和24小时在15℃下使用冷休克载体的线虫(C.elegans)蛋白的表达。

图3是显示三个用冷休克载体生产线虫(C.elegans)蛋白的时间分布图凝胶。显示在15℃下在0、24、48、72、96和120小时时WR49、WR35和WR26的表达。分析总的细胞裂解物。用考马斯蓝染料将凝胶染色。

图4A和4B是使用冷休克载体表达γ-干扰素的SDS-PAGE分析。在图4A中显示SDS-PAGE的考马斯染色，泳道1：在15℃下使用IPTG诱导前；泳道2-5：分别是在15℃下24、48、72和96小时的表达；泳道6：在37℃的表达。在图4B中显示脉冲标记细胞的SDS-PAGE分析，泳道1：在37℃的表达；泳道2-4：分别是在15℃下1小时、3小时和5小时的表达。

图5是显示N¹²-下游序列的A/T含量和β-半乳糖苷酶活性之间相关性的图。对于57个随机选择的克隆中的每一个，计数A加T的数量并且对相应β-半乳糖苷酶的活性绘图。

图6显示所选克隆的蛋白水平和β-半乳糖苷酶活性之间关系的图。含有各自质粒的细胞在37℃生长到0.5的OD₆₀₀nm并用1mM IPTG诱导。通过SDS-PAGE分析蛋白的表达，通过光密度分析测量条带的强度。

图7是显示所选克隆的β-半乳糖苷酶活性、蛋白水平和lacZmRNA水平的条形图和凝胶的联合图。

图8是显示在具有最高和最低β-半乳糖苷酶活性的克隆的多聚核糖体分布图中lacZ和ompA mRNA分布的图和凝胶。显示了各自的N¹²序列(SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：26)。

图9显示cspA mRNA 5’-UTR结构的图示。在每个第10碱基上打上小点。上游盒(UB)被圈成盒，SD序列用粗体显示，在起始密码子下有下划线，cspA的ORF用粗体表示并被圈成盒。cspA ORF的上游5’-UTR序列对应于SEQ ID NO：48，cspA ORF的下游3’-UTR序列对应于SEQ ID NO：49。

图10A和10B显示5’-UTR cspA mRNA中SD序列的上游ε样序列。图10A是ε样序列的突变分析，其中野生型序列显示为Wt(SEQ ID NO：28)。ε序列以粗体显示。图10B是SD序列以及ε序列和AUG密码子之间的距离的突变分析。ε样序列1-16分别是SEQ ID Nos：29-44。

图11A-11C显示pCold I、II和III载体结构的图示。

图12A-12C显示核苷酸序列SEQ ID NO：45(图12A)，SEQ ID NO：46(图12B)和SEQ ID NO：47(图12C)，它们被插入到用HindIII和EcoRI切割并用克列诺片段填平的pUC19中。

图13是cspA、cspB、cspG和cspI的启动子、5’-UTR以及最初的13个密码子核苷酸的序列对比。与cspI相同的核苷酸显示为点。为了使对比最大化，引进了一些缺口，这些缺口用短条表示。转录起始位点用粗体字母显示并且标记为+1。翻译起始密码子ATGs也用粗体字母显示并在下面划线。将最同源的序列(正元件，-35区，-10区，冷盒，上游序列，Shine-Dalgarno(SD)序列和下游盒)圈成盒并标示。

图14A和14B显示在用考马斯亮蓝染色、超速离心后，大肠杆菌(E.coli)BL21的上清液(将500ml含有pColdI-Envz ATP结合域的大肠杆菌(E.coli)BL21培养物培养48小时，冷休克)的用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶(图14A)以及冷休克后的总细胞裂解液、沉淀和上清液的SDS-PAGE凝胶(图14B)。Envz ATP结合域也被称为片段B。在图14B中，泳道1：冷休克12小时后加样50μl总细胞裂解液；泳道2：冷休克24小时后加样50μl总细胞裂解液；泳道3：冷休克36小时后加样50μl总细胞裂解液；泳道4：冷休克48小时后加样50μl总细胞裂解液；泳道5：在第2轮超声处理期间以15,000rpm离心30分钟后，加样2μl沉淀(总共1ml)；泳道6：在第2轮超声处理期间以45,000rpm超速离心4小时后，加样2μl沉淀(总共1ml)；泳道7：在第2轮超声处理期间以45,000rpm超速离心4小时后，加样1μl上清液；泳道8：在第1轮超声处理期间以45,000rpm超速离心4小时后，加样1μl上清液(用于NMR的样品)。

图15A和15B显示含有EnvZ-ATP结合域的没有纯化的细胞裂解液上清的(¹H-¹⁵N)HSQC NMR光谱(图15A)以及纯化的EnvZ-ATP结合域的HSQC NMR光谱(图15B)。

发明详述

使用大肠杆菌(Escherichia coli)作为模型系统，本发明人的实验室已经发现有许多仅在低温时是生长所需的冷激蛋白。在这些冷激蛋白中，CspA是主要的冷激蛋白，并且一旦发生冷休克便以高于10⁶分子/细胞(10^-4M)的水平被诱导。已经显示cspA mRNA的翻译起始在低温时特别高效，并且发现cspA mRNA具有抑制所有其它细胞mRNA翻译的能力。例如，当紧邻cspA的起始密码子之后加入无义密码子时，来自pUC载体中截短的cspA基因的mRNA捕获所有的细胞核糖体，在冷休克后完全阻断其它细胞蛋白的合成，从而完全抑制细胞在低温下的生长。这种现象被称为“LACE效应”。因此，与其冷休克诱导的mRNA稳定性和其高效的启动子一起利用cspA mRNA的显著的翻译优势，本发明人设计了冷休克诱导的载体-宿主系统，其中所有的细胞核糖体仅仅用于在低温时生产克隆的基因产物，从而在冷休克后提供极高的感兴趣基因产物/蛋白的表达。

尽管已经显示含有cspA启动子的冷诱导的载体可用于倾向于聚集的蛋白如前S2-S’-β-半乳糖苷酶和TolAI-β-内酰胺酶的表达(Mujacic等，1999；Vasina等，1996和1997)，然而其它元件对在低冷休克诱导温度时的高效翻译最为关键。

本发明因而提供了能够在冷休克条件下表达异源多肽的DNA分子，其中DNA分子优选是自我复制的表达载体。根据本发明的DNA分子含有编码感兴趣的异源多肽/蛋白的核苷酸序列以及可操作地连接到其上的冷休克诱导的启动子和5’-非编码区(5’-UTR)以便在引起冷休克反应的条件下控制和指导宿主细胞中感兴趣的异源多肽的表达和生产。为了增强翻译效率，或者编码异源多肽的核酸序列在起始密码子下游约第4到第7个密码上具有富含AT的序列(自然发生的或者通过例如定点诱变产生的)，或者在多肽以及冷休克诱导的启动子和5’-UTR序列之间插入翻译增强元件。这种翻译增强元件含有起始密码子和在起始密码子下游约第4或第7个密码子上富含AT的序列以与编码异源多肽的核苷酸序列形成翻译的符合读框的融合。

本发明人已经发现富含AT的序列在翻译起始步骤增强翻译。已经提出富含AT的序列，其不具有起始密码子下游的二级结构，可能便于核糖体进入，因而提高翻译起始和随后的延伸反应的效率。这反过来将提高mRNA的稳定性以及最终的多肽/蛋白产量。富含A或A/T的信使RNA是不形成结构的，这样的容易变性的mRNA被核糖体高效地容纳，因而有利于翻译起始和/或早期延伸。

术语“异源多肽”意指不是在天然存在的宿主细胞中从冷休克诱导的启动子中天然表达的任何多肽。因此，虽然“异源多肽”可能是与冷休克诱导的启动子和5’-UTR相同来源的多肽，例如来源于大肠杆菌(E.coi)，但是只要其不是从这个启动子中天然表达的，然而优选地，这个多肽是在不同于冷休克诱导的启动子和5’-UTR来源的来源，例如非大肠杆菌(E.coi)来源，如人中天然表达的。

如果其含有包含转录和翻译调节信息的核苷酸序列，并且这样的序列是“可操作地连接到”编码多肽的核苷酸序列上，那么所述的DNA分子将“能够表达”多肽，如异源多肽。可操作的连接是一种键，其中调节的DNA序列和试图要表达的DNA序列以这种方式连接以便允许基因表达。基因表达需要的调节区一般包括启动子区和DNA序列，当该序列被转录成RNA时，将标志蛋白合成的开始。这样的区域通常将包括那些涉及转录和翻译起始的5’-非编码序列。

如果启动子能够影响那个DNA序列的转录，那么启动子区将被可操作地连接到DNA序列上。这里使用的“启动子序列”是在DNA上发现并且是被RNA聚合酶转录的启动子序列。因此，为了表达异源多肽，被宿主细胞识别的转录和翻译信号是必需的。

就术语“冷休克”来说，其意思是将宿主细胞的培养/生长温度降到其正常生理生长温度以下，如温度至少降到约13℃。

用于核苷酸序列的术语“富含AT”被定义为具有至少70％的AT碱基含量。

诱导冷休克的启动子和5’UTR序列优选是大肠杆菌(E.coli)的cspA、cspB，cspG或cspI基因的诱导冷休克的启动子和5’-UTR序列中的任何一种。启动子和5’-UTR区的核苷酸序列以及上述大肠杆菌(E.coli)冷激蛋白的编码区和3’-UTR区呈现为具有SEQ ID NO：2作为编码的CspA氨基酸序列的SEQ ID NO：1(cspA)，具有SEQ ID NO：4作为编码的CspB氨基酸序列的SEQ ID NO：3(cspB)，具有SEQ ID NO：6作为编码的CspG氨基酸序列的SEQ ID NO：5(cspG)，具有SEQ ID NO：8作为编码的CspI氨基酸序列的SEQ ID NO：7(cspI)。序列也可以从NCBI GenBank数据库中以登记号AE000252(CspB和CspI)、AE000433(CspA)和AE000201(CspG)获得。CspA、cspB、cspG和cspI的启动子和5’-UTR区序列分别对应于SEQ ID NO：1的第22-441位核苷酸、SEQ ID NO：3的第11-214位核苷酸、SEQ ID NO：5的第12-213位核苷酸以及SEQ ID NO：7的第11-201位核苷酸，并在图13中显示为序列对比。

