CN105238805A - 一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的表达及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的表达及制备方法，通过设计引物，以质粒pET30a-LTRG为模板，进行PCR扩增，得到A亚基C端和B亚基的N端均带有His标签的重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体LTRG基因，选择冷休克载体pcoldII，构建出pcoldII-LTRG表达载体，并对其在低温条件下进行可溶性表达，之后采用Ni柱亲和层析纯化的方法对大量表达的蛋白质进行纯化。本发明利用冷休克基因CSPA获得高效的表达能力，进行诱导表达后，可溶性表达的产物不需进行变性和复性，省掉了蛋白质变性及复性的繁琐过程，避免了变性及复性过程中蛋白质的损失。

Description

一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的表达及制备方法

技术领域

本发明涉及大肠杆菌热敏性肠毒素的制备领域，具体涉及一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的表达及制备方法。

背景技术

大肠杆菌热敏性肠毒素(Escherichiacoliheat-labileenterotoxin，LT)虽然是一种蛋白，但也是一种很强的黏膜免疫原，经黏膜途径免疫时，能刺激机体产生大量针对该毒素的抗体，而且在与其他抗原同时免疫或者与其他蛋白融合表达后免疫时，还能刺激机体产生针对该抗原的抗体和黏膜IgA，起到佐剂的功能，被认为是目前最具潜力的黏膜佐剂之一。

用作佐剂时，LT可以促进机体产生比较平衡的Th1和Th2反应，可刺激机体产生高水平的针对共同免疫抗原的黏膜IgA和血清IgG，而且免疫反应持久。

LT是AB5型的毒素，B亚基介导毒素与哺乳动物细胞表面受体结合，而A亚基则具有具有腺苷酸酶活性，可引起人和动物水样腹泻。作为一种毒素，LT的毒性制约了其应用，从发现LT的佐剂功能三十年来，研究人员一直尝试将其毒性和佐剂功能分开，主要是通过基因工程的方法对LT进行点突变来制备LT的减毒甚至无毒突变体，后来还发现单独的LTB也具有佐剂功能，而且将LTB与其他一些基因串联表达时，也能起到很好的佐剂功能。

中国专利CN101560247对LT进行了双突变，并构建了双突变重组LT的原核表达载体pET30a-LTRG(R72G192)，诱导表达后重组LT的A亚单位以包涵体形式表达而B亚单位以可溶性形式表达，蛋白变复性后具有良好的佐剂功能。但蛋白后续复性过程比较繁琐，且复性过程中有大量蛋白损失。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的表达及制备方法，选择冷休克载体pcoldII，利用冷休克基因CSPA获得高效的表达能力，对大肠杆菌热敏性肠毒素突变体(LTRG，下同)基因进行可溶性表达，提高了可溶性表达的量，并且蛋白质经诱导表达后不需进行变性和复性，省掉了蛋白质变性及复性的繁琐过程，避免了变性及复性过程中的蛋白质的损失。

为了达到以上目的，本发明的技术方案是：

一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的表达载体，其为利用冷休克载体pcoldII与LTRG基因构建的表达载体pcoldII-LTRG，并且所述的LTRG基因的A亚基C端和B亚基的N端上均引入了His标签。

进一步，构建表达载体pcoldII-LTRG的方法，包括：

1)设计引物：参照表达载体pcoldII的多克隆位点序列和LTRG基因序列设计引物L1F和L1R，并引入PstI和XhoI酶切位点；所述引物序列L1F和L1R分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示：

2)以质粒pET30a-LTRG为模板，进行PCR扩增，得到A亚基C端和B亚基的N端均带有His标签的LTRG基因的目的片段；

3)将冷休克载体pcoldII及步骤2)中的目的片段分别进行双酶切，再将酶切片段用连接酶连接，获得表达载体pcoldII-LTRG，将其转化到克隆菌DH5a中扩增，并进行双酶切验证；

本发明提供的一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)构建表达载体pcoldII-LTRG；

2)将表达载体pcoldII-LTRG转化到BL21(DE3)感受态菌并进行IPTG诱导表达，添加IPTG后，诱导温度为15～16℃，时间为12～24小时，获得目的蛋白；

3)将目的蛋白在非变性条件下采用重力法Ni柱亲和层析进行纯化，用PBS缓冲液和咪唑洗脱缓冲液配制清洗液，洗脱获得纯化的目的蛋白；纯化过程中所用缓冲液均预冷至4～8℃。

