IT9022514A1 - Procedimento enzimatico per la produzione di acido 7- amminocefalosporanico e derivati - Google Patents
Procedimento enzimatico per la produzione di acido 7- amminocefalosporanico e derivati Download PDFInfo
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo: Procedimento enzimatico per la produzione di acido 7-amminocefalosporanico e derivati
AMBITO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda un procedimento per la produzione enzimatica di acidi 7-amminocefalosporanici o derivati a partire da Cefalosporina C o dai corrispondenti derivati. Più in particolare, il procedimento si riferisce alla trasformazione della Cefalosporina C o suoi derivati e sali in acido 7_ amminocefalosporanico o suoi derivati mediante un processo enzimatico a due stadi con enzimi immobilizzati su una matrice solida.
L'acido 7-amminocefalosporanico (7-ACA), come è noto, è un importante intermedio per la produzione degli antibiotici della Famiglia delle Cefalosporine.
La conversione della Cefalosporina C in 7~ACA è nota da tempo e può essere effettuata sia con procedimento chimico di idrolisi (vedi Brevetto Belga 615955) sia con un procedimento enzimatico. Il procedimento chimico comporta l'impiego di reagenti molto tossici e inquinanti (solventi clorurati, clorosilani, dimetilanilina) e condizioni operative onerose (temperature molto basse: -50°0).
I procedimenti enzimatici noti si possono dividere in due gruppi: quelli che effettuano l'operazione in un solo stadio usando enzima costituito da un'acilasi attiva sulla Cefalosporina C, ottenuto ad esempio da coltura di Pseudomonas (EP 275901) e quelli che operano in due stadi.
Secondo quest'ultima metodologia nel primo stadio si realizza la conversione enzimatica della Cefalosporina C in acido glutaril-7-amminocefalosporanico, utilizzando D-amminoacido ossidasi (DAO; EC-l.4.3.3) ottenuta da colture di vari microorganismi come:
Trigonopsis variabilis, Aspergillus, Penicillium, Neurospora, Pseudomonas, Cephalosporium, secondo quanto descritto nei brevetti BE 736934, DT 2219454, FR 2133927. JP 125696 e JP 128295.
Nel secondo stadio il glutaril derivato sopra menzionato viene idrolizzato a 7-ACA con l'impiego di un'acilasi specifica ottenuta da colture batteriche di Comamonas, Pseudomonas (JP 142761) o Arthrobacter (JP 43657)·
II procedimento secondo la presente invenzione rappresenta rispetto ai procedimenti a due stadi finora noti un progresso tecnico innovativo in termini di rese notevolmente elevate. Tale vantaggio viene conseguito mediante l'adozione di particolari accorgimenti e condizioni operative e con l'impiego di enzimi altamente selettivi, purificati e immobilizzati su matrici solide insolubili nel mezzo di reazione.
II processo può essere schematicamente rappresentato come segue: Primo stadio:
Secondo stadio:
dove R é -OCOCH3.-H.-OH,-OCONH2
.PROCEDIMENTO SECONDO L'INVENZIONE
Secondo là presente invenzione la conversione enzimatica non utilizza enzimi sotto Forma di massa cellulare o di soluzione acquosa, ma detti enzimi vengono trasformati in una forma immobilizzata solida e insolubile in ambiente acquoso, particolarmente idonea per la conversione industriale della Cefalosporina C in acido 7-amminocefalosporanico (R= - OCOCH3). In virtù della loro insolubilità nel mezzo di reazione, tali enzimi immobilizzati presentano il vantaggio di poter
essere facilmente recuperati dal mezzo di reazione e reimpiegati per un elevato numero di volte, condizione questa necessaria ed indispensabile per un processo industriale.
Altro importante vantaggio sotto l'aspetto industriale conseguito dalla presente invenzione è rappresentato dal fatto che la facilità di recupero dell'enzima dalla massa di reazione permette non solo una semplificazione nel recupero del prodotto finale, ma anche un utilizzo diretto nel secondo stàdio enzimatico della soluzione di reazione ottenuta nel primo stadio. Questi vantaggi rendono pertanto possibile una conduzione del processo in maniera continua con un solo flusso liquido da uno stadio enzimatico all'altro.
PRIMO STADIO: DEAMMINAZIONE OSSIDATIVA A GLUTARIL DERIVATO
Il primo stadio del procedimento di conversione del composto cefalosporanico (I) secondo la presente invenzione è basato sull 'utilizzo di una D-amminoacido ossidasi (DAO) particolarmente specifica per la reazione di deamminazione ossidativa sulla catena D-amminoadipica.
L'enzima usato nel procedimento secondo l'invenzione è ottenuto da colture di Rhodotorula gracills ATCC 26217*
Dalla coltura ottenuta per fermentazione, l'enzima viene isolato, purificato da enzimi interferenti e sottoposto ad un processo di immobilizzazione al fine di ottenere una forma insolubile in ambiente acquoso e di aumentarne la stabilità.
La conversione enzimatica del composto (I) in glutaril derivato (II) viene effettuata in soluzione acquosa mantenendo il pH ad un valore opportuno mediante aggiunta di reattivi basificanti.
Il pH può variare da 7 a 8,5; tuttavia, per l'instabilità dei composti cefalosporanici in ambiente alcalino, si preferisce operare a pH 7,5- La temperatura di reazione può variare da 20 a 30°C, nella norma 25°C.
La conversione enzimatica deve essere effettuata in presenza di aria o di ossigeno insufflando tali gas nella soluzione acquosa. Il flusso di gas può variare da 0,5 a 1 volumi/volume di soluzione/minuto .
La concentrazione del substrato di partenza (I) può variare da 20 a 100 g/1. Nel caso particolare della Cefalosporina C possono essere usati indifferentemente il suo sale sodico o potassico cristallizzati o direttamente le loro soluzioni purificate, cosi come si ottengono nei processi di recupero dei brodi di fermentazióne prima della fase finale di cristallizzazione.
L'enzima immobilizzato secondo la presente invenzione viene utilizzato in forma granulare fine e viene mantenuto in sospensione mediante agitazione meccanica e con l’aiuto del flusso di aria o ossigeno. In alternativa, la conversione può essere realizzata con un processo continuo caricando l'enzima immobilizzato in un colonna di percolamento e facendo passare attraverso questa la soluzione di substrato mantenuta satura di ossigeno e ad un pH costante di 7,5·
Il tempo occorrente per una completa trasformazione è dell'ordine di 0,5-3 ore in dipendenza delle condizioni operative. Le rese di conversione a glutaril derivato sono elevate, di norma intorno al 90%.
Il prodotto alla fine della reazione contiene sempre dell'acido 5-chetoadipil-7_amminocefalosporanico (IV) non convertito nel glutaril derivato (II) desiderato.
dove R è -OCOCH3.-H.-OH, -0C0NH2 Secondo il presente trovato si può ulteriormente convertire questo chetoadipil derivato (IV) in glutaril derivato (II) addizionando alla soluzione acquosa di. reazione, previa separazione dell’enzima DAO immobilizzato, una quantità stechiometrica di H202 rispetto al composto da trasformare e lasciando reagire alla temperatura di 20-25°C per un tempo compreso fra 10 e 15 minuti. Si può usare un eccesso di H2O2 per ridurre il tempo di reazione: l'eccesso di H202 va poi eliminato prima di passare allo stadio successivo, mediante un idoneo agente riducente come acido piruvico o suoi sali o solfiti alcalini.
L'eliminazione praticamente completa del composto (IV) sopra citato non solo permette di raggiungere rese finali di glutaril derivato intorno al 95%. ma rappresenta un grande vantaggio per la successiva fase di idrolisi enzimatica. L'idrolisi con GL-7CA
acilasi è, infatti, specifica per -i glutaril derivati e non riconosce i chetoadipil derivati (IV) che rimangono come impurezze indesiderate nel prodotto finale.