本领域那些技术人员理解将会，因此只要维持其在冷休克诱导的条件下指导高效表达和翻译的能力，那么在本发明的DNA分子中使用的冷休克诱导的启动子和5’-UTR可以是cspA、cspB、cspG或cspI中任何一个的启动子和5’-UTR序列的片段或变体。其中某些序列被删除、取代或插入的片段和突变体将被包含在本发明内，并且在实施例中提供指导。

本发明一个优选的实施方案是其中已经在编码异源多肽核苷酸序列的第4至第7个密码子中存在的富含AT的序列用作翻译增强元件。这种富含AT的序列可以存在于天然存在的编码异源多肽的核苷酸序列中，或者可以通过例如定点突变被引入到编码序列中。例如，可以通过将每个密码子的第3个碱基，如果其是G或C，则替换成A或T以提高从第4密码子到第7密码子区的AT含量。由于密码子选择的简并性，因此这通常是可以做到的而不改变这个区域的氨基酸序列。

另一个优选的实施方案是其中优选将冷休克诱导的启动子和5’-UTR序列通过由7个密码子的核苷酸序列构成的翻译增强元件连接到编码异源多肽的核苷酸序列上，其中第一个密码是起始密码子，第4到第7个密码子构成富含AT的序列。这种翻译增强元件的一个实施方案是SEQ ID NO：9的第1-18个核苷酸的核苷酸序列，它可通过克隆到实施例3中描述的pColdII载体NdeI位点中而产生。

优选地，根据本发明的DNA分子也包括3’UTR序列，如cspA、cspB、cgpG或cspI中任何一个的3’UTR。3’UTR特别优选的实施方案是cspA3’UTR，其包括SEQ ID NO：1的第442-539位核苷酸或其片段。

在另一个实施方案中，本发明的DNA分子可任选地含有lacI操纵子序列，如SEQ ID NO：10的核苷酸序列，紧邻冷休克诱导的启动子的转录起始位点下游。如果异源多肽，甚至在非诱导的条件下处于渗漏的低表达水平的异源多肽对宿主细胞在其正常生理生长温度时的生长是有毒的，那么可使用这样的lacI操纵子避开这些问题。以这种方式，仅在冷休克和存在IPTG时才能产生异源蛋白。

本发明也提供含有根据本发明DNA分子的载体。优选地，载体自我复制并且在引起冷休克反应的条件下指导异源多肽在宿主细胞中的表达。本发明载体优选的实施方案是实施例3中描述的pColdI、pColdII和pColdIII载体。所有这三种载体具有相同的pUC19主链(在HindIII和EcoRI位点切割，接着用克列诺片段填平)，但是插入序列不同。图12A-12C分别显示了pColdI、II和III的插入序列。

本发明的另一个方面提供用根据本发明的DNA分子或载体转化的原核宿主细胞。优选地，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。如这里的实施例4中讨论的，优选宿主细胞是缺乏多核苷酸磷酸化酶活性(pnp^-)的多核苷酸磷酸化酶(pnpase)突变体或者是缺乏与游离30s核糖体亚单位结合而不与70s核糖体亚单位结合(rbfA^-)的15KDa RbfA蛋白的rbfA突变体。本发明宿主细胞的另一个优选的实施方案是pnp^-和rbfA^-两者的宿主细胞。进一步的实施方案包括缺乏CsdA RNA解旋酶活性(csdA^-)的CsdA RNA解旋酶突变体以及与在宿主细胞中过度表达CsdA RNA解旋酶的载体一起共转化的宿主细胞。这些csdA^-或CsdA过度表达的宿主细胞优选也是pnp^-和/或rbfA^-。

本发明的进一步方面是致力于生产异源多肽的方法，包括单不限于药用的重要蛋白，如用作治疗或作为靶的人蛋白、易于热变性的蛋白、标记蛋白和在NMR研究中使用的蛋白。该方法包括在营养培养基中在宿主细胞的正常生理生长温度下，培养含有本发明DNA分子或载体的本发明的宿主细胞，然后通过将培养温度降到至少比宿主细胞的正常生理生长温度低13℃的温度，将培养的宿主细胞进行冷休克以诱导异源多肽的生产。将冷休克的宿主细胞保持在经过降低的冷休克温度以在生产期期间生产异源蛋白。随后回收所生产的异源多肽。在另一个实施方案中，将培养温度降到比宿主细胞的正常生理生长温度低至少20℃。

本发明方法的优点如下：

1.由于通过下调温度来进行蛋白诱导，因此不需要化学诱导物如IPTG。

2.一旦发生冷休克，细胞被转变进入用于单一感兴趣蛋白的蛋白合成机制。由于所有的细胞核糖体被用于在载体上克隆蛋白的mRNA捕获了，因此实际上阻滞了细胞内所有其它蛋白的合成。

3.因此，冷休克后通过更换培养基(例如将¹²C-葡萄糖/¹⁴NH₄Cl-碱培养基更换成¹³C-葡萄糖/¹⁵NH₄Cl-碱培养基)，仅仅是感兴趣的蛋白可以被同位素标记，消除了¹³C，¹⁵N同位素标记样品的纯化过程。

4.如果产生分子量为20kDa的蛋白(以总细胞蛋白的60％的水平，并且注意到一旦冷休克后只有这种蛋白是新合成的)，那么每升蛋白的总产量是大约120mg。假如80％的这种蛋白是以可溶形式产生的，使用在4ml缓冲液中的细胞悬液或从悬液中制备的细胞裂解液(超声处理，随后离心以除去细胞碎屑和膜碎片)，一次可以获得25mg/ml或1.25mM感兴趣的蛋白溶液，后者可直接用于NMR光谱研究。

5.由于可用少于1ml溶液进行NMR光谱研究，因此现在可以将培养规模减小到250ml，这将昂贵的¹³C-葡萄糖和¹⁵N-NH₄Cl[或(¹⁵NH₄)₂SO₄]的用量减少到四分之一。此外，由于一旦冷休克后细胞不能在建议的条件下生长，因此总的碳利用度将大大少于生长细胞。因此，培养基中葡萄糖的浓度将少于通常使用的¹³C-葡萄糖浓度(0.2％)。这进一步节约了昂贵的¹³C-葡萄糖的消耗。

6.一些蛋白非常易于热变性。特别是，在大肠杆菌(E.coli)中通常在较低温度环境中生活的那些生物(如线虫(Caenorhabditis elegans))的蛋白表达在较高温度下表达是成问题的。所提出的冷休克载体-宿主系统避开了这个问题。

7.尽管使用T7载体系统时一些蛋白的表达可能会更高，但是不仅由于蛋白折叠问题，而且由于转录和翻译调节，其它蛋白的表达可能只有用所提出的冷休克载体系统才能达到。由于可以将数量庞大的基因从人转移到细菌，这可能变得越来越明显。

8.由于鉴定了越来越多的医学上重要的人蛋白，因此很重要的是以可溶的形式以及大量地表达这些蛋白。根据本发明的冷休克载体用作常规T7表达系统的替代或者互补系统。

正如本领域技术人员将会认识到的，根据本发明的生产异源多肽的方法可用于掺入可检测的标记的化合物，如用¹³C和¹⁵N标记的化合物，其是在宿主细胞中正常发现的不超过可忽略量的同位素。当期望将可检测地标记的化合物掺入到通过本发明方法生产的，如用于NMR光谱研究分析的异源多肽中时，用含有可用于检测地标记的异源多肽化合物的培养基更换/替代营养培养基。可检测地标记的化合物优选是¹⁵NH₄Cl、(¹⁵NH₄)₂SO4、¹³C-葡萄糖、用¹⁵N标记的单个氨基酸残基、用¹³C标记的单个氨基酸残基、或者用¹⁵N和¹³C双标记的单个氨基酸残基。虽然¹⁵NH₄Cl、(¹⁵NH₄)₂SO4和¹³C-葡萄糖提供遍及所生产的异源多肽的非选择性标记，然而用¹⁵N和/或¹³C标记的单个的氨基酸残基，例如谷氨酸提供在异源多肽中相应于特定单个氨基酸残基的残基位置上的选择性标记。

在下文中介绍的实施例5说明了适合没有进行蛋白纯化的细胞裂解液上清的NMR光谱研究的异源多肽(EnvZ的ATP结合域)的生产。在实施例5中用作宿主细胞的大肠杆菌(E.coli)B株BL21不是缺乏任何一种主要的冷激蛋白如CspA的突变体。然而，如果期望由于标记的主要冷激蛋白的存在导致在NMR光谱研究中背景噪音很少的情况，那么可代替使用缺乏一种或多种主要的冷激蛋白的突变体宿主细胞，优选缺乏CspA或CspA和其它冷激蛋白的组合例如在四突变体ΔcspAΔcspBΔcspGΔcspE中。

本发明进一步提供获得异源多肽的NMR光谱的方法。这个方法包括在营养培养基中培养用含有编码异源多肽以及能够表达和生产对冷休克反应的异源多肽的核苷酸序列的核酸转化的原核宿主细胞。这之后通过将培养温度降到宿主细胞正常生理生长温度以下的温度而将培养的宿主细胞进行冷休克，以诱导异源多肽的生产。在冷休克后，用含有可检测的标记的异源多肽的化合物的培养基更换/替代营养培养基。在降低的培养温度培养经过冷休克的宿主细胞以生产用该化合物可检测地标记的异源多肽，然后进行分离。可以对分离的冷休克的宿主细胞进行NMR光谱研究(全细胞NMR光谱研究)，或者对分离的冷休克的宿主细胞的细胞裂解液上清进行NMR光谱研究，以获得异源多肽的NMR光谱。