所述步骤3)的清洗液中咪唑洗脱缓冲液的含量为25～40％(体积比)，咪唑的浓度为125mmol/L～200mmol/L。

本发明所述的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体LTRG基因的突变位点为大肠杆菌热敏性肠毒素LT的A亚基上第72位由丙氨酸A突变为精氨酸R，第192位由精氨酸R突变为甘氨酸G。

本发明所述的目的蛋白即重组LTRG蛋白，是大肠杆菌热敏性肠毒素突变体LTRG基因经诱导表达后的获得的蛋白质。

本发明的有益效果：

1.本发明选择的表达载体对LTRG重组蛋白进行可溶性表达，表达的产物不需进行变性和复性，省掉了蛋白质变性和复性的繁琐过程，也避免了变性和复性过程中蛋白质的损失。

2.本发明选择冷休克表达载体pcoldII，利用冷休克基因CSPA的启动子设计高效率的蛋白质表达载体，在CSPA的启动子的下游处，插入了lac操纵子，以便严格控制表达，当培养的大肠杆菌的温度充分降低，几乎暂时停止生长，大部分的蛋白表达减少，由于5’非翻译区(5’UTR)，翻译增强元件(TEE)，His标签序列和多克隆位点(MCS)位于CSPA启动子的下游，此时克隆到冷休克基因下游多克隆位点中的的LTRG基因被专门诱导表达。

本发明在构建表达载体时，在大肠杆菌热敏性肠毒素突变体LTRG基因的A亚基C端和B亚基的N端引入His标签，由于在目的蛋白上引入了His标签而且该蛋白以可溶形式表达，故在非变性条件下采用重力法Ni柱亲和层析纯化，用咪唑梯度浓度洗脱获得纯化的目的蛋白，纯化过程中所用缓冲液均预冷至4℃，能有效减少蛋白质的降解。

附图说明

图1为LTRG基因的PCR扩增产物的琼脂糖电泳图；

其中，M.DNAMarkerDL2000；1.PCR扩增的LTRG基因产物。

图2为pcoldII-LTRG质粒双酶切后的核酸电泳图；

其中，M：DNAMarkerDL2000/DL1500；1：双酶切后的pcoldII-LTRG质粒；2：未酶切的pcoldII-LTRG质粒；3、4：pcoldII质粒。

图3为pcoldII-LTRG诱导表达后SDS-PAGE结果；

其中，1：pcoldII-LTRG诱导前；2：pcoldII-LTRG诱导破碎后上清；3：pcoldII-LTRG诱导破碎后沉淀。

图4为蛋白诱导表达后WesternBlot验证结果；

其中，M：蛋白Marker；1：以抗His-tag单抗作为一抗；2：以抗CTB单抗作为一抗。

图5为LTRG蛋白诱导表达和纯化结果；

其中，1：蛋白Marker；2：诱导前；3-5：诱导后；6：纯化后。

具体实施方式

为了进一步了解本发明，下面结合实施例和附图对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明实施例中所用到的主要材料、试剂及仪器列举如下：

DH5a、BL21(DE3)、pcoldII表达载体、PstI、NcoI限制性内切酶Taq酶、T4DNA连接酶、DNAMarker和蛋白质Marker为大连宝生物公司产品，羊抗CTB单抗和鼠抗His-tag单抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

pET30a-LTRG质粒为本实验室构建保存。质粒小量抽提试剂盒、DNA回收试剂盒为Axygen公司产品；酵母粉、胰蛋白胨为oxide公司产品；蛋白纯化仪为GEAKTApurifier10；其他试剂均为国产分析纯。

实施例1pcoldII-LTRG表达载体的构建

1.引物设计

以pET30a-LTRG为模板，参照pcoldII表达载体的多克隆位点序列和LTRG序列设计引物，标记为L1F和L1R，下划线部分分别为PstI和XhoI酶切位点，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

L1F：5’-ccgctcgagaatggcgacagattatac-3’

L1R：5’-aactgcagttagtggtggtggtggtggtggtttttcatactgattgc-3’。

引物L1F和L1R可从pET30a-LTRG扩增出C端带有His标签的LT成熟肽基因，并在下游引入了六个组氨酸编码序列，使LT的B亚基N段也含His标签，方便纯化。

2.质粒提取及验证

提取保存的质粒并进行凝胶电泳验证：质粒提取使用Axygen质粒小量提取试剂盒，按操作说明书进行，提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小进行验证，具体过程如下：