Come già detto sopra un aspetto del trovato è quello di usare un enzima DAO prodotto da Rhodotorula gracilis ATCC 26217: esso è un enzima FAD dipendente (flavoproteina) di natura endocellulare così come quello ottenuto da Trigonopsis variabilis che è la fonte maggiormente citata nella letteratura tecnica. La DAO da Rhodotorula gracilis è caratterizzata tuttavia da un più stabile legame con il FAD, come risulta dal basso valore della costante di dissociazione pari a 2,2x10~8υΜ.
La DAO da Rhodotorula gracilis si differenzia in modo netto non solo per le proprietà chimico-fisiche della proteina enzimatica, ma anche per il quadro degli inibitori e per la specificità sui D-amminoacidi presi come substrato. (Pilone Simonetta M. et al., Eur. J. Biochem. 180, 199 (1989); Kubicek-Pranz E.M. et al., J. Appi. Biochem. 104 (1985))·
In particolare la DAO da Rhodotorula gracilis ha un'ottima specificità per la Cefalosporina C con valori di Km e Vmax molto simili a quelli riscontrati per la D-alanina che è il substrato specifico per questo enzima.
Il presente trovato permette di ottenere da colture di Rhodotorula gracilis, attraverso un semplice metodo di frazionamento in colonna, l'enzima D-amminoacido ossidasi in forma purificata e praticamente esente da catalasi, esterasi e βlattamasi, ossia dagli enzimi che sono normalmente presenti nelle soluzioni di DAO grezze e che risultano interferenti nel sistema idi trasformazione enzimatica della Cefalosporina C ad acidi glutaril-7-amminocefalosporanici in quanto:
- la catalasi distrugge l'H2O2 con conseguente blocco della decarbossilazione ed arresto della reazione a chetoadipil derivati
l'esterasi, nei composti di tipo (I) dove R = OCOCH3, porta alla formazione di desacetil derivati non voluti;
la β-lattamasi idrolizza l'anello β-lattamico con distruzione della struttura cefalosporanica.
Le soluzioni di DAO così ottenute sono quindi valide per quanto riguarda la purezza e la funzionalità catalitica ma, cosi come per tutte le DAO in soluzione, non sono molto stabili e, sotto questa forma, hanno scarso interesse industriale. Le forme immobilizzate ottenute secondo il trovato, presentano invece una stabilità molto elevata e sono industrialmente valide per la produzione di acidi glutaril-7-amminocefalosporanici.
Si veda a questo proposito il diagramma di stabilità della DAO immobilizzata in Fig. 1 e, per confronto, quello di Fig. 2 relativo all'enzima in soluzione acquosa.
Inoltre la DAO immobilizzata secondo l'invenzione mantiene una elevata attività nelle condizioni di impiego del processo di deamminazione ossidativa della Cefalosporina C o suoi derivati per un periodo molto lungo e quindi per un grande numero di operazioni; si veda a questo proposito il diagramma di Fig. 3 dove si riporta la attività (in percentuale rispetto a quella iniziale) in Funzione delle ore di impiego nel processo enzimatico a 25°C e pH 7,5·
L'utilizzo dell'enzima DAO da Rhodotorula gracilis in forma purificata secondo il presente trovato é quindi caratteristica fondamentale per ottenere soluzioni di acidi glutaril-7-amminocefalosporanici particolarmente idonei per essere utilizzati tal quali e senza ulteriori trattamenti di purificazione nel processo enzimatico successivo in presenza di acilasi.
La preparazione dell'enzima immobilizzato necessario per il primo stadio della presente invenzione è essenzialmente basato sulle seguenti fasi operative:
1 - Fermentazione per la produzione delle cellule di Rhodotorula gracilis ATCC 26217·
2 - Estrazione e purificazione dell'enzima D-amminoacido ossidasi dalle cellule di Rhodotorula gracilis.
3 - Immobilizzazione della D-amminoacido ossidasi su matrici solide insolubili in acqua.
1-Fermentazione di Rhodotorula gracilis ATCC 26217
La coltura di Rhodotorula gracilis viene effettuata mediante fermentazione aerobica. Come componenti del brodo si usano quelli generalmente impiegati per la produzione di lieviti utilizzando fonti di azoto come amminoacidi nella forma D e DL, peptone, estratti, di lievito, corn steep liquor, ecc,; fonti di carbonio come glucosio, saccarosio, maltosio, melasso di barbabietola e di canna da zucchero; sali minerali come cloruro di sodio, cloruro di calcio, solfato di zinco, solfato di magnesio, ecc. Un brodo di coltura particolarmente idoneo per la produzione di cellule di Rhodotorula gracilis ad alto contenuto di enzima DA0 è quello di composizione compresa nei seguenti limiti: ·
La fermentazione viene effettuata previa sterilizzazione del brodo a 120"C portando poi a 30°C e introducendo quindi l'inoculo costituito da coltura vegetativa di Rhodotorula gracilis.
La coltura è mantenuta in agitazione a 24-32°C ed aereata mediante insufflazione bilanciata di aria ad una portata di 0,5 - 1 volumi /volume di brodo/minuto. Il pH del mezzo è mantenuto fra 4 e 6,5 preferibilmente 5 con aggiunta di basi non azotate. La durata della fermentazione può variare da 24 a 48 ore in dipendenza delle condizioni operative come composizione del mezzo di coltura, agitazione, temperatura.
2 - Estrazione e purificazione
La D-amminoacido ossidasi da Rhodotorula gracili's è un enzima endocellulare.
Al termine della fermentazione il brodo di coltura è quindi centrifugato per la separazione ed il recupero del corpuscolato. La pasta cellulare è risospesa in acqua, portata a pH da 6 a 9 (preferibilmente 8) con aggiunta di NaOH e sottoposta a trattamenti di lisi con mezzi fisici (sonicazione) o trattamenti chimici (aggiunta di tensioattivi e solventi immiscibili in H^O). Una tecnica preferenziale è quella di risospendere la pasta cellulare in un mezzo tamponato a pH 8 (preferibilmente tampone fosfato con aggiunta di piccole quantità di bisolfito alcalino e di un tensioattivo cationico come cetilpiridinio cloruro) e di sottoporre la sospensione a passaggi multipli su pressa a 550 bar o su mulino a sfere.
Il lisato cellulare viene quindi flocculato, chiarificato per centrifugazione, concentrato mediante ultrafiltrazione e salato con aggiunte di solfato d’ammonio. Il precipitato per salatura, che contiene la D-amminoacido ossidasi, è separato per filtrazione e risospeso in tampone a pH 8.
Si ottiene così una soluzione di enzima grezzo accompagnato da piccole quantità degli enzimi interferenti: catalasi, esterasi e β-lattamasi. L'enzima grezzo viene poi purificato, con metodi noti.
Una tecnica preferenziale di purificazione dell'enzima così ottenuto è il frazionamento cromatografico su colonna ,con resina a scambio ionico avente come funzione ionizzabile il gruppo dietilamminoetile (DEAE) come ad esempio Sepharose (Pharmacia), Trisacry (IBF), Toyopearl (Toso Haas) con tampone fosfato 25 mM, pH 8.
Gli enzimi interferenti, in particolare l’esterasi, sono trattenuti dalla resina della colonna mentre la DAO così purificata passa direttamente nel percolato.
Si ottiene in questo modo un enzima con un'attività specifica di 15-20 U/mg di proteina, privo di attività catalitiche non volute.
La DAO così purificata è stabile 6 giorni a 4 °C e almeno 6 mesi a -20°C e può essere direttamente utilizzata nel processo di immobilizzazione.