虽然现在大体上描述了本发明，但是通过参考下列实施例同样更容易理解本发明，该实施例是通过举例说明的方式提供的，不应当被认为是对本发明的限定。

实施例1

原型载体的构建

通过消化含有NdeI的原始质粒，随后通过克列诺填平和连接来产生无NdeI位点的pUC19载体(New England BioLabs，Beverly，MA)。将包括T7/cspA启动子、CspA的5’-UTR区以及其编码区的PCR产物克隆到pUC19ΔNdeI质粒的EcoRI和HindIII位点中。接着通过克列诺填平而删除这两个限制性酶切位点。通过定点突变，在紧邻cspA终止密码子之后产生SalI和BamHI位点。合成含有6个组氨酸标记、用于蛋白酶切割的Xa因子位点和包括NdeI、HindIII和KpnI的多克隆位点以及cspA的3’区的第二个DNA片段，并且在这个载体中克隆。在图1中显示了原型质粒载体图。

克隆和表达线虫(Caenorhabditis elegans)的蛋白

一些蛋白非常易于热变性。特别是，在大肠杆菌(E.coli)中通常在较低的温度环境中生活的那些生物(如线虫(C.elegans))的蛋白表达在较高温度下表达是困难的。选择5种在pET载体中克隆的并且在37℃不能很好表达(图2A)的线虫(C.elegans)蛋白并由G.Montelione博士提供(称为WR49，WR35，WR26，WR27和WR53，Genebank登记号分别是：AV185320，AV183398，C50788，D71923和C48848)。将含有编码这些蛋白基因的插入片段亚克隆到图1描述的冷休克载体中。细胞在37℃生长到0.5的OD600nm，接着将其转移到15℃，用1mMIPTG(异丙基b-D硫代吡喃半乳糖苷以诱导T7启动子)诱导，在0、12和24小时时移走样品，并且通过SDS-PAGE分析蛋白的表达。图2A显示用1mM IPTG诱导3小时后，所有这些使用pET载体的蛋白在37℃的表达水平，图2B显示使用各自的冷休克载体在15℃时它们的表达。使用pET表达载体，蛋白WR49和WR35(分别是图2A中的泳道2和4)在37℃根本不能表达。蛋白WR26非常弱地表达(图2A中泳道6)。使用冷休克载体，所有这三种蛋白在15℃高度表达。使用冷休克载体，蛋白WR27和WR53的表达也显著地增高。冷休克载体也成功地用于不能用常规载体很好地表达的人蛋白的表达。

线虫(C.elegans)蛋白生产的时间分布图

接下去，检查使用冷休克载体进行的蛋白生产的时间分布图。选择使用常规的T7载体在37℃根本不能表达或者非常弱地表达的WR49，WR35和WR26蛋白(图2A)。含有各自质粒的细胞在37℃生长到OD600nm为0.5，接着将其转移到15℃，用1mM IPTG诱导，从0-120小时每隔24小时移走样品，通过SDS-PAGE分析蛋白表达。图3显示这些蛋白的表达水平。观察到每种蛋白的最大表达在3-4天内并且在以后稳定维持。其次，所有其它细胞蛋白的表达被显著地抑制，导致生产出纯度约85％的感兴趣的蛋白。

使用仅含有cspA启动子的冷休克载体的蛋白表达

本发明的一个特定的目的是在细胞中以90-95％的翻译效率合成感兴趣的蛋白，蛋白产量高于总细胞蛋白的60-70％，其中可直接将细胞裂解液或者直接的细胞悬液用于NMR光谱研究。融合蛋白在这个方面提出了一个问题，在NMR光谱研究以前需要从CspA中分离和纯化兴趣蛋白。因此，本发明者的实验室也已经构建了含cspA启动子而不含cspA编码区的冷休克载体。该载体在cspA 5’UTR的上游也含有lac操纵子，因而可通过IPTG诱导感兴趣的基因。从药用视角选择很重要的γ-干扰素蛋白。在这个载体上克隆编码γ-干扰素的基因，根据上面描述的对线虫蛋白(C.elegans)的检测方法检查其在15℃下的生产。图4显示在37℃和15℃下γ-干扰素蛋白的表达。这与cspA 5’UTR是负责cspA mRNA的不稳定性的事实一致，因而其在37℃缺乏表达，在这个温度下没有观察到γ-干扰素的表达(泳道6)。在另一方面，其在15℃有很好的表达(泳道2-5)。然而，作为从在37℃下生长延续下来的结果，很可能存在其它的细胞蛋白。为了检查这种可能性，在15℃下脉冲标记细胞。细胞在标记培养基中生长到指数生长期并转移到15℃。根据以前描述的方法(Xia等，2001)用5ml³⁵S-甲硫氨酸标记1ml培养物。通过添加非放射性甲硫氨酸追踪细胞。用20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)冲洗细胞，将细胞重悬在100mlSDS样品缓冲液中。通过SDS-PAGE分析样品。现在发现γ-干扰素包括90％以上的细胞标记蛋白(图4B，泳道2)。这显示γ-干扰素可能是几乎全部用冷休克载体在15℃生产的。这种方法因而将在用同位素如¹³C和¹⁵N特异性地标记蛋白中非常有用，允许在不进行蛋白纯化的情况下对全细胞进行NMR光谱研究。

有利于蛋白合成起始的mRNA下游顺式元件的鉴定

为了进一步改善本发明的冷休克载体系统，本发明人的实验室借助于通过lacZ的表达系统构建分子的所有组成成分，研究了有利于蛋白合成起始的起始密码子下游的mRNA顺式元件。使用的序列如下：5’-GGATCTAGAGGGTATTAATA ATGACTGGTGCA NNNNNNNNNNNN-lacZ-终止信号-3’(SEQ ID NO：11)。在起始密码子和随机插入序列的下端划线。将此序列在IPTG诱导的pINIII载体中克隆(Inouye，1983)并将质粒在CL83细胞中转化。随机地挑选和测序130个克隆。

从130个克隆中选择57个克隆，根据Miller的方法(Miller，1992)测量β-半乳糖苷酶的活性。最有趣地，β-半乳糖苷酶的活性范围为从1,500到43,000单位，表明密码子4到密码子7的编码区在基因表达中起着重要的作用。尽管没有任何一个负责较高酶活性(没有显示数据)的特定的共有序列，但是在显示较高β-半乳糖苷酶活性的克隆中，(A+T)/(A+T+G+C)的比率接近70％(图5)。也显而易见的是，在显示较高lacZ表达的克隆中，最频繁使用的密码子是编码氨基酸如酪氨酸、苏氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的密码子。选择4个具有高β-半乳糖苷酶活性的克隆，在其中的每一个中引入移码。从表1中看出，除了两个导致引入终止密码子(表中的下划线部分)的突变之外，没有一个突变对lacZ的表达有任何显著的影响。

表1

移码突变对β-半乳糖苷酶活性的影响

插入序列： TGCANNNNNNNNNNNNCCAA (SEQ ID NO：13) β-半乳糖苷酶

(U)

克隆1：

原始序列 ATT TAT ATA TAT (SEQ ID NO：14) 42440

移码突变 CAT TTA TAT ATA (SEQ ID NO：15) 41823

移码突变 TTT ATA TAT ATA (SEQ ID NO：16) 42220

克隆2：

原始序列 ACT TTT ACA AAG (SEQ ID NO：17) 42150

移码突变 CAC TTT TAC AAA (SEQ ID NO：18) 41823

移码突变 CTT TTA CAA AGA (SEQ ID NO：19) 43824

克隆3：

原始序列 ACA CAT GAA CAC (SEQ ID NO：20) 37228

移码突变 CAC ACA TGAACA (SEQ ID NO：21) 519

移码突变 CAC ATG AAC ACA (SEQ ID NO：22) 35495

克隆4：

原始序列 CAT AGT TTT CAA (SEQ ID NO：2 3) 35804

移码突变 CCA TAGTTT TCA (SEQ ID NO：24) 759

移码突变 ATA GTT TTC AAA (SEQ ID NO：25) 35100

因此，特定密码子的使用对lacZ的表达没有明显影响。这支持了高AT含量对于较高表达是很重要的这样的观念。因此下游盒的翻译增强效应似乎应当归因于其较高的AT(AU)含量而不是其与16S RNA互补的序列。起始密码子下游的富含A/T的序列可以增强大肠杆菌(E.coli)中蛋白的翻译，因为富含A/T的序列的不稳定的二级结构可能导致起始核糖体数量的增加。

β-半乳糖苷酶活性的增加归因于蛋白表达的增加

进一步分析上述57个克隆的蛋白分布图和β-半乳糖苷酶活性。含有各自质粒的细胞在37℃生长到OD600nm为0.5，用1mM IPTG诱导。通过SDS-PAGE分析蛋白的表达并通过光密度分析测量蛋白条带的密度。根据前面描述的方法测量β-半乳糖苷酶的活性。从图6中看出，β-半乳糖苷酶活性很好地与各自的蛋白水平相对应。本发明人推断，较高的β-半乳糖苷酶活性归因于蛋白本身的较高的特异活性。

增强的翻译而不是转录负责较高的β-半乳糖苷酶活性

根据其β-半乳糖苷酶活性可将获得的克隆分成4组，即酶单位在下列范围的克隆：(i)43,000-35,000，(ii)35,000-25,000，(iii)25,000-10,000和(iv)10,000以下。挑选代表所有这四组(从每组中选4个)的16个克隆，使用相应于lacZ的寡核苷酸通过引物延伸(Etchegaray等，1999)检测这些克隆中的lacZ mRNA水平。图7显示在这些克隆中β-半乳糖苷酶的活性、蛋白水平和lacZ mRNA水平。与在图6中所表明的类似，β-半乳糖苷酶活性对应于蛋白水平。然而，显示高水平和低水平β-半乳糖苷酶活性的克隆显示了相似的lacZ mRNA水平，表明较高的β-半乳糖苷酶活性不应归因于转录的上调。因此，本发明人推断这是翻译增强的结果。