1)将分别保有pET30a-LTRG质粒、pcoldII质粒的DH5a甘油菌从-80℃冰箱取出，蘸取少量菌液划线接种至相应抗性的LB培养板(pET30a为kan抗性，pcoldII为Amp抗性)，37℃倒置培养12～16小时。

2)分别从平板上挑取单菌落接种到含5mLLB液体培养液的试管中，37℃摇床中以200r/min培养过夜。

3)吸取菌液1mL转移到1.5mL离心管中，12000rpm离心2min，弃上清收集菌体；

4)向沉淀中加入250μLsolutionA重悬菌体；

5)加入250μLsolutionB，上下颠倒几次使混匀，直至形成透亮的溶液。此步骤不超过5min。

6)加入350μLsolutionC并温和翻转几次混匀液体，4℃，以12000rpm离心10min。

7)小心吸取步骤6中的上清转移到置于收集管的DNA吸附柱中，12000rpm/min离心1min，弃滤液，将吸附柱放回收集管。

8)加入WashI液500μL，12000rpm离心1min，弃滤液后将吸附柱放回收集管。

9)在吸附柱中加入700μL的WashII洗脱液，12000rpm离心1min，弃滤液。并重复一次。

10)弃滤液后仍将吸附柱放回收集管内，12000rpm离心1min。

11)将吸附柱转移到新的1.5mLEP管，向膜中央小心加入60μL预热到65℃的双蒸水溶解质粒，静置3min后以12000rpm的速度离心2min，EP管内即为所提质粒pET30a-LTRG，置-20℃保存备用。

3.PCR扩增目的片段

以步骤2中提取的pET30a-LTRG质粒为模板，用相应的引物进行PCR扩增，分别扩增出含有His标签的LTRG基因目的片段，扩增出的LTRG基因片段大小为1300bp，与预期相符，见图1。

PCR反应体系：

PCR反应参数：

4.胶回收目的片段

使用Axygen凝胶DNA回收试剂盒从PCR产物中回收目的片段，操作按说明书进行：

1)制备浓度1％的TAE琼脂糖凝胶。

2)将PCR产物与6×Loadingbuffer混合均匀后上样，100V恒压电泳20分钟，切胶，将含目的片段的凝胶放入洁净EP管。

3)按重量比1:3(含DNA的琼脂糖：溶液S1)加入溶液S1。

4)50℃水浴10min，每2min颠倒混匀1次，使琼脂糖完全融化。

5)将融化后的琼脂糖液移到置于收集管上的吸附柱中，12000g离心1min后倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。

6)向吸附柱中加入500μL的W1液，静置1min后，12000g离心15秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。如果室温低于20℃，离心前先静置1min。

7)在吸附柱中加入500μL的W2液，静置1min后，离心15秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，12000g离心1min。

8)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30μLT1液，静置1min后，离心1min。将回收的DNA保存于-20℃。

5.目的片段与质粒pcoldII双酶切

将质粒pcoldII及PCR目的片段进行双酶切，获取可以进行连接的片段。

PCR目的片段酶切体系：

质粒酶切体系：

6.酶切目的片段与酶切质粒连接

使用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物和质粒的酶切片段，方法同步骤4，获得片段后进行连接。

连接体系：

7.连接产物转化到DH5a

1)将连接产物转化到克隆菌DH5a，克隆并扩增质粒。

2)从-80℃冰箱取出50μL分装的DH5α感受态细胞放置冰上5min；

3)加入连接产物2μL，缓慢摇动以混匀，冰浴30min。

4)在42℃水浴中热激90s，冰浴4min。

5)加入800μLSOB培养基，37℃，摇动培养30min，同时取相应抗性(pcoldII-LTRG用Amp抗性，pET28a-LTB用Kan抗性)LB平板于37℃培养箱中预热。

6)吸取菌液200μL涂布平板，干燥后放37℃培养箱倒置培养14～16小时。

8.pcoldII-LTRG重组质粒提取和验证

1)质粒提取，方法同步骤2。用Axygen质粒小量提取试剂盒提取质粒，操作按说明书进行。

2)质粒双酶切验证：连接产物用PstⅠ和XhoⅠ/NcoI进行双酶切，经琼脂糖电泳检测，图2所示为构建的表达质粒进行双酶切验证之后的核酸电泳图，泳道1为pcoldII-LTRG质粒双酶切后，2为未酶切，3、4为pcoldII质粒，可见pcoldII-LTRG质粒双酶切后出现的两条带一条与pcoldII大小一致，一条大小约1300bp与LTRG片段大小一致。

3)将阳性质粒转化到DH5a后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，其碱基序列如SEQIDNO.3所示。