3 - Immobilizzazione della D-amminoacido ossidasi
Il metodo, secondo la presente invenzione; consiste nell'immobilizzare la D-amminoacido ossidasi su supporti solidi, in genere resine commerciali a scambio ionico.
La tecnica di immobilizzazione degli enzimi su resine a scambio ionico è nota da tempo, ma non è mai stata descritta e sperimentata per la DAO da Rhodotorula gracilis.
Nella presente invenzione si sono utilizzate come matrici:
- Resine a struttura polistirenica macroreticolare fortemente basiche e con funzione amminica quaternaria come Amberlite IRA 900 (Rohm e Haas).
Resine a struttura polistirenica macroreticolare debolmente basiche con funzione amminica primaria come Duolite A 365 (Rohm e Haas ).
- Resine a struttura fenolformaldeide policondensata mediamente basiche con gruppi funzionali amminici secondari e terziari come Duolite A 568 e Duolite A 7 (Rohm e Haas).
Secondo il presente trovato i suddetti tipi di resina sono Ramponati a pH da 6 a 9. preferibilmente a pH 8, con tampone fosfato 0,1 M. Alla resina tamponata si aggiunge una soluzione di un agente bifunzionale adatto per la formazione di legami di reticolazione fra la proteina enzimatica e la matrice funzionalizzata. Agenti bifunzionali idonei sono le dialdeidi alifatiche come ad esempio la glutaraldeide e la malonaldeide. Di norma si impiega una soluzione di glutaraldeide in tampone fosfato pH 7 - 9, generalmente 8, ad una concentrazione di 1-4%, generalmente 2%. Dopo 15-60 minuti a 4°-30°C, preferibilmente 30 minuti a 20°C, si separa il surnatante per decantazione ed alla resina umida attivata si aggiunge la soluzione dell'enzima DAO ad un pH compreso fra 6 e 9. preferibilmente 8, in tampone fosfato 25 mM. Dopo un contatto per 2-24 ore alla temperatura di 4°-20°C, nella norma 12 ore a 4’C, la resina con l'enzima immobilizzato si separa per filtrazione.
E' oggetto del presente trovato anche l'immobilizzazione della DAO su :
matrici a struttura poliacrilica ed in particolare con gruppi terminali epossidici quali Eupergit (Rohm-Pharma) ;
matrici inorganiche come l'allumina porosa impregnata con un complesso costituito da polietilenimina e glutaraldeide come UOP IPS-201 (UOP-USA)
In tabella 1 sono riportate le caratteristiche delle matrici oggetto della presente invenzione, la capacità di legame e l'attività della DAO immobilizzata.
Per ciascuna matrice sono riportate tre prove di immobilizzazione eseguite con quantità crescenti di enzima in modo da raggiungere la completa saturazione del supporto. . A supporto saturo le migliori attività legate sono nell'ordine di 50-75 U/g umido. Nella norma si mettono a legare 200 U per grammo di supporto umido in modo che l'attacco sia completo, l'attività legata sia intorno a 40-50 U/g umido e la Funzionalità, intesa come attività dell'enzima immobilizzato espressa in percentuale rispetto all'attività del corrispondente enzima libero, sia del 20-30%. Il grande vantaggio della DAO immobilizzata è la stabilità che ne consente l'utilizzo per più di 200 ore nella conversione di composti cefalosporanici di tipo (I) in glutaril derivati (II), nel processo enzimatico a 25°C a pH 7.5 (vedi fig. 3)· Dosaggio della attività della D-amminoacido ossidasi (DAO).
L'attività dell'enzima D-amminoacido ossidasi è valutata misurando la quantità di H202 che si sviluppa facendo reagire l'enzima su un substrato di D-alanina in tampone fosfato 100 mM a pH 7.5 saturo di ossigeno a 37°C.
L'H202 è determinata cineticamente con un reattivo a base di perossidasi, 4-amminofenazone e 2,4-diclorofenolsoifonato secondo la reazione di Trinder modificata (J. Clin. Path. 22, 246, 1969). Il colore rosso che si forma (Chinonimmina) è proporzionale all'acqua ossigenata che si sviluppa .nel saggio ed è valutata spettrofotometricamente a 510 nm.
Una unità di D-amminoacido ossidasi è quella quantità di enzima (libero o immobilizzato) che produce nelle condizioni del metodo una pinole di per minutò.
Dosaggio proteine
Il contenuto proteico delle soluzioni enzimatiche è misurato spettrofotometricamente secondo il metodo di Bradford (Anal. Biochem. 72 248, 1976) con il colorante Comassie Brillant Blue G 250 contro curva standard di albumina bovina.
SECONDO STADIO: DEACILAZIONE DEL GLUTARIL DERIVATO
Il secondo stadio del procedimento di conversione della Cefalosporina C o derivati e sali in acido 7-amminocefalosporanico o derivati è basato sull'impiego di una specifica acilasi immobilizzata per catalizzare la reazione di deacilazione del glutaril derivato (II).
Questo enzima, denominato d'ora in poi G1-.7-ACA acilasi (Glutaril-7-ACA acilasi), viene prodotto da colture di microorganismi geneticamente ingegnerizzati ottenuti da ceppi di collezione di Escherichia coli non produttori di β-làttamasi in cui è stato clonato il gene di GI-7-ACA acilasi isolato da qualsiasi microorganismo appartenente alla specie Acinetobacter produttore di questo enzima.
L'ottenimento di questi microorganismi mediante la tecnica del DNA ricombinante è oggetto di domanda di brevetto spagnolo n° 9002109 del 3 agosto 1990 , consociata della Richiedente Antibioticos S.p.A. della presente domanda di brevetto. Uno dei suddetti microorganismi particolarmente idoneo per la produzione di G1-7-ACA acilasi è E. coli 9637 (pJC ZOO), discendente dal ceppo di E. coli ATCC 9637 in cui è stato clonato il gene di Gl-7-ACA acilasi ottenuto ad esempio dal microorganismo Acinetobacter ATCC 53891 produttore di questo enzima.
L'ottimizzazione delle condizioni fermentative con questo microorganismo ha permesso di pervenire ad una elevata produttività in GI-7-ACA acilasi senza β-lattamasi e con solo piccole quantità di esterasi.
Con la presente invenzione la GI-7-ACA acilasi è purificata dall 'esterasi mediante cromatografia su colonna e l'enzima così purificato è immobilizzato su matrici solide.
La reazione enzimatica può essere cosi schematicamente rappresentata :
dove R è: -OCOCH3.-H.-OH.-OCONH2
In questo secondo stadio si impiega direttamente come substrato la soluzione acquosa di glutaril derivato (II) ottenuta nel primo stadio, che non richiede alcun trattamento preliminare di purificazione data l'elevata selettività conseguita nel primo stadio di conversione.
La concentrazione in glutaril derivato (II) nella soluzione può variare da 10 a 30 g/1.
La conversione enzimatica viene effettuata mettendo a contatto la soluzione del glutaril derivato (II) con l'enzima G1-7-ACA acilasi in forma immobilizzata su supporto solido operando a temperatura tra 20 e 35°C. Nelle condizioni operative il pH della soluzione del glutarilderivato viene mantenuto tra 7 e 9, preferibilmente intorno ad 8, mediante aggiunta di basi inorganiche od organiche come idrossido di ammonio, idrossidi alcalini, ammine alifatiche come trietilammina o soluzioni tampone del tipo dei fosfati alcalini.
La durata della conversione può variare tra 30 e 120 minuti in dipendenza delle condizioni operative.
La conversione enzimatica può essere condotta in discontinuo mantenendo in dispersione l'enzima immobilizzato nella soluzione del glutaril derivato (II).