起始密码子下游的富含A/T(A/U)的元件增强翻译的起始

接下去，本发明人的实验室研究了是否翻译起始或延伸负责这个效应。选择显示最高和最低活性的两个克隆。在图8中显示了它们的序列SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：26。β-半乳糖苷酶活性为42,440单位的克隆具有在起始密码子下游的富含A/T的序列ATTTATATATAT(SEQ ID NO：14)，而活性为4410单位的克隆具有相应的富含G/C的序列CGGTCTCTCCGC(SEQ ID NO：26)。检查这两个克隆的核糖体分布图。根据以前描述的方法(Etchegaray等，1996和Xia等，2001)制备和分级分离核糖体。进行引物延伸以检查多聚核糖体和70S、50S或30S核糖体中lacZ mRNA的分布。也检查ompA mRNA水平作为阴性对照。从图8中看出，具有较高活性的克隆与具有较低β-半乳糖苷酶活性的克隆相比，显示在多聚核糖体和蔗糖梯度的70S部分中有较高的lacZ与ompA mRNA之比。这提示较高的β-半乳糖苷酶表达归因于由起始密码子下游的富含A/T序列的介导的翻译起始的增强。

实施例2

cspA mRNA中负责LACE效应的翻译顺式元件的鉴定

cspA mRNA含有159个碱基长的5’UTR(非翻译区)，其被认为在LACE效应中起最本质的作用。本发明人的实验室已经表明LACE效应是由于cspA mRNA捕获了所有的细胞功能性核糖体所致，因而抑制了细胞的所有其它mRNAs形成用于翻译的起始复合体。推测cspA mRNA阻止其它mRNAs与30S核糖体相互作用的这种能力归因于其能高效地与核糖体形成起始复合体。

在原核生物中，至少有两个重要的翻译起始元件：一个是核糖体结合序列，所谓的Shine-Dalgarano序列(SD)，另一个是起始密码子AUG。另外，已经报道了许多增强翻译起始的其它元件(Gold等，1988)。例如，已经报道SD序列上游有翻译增强元件，称为“ε”(Olins等，1989)。一直争论起始密码子下游是否也有一个元件，称为“下游盒”(Etchegaray等，1999a和1999b；O’Connor等，1999)。也很重要的是注意到，在翻译起始调节中涉及5’UTR的二级结构。特别地，在SD序列处或附近二级结构的形成经常抑制起始复合体的形成(Yamanaka等，1999)。

细胞中细菌mRNAs的稳定性是基因表达调控中的另一个重要因素。特别地，如cspA mRNA具有异常长5’-UTR的mRNAs，一般更易于受到核酸内切酶的攻击。实际上，cspA mRNA在较高温度时高度不稳定。在37℃，其半衰期仅少于12秒并且显示这种不稳定性归因于紧邻SD序列上游的富含AU的序列。已经显示在这个区域的碱基取代突变显著地稳定cspA mRNA，使得在37℃下CspA的生产成为基本的(Fang等，1998)。在cspA 5’-UTR中翻译起始增强必需的元件将会被鉴定出来。通过这些分析，可以进一步提高翻译起始的效率。将采取下列方法。

(i)发展评价翻译起始效率的系统

已经表明LACE效应是由cspA mRNA的高效翻译起始能力所致(Xia等，2001)。LACE效应是这样定义的：(a)通过在15℃下克隆对包含克隆的细胞菌落形成的抗生素效应，(b)通过在15℃下克隆对[³⁵S]甲硫氨酸掺入到总细胞蛋白中的影响，其可以通过SDS-PAGE进行分析以及(c)通过包含导致LACE克隆的细胞的生长曲线。

为了评价在单个克隆中LACE效应的强度，很重要的是能够定量地测量LACE效应。例如，在早期通过分别在cspA基因中第2，第11和第31个密码子中插入无义密码子构建pA01S、pA10S和pA30S的情况下，本发明人的实验室证明在15℃下完全抑制菌落的形成，并且在冷休克后在15℃下几乎完全抑制对[³⁵S]甲硫氨酸掺入细胞蛋白的影响。然而，如果在较高的温度测量菌落的形成和蛋白的合成，那么这3个克隆的LACE效应可能能够通过其效力而得到评价。这些具有严格LACE效应的克隆还可以在20℃或者甚至在25℃仍然保持其有效的LACE效应，而那些具有较弱LACE效应的克隆可以在20℃开始形成菌落并且可以在这个温度下观察到蛋白合成。因此，简单的铺平板的方法应当能够评价单个的导致LACE的克隆的效力。本发明人的实验室将用在它们的实验室中可获得的导致LACE的克隆、pA01S、pA10S和pA30S来检验这种方法(Xia等，2001)。将含有这些质粒的细胞铺到4个LB琼脂平板上，并且分别在37、25、20和15℃下培养。将通过检查在较高温度时对菌落形成的抑制以及也通过在给定温度下菌落的大小将LACE效应的强度进行分类。

接着将通过[³⁵S]甲硫氨酸的掺入和生长曲线进一步确定在不同温度下的LACE效应。很可能通过这些方法中的任何一种获得针对所构建的单个克隆的LACE效力的相似评价结果。然而，由于铺平板是这3种方法中最简单的方法，因此如果证明这种方法与其它方法一样有效，那么将使用这种方法。

(ii)分析cspA mRNA的5’-UTR

可以以许多不同的方式画出给定的RNA的二级结构，特别地，很难确定细胞中一种mRNA所采取的确切的二级结构。然而，可以使用计算机程序来预测一种mRNA的可能的稳定的二级结构。图9显示了使用RNA折叠的Zuker程序(可在www.bioinfo.math.rpi.edu获得的3.1版本)通过计算机分析获得的cspA mRNA 5’-UTR最稳定的二级结构。其显示有从I到VI的6个二级结构，它们的稳定性经过计算分别是-7.0、-14.8、-2.1、-8.3、2.7、1.5千卡。标记为VII的二级结构是在3’端形成的二级结构，并被认为是不依赖于ρ的转录终止子。

在6个二级结构中，已知结构I是冷盒，其对于cspA mRNA的稳定性很重要；因此，其不能被删除。在现有的研究从II到V的其它结构的作用的方法中，使用在编码cspA序列中第31个位置上具有无义密码子的pA30S将它们一个接着一个地缺失以检查缺失对LACE效应的影响(Xia等，2001)。如果通过缺失发现了任何影响，特别是就结构II来说，那么就将进一步将这种大结构分割成小片段。可将茎区进一步分成3个部分，如在图9中显示的IIa、IIb和IIc。将构建下列缺失：ΔIIa、ΔIIb、ΔIIc、ΔIIbΔIIc、ΔIIaΔIIb以及ΔIIaΔIIc。将使用在(i)部分中开发的铺平板法检查pA30S中这些缺失的LACE效应。

结构IV的作用

较早以前显示这个区域在翻译效率中起着重要的作用(Yamanaka等，1999)。本发明人的实验室报道被称为上游盒的13个碱基序列(碱基123到135；UB序列)可能是除SD序列外在cspA mRNA翻译效率中涉及的另一个顺式结构，其在cspA、cspB、cspG和cspI中高度保守并且位于SD序列上游的11个碱基处(Xia等，2001和Yamanaka等，1999)。将通过在该结构删除较小的区域以及通过碱基取代来进一步剖析该结构从而检查这种结构的确切要求。

结构V的作用

也很有趣地注意到，在SD序列的上游有一个称为“ε”的顺式元件，已经提出其增强T7噬菌体中基因的翻译(Olins等，1989)。该ε序列，UUAACUUUA(SEQ ID NO：27)，最初是在T7噬菌体基因10的前导区中发现的。已经报道当与16S rRNA的互补性延伸时，ε从增强子被转化成独立的翻译的起始子。已经显示由于其天然的与16S rRNA有9个核苷酸长的互补性以及距起始密码子有16个核苷酸长的距离，因此ε作为翻译起始子表现出最大的活性。在这些条件下，其效率可与共有的Shine-Dalgarno序列相比(Golshai等，2000)。结构V的序列与ε相似(图9、10A和10B)。

首先，将分析紧邻SD序列(AAGG)上游的10个碱基序列，UUAAUUAUUA(SEQ ID NO：28的第16-28核苷酸)在LACE效应中的作用。这个ε样序列仅由A和U残基构成。将构建各种缺失突变(图10A中突变体1、2、9、10和11)和取代突变(突变体3到8)。这些突变对LACE效应的影响将揭示在这个元件中是否如所提出的存在ε序列所需的独特序列。如果本发明人的实验室能够证明该10个碱基序列在增强翻译(或LACE效应)中具有重要的作用，那么将检查该序列是否甚至在无SD序列时其本身就能够启动翻译。为了这个目的，将通过将cspASD序列(AAGG)突变成AACC(在图10B中突变12)而消除它。如果突变体12能够发挥LACE效应，那么可将该10个碱基缺失以进一步证实这个区域实际上是核糖体结合所需要的(突变体13)。随后，将通过如在突变体14、15和16中所显示的缺失突变来确定对ε样序列和起始密码子之间的距离的要求。

可能所谓的ε序列起作用仅因为其富含AU而不是任何序列的特异性。对这个理由，本发明人的实验室也将增加或延长AU序列，从现在的10个碱基延长成为13、14和16个碱基长的AU序列，以检查它们对LACE效应的影响。如果富含AU的序列确实能够增强翻译，那么将在野生型cspA mRNA、突变体1(图10A)以及突变体12(图10B)之间比较多聚核糖体模式以确定LACE效应是由于捕获了细胞的核糖体所致。