实施例2重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的制备方法

1.将重组载体pcoldII-LTRG转化到BL21(DE3)感受态菌

融化感受态：从-80℃冰箱取出50μL分装的BL21(DE3)感受态细胞，冰上放置5min；

1)冰浴：加入连接产物2μL，缓慢摇动以混匀，冰浴30min。

2)热激：在42℃水浴中热激90s，冰浴4min。

3)培养：加入800μL的SOB培养基，37℃，摇动培养30min，同时取相应抗性(pcoldII-LTRG用Amp抗性，pET28-LTB用Kan抗性)LB平板于37℃培养箱中预热。

4)涂板：吸取菌液200μL涂布平板，干燥后放37℃培养箱倒置培养12小时。

2.诱导表达

1)种子液制备：挑取单个基因工程菌菌落，接种于5mL相应抗性的LB培养液，37℃，180r/min振荡培养过夜作为种子液。

2)培养：取1mL种子液接入100mLLB培养液中(4管)，37℃，180r/min扩大培养1.5小时后每半小时取菌液1mL测OD600。

3)pcoldII-LTRG诱导表达：当OD600达到0.4～0.5时，将培养液转至15℃低温培养箱放置30分钟使降温，添加IPTG至1.0mM终浓度，在15℃继续震荡培养24小时后收获菌液。

4)收获菌体：将收获的菌液以8000rpm离心10min，弃上清，沉淀用PBS重悬清洗，离心弃上清；

5)胞质周隙蛋白提取：取少量表达pcoldII-LTRG的菌体先后用20％蔗糖和去离子水进行高渗和低渗处理，使菌体胞质周隙中的蛋白释放，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，确定表达产物位置是胞内还是胞质间隙。

6)破碎菌体：将收获菌体用10mL的PBS重悬，进行超声破碎(功率：300W，工作时间5秒，间歇时间10秒，总次数30)。

7)离心：破碎的菌液以12000rpm离心10min，吸取上清100μL至EP管，加入SDS-PAGE2×Loadingbuffer100μL，沉淀用2mLPBS重悬后也吸取100μL加入100μL的2×Loadingbuffer处理，SDS-PAGE或-20℃保存。

3.表达形式分析

将诱导前和诱导后收集的菌体以及收菌后破碎菌体进行SDS-PAGE，胶浓度为15％，结果见图3，所表达的目的蛋白主要位于上清液中，表明目的蛋白以可溶性形式表达。

1)SDS-PAGE

样品处理：将已加Loadingbuffer的样品沸水浴8分钟，500rpm离心30s。

上样：每孔上样量10μL，先80V电压电泳约25min，待溴酚蓝指示剂进入分离胶层后加大电压至120V，电泳直至阳极外层电泳液变蓝。

染色：将凝胶浸泡到考马斯亮蓝染液，置摇床上振荡染色30min。

脱色：回收染色液，用自来水清洗掉染色液后加入脱色液，振荡脱色6小时以上。

拍照及分析：凝胶用凝胶成像系统拍照，分析。

2)表达产物Westernblot验证

取表达载体pcoldII-LTRG经诱导后菌体进行蛋白免疫印迹实验，验证产物是否目的蛋白。按常规方法进行15％分离胶和5％浓缩胶的SDS-PAGE电泳，转印到NC膜上，用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，以羊抗CTB单抗和抗His-tag单抗为一抗，HRP标记兔抗山羊IgG和羊抗鼠IgG为二抗，膜型DAB进行显色，见图4，结果均在目的蛋白大小的位置出现了黑色印迹，表明表达出的蛋白正是目的蛋白。具体过程如下：