Un metodo preferito è quello di caricare l'enzima supportato in una colonna (o più colonne operanti in serie) e far passare la soluzione di substrato in continuo attraverso queste.
Dalla soluzione di reazione ottenuta si separa quindi l'acido 7-amminocefalosporanico o i suoi derivati mediante cristallizzazione, previa acidificazione a pH 3 " 3.5, in dipendenza del punto isoelettrico del prodotto finale, con acidi inorganici come acido cloridrico, solforico o fosforico.
Un 'importante innovazione rispetto alla „ tecnica nota è rappresentata dal fatto che detto enzima, oltre ad essere ottenuto in forma molto pura, non viene utilizzato sotto forma di massa cellulare o di soluzione acquosa, ma viene trasformato in una forma immobilizzata solida insolubile in ambiente acquoso particolarmente idonea per la conversione industriale dell'acido glutaril-7-amminocefalosporanico in 7-ACA.
In virtù della insolubilità nel mezzo di reazione, tale enzima immobilizzato presenta il vantaggio di poter essere facilmente, recuperato dal mezzo di reazione e reimpiegato per un elevato numero di volte, condizione questa necessaria ed indispensabile per un processo industriale.
Tutti questi vantaggi portano infine alla possibilità di poter effettuare il processo sia in discontinuo operando in reattore agitato con l'enzima mantenuto in sospensione, sia operando con colonne a letto fisso attraverso le quali viene fatta passare in continuo la soluzione dell'acido glutaril-7-amminocefalosporanico direttamente ottenuta nel primo stadio enzimatico.
Altro importante vantaggio sotto l'aspetto industriale conseguito dalla présente invenzione è rappresentato dal fatto che la facilità di separazione dell'enzima dalla massa di reazione permette anche una semplificazione nel recupero del prodotto finale.
Altri importanti vantaggi ottenuti con l'impiego della GI-7-ACA acilasi immobilizzata secondo la presente invenzione sono i seguenti:
l'elevata selettività dell'enzima immobilizzato porta a conversioni e rese elevate, generalmente dell'ordine dell'80-90% che si traducono con l'ottenimento di un prodotto finale con elevata purezza che non richiede pertanto laboriose procedure di purificazione; '
l'enzima immobilizzato per la sua stessa caratteristica di insolubilità, a differenza di enzimi sotto forma di pasta cellulare o di soluzioni acquose, non rilascia impurezze nel mezzo di reazione che porterebbe ad un abbassamento del titolo o a colorazione del prodotto finale.
La preparazione dell'enzima Gl-7-ACA acilasi, secondo la presente invenzione, da colture di microorganismi ottenuti con l'impiego della tecnica del DNA ricombinante comprende le seguenti fasi operative.
1) Clonazione in E. coli non produttore di β-lattamasi del gene per la GI-7-ACA acilasi che viene effettuata secondo il seguente schema convenzionale:
a) preparazione dei plasmidi;
b) preparazione del DNA donatore contenente l'informazione genetica relativa alla produzione di Gl-7-ACA acilasi;
c) inserimento dei frammenti di DNA donatore nei plasmidi di cui al punto a);
d) selezione dei plasmidi portatori del gene G1-7-ACA acilasi; e) costruzione del vettore finale;
F) trasformazione dei ceppi di E. coli non produttori di βlattamasi con il vettore di cui al punto e).
2 - Fermentazione del microorganismo ottenuto in 1).
La coltura di E. coli clonato viene condotta mediante fermentazione aerobica. Il mezzo viene preparato utilizzando fonti di carbonio come glucosio, saccarosio, amido, ecc.; fonti di azoto come amminoacidi, idrolizzati di proteine, estratto di lievito, corn steep liquor, farina di soia; sali minerali come cloruro di sodio, fosfati di potassio, ecc.
La fermentazione viene effettuata previa sterilizzazione del brodo a 120 C, portando poi a 21-28°C ed introducendo quindi sterilmente cloramfenicolo a 30 mg/1.
Al brodo sterile con cloramfenicolo viene aggiunta la coltura vegetativa del microrganismo.
La coltura mantenuta in agitazione ad una temperatura di 21-28°C viene aerata mediante insufflazione di aria con una portata da 0,5 a 1 volumi/voiurne di brodo/minuto.
Si riporta a titolo di esempio una composizione tipica di un brodo presa nell'intervallo della sperimentazione:
La durata della fermentazione è di 24-72 ore in dipendenza delle condizioni operative, ottenendosi circa 3000 U/l di Gl-7-ACA acilasi .
3 - Estrazione e purificazione dell'enzima acilasi Gl-7-ACA acilasi.
La Gl-7-ACA acilasi è un enzima endocellulare. Al termine della fermentazione il brodo di coltura è centrifugato e le cellule sono sottoposte a trattamenti chimici (aggiunta di solventi insolubili in acqua e tensioattivi) o fisici (presse o mulini a sfere) per la lisi della membrana cellulare.
Una tecnica preferenziale è quella di risospendere la massa cellulare in una soluzione acquosa tamponata a pH 8 per aggiunta di fosfati alcalini e quindi sottoporla ad una lisi su pressa Manton-Gaulin a 500-600 bar. Il lisato cellulare è flocculato mediante l'aggiunta di polielettroliti di tipo cationico e ripassato in centrifuga.
Il chiarificato, contenente l'enzima grezzo, è purificato per ultrafiltrazione, salatura ed estrazione con solventi insolubili nella fase acquosa.
Una tecnica preferenziale è quella di purificare direttamente il chiarificato dopo centrifugazione su una colonna di resina a scambio ionico, avente come funzione ionizzabile il gruppo dietilamminoetile {tipo DEAE).
Una resina cromatografica dimostratasi molto efficiente è la Sepharose DEAE "fast flow" (Pharmacia). Attraverso una eluizione con quantità scalari di cloruro di sodio è possibile ottenere la Gl-7-ACA acilasi in forma particolarmente pura e priva di esterasi.
La GI-7-ACA acilasi purificata così ottenuta è molto stabile. Non si ha perdita di attività dopo 10 giorni a 25°C e dopo 1 mese a 4 °C (vedi fig.4).
4 - Immobilizzazione dell'enzima G1-7-ACA acilasi
Il metodo consiste nell’immobilizzare questo enzima su supporti solidi come polimeri artificiali e materiali inorganici, insolubili nell'ambiente acquoso utilizzato nel processo enzimatico di conversione del glutaril derivato (II) ad acido 7-amminocefalosporanico (III).
Resine adatte per l'immobilizzazione dell'acilasi sono quelle di tipo macroreticolare a struttura polistirenica fortemente .basica come Amberlite 900 e Amberlite 904. Oppure resine fenolformaldeide con gruppi funzionali amminici secondari e terziari come Duolite A 7 e Duolite A 568.
.Secondo il presente trovato l’enzima è messo a contatto con la resina, immobilizzato su questa e stabilizzato per mezzo di un agente bifunzionale del tipo delle dialdeidi alifatiche in modo 'particolare glutaraldeide, attraverso legami di reticolazione fra la proteina enzimatica e la matrice stessa.
Altre resine adatte per l'immobilizzazione dell'acilasi sono quelle con struttura poliacrilica reticolata con divinilbenzene e funzionalizzata con gruppi amminici primari come Duolite A 365. Si è inoltre immobilizzata la GI-7-ACA acilasi su resine acriliche con gruppi funzionali epossidici come Eupergit C {Rohm Pharma) o su supporti inorganici come allumina ed in modo particolare allumina impregnata con un complesso di polietilenimmina e glutaraldeide come UOP IPS-200 (UOP-USA).