将用已经构建好的pAlacZ进一步确定结构V在翻译增强中的作用，其中pAlacZ含有cspA启动子、5’UTR以及直到其融合到lacZ基因的第13个密码子的cspA编码区。使用这种pAlacZ载体也将产生类似于上面描述的缺失和取代突变。ΔcspA细胞将被用作用于转化的宿主以避免从染色体基因中产生的cspA的自身调节效应，并且将通过β-半乳糖苷酶分析来检查从这些质粒表达的cspA的水平。通过这些实验，将确定结构V在翻译起始中的确切作用。

实施例3

冷休克载体的构建

将构建3种形式的冷休克载体。在第一种类型中，pColdI(图11A)是一种载体，其中将基因的编码区克隆成为与CspA全部编码区融合的融合蛋白。图12A中显示的SEQ ID NO：45作为pUC19(New EnglandBioLabs，Beverly，MA)的钝性HindIII-EcoRI位点内的插入片段。第二个载体pColdII(图11B)是一种感兴趣的基因的编码区在第7密码子之后克隆的载体，其中密码子1到密码子7是在第7个Met密码子处产生的位于唯一的NdeI位点处的MetAsnHisLysValHisMet(SEQID NO：50)。这种额外的序列是由顺式翻译增强元件(ATGAATCACAAAGTG CATATG；SEQ ID NO：9，其中在NdeI位点下划线)编码的，已知显示含有这种序列的克隆基因的表达比没有这种序列的高8倍(Etchegaray等，1999)。图12B中显示的SEQ ID NO：46作为pUC19的钝性的HindIII-EcoRI位点内的插入片段而存在。第三种类型pColdIII(图11C)是一种使用NdeI位点直接在起始密码子处克隆编码区的载体。在这个载体中，图12C中显示的SEQ ID NO：47作为pUC19的钝性HindIII-EcoRI位点内的插入片段而存在。

三种载体pColdI、pColdII和pColdIII是相同的载体，因为它们都具有含有cspA启动子、cspA 5’-UTR区以及cspA 3’端转录终止子位点的pUC19主链。除此之外的区别是pColdI具有cspA的编码区，而pColdII具有富含AT的DB序列。由于在pColdI中包括了cspA的编码区，因此利用了其内在的高效率翻译起始特性的优点。如在MBP(麦芽糖结合蛋白)融合蛋白的实例中所显示的，也可能CspA在N-末端的结构域的折叠可能帮助克隆基因产物的折叠。另外，将pColdI设计成具有6个组氨酸标记，其后跟随位于NdeI克隆位点上游的Xa因子切割位点，以这种方式从这个载体中生产的产物可以通过Ni-NTA柱纯化并且可以通过Xa因子切割而除去N-端片段。

很重要的是注意到，当使用pColdII载体时，在给定基因的起始密码子前加入了6个氨基酸残基，MetAsnHisLysValHis(SEQ ID NO：50的残基1-6)。因此，对于每个实例必需检查是否这种额外的N-端延伸影响克隆基因产物的结构和功能。可以利用这种额外序列的优点来开发抗这种序列的抗血清，其可用于产物的鉴定，并且如果需要时可用于纯化。

以这样的方式设计所有这些载体使得可将感兴趣的基因的NdeI-BamHI片段在相同的阅读框中克隆并且能够在pCold和常规的pET载体之间相互交换。假使感兴趣的基因对大肠杆菌(E.coli)生长有毒，那么在37℃生长期间甚至低水平的该基因的渗漏表达也可能导致问题。由于这个原因，将在紧邻cspA转录起始位点的下游处构建具有lacI操纵子序列ATTGTGAGCGGATAACAATTGATGTG(SEQ ID NO：10)的pColdI、pColdII和pColdIII，使得所克隆的基因的表达在低温下仅在IPTG存在时可被诱导。这些pCold载体将分别被称为pColdIo、pColdIIo和pColdIIIo。

另外，下面将试图确定用于较高冷休克表达的最可能的SD序列以及位于起始密码子下游处的序列(下游盒)的影响：

(i)SD序列

在cspA mRNA上发现的SD序列(AAGG)和与16S RNA的3’端具有最高互补性的可能的SD序列相比不是最好的SD序列。其可能通过将cspA SD区变成较长的共有序列而得到提高，例如通过在cspA mRNA中插入AGG而变成AAGG AGGU。如在图10A和10B中所示，一个碱基接着一个碱基地通过点突变将改变SD序列。最后，将会确定载体的最佳SD序列。

(ii)在pColdIII中AUG下游处序列的翻译增强效应

根据在从第4密码子到第7密码子区域(12个碱基序列)处添加的随机序列的分析实验中判断，所谓的下游盒(DB)效应实际上产生了其对翻译起始的效应。如在实施例1(图5)中所示，显著地增强LACE效应的DB序列正如Sprengart和其同事最初(1996)提出的那样，基本上由富含AT的序列(但不是与16S rRNA互补的序列)构成。有趣的是，以非常高水平表达的γ-干扰素，即使其直接从其自己的起始密码子开始表达(图4A和4B)，也含有这个区域的12个残基中的9个A/T残基。当使用pColdIII载体时，可以将每个密码子的第3个碱基，如果其是G或C，替换成A或T，从而可提高从密码子4到密码子7区域中的AT含量。这是可以做到的而不改变这个区域的氨基酸序列，这是由于密码子选择的简并性。一旦将基因克隆到pColdIII中，就将检查在前7个密码子中改变的AT含量的影响是否有利于每个克隆的基因产物的表达。

实施例4

宿主系统的改善

为了获得使用上面描述的冷休克载体表达的蛋白的最大产量，本发明人希望改善宿主系统并且建立在低温时的生长条件。宿主改善需要重点考虑的事是：(i)所克隆基因的mRNA的稳定性，(ii)延长顺应期以阻止冷休克适应以及(iii)提高冷休克核糖体因子如CsdA的产量，其可以增强翻译起始和蛋白的合成。

(i)使用pnp缺失细胞作为宿主细胞在15℃延长克隆蛋白的表达

一旦发生冷休克，大肠杆菌(E.coli)的生长就暂时停止，在这个顺应期期间高度诱导特异性的冷激蛋白。在顺应期结束时，它们的合成被减少到新的基础水平，而非冷激蛋白的合成得到恢复，导致细胞的生长重新开始。多核苷酸磷酸化酶是冷休克诱导的核糖核酸外切酶并且是在mRNA降解中涉及的RNA降解体的组分。在本发明人的实验室中已经显示多核苷酸磷酸化酶是在顺应期结束时抑制Csp产物所需要的。发现在15℃时多核苷酸磷酸化酶对于csp mRNAs的选择性降解是必需的(Yamanaka等，2001)。在pnp突变体中，在冷休克后正常地观察到与在野生型菌株中一样的Csps的诱导；然而，它们的生产不再被自我调节并且在整个冷休克处理中维持在高水平。这导致在25℃以下细胞的生长停滞以及菌落形成能力的显著降低。结果，一旦发生冷休克，甚至在24小时后细胞也维持高水平的Csps。在聚腺苷酸聚合酶突变体和CsdA RNA解旋酶突变体中，一旦发生冷休克，Csp的表达就被显著延长，表明在冷休克适应中多核苷酸磷酸化酶协同聚腺苷酸聚合酶和csdA RNA解旋酶一起起着关键性的作用。因此，使用缺失pnp的株作为我们冷休克载体的宿主很可能会有助于在非常长的时间期间内维持克隆基因的表达。这类细胞已经可以在我们的实验室中获得。预计在缺乏多核苷酸磷酸化酶时，将会延长从本发明冷休克载体中表达csdA，导致感兴趣的蛋白的表达的延长。将用含有对应于编码感兴趣的蛋白的基因插入片段的冷休克载体转化缺失pnp的细胞，细胞将在37℃生长到OD600nm为0.5，接着转移到15℃。在0-120小时期间，每隔12小时移走样品以通过SDS-PAGE分析蛋白的生产。

(ii)使用缺失rbfA的细胞作为宿主细胞在15℃延长克隆蛋白的表达

rbfA基因编码与游离的30S结合但不与70S核糖体亚单位结合的15kDa蛋白(RbfA)(Dammel等，1995)。该基因最初是作为位于16S rRNA的5’螺旋中的优势冷敏感突变的多拷贝抑制因子而被分离的。缺失RbfA的突变体以与在缺失pnp的细胞中类似的方式显示在低温下生长受到损害(Dammel等，1995)。本发明人的实验室证明RbfA是冷激蛋白，在rbfA缺失株中尽管在低温下生长严重抑制，但是能高度诱导冷激蛋白和核糖体蛋白，它们的表达以类似于用缺失pnp的细胞表达的方式而成为基本的(Dammel等，1995)。本发明人的实验室最近已经证明RbfA具有双重功能，因为其涉及30S核糖体亚单位成熟以及低温下的翻译起始。考虑到rbfA的缺失导致冷激蛋白如CspA基本表达的事实，这些细胞对于在15℃使用冷休克载体的蛋白表达将是理想的。

已经构建了pnp和rbfA缺失菌株，将产生这两个基因双缺失的突变体用于使用冷休克载体的蛋白的表达。通过转导CD28株的被破坏的rbfA等位基因来构建被称为BX41的RbfA突变体株。由Dammel和Noller(1995)公开的CD28是从他们的实验室获得是并使用P1噬菌体转导到MC4100中。pnp突变体株，在Kushner博士实验室的文章中公开，Arraiano等(1988)，可从他的实验室获得。