取胶：SDS-PAGE电泳结束后取出凝胶，裁切下需要的部分，置转印缓冲液中浸泡。

剪膜：剪下与凝胶大小相同的NC膜和6张Whatman滤纸，与纤维垫一起置转印缓冲液中浸泡。

装好转印装置，NC膜位于胶偏向正极的那面，向转印槽内注满转印缓冲液，冰浴条件下100V电压转印1小时。

洗膜：转印完成后将膜卸下，用TBS溶液洗膜5～10min；

封闭：将膜用TTBS在4度封闭过夜；

洗膜：用TTBS洗膜，两次，每次5～10min；

一抗孵育：将膜于TTBS稀释的山羊抗CTB抗体溶液中，于37度恒温箱中孵育1.5小时；

洗膜：用TTBS洗膜，两次，每次5～10min；

二抗孵育：将膜用TTBS稀释的兔抗山羊IgG抗体中，于37度恒温箱中孵育45min；

洗膜：用TTBS洗膜，两次，每次5～10min，最后用去TBS洗膜以除去膜表面的Tween20；

显色：按照增强型膜显色液的说明书进行，配制好显色液后滴加到膜上，待出现紫色条带后用去离子水浸泡10min以终止显色，中间换水一次；

干燥保存：在膜仍湿润时进行拍照，将膜置于滤纸上干燥后保存备查。

4.目的蛋白的纯化

由于在目的蛋白上引入了His标签而且以可溶形式表达，故在非变性条件下采用重力法Ni柱亲和层析纯化，用咪唑梯度浓度洗脱获得纯化的目的蛋白，纯化过程中所用缓冲液均预冷至4℃，以减少蛋白降解，成功获得了比较纯的重组LTRG蛋白，见图5，其中第6泳道为纯化后的LTRG,可见两条条带，大小分别为30kd和15kd。

具体过程如下：

1)装柱：将1.6×40cm规格的层析柱固定到旋转混匀仪上，保持下端出液口关闭，加入20mL保存于20％乙醇的Ni-NTAresin，打开下端出液口使乙醇溶液流出。

2)水清洗：加入30mL去离子水，关闭两端出口，开动旋转混匀仪5min，以5rpm速度缓慢旋转使Ni-NTAresin与水充分混合，然后打开下端出液口使水流出，达到清洗目的，重复清洗三次，每次30mL去离子水。

3)平衡：用上样缓冲液平衡Ni柱，每次30mL，两次。

4)上样：加入处理好的破碎上清20mL，开动旋转混匀仪1小时，使目的蛋白挂柱。

5)清洗：排出破碎上清后用上样缓冲液清洗柱子两次，每次用上样缓冲液30mL，收集清洗液。

6)咪唑梯度浓度清洗：用上样缓冲液和洗脱缓冲液配制含不同浓度咪唑的清洗液，清洗柱子，清洗液中咪唑浓度逐步提高，分别用5％，10％，20％，30％，40％，50％，80％，100％洗脱缓冲液比例洗脱，每个浓度清洗两次，每次30mL，收集各梯度的洗脱液；其中上样缓冲液是PBS缓冲液，100％洗脱缓冲液中咪唑的浓度为500mmol/L。

7)平衡：100％洗脱缓冲液洗脱完毕后，用上样缓冲液平衡柱子至少3个体积。

8)清洗：用去离子水洗层析柱两次，每次30mL，再用30mL20％乙醇清洗1次后加入20mL20％乙醇，将Ni-NTAresin排出，置柱4℃保存。

9)SDS-PAGE：将各阶段所取洗脱液分别取少量处理后进行SDS-PAGE，确定洗脱目的蛋白所需咪唑浓度为125mmol/L～200mmol/L，取含纯化目的蛋白浓度较大的各管混合、通过PEG透析浓缩分装保存于-80℃冰箱。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (5)

1.一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的表达载体，其特征在于，其为利用冷休克载体pcoldII与LTRG基因构建的表达载体pcoldII-LTRG，并且所述的LTRG基因的A亚基C端和B亚基的N端上均引入了His标签。

2.构建权利要求1所述的表达载体的方法，包括：

1)设计引物：参照表达载体pcoldII的多克隆位点序列和LTRG基因序列设计引物，并引入PstI和XhoI酶切位点；

2)以质粒pET30a-LTRG为模板，进行PCR扩增，得到A亚基C端和B亚基的N端均带有His标签的LTRG基因的目的片段；

3)将冷休克载体pcoldII及步骤2)中的目的片段分别进行双酶切，再将酶切片段用连接酶连接，获得表达载体pcoldII-LTRG，将其转化到克隆菌DH5a中扩增，并进行双酶切验证。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。

4.一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)构建表达载体pcoldII-LTRG；

2)将表达载体pcoldII-LTRG转化到BL21(DE3)感受态菌中并进行IPTG诱导表达，添加IPTG后，诱导温度为15～16℃，时间为12～24小时，获得目的蛋白；

3)将目的蛋白在非变性条件下采用重力法Ni柱亲和层析进行纯化，用PBS缓冲液和咪唑洗脱缓冲液配制清洗液，洗脱获得纯化的目的蛋白；纯化过程中所用缓冲液均预冷至4～8℃。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)的清洗液中咪唑洗脱缓冲液的含量为25～40％(体积比)，咪唑的浓度为125mmol/L～200mmol/L。