In tabella 2 sono riportate le caratteristiche principali delle matrici impiegate ed i corrispondenti dati di immobilizzazione. Nell'intervallo scelto di 10-20 U di enzima per g di supporto umido l'attacco è praticamente completo e la funzionalità dell'enzima immobilizzato è 70-803⁄4 espresso come attività in percentuale di quella che avrebbe l'enzima libero.
Nella norma si mettono a legare 20 U di G1-7-ACA acilasi pér Favorevole di immobilizzazione ed un attività legata sufficiente per garantire una buona funzionalità operativa nel processo di trasformazione dei glutaril derivati ad acidi 7-amminocefalosporanici .
La G1-7-ACA acilasi immobilizzata è molto stabile come dimostra il grafico di fig. 5 e può essere impiegata per più di 200 ore nel processo di conversione dei composti cefalosporanici di tipo (II) (glutaril derivati) in quelli di tipo III (7~ACA o derivati) come risulta dal grafico di fig. 6.
Dosaggio dell’attività della G1-7-ACA acilasi
L’attività dell'enzima Gl-7-ACA acilasi è valutata misurando la velocità di idrolisi del glutaril-7-ACA a 7“ACA in tampone fosfato 0,1 M pH 7,8 a 37*C. Il 7-ACA è determinato spettrofotometricamente contro curva standard, misurando a 410 nm il colore giallo (base di Schiff) che si forma con il reattivo pdìmetilamminobenzaldeide secondo il metodo di Bulasingham modificato (Biochim. Biophys. Acta 276250, 1972).
Una unità di acilasi è definita come quella quantità di enzima (in soluzione o immobilizzato) che nelle condizioni del metodo produce una μ mole di 7“ACA in un minuto.
I seguenti esempi e preparazioni sono dati a titolo puramente illustrativo delle possibilità di attuazione del trovato sia per il primo sia per il secondo stadio del processo enzimatico.
Esempio 1
Produzione di D-amminoacido ossidasi con coltura di Rhodotorula gracilis ATCC 26217.
Un fermentatore da 1001 è caricato con 701 di brodo avente la seguente composizione:
Il mezzo è portato a pH 5.6 con H2SO42N, sterilizzato a 120°C per 20 minuti e raffreddato a 30*C. Si inocula con una coltura vegetativa di Rhodotorula gracilis ATCC 26217 e si fermenta per 28 ore a 30°C con una agitazione di 200 rpm ed una aerazione di 0,5 1/l/min. Durante la fermentazione il pH è lasciato scendere spontaneamente fino a 5 e quindi è mantenuto costante con aggiunte automatiche di NaOH 10%.
A fine fermentazione si ottengono 721 di brodo coltura con una OD660 =39 ed un'attività di D-amminoacido ossidasi di 4600 U/l. Il brodo è centrifugato a 5000 g su centrifuga a camere tipo Westfalia.
Si ottengono 3.1 Kg di pasta cellulare (umidità: 80% ca.) corrispondenti a 320.000 U di D-amminoacido ossidasi.
Esempio 2
Estrazione e purificazione di D-amminoacido ossidasi.
I Kg di pasta cellulare {103-000 U di DAO) ottenuta come descritto nell'Esempio 1 è dispersa in 3 litri di tampone fosfato 25 mM pH 8 contenente 0,5 g/1 di sodio metabisolfito e 0,5 g/1 di cetilpiridinio cloruro.
La sospensione è raffreddata a 4°C e passata su pressa Manton-Gaulin a 550 bar.
L’omogeneizzato (4,3 1) è flocculato con aggiunta di 20 ml di polielettrolita cationico (Nymco 2045C), Il flocculato si chiarifica per filtrazione su Hyflo. Il chiarificato (4,9 1) è concentrato per ultrafiltrazione a 4*0 su membrana polisolfonica a PM 30000.
Al concentrato ottenuto per ultrafiltrazione (0,750 1) si aggiungono 262 g di ammonio solfato.
II precipitato è separato dal sum atante per centrifugazione e ridisciolto in 300 m dli tampone fosfato 25 mM pH 8 contenente 0,5 g/1 di sodio metabisolfito.
La soluzione (320 mi) è diafiltrata per ultrafiltrazione su membrana PM 30000.
Il diafiltrato (340 mi) contiene la DAO grezza in concentrazione di 224 U/ml.
La purificazione della D-amminoacido ossidasi è effettuata caricando la soluzione di enzima grezzo su una colonna di Sepharose DEAE fast flow (volume letto 800 mi, ø 5 cm, h 40 cm) ed eluendo con lo stesso tampone potassio fosfato 25 mM pH 8. La DAO non viene trattenuta dalla resina ma solo rallentata nella sua corsa e passa nel percolato.
Gli enzimi interferenti, in particolare l'esterasi, non vengono eluiti con tampone 25 mM pH 8 e sono spostati solo in fase di rigenerazione della colonna con NaCl 0,5 M.
La D-amminoacido ossidasi purificata si raccoglie in un volume di 1230 ml con un'attività di 52 U/ml e con un'attività specifica di 19 U/mg proteine.
La resa totale di purificazione è del 62% corrispondente a 63920 U totali.
La D-amminoacido ossidasi purificata è stabile almeno 6 giorni à 4°C e per almeno 6 mesi a -20°C.
Esempio 3
Immobilizzazione di D-amminoacido ossidasi su Duolite A 365· 35 B di resina Duolite A 365 con una granulometria di 100-200 μ sono trattati con 0,5 l di tampone potassio fosfato 100 mM pH 8. Dopo 15 minuti di agitazione il pH si aggiusta con aggiunte in sequenza di H3PO4 10% (6 mi). A pH costante di 8 il surnatante si rimuove per filtrazione. Alla resina umida si aggiungono 400 ml di glutaraldeide al 2% in tampone potassio fosfato 25 mM pH 8. Si lascia sotto agitazione per 30 minuti ad una temperatura di 20°-25°C e quindi si separa il surnatante per filtrazione fino a massa solida umida.
Alla massa umida di resina attivata sono aggiunti 386 ml di soluzione di D-amminoacido ossidasi (52 U/ml; 19 U/mg proteine) purificata come da esempio 2. Il tutto si tiene sotto blanda agitazione per 12 ore a V e. La resa di immobilizzazione, calcolata sul titolo del surnatante esausto, è del 100%.
Il prodotto è filtrato e la massa umida è lavata con 0,5 M NaCl in tampone potassio fosfato 25 mM pH 8, quindi con tampone potassio fosfato 25 mM pH 7.5-Si ottengono 103 g di D-amminoacido ossidasi immobilizzata con un'attività di 48 U/g di prodotto umido.
Esempio 4
Immobilizzazione di D-amminoacido ossidasi su Eupergit C.
A 120 ml di tampone potassio fosfato 1M pH 8 raffreddato a 4°C sono addizionati sotto agitazione 4,5 g di Eupergit C (150μ) e di seguito 55 m dli soluzione di D-amminoacido ossidasi (58 U/ml; 17 U/ mg proteine) ottenuta come da Esempio 2. Il tutto si lascia in leggera agitazione per 2 ore a 4’C ed il prodotto si recupera per filtrazione. Si ottengono alla fine 15,7 g umidi di D-amminoacido ossidasi immobilizzata su Eupergit C con un'attività di 58 U/g di prodotto umido.
Esempio 5
Immobilizzazione di D-amminoacido-ossldasi su UOP JPS-200.
80 ml di soluzione di D-amminoacido ossidasi (45 U/ml; 17U/mg proteine) purificata come da Esempio 2 sono diluiti con 80 mldi tampone potassio fosfato 1M pH 7,5.