将使用pnp菌株与rbfA株的噬菌体Plvir介导的转导(Miller，1992)来产生双缺失突变体。例如，使用P1噬菌体制备rbfA突变体株裂解物，接着使用rbfA裂解物和多核苷酸磷酸化酶(pnp)突变体株通过P1噬菌体转导来制备rbfA、多核苷酸磷酸化酶双突变体。检查P1噬菌体转导后每个菌落的rbfA PCR产物以进一步确定他们是rbfA突变体。制备这些突变体株的感受态细胞，接着将pINrbfA质粒转化到感受态细胞中，在15℃培养并且检查冷敏感性以确定双突变。

(iii)CsdA在克隆基因表达中的作用

通过Far Western分析的方法报道了大肠杆菌(E.coli)聚腺苷酸聚合酶与RNA、RNA酶E以及RhlE、SrmB、CsdA的DEAD-盒RNA解旋酶的相互作用(Raynal等，1999)。在它们中，CsdA是冷休克诱导的蛋白并且在缺乏ATP时具有解开双链RNA的活性(Jones等，1996)。与RbfA相似，CsdA是低温生长所必需的(数据没有显示)。已经提出CsdA的功能对核糖体的功能是必需的，其通过解开在低温下形成的稳定的二级结构而提高mRNAs的翻译的效率(Jones等，1996)。

构建缺失csdA的突变体，其中类似在pnp和rbfA缺失株中的基因表达，冷休克基因的表达被延长。将来自pUC7Km(Pst)的卡那霉素抗性基因(1.3K HincII片段)在EcoRV位点插入到pKX164中csdA基因(或者deadD和mssB)的编码区中间，产生pKNJ9026。接着将含有被破坏的csdA(csdA∷Kan)的线性化的pKNJ9026 DNA片段引入recD突变体FS1576的染色体中。分离卡抗那霉素的转化体，通过Southern杂交进一步确定染色体上csdA的分布。将csdA∷Kan突变转导进野生型菌株MC4100，产生KNJ130。然而，csdA缺失可能如在pnp和rbfA缺失的实例中预测的一样不促进克隆基因的表达。这是因为非冷激蛋白的mRNAs的解旋可能需要CsdA。由于我们的冷休克载体系统将被用于非冷激蛋白，宿主系统中的CsdA可能甚至会帮助克隆基因的表达。注意到与CsdA形成对照，由于翻译起始所需要的元件来自cspA，因此很可能使用我们冷休克载体的克隆基因的表达不需要RbfA。

基于这些考虑，将不仅检查csdA缺失而且要检查CsdA过度表达对在我们载体上克隆的许多基因的表达的影响。通过将在pINIII载体上克隆这些基因来进行CsdA的过度表达(Inouye，1983)，而且将在细胞内与冷休克载体共转化。使用pINIII载体，可在冷休克前用IPTG诱导CsdA，并且可以评价其对感兴趣的基因表达的冷休克诱导的影响。

(iv)生长培养基条件的标准化

这个研究的目的是在总细胞蛋白合成的90-95％水平上合成兴趣蛋白，蛋白产量高于总细胞蛋白的60-70％。因此通过离心除去不溶材料如膜碎片和核糖体碎片后的细胞裂解液不用任何进一步的纯化就可用于NMR光谱研究。在这样的实例中，甚至没有裂解的全细胞悬液也可用于NMR光谱研究。因此，冷休克后通过调换培养基(例如从¹²C葡萄糖/¹⁴NH₄Cl碱培养基换成¹³C葡萄糖/¹⁵NH₄Cl碱培养基)，仅仅感兴趣的蛋白能被同位素标记，消除了纯化过程。假定分子量为20KDa的蛋白是以总细胞蛋白60％的水平生产的(注意到一旦冷休克只有这种蛋白是新合成的)，那么预期每升蛋白的总产量将为大约120mg。如果这种蛋白以可溶的形式生产，从4ml培养物制备细胞裂解液(超声处理，随后超速离心以除去细胞碎屑、膜碎片和核糖体碎片)，那么可以获得30mg/ml或1.5mM感兴趣的蛋白溶液，其可以直接用于NMR光谱研究。由于可用少于1ml的溶液进行NMR光谱研究，因此现在培养规模可以减小到250ml，这将昂贵的¹³C葡萄糖和¹⁵NH₄Cl[或(¹⁵NH₄)₂SO₄]的用量削减到四分之一。可单独或者联合使用用¹⁵N、¹³C或两者标记的氨基酸。此外，由于一旦冷休克细胞不能在建议的条件下生长，因此总的碳利用度将大大少于生长细胞。因此，培养基中葡萄糖的浓度将少于通常用于¹³C葡萄糖的浓度(0.2％)。这进一步节省了昂贵¹³C葡萄糖的消耗。

为了确定在受LACE效应影响的细胞冷休克培养期间转化了多少葡萄糖，将检验冷休克后葡萄糖的浓度(0.2％、0.15％、0.1％、0.05％和0.025％)对蛋白生产的影响。将检验含有实施例1描述的表达系统的细胞。在冷休克以前，通过离心收集细胞(10ml培养物)，用M9培养基洗涤，重悬在10ml含有不同浓度葡萄糖的M9培养基中。将这些培养物与对照培养物一起(没有离心；总共6个培养物)在15℃培养，每24小时检查一次蛋白生产，持续5天。在这种方式中，将测定在不减少蛋白产量时培养基中葡萄糖的最小需要量。在确定葡萄糖的浓度后，将该条件用于少数几个可得到的克隆，其以高产量生产可溶蛋白以用¹³C和¹⁵N标记它们。将使用细胞裂解液对这些蛋白进行NMR光谱研究，并且将评价冷休克载体的效力。

实施例5

没有进行蛋白纯化的NMR光谱研究

使用没有进行蛋白纯化的完整细胞裂解液上清进行NMR光谱学分析[(¹H-¹⁵N)HSQC]。因为在本发明人的实验室和Ontario癌症研究所的Ikura博士之间的合作已经解析了其NMR溶液结构(Nature 386：88-92，1998)，因此对于这个实验，使用大肠杆菌(E.coli)中的一种渗透敏感的组氨酸激酶EnvZ的ATP结合域(164个残基)作为模型系统。

将500ml含有pCold-EnvZ(ATP结合域或片段B)的大肠杆菌(E.coli)BL21培养物在M9基本培养基中生长到OD₆₀₀nm为0.6。通过离心收集细胞，并重悬在250ml含有0.1％¹⁵NH₄Cl和0.4％葡萄糖的预先冷却的M9基本培养基中。重悬细胞在15℃生长48小时后，通过离心收集细胞并通过反复冻融和超声处理而裂解。通过超速离心分离出细胞碎片和膜碎片(沉淀)后，将得到的上清液直接用于NMR分析。

图14A显示在超速离心后经考马斯亮蓝染过色的所得上清液的SDS-PAGE凝胶。在图14A中EnvZ ATP结合域几乎占总蛋白样品的80％。特别注意到，在图14A凝胶中所见的绝大部分小条带是那些细胞在37℃延续下来的蛋白，因此没有被¹⁵N标记。图14B显示总细胞裂解液以及超速离心后得到的沉淀和上清液的SDS-PAGE凝胶。

从不经过任何蛋白纯化过程的总细胞裂解液上清(图15A)中获得可与纯化的EnvZ ATP结合域的光谱(图15B)相比较的独特的(¹H-¹⁵N)HSQC NMR光谱。这种使用冷休克载体系统以获得单个膜蛋白被¹⁵N和/或¹³C唯一标记的方法允许在原位测定没有进行蛋白纯化的异源蛋白和膜蛋白的结构。

尽管现在已经充分描述了本发明，但是本领域技术人员将会理解，在不背离本发明的精神和范围以及不需要过多实验的情况下，可在广泛的等同参数、浓度和条件的范围内实现本发明。

尽管已经结合特定的实施方案描述了本发明，但是本发明应当被理解为其能够被进一步修改。本申请意味着包括本发明的任何变异、用途或调整，一般地，其遵循本发明的原理和包括本发明公开的变更，如来自公知范围内或与本发明有关的现有技术范围内的习惯做法，以及可被应用到如下在所附的权利要求的范围内的上文提出的必要特征的变更。

所有这里引用的参考文献，包括杂志文章或摘要、公开的或相应的美国或外国专利申请、颁发的美国专利或外国专利或任何其它参考文献，在此全部并入作为参考，包括所有的数据、表格、附图以及在引用的参考文献中描述的原文。另外，在这里引用的参考文献的范围内引用的参考文献的全部内容也全部并入作为参考。

参考已知的方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法不是以任何方式承认在相关的技术中公开、教导或暗示了本发明的任何方面、描述或实施方案。

前述对特定实施方案的描述充分地展现了本发明总的特性，以致于不需要过多的实验，在不背离本发明总的思想的情况下，其他人可以通过应用现有技术范围内的知识(包括这里引用的参考文献的内容)，很容易地对各种应用如特定实施方式进行修改和/或调整。因此，意味着这样的调整和修改是在与公开的实施方案等同的含意和范围内，基于这里描述的教导和指导。应当理解的是，这里的专门用语或术语是为了描述的目的而不是用于限定，技术人员根据这里描述的教导和指导，结合本领域普通技术人员的知识能够解释本发明说明书的术语或专门用语。

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序列表

<110> INOUYE，Masayori

XIA，Bing

PHADTARE，Sangita

Qing，Guoliang

KE，Haiping

<120> 冷休克诱导的异源多肽的表达和生产

<130> INOUYE＝2.1 PCT

<150> 60/361,069

<151> 2002-03-01

<150> 60/402,921

<151> 2002-08-14

<160> 50

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 539

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> CDS

<222> (229)..(441)

<400> 1

aaccgattaa tcataaatat gaaaaataat tgttgcatca cccgccaatg cgtggcttaa 60

tgcacatcaa cggtttgacg tacagaccat taaagcagtg tagtaaggca agtcccttca 120

agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattccttta acgcttcaaa atctgtaaag 180

cacgccatat cgccgaaagg cacacttaat tattaaaggt aatacact atg tcc ggt 237

Met Ser Gly

1

aaa atg act ggt atc gta aaa tgg ttc aac gct gac aaa ggc ttc ggc 285

Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys Gly Phe Gly

5 10 15

ttc atc act cct gac gat ggc tct aaa gat gtg ttc gta cac ttc tct 333

Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val His Phe Ser

20 25 30 35

gct atc cag aac gat ggt tac aaa tct ctg gac gaa ggt cag aaa gtg 381

Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly Gln Lys Val

40 45 50

tcc ttc acc atc gaa agc ggc gct aaa ggc ccg gca gct ggt aac gta 429

Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala Gly Asn Val

55 60 65

acc agc ctg taa tctctgctta aaagcacaga atctaagatc cctgccattt 481

Thr Ser Leu

70

ggcggggatt tttttatttg ttttcaggaa ataaataatc gatcgcgtaa taaaatct 539

<210> 2

<211> 70

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 2

Met Ser Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys

1 5 10 15

Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val

20 25 30

His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly

35 40 45

Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala

50 55 60

Gly Asn Val Thr Ser Leu

65 70

<210> 3

<211> 563

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> CDS

<222> (215)..(430)

<400> 3

gctggatgtc taaaataaac attgcttcat atgttcaact atgcgttaat gattgcgtcg 60

gtttgaagaa cagacgatat acgaagtagt ttactaaagc agttctcatt tcaggtgtta 120

ttcacttatt ccttctttga gtctctccaa ttaagtacga agtcgtttct gttatgcaaa 180

ccatttatgc cgaaaggctc aagttaagga atgt aga atg tca aat aaa atg act 235

Arg Met Ser Asn Lys Met Thr

1 5

ggt tta gta aaa tgg ttt aac gct gat aaa ggt ttc ggc ttt att tct 283

Gly Leu Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys Gly Phe Gly Phe Ile Ser

10 15 20

cct gtt gat ggt agt aaa gat gtg ttt gtg cat ttt tct gcg att cag 331

Pro Val Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala Ile Gln

25 30 35

aat gat aat tat cga acc tta ttt gaa ggt caa aag gtt acc ttc tct 379

Asn Asp Asn Tyr Arg Thr Leu Phe Glu Gly Gln Lys Val Thr Phe Ser

40 45 50 55

ata gag agt ggt gct aaa ggt cct gca gca gca aat gtc atc att act 427

Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala Ala Asn Val Ile Ile Thr

60 65 70

gat taaaattcat cgctcgtctg tatacgataa cgaagaaggc tgatgcctga 480

Asp

gtagagatac ggacagagta gtgaatattg gatctcttta ataaaaagta aggaggtcca 540

atacatgaaa caatggctag cat 563

<210> 4

<211> 72

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<223> 合成的

<400> 4

Arg Met Ser Asn Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp

1 5 10 15

Lys Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro Val Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe

20 25 30

Val His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Asn Tyr Arg Thr Leu Phe Glu

35 40 45

Gly Gln Lys Val Thr Phe Ser Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala

50 55 60

Ala Ala Asn Val Ile Ile Thr Asp

65 70

<210> 5

<211> 520

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> CDS

<222> (214)..(426)

<400> 5

cgccggacgg ctaaaataaa atttgcttaa tctcaattat catgcgttaa tagctgcgtc 60

ggtttgaaag acagacagca tacaaagtag tttactaaag cagttctcat tatcaggcat 120

tatccccttc ttttgagtct ctctcctgaa cactaagtag tttctgtatt aaagccctgt 180

ttgccgaaag gcccaaaatg aaggaagtaa aat atg tct aat aaa atg act ggt 234

Met Ser Asn Lys Met Thr Gly

1 5

tta gta aaa tgg ttt aac gca gat aaa ggt ttt ggc ttt atc act cct 282

Leu Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro

10 15 20

gat gat ggc agc aaa gac gtt ttc gtc cat ttc acc gcc atc cag agc 330

Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val His Phe Thr Ala Ile Gln Ser

25 30 35

aat gaa ttc cgc acg ctg aac gaa aat cag aaa gtt gaa ttt tct att 378

Asn Glu Phe Arg Thr Leu Asn Glu Asn Gln Lys Val Glu Phe Ser Ile

40 45 50 55

gag cag ggg caa cgt ggc ccc gcg gca gcg aac gtt gtt acg ctc taa 426

Glu Gln Gly Gln Arg Gly Pro Ala Ala Ala Asn Val Val Thr Leu

60 65 70

ggttgccatt attactcaac atctccattt ccgctgtcca tgttgtcatg gttcacagta 486

ccgcacatcg gcattcgatg tgacggagcg aaac 520

<210> 6

<211> 70

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Met Ser Asn Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys

1 5 10 15

Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val

20 25 30

His Phe Thr Ala Ile Gln Ser Asn Glu Phe Arg Thr Leu Asn Glu Asn

35 40 45

Gln Lys Val Glu Phe Ser Ile Glu Gln Gly Gln Arg Gly Pro Ala Ala

50 55 60

Ala Asn Val Val Thr Leu

65 70

<210> 7

<211> 560

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> CDS

<222> (202)..(414)

<400> 7

ttttctttac aaaagtaatc cttgctatgg gtggttaatc atgcgttaat ggtgttctgg 60

tttgttacaa atttatctga agcagtcatt gttataattt tattatttgt acctcttgag 120

atttccttgt tggtttttct ctctgatatt ttttttcgga ccattctgcc caagggctaa 180

tttcttcaaa aggtaataat t atg tct aac aaa atg act ggt tta gtg aaa 231

Met Ser Asn Lys Met Thr Gly Leu Val Lys

1 5 10

tgg tgt aac cct gaa aaa ggt ttt ggt ttc atc acg ccg aaa gag ggc 279

Trp Cys Asn Pro Glu Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Lys Glu Gly

15 20 25

agc aaa gat gtg ttt gtc cat ttc tca gca atg cag agc aac gat ttc 327

Ser Lys Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala Met Gln Ser Asn Asp Phe

30 35 40

aaa aca tta act gag aat cag gaa gtt gaa ttt ggt att gag aac gga 375

Lys Thr Leu Thr Glu Asn Gln Glu Val Glu Phe Gly Ile Glu Asn Gly

45 50 55

cct aaa ggt cct gcc gct gtt cat gta gtg gcg ctt tga ggtagacaat 424

Pro Lys Gly Pro Ala Ala Val His Val Val Ala Leu

60 65 70

attacaaacc atattcactt tagatgcccg tgttgtcatg gttcccagta tagaacatca 484

tcttttgatg tttctgacat gaatcctttc ggggcaaaat gtatcttttg taaatcaatg 544

atgattacat ttgata 560

<210> 8

<211> 70

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Met Ser Asn Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp Cys Asn Pro Glu Lys

1 5 10 15

Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Lys Glu Gly Ser Lys Asp Val Phe Val

20 25 30

His Phe Ser Ala Met Gln Ser Asn Asp Phe Lys Thr Leu Thr Glu Asn

35 40 45

Gln Glu Val Glu Phe Gly Ile Glu Asn Gly Pro Lys Gly Pro Ala Ala

50 55 60

Val His Val Val Ala Leu

65 70

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 9

atgaatcaca aagtgcatat g 21

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 10

attgtgagcg gataacaatt gatgtg 26

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_特征

<222> (33)..(44)

<223> n是a，c，g或t.

<400> 11

ggatctagag ggtattaata atgactggtg cannnnnnnn nnnn 44

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_特征

<222> (13)..(24)

<223> n是a，c，g或t.

<400> 12

atgactggtg cannnnnnnn nnnn 24

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_特征

<222> (5)..(16)

<223> n是a，c，g或t.

<400> 13

tgcannnnnn nnnnnnccga 20

<210> 14

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

atttatatat at 12

<210> 15

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

catttatata ta 12

<210> 16

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

tttatatata ta 12

<210> 17

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 17

act tttacaa ag 12

<210> 18

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 18

cacttttaca aa 12

<210> 19

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

cttttacaaa ga 12

<210> 20

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

acacatgaac ac 12

<210> 21

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 21

cacacatgaa ca 12

<210> 22

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 22

cacatgaaca ca 12

<210> 23

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 23

catagttttc aa 12

<210> 24

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 24

ccatagtttt ca 12

<210> 25

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 25

atagttttca aa 12

<210> 26

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 26

cggtctctcc gc 12

<210> 27

<211> 9

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 27

uuaacuuua 9

<210> 28

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 28

cgccgaaagg cacacuuaau uauuaaaggu aauacacuau gucc 44

<210> 29

<211> 34

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 29

cgccgaaagg cacacaaggu aauacacuau gucc 34

<210> 30

<211> 43

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 30

cgccgaaagg cacacuuaau uuuaaaggua auacacuaug ucc 43

<210> 31

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 31

cgccgaaagg cacacuugau uauuaaaggu aauacacuau gucc 44

<210> 32

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 32

cgccgaaagg cacacuuaac uauuaaaggu aauacacuau gucc 44

<210> 33

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 33

cgccgaaagg cacacuugac uauuaaaggu aauacacuau gucc 44

<210> 34

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 34

cgccgaaagg cacacuuaau uguuaaaggu aauacacuau gucc 44

<210> 35

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 35

cgccgaaagg cacacuuaac uguuaaaggu aauacacuau gucc 44

<210> 36

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 36

cgccgaaagg cacacuugac uguuaaaggu aauacacuau gucc 44

<210> 37

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 37

cgccgaaagg cacacauuau uaaagguaau acacuauguc c 41

<210> 38

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 38

cgccgaaagg cacacuuaau uaaagguaau acacuauguc c 41

<210> 39

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 39

cgccgaaagg cacacuuaau uaagguaaua cacuaugucc 40

<210> 40

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 40

cgccgaaagg cacacuuaau uauuaaaccu aauacacuau gucc 44

<210> 41

<211> 34

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 41

cgccgaaagg cacacaaccu aauacacuau gucc 34

<210> 42

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 42

cgccgaaagg cacacuuaau uauuaccuaa uacacuaugu cc 42

<210> 43

<211> 39

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 43

cgccgaaagg cacacuuaau uauauaauac acuaugucc 39

<210> 44

<211> 35

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 44

cgccgaaagg cacacuuaau uauuacacua ugucc 35

<210> 45

<211> 596

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 45

aaccgattaa tcataaatat gaaaaataat tgttgcatca cccgccaatg cgtggcttaa 60

tgcacatcaa cggtttgacg tacagaccat taaagcagtg tagtaaggca agtcccttca 120

agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattccttta acgcttcaaa atctgtaaag 180