La soluzione a 4°C è pompata con riciclo a 600 ml/ora attraverso una colonna (Φ 2 cm; h 8 cm) contenente 20 g di UOP IPS-200 per 4 ore. Dopo questo tempo il 91% dell'attività D-amminoacido ossidasi è immobilizzata.
Si ottengono 19 g di massa umida filtrata con un’attività di 21 U/s.
Esempio 6
Trasformazione di Cefalosporina C a glutariI-7-ACA con D-amminoacido ossidasi immobilizzata su Duolite A 365.
A) Conversione in discontinuo.
66 g di Cefalosporina C sale sodico biidrato (purezza 90,9%) sono sciolti in 21 di tampone potassio fosfato alla concentrazione di 25 mM a pH8, contenente.0,5 g di sodio metàbisolfito.
La soluzione di Cefalosporina C è caricata in un reattore da 3 litri con 150 g umidi di D-amminoacido ossidasi immobilizzata su Duolite A 365 come visto in Esempio 3·
L'incubazione è condotta a 25°C sotto leggera agitazione e con un flusso di ossigeno da diffusore di fondo pari a 1 v/v/min. Il pH è mantenuto costante a 7.5 con aggiunte automatiche di ammoniaca al 5%.
In 75 minuti tutta la Cefalosporina è completamente trasformata. La composizione percentuale dei prodotti cefalosporinici di trasformazione è:
Per la trasformazione del chetoadipil-7-ACA residuo a glutaril -7-ACA, la soluzione ottenuta dopo incubazione è separata dalla massa di enzima immobilizzato per filtrazione. Per ogni litro di filtrato sono aggiunti, sotto agitazione, 10 ml di acqua ossigenata al 3.5%. Si lascia per 15 minuti a 25°C e quindi si aggiungono 0,5 g di sodio piruvato.
La composizione percentuale a fine trattamento è:
La carica enzimatica è stata provata per 100 cicli in intervalli di 75-120 minuti.
La produttività totale è stata di 4760 g di glutaril-7-ACA pari a 31,7 g di glutaril-7-ACA per g di enzima immobilizzato.
B) Conversione in continuo su colonna.
Una soluzione di Cefalosporina C a 15 g/1 come sale sodico biidrato in tampone fosfato 0,1 M pH 8, è fatta passare alla velocità di 1 l/ora su cinque colonne (Φ 40 mm) contenenti 100 g (150 ml volume apparente) ciascuna di DAO immobilizzata su Duolite A 365 (vedi Esempio 3).
Tutto il sistema, che opera in continuo con le colonne collegate in serie, è termostatato a 25°C e mantenuto a 3 bar con iniezioni di ossigeno dopo ogni colonna.
All'uscita della quinta colonna la Cefalosporina C residua è intorno all'1% e la conversione a glutaril-7-ACA è pari al 92% dello stechiometrico (11 ,2 g/1).
Esempio 7
Trasformazione di Cefalosporina C a glutaril-7-ACA con D-amminoacido ossidasi immobilizzata su Eupergit C.
2 1 di soluzione di Cefalosporina C preparata come in Esempio 6 sono incubati con 150 g di D-amminoacido ossidasi immobilizzata su Eupergit C (come in Esempio 4). L'incubazione è condotta a 25 °C e in corrente di ossigeno.
Dopo 60 minuti a pH 7,5, la Cefalosporina C è completamente trasformata con una resa in glutaril-7-ACA del 91% e di chetoadipil-7-ACA del 5.8%.
La soluzione è separata dall'enzima immobilizzato per filtrazione.
1 1 di filtrato è trattato con 10 mdli acqua ossigenata al 3.5# e, dopo 15 minuti, con 0,25 g di sodio metabisolfito.
La composizione finale del prodotto di trasformazione è:
La carica enzimatica è stata sperimentata per 100 cicli. La produttività totale è stata di 4700 g di glùtaril-7-ACA pari a 31 g/g di enzima immobilizzato.
Esempio 8
Trasformazione di Cefalosporina C a glutaril-7-ACA con D-ammlnoacido ossidasi immobilizzata su UOP IPS-200.
6,57 g di Cefalosporina C sale sodico biidrato (purezza 91.3%) sono sciolti in 200 mdli acqua. Alla soluzione si aggiungono 0,68 g di KI2PO4, 0,1 g di sodio metabisolfito e si corregge il pH a 7,5 con NaOH 5%·
Questa soluzione di Cefalosporina è pompata attraverso una colonna termostatata a 25°C contenente 20 g di D-amminoacido ossidasi immobilizzata su UOP IPS-200 (Φ 3 cm; h 4 cm; volume letto 28 mi). La velocità di flusso è mantenuta a 50 ml/min. La soluzione in uscita dalla colonna, presa in un recipiente di raccolta, viene ossigenata con un diffusore di ossigeno, corretta a pH 7.5 e riciclata per un tempo di due ore.
Dopo due ore di riciclo, la conversione della Cefalosporina C è completa.
La soluzione (100 mi) è trattata con 1 mldi H2O2 3.5%· e, dopo 15 minuti, con 50 mg di sodio piruvato. '
La composizione percentuale dei prodotti di trasformazione è:
La sperimentazione si è condotta per 60 cicli con una produzione complessiva di glutaril-7-ACA di 280 g pari a 14 g/g di enzima immobilizzato.
Esempio 9
Produzione di GI-7-ACA acilasi :on coltura di E. coli ATCC 9637 (pJc 200)
1) Preparazione del microorganismo E. coli ATCC 9637 (pJc 200) a) Preparazione del plasmidio pACYC 184
Il ceppo E. coli ATCC 37033 che contiene il vettore plasmidico pACYC 184' {Tetr, Camr) viene incubato per 16 ore a 37 in 0,5 1 di mezzo di coltura LB contenente 10 g/1 di Bacto Tryptone Difco, 5 g/1 di Bacto yeast extract Difco e 10 g/1 di NaCl.
Le cellule ottenute vengono sedimentate, lavate, lisate e il plasmidio viene isolato seguendo il metodo alcalino (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory, Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
Il DNA plasmidico ottenuto viene poi purificato mediante centrifugazione in gradiente di CsCl.
b) Preparazione del DNA donatore che contiene l'informazione genetica relativa alla produzione di glutaril-7-ACA acilasi.
Il ceppo della specie Acinetobacter ATCC 53891, produttore di Gl
7“ACA acilasi viene coltivato in un mezzo contenente (in gr/1): glutammato acido di sodio; 5; KH2PO4: 1,5; NaCL: 5; idrolizzato di collagene: 25; corn steep liquor: 5; glucosio: 2. Si incuba per 48 ore ad una temperatura di 25°C.
Le cellule ottenute vengono quindi sedimentate, lavate e lisate con SDS1-%, ETDA 20 mM e proteinasi-K 0,1 mg/ml,
La miscela lisata viene riscaldata a 55°C per 3 ore, poi estretta varie volte con fenolo e cloroformio-alcool isoamilico; nella fase acquosa si precipita il DNA mediante etanolo.
Il DNA precipitato viene lavato con etanolo a 100% ed etanolo al 70% e disciolto in un tampone Tris-HCl 10 mM pH 7.5 contenente ETDA 1 mM.
c) Inserimento dei frammenti di DNA donatore nel vettore.
Vari campioni contenenti 1 pg del DNA ottenuto dal ceppo di Acinetobacter sp. ATCC 53&91 vengono digeriti con la endonucleasi di restrizione BamHI a 37°C e a tempi distinti si blocca la reazione riscaldando il campione a 65*C per 10 minuti. In questo modo si ottengono distinte digestioni parziali del DNA che vengono visualizzate mediante colorazione con bromuro di etidio dopo elettroforesi su gel di agarosio.
Vari campioni contenenti 2 pg di DNA del plasmidio pACYC 184 vengono digeriti con la endonucleasi di restrizione BamHI a 37°C per 1 ora, indi si riscaldano a 65°c per 10 minuti per bloccare la reazione.
Ciascun campione delle digestioni parziali BamHI del DNA della
specie Acinetobacter viene legato con un campione della digestione BaraHI del plasmidio pACYC 184 mediante T4 DNA ligasi in- presenza di ATP, ioni Mg2+ e 2-mercaptoetanolo per 16 ore a 14°C.
Con questo procedimento vengono ottenute varie collezioni di vettori ricombinanti contenenti frammenti del DNA della specie Acinetobacter ATCC 53891 inseriti nel plasmidio pACYC 184.
d) Selezione del plasmidio portatore del gene che codifica per l'attività enzimatica GI-7-ACA acilasi.
Con la genoteca del ceppo della specie Acinetobacter produttore di G1-7-ACA acilasi si trasforma E.coli HB101, selezionando i trasformanti portatori del gene GI-7-ACA acilasi per la loro capacità di crescere a 37°C nel terreno minimo M9. addizionato di glucosio 0,2 g/dl, tiamina-HCl 0,1 mg/dl, L-prolina 10 mg/dl, glutaril-leucina 5 mg/dl e cloramfenicolo 5 mg/dl (T.Maniatis et.al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
In questo modo si ottiene il ceppo E. coli HB101 (pJCll).
Il plasmidio PJCll è caratterizzato dal possedere il gene per la resistenza al cloramfenicolo e il gene GI-7-ACA acilasi ,(localizzato in un frammento del DNA di circa 8,5 kb parzialmente digerito con BamHI) espresso sotto il controllo del promotore del gene per la resistenza alla tetraciclina (Bolivar et. al., (1977) Gene 2:95).
Dopo digestione di 5μg del DNA di pJCll con le endonucleasi EcoRV e Hpal e purificazione di un frammento di 3 kb portatore del gene GL-7-ACA acilasi, quest'ultimo viene legato al plasmidio pUCl8 previamente digerito con HirocII e defosforilato. Il plasmidio risultante viene denominato pJC40 (vedi fig.7).
5μg del plasmidio pDR540 (de Boer et. al., (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:21) vengono digeriti con la endonucleasi BamHI e successivamente vengono defosforilati nelle condizioni descritte da T.Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.
Partendo inoltre da pJC40 si purfica un frammento parziale BamHI di 3 kb portatore del gene GL-7-ACA acilasi, che viene legato al sito BamHI del plasmidio pDR540.
Il vettore risultante viene denominato pJC54011 (vedi fig.8). e) Costruzione del plasmidio pJC 200.
5 μg del plasmidio pACYC-184 vengono digeriti con la endonucleasi di restrizione XbaI e Hlnd III nelle condizioni descritte in Biochemicals Catalogue, Boehringer Mannheim GmbH, (1987) e successivamente si legano ad un frammento del DNA Xbal-Hind III portatore dal gene GL-7-ACA acilasi derivante da pJC54011. Il .plasmidio risultante viene denominato pJC 200 (vedi fig.8). Tutte le tecniche utilizzate nella manipolazione di questi DNA sono state descritte da T. Maniatis et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982.
Il plasmidio pJC 200 è caratterizzato dal possedere il gene per la resistenza al cloramfenicolo come marcatore di selezione in E.coli e il gene che codifica per l'attività glutaril-7-ACA acilasi della specie Acinetobacter ATCC 53891 espresso sotto il controllo del promotore tac.
f) Trasformazione di E.coli ATCC 9637 con il vettore di alta espressione pJC 200
L'introduzione del plasmidio pJC 200 in E.coli ATCC 9637 non produttore di β-lattamasi viene realizzata col metodo descritto da Hanahan, J. Mol. Biol., 166. 557’580 (1983).
Le cellule di E.coli ATCC 9637 vengono dapprima fatte crescere nel mezzo SOB a 37°C e a 250 rpm fino a raggiungere un OD600=0,45· Successivamente la coltura viene centrifugata a 3000 g a 4°C per 10 minuti e le cellule si risospendono in 1/3 del volume iniziale di RP1. Dopo incubazione in ghiaccio per 15 minuti e centrifugazione nelle stesse condizioni le cellule si risospendono in 1/12,5 del volume iniziale di RF2.
La miscela viene nuovamente incubata in ghiaccio per 15 minuti. Le cellule così ottenute, denominate "competenti", si caratterizzano per la capacità di accettare DNA esogeno con grande efficienza.
L'introduzione di questo DNA viene realizzata mescolando 10 ng del plasmidio pJC 200 con 100 pi di cellule competenti; il tutto viene incubato in ghiaccio per 30 minuti.
Dopo uno schock termico a 42 C per 60 secondi, si raggiungono 800 pi di mezzo SOB e si incuba a 37°C e a 200 rpm per 60 minuti. La selezione dei trasformanti si porta a termine nel mezzo LB addizionato di 30 ug/ml di cloramfenicolo.
Il microorganismo così ottenuto, che possiede una elevata capacità produttiva di glutaril-7-ACA-acilasi viene denominato E.coli ATCC 9637 (pJC 200).
Le composizioni di LB, SOB, RF1 e RF2 sono descritte da Maniatis et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982).
2) Fermentazione
a) Fase vegetativa
Le cellule di E. coli ATCC 9637 (pJC 200) cresciute a 28°C per 24 ore su uno slant di 180X10 mm con terreno solido a base di: triptone (10 g/1), estratto di lievito (5 g/1). NaCl (5 g/1), cloramfenicolo (30 mg/1), agar (15 g/1) a pH 7 ,5 sono riprese con 5 ml di soluzione fisiologica sterile.
0 ,5 mdlella sopra detta sospensione cellulare sono trasferiti in matracci da 500 ml contenenti 100 mldi terreno vegetativo avente la seguente composizione: triptone ( 12 g/1), estratto di lievito (24 g/1), glucosio (5 g/1), KH2P04 (1 , 1 g/1),K2ΗΡΟ4 (6,2 g/1), cloramfenicolo (30 mg/1).
La coltura è fatta crescere a 28°C e 250 rpm per 24 ore fino a una OD600= 15-18.
b) Fase produttiva
Un fermentatore da 1001 contenente 58 l di brodo con la seguente composizione: sodio glutammato acido ( 6 g/1), estratto di lievito (3 g/1). idrolizzato di collagene (20 g/1), corn steep liquor (3 g/l), KH2PO4 (1,1 g/1), K2HPO4 (6,2 g/1) è sterilizzato a 120°C per 20 minuti, raffreddato a 23°C ed addizionato di glucosio (6 g/1) e cloramfenicolo (30 mg/1), sterilizzati separatamente.
Il mezzo è inoculato con il 2% della coltura vegetativa ottenuta come al punto precedente. La fermentazione è condotta per 72 ore a 23*C con un'aereazione di 0,5 v/v/min., un'agitazione di 200 rpm ed un'aggiunta ogni 12 ore di 3 g/1 di glucosio. .
Alla fine della fermentazione si hanno 631 di brodo coltura avente pH = 8, OD600=28, attività G1-7-ACA acilasi = 2790 U/l. Per centrifugazione a 6000 g si recuperano 1,8 kg di pasta cellulare (umidità 80%) corrispondenti a I669SO U totali di Gl-7-ACA acilasi.