cacgccatat cgccgaaagg cacacttaat tattaaaggt aatacactat gtccggtaaa 240

atgactggta tcgtaaaatg gttcaacgct gacaaaggct tcggcttcat cactcctgac 300

gatggctcta aagatgtgtt cgtacacttc tctgctatcc agaacgatgg ttacaaatct 360

ctggacgaag gtcagaaagt gtccttcacc atcgaaagcg gcgctaaagg cccggcagct 420

ggtaacgtaa ccagcctggt cgaccatcat catcatcatc atatcgaagg taggcatatg 480

aagcttggta ccggatcctc tctgcttaaa agcacagaat ctaagatccc tgccatttgg 540

cggggatttt tttatttgtt ttcaggaaat aaataatcga tcgcgtaata aaatct 596

<210> 46

<211> 365

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 46

aaccgattaa tcataaatat gaaaaataat tgttgcatca cccgccaatg cgtggcttaa 60

tgcacatcaa cggtttgacg tacagaccat taaagcagtg tagtaaggca agtcccttca 120

agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattccttta acgcttcaaa atctgtaaag 180

cacgccatat cgccgaaagg cacacttaat tattaaaggt aatacactat gaatcacaaa 240

gtgcatatga agcttggtac cggatcctct ctgcttaaaa gcacagaatc taagatccct 300

gccatttggc ggggattttt ttatttgttt tcaggaaata aataatcgat cgcgtaataa 360

aatct 365

<210> 47

<211> 350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 47

aaccgattaa tcataaatat gaaaaataat tgttgcatca cccgccaatg cgtggcttaa 60

tgcacatcaa cggtttgacg tacagaccat taaagcagtg tagtaaggca agtcccttca 120

agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattccttta acgcttcaaa atctgtaaag 180

cacgccatat cgccgaaagg cacacttaat tattaaaggt aatacactca tatgaagctt 240

ggtaccggat cctctctgct taaaagcaca gaatctaaga tccctgccat ttggcgggga 300

tttttttatt tgttttcagg aaataaataa tcgatcgcgt aataaaatct 350

<210> 48

<211> 162

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 48

acgguuugac guacagacca uuaaagcagu guaguaaggc aagucccuuc aagaguuauc 60

guugauaccc cucguagugc acauuccuuu aacgcuucaa aaucuguaaa gcacgccaua 120

ucgccgaaag gcacacuuaa uuauuaaagg uaauacacua ug 162

<210> 49

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 49

ucccugccau uuggcgggga uuuuu 25

<210> 50

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 50

Met Asn His Lys Val His Met

1 5

Claims

1.能够表达异源多肽的DNA分子，包括：编码异源多肽的核苷酸序列；以及可操纵地连接到编码所述异源蛋白的所述核苷酸序列上，以在引起冷休克反应的条件下控制所述异源多肽的表达和生产的冷休克诱导的启动子和5’-非翻译区(5’-UTR)，其中或者(1)将在起始密码子下游大约第4到第7个密码子处包含富含AT的12个核苷酸序列的翻译增强元件安置在所述的冷休克诱导的启动子和5’-UTR以及所述的编码所述异源多肽的核苷酸序列之间，来与所述的编码所述异源多肽的核苷酸序列形成翻译的符合读框的融合，或者(2)所述的编码所述异源多肽的核苷酸序列在起始密码子下游的第4到第7个密码子中包含富含AT的序列。

2.权利要求1的DNA分子，其中所述的冷休克诱导的启动子和5’-UTR是从由SEQ ID NO：1的第22-441位核苷酸、SEQ ID NO：3的第11-214位核苷酸、SEQ ID NO：5的第12-213位核苷酸、SEQ IDNO：7的第11-201位核苷酸、其片段和其变体构成的组中选出的。

3.权利要求1的DNA分子，其中存在(1)。

4.权利要求3的DNA分子，其中通过由7个密码子的核苷酸序列构成的所述翻译增强元件将所述的冷休克诱导的启动子和5’-UTR连接到所述的编码所述异源多肽的核苷酸序列上，其中第1个密码子是起始密码子，第4-第7个密码子形成所述富含AT的序列。

5.权利要求4的DNA分子，其中所述的翻译增强元件包括SEQ IDNO：9的第1-18位核苷酸。

6.权利要求1的DNA分子，其中所述的编码所述异源多肽的核苷酸序列起始密码子下游的第4到第7个密码子中包含富含AT的序列。

7.权利要求1的DNA分子，它进一步包含排列在编码所述异源多肽核苷酸序列下游的冷休克诱导基因的3’-非编码区(3’-UTR)。

8.权利要求7的DNA分子，其中所述的3’-UTR选自由cspA、cspB、cspG和cspI构成的组中的3’-UTR。

9.权利要求7的DNA分子，其中所述的3’-UTR包含SEQ ID NO：1的第442-539位核苷酸。

10.权利要求1的DNA分子，其中所述的冷休克诱导的启动子和5’-UTR区序列包含紧邻转录起始位点下游的lacI操纵子序列。

11.权利要求10的DNA分子，其中lacI操纵子序列是SEQ ID NO：10的核苷酸序列。

12.权利要求1的DNA分子，它是载体。

13.权利要求12的载体，它是自我复制的载体。

14.权利要求13的载体，它是pColdI。

15.权利要求13的载体，它是pColdII。

16.权利要求13的载体，它是pColdIII。

17.用权利要求1的DNA分子转化的原核宿主细胞。

18.权利要求17的宿主细胞，它是大肠杆菌。

19.权利要求17的宿主细胞，它是缺乏多核苷酸磷酸化酶活性的多核苷酸磷酸化酶突变体。

20.权利要求17的宿主细胞，它是缺乏与游离的30S核糖体亚单位结合而不与70S核糖体亚单位结合的15KDa RbfA蛋白的rbfA突变体。

21.权利要求17的宿主细胞，它是缺乏csdA RNA解旋酶活性的csdA RNA解旋酶突变体。

22.权利要求17的宿主细胞，它与过度表达csdA RNA解旋酶的载体在所述宿主细胞中共转化。

23.生产异源多肽的方法，包括：在宿主细胞的正常生理生长的温度下在营养培养基中培养权利要求17的宿主细胞；通过将培养温度降到至少比宿主细胞正常生长的温度低13℃的温度，对所培养的宿主细胞进行冷休克以诱导异源多肽的生产；以及在降低的培养温度下培养冷休克的宿主细胞以生产异源多肽。

24.权利要求23的方法，它进一步包括回收所生产的异源多肽的步骤。

25.权利要求23的方法，其中将培养温度降到比宿主细胞的正常生理生长温度低至少20℃。

26.权利要求23的方法，进一步包括在使所培养的宿主细胞发生冷休克以后，用含有可检测地标记的异源多肽的化合物的培养基替换营养培养基的步骤。

27.权利要求26的方法，其中所述的化合物含有通常在宿主细胞中以可忽略量存在的同位素。

28.权利要求27的方法，其中所述的同位素是¹⁵N或¹³C。

29.权利要求27的方法，其中所述的化合物是从由¹⁵NH₄Cl、(¹⁵NH₄)₂SO₄、¹³C葡萄糖、用¹⁵N标记的氨基酸残基、用¹³C标记的氨基酸残基以及用¹⁵N和¹³C两者标记的氨基酸残基构成的组中选出。

30.权利要求27的方法，其中所述的宿主细胞是缺乏一种或更多种主要冷激蛋白的突变体。

31.权利要求30的方法，其中所述的突变体宿主细胞缺乏CspA。

32.权利要求30的方法，其中所述的突变体宿主细胞缺乏CspA、CspB、CspG和CspE。

33.获得异源多肽的NMR光谱的方法，包括：将在权利要求26的方法中在降低的培养温度下培养的冷休克的宿主细胞分离，以生产用所述化合物可检测地标记的异源多肽；和对分离的冷休克的宿主细胞进行全细胞的NMR光谱研究，或者对分离的冷休克的宿主细胞的细胞裂解液上清进行NMR光谱研究以获得异源多肽的NMR光谱。

34.权利要求33的方法，其中对分离的经冷休克的全细胞进行全细胞NMR光谱研究。

35.权利要求33的方法，其中对分离的经过冷休克的宿主细胞的细胞裂解液上清进行NMR光谱研究。

36.获得异源多肽NMR光谱的方法，包括：在营养培养基中培养用包含编码异源多肽并且能够表达和生产对冷休克反应的异源多肽的核苷酸序列的核酸转化的原核宿主细胞；通过将培养温度降到宿主细胞的正常生理生长温度以下的温度，而使所培养的宿主细胞发生冷休克以诱导异源多肽的生产；在所培养的宿主细胞发生冷休克后，用含有可检测地标记的异源多肽的化合物的培养基替换营养培养基；在降低的培养温度下培养冷休克的宿主细胞以生产用所述的化合物可检测地标记的异源多肽；将在降低的培养温度下培养的冷休克的宿主细胞分离；以及对分离的冷休克的宿主细胞进行全细胞的NMR光谱研究或者对分离的冷休克的宿主细胞的细胞裂解液上清进行NMR光谱研究以获得异源多肽的NMR光谱。