Esempio 10
Estrazione e purificazione di G1~7~ACA acilasi
I kg di pasta cellulare (92766 U di GI-7-ACA acilasi) ottenuti come descritto in Esempio 9 sono dispersi in 2 1 di tampone potassio fosfato 25 mM pH 8. La sospensione è.raffreddata a 4°C e passata per due volte su pressa Manton-Gaulin a 550 bar. Il lisato è portato a 6 litri con tampone potassio fosfato 25 mM pH 8 e flocculato con l'aggiunta di 6 ml di polielettrolita cationico Nymco 2045 C. Il flocculato è chiarificato per centrifugazione a 6000 g.
Si ottengono 5.5 l di chiarificato con un'attività di GI-7-ACA acilasi di 13915 U/l pari a 76532 U totali.
II chiarificato è concentrato per ultrafiltrazione su membrana polisolfonica PM 50000.
Il concentrato grezzo 1580 ml (GI-7-ACA acilasi = 48 U/ml; proteine 45 mg/ml) è caricato su una colonna da 11 di Sepharose DEAE equilibrata con tampone fosfato 25 mM pH 8.
La G1-7-ACA acilasi è eluita in un volume di 2170 ml con lo stesso tampone addizionato di 0,15 M di NaCl.
L'enzima purificato ha un'attività di 20,3 U/ml ed un’attività specifica di 2,6 U/mg proteine.
Esempio 11
Immobilizzazione di G1-7-ACA acilasi su Duolite A 568
40 g di resina Duolite A 568 con granulometria di 100-300 y sono trattati con 0,6 1 di tampone potassio fosfato 100 mM, pH 8 Dopo 15 minuti di agitazione il pH si aggiusta con aggiunte in sequenza di H3PO4 10% (12 ml). A pH 8 costante il surnatante si rimuove per filtrazione. Alla resina umida si aggiungono 500 mi di glutaraldeide al 2%. Si lascia il tutto sotto agitazione per 15 minuti a temperatura ambiente e quindi si separa il liquido per filtrazione fino a massa solida umida.
Alla massa umida attivata sono aggiunti 200 mdli soluzione di G1-7"ACA acilasi (10,8 U/ml; 2,4 U/mg proteine) purificata come da esempio 10. Il tutto si tiene sotto blanda agitazione per 12 ore a 4°C. Si aggiungono quindi 5 ml di glutaraldeide al 25% e si continua l'agitazione per oltre 6 ore a 4°C.
Il prodotto è quindi filtrato e la massa umida è lavata con 500 ml di NaCl 0,5 M in tampone potassio fosfato 25 mM pH .8, quindi con lo stesso tampone senza cloruro di sodio.
Si ottengono 108 g (massa umida) di GI-7-ACA acilasi immobilizzata con un’attività di 19 U/g e una resa di attacco pari al 100%.
L'enzima immobilizzato è conservato sotto tampone fosfato 25 mM a pH 8 ed è stabile almeno un mese a 25°C e 6 mesi a 4*C.
Esempio 12
Immobilizzazione di G1-7-ACA acilasi su Eupergit C
A 250 mldi tampone potassio fosfato 1M pH 8 à 20°C sono aggiunti 10 g di Eupergit C (150 μ) e di seguito 120 mdli soluzione di GI-7-ACA acilasi (10,8 U/ml, 2,4 U/mg di proteine) ottenute come da Esempio 10. Il tutto si lascia in leggera agitazione per 6 ore a 20°C. La resina si recupera per filtrazione. La massa umida si lava con tampone fosfato 25 mM, pH 8. Si ottengono alla fine 34 g umidi di GI-7-ACA acilasi immobilizzata con un'attività di 31 U/g pari all’81% dell'attività enzimatica messa ad immobilizzare. Esempio 13
Immobilizzazione G1~7~ACA acilasi su UOP IPS-200
25 ml di soluzione di G1-7“ACA acilasi (16,4 U/ml; 2,2 U/mg proteine) purificata come da esempio 10 sono diluiti con 75 ml di tampone potassio fosfato 1M, pH 8. La soluzione di enzima a 4°C è pompata con riciclo a 11/h attraverso una colonna {Φ 2 cm; h 8 cm) contenente 20 g di UOP IPS-200.
Dopo 4 ore di riciclo la colonna è lavata con tampone fosfato 25 mM , pH8.
La massa umida di enzima immobilizzato (22 g) ha un'attività di 14 U/g pari al 13% dell'enzima iniziale messo a reagire.
Esempio 14
Trasformazione di glutaril-7-ACA con G1-7-ACA acilasi immobilizzata su Duolite A 568
500 g di G1-7-ACA acilasi immobilizzata su Duolite A 568 (Esempio 11) sono caricati in cinque colonne (Φ 22 mm). .
La carica enzimatica è distribuita secondo le seguenti proporzioni (1a colonna 50 g; 2a colonna 75 g; 3a colonna 100 g; 4a colonna 125 g; 5a colonna 150 g).
Una soluzione di glutaril-7-ACA (22,8 g/1; pH 8; 25°C) ottenuta per trasformazione enzimatica della Cefalosporina C con D-amminoacido-ossidasi immobilizzata è pompata sulla prima colonna della serie alla velocità di 2 1/h. Il percolato della prima colonna è ricorretto in linea a pH 8 e ripompato nella seconda. L'operazione si ripete per tutte le colonne della serie in modo da avere una conversione in flusso continuo.
.All'uscita della quinta colonna la soluzione ha la seguente composizione :
Chetoadipil-7-ACA 0,l4 %
La produzione di 7-ACA dopo 200 ore è pari a 5480 g.
La resa totale di trasformazione è dell'83,5%·
Per il recupero del cristallo di 7-ACA si opera come segue:
10 1 di soluzione in uscita dalla quinta colonna sono portati a pΗ 6 con HC12M e concentrati per osmosi a 4°C fino ad un volume di 4,51· Il pH del concentrato si porta a 3.5 ed il cristallo si recupera per filtrazione.
Resa di cristallizzazione: 94,5%·
Titolo del cristallo di 7-ACA: 97%·
Esemplo 15
Trasformazione di glutaril-7-ACA a 7-ACA con G1-7-ACA acilasi immobilizzata su Eupergit C
A 150 ml di soluzione di glutaril-7-ACA (20,3 g/1) ottenuta per trasformazione enzimatica di Cefalosporina C con D-amminoacido ossidasi immobilizzata, si aggiungono 12 g di G1-7-ACA acilasi immobilizzata su Eupergit secondo l'Esempio 12.
Si incuba sotto agitazione a 25°C mantenendo il pH a 8 con aggiunte automatiche di ammoniaca 5%·
Dopo 50 minuti si raggiunge il massimo di trasformazione con una resa di conversione a 7-ACA pari all'86%.
Esempio 16
Trasformazione di glutaril-7-ACA a 7-ACA con Gl-7-ACA acilasi immobilizzata su UOP 200 IPS-200.
50 g (peso umido) di enzima acilasi immobilizzata su UOP IPS-200 come in Esempio 13 sono caricati in colonna (Φ4 era; h 5 cm).
Attraverso la colonna sono riciclati alla velocità di 50 ml/min, 500 mldi una soluzione di glutaril-7-ACA 1%.
Il pH è mantenuto costante a 7.8 con aggiunta automatica di ammonìaca 5% · Dopo 60 minuti il 93% di glutaril-7-ACA è trasformato a 7-ACA.
La soluzione, separata dalla massa enzimatica, è portata a pH 3,5 con aggiunta di HC12N e lasciata una notte a 4°C.
Si recuperano 3,78 di 7~ACA. Titolo 98%.
Claims (1)
- Rivendicazioni 1) Procedimento enzimatico per la produzione di acido 7-amminocefalosporanico o suoi derivati a partire da Cefalosporina C o suoi derivati secondo lo schema di reazione:dove R è -OCOCH3, -H, -OH, -0C0NH2, mediante enzima D-amminoacido ossidasi (DAO), ottenuto da coltura di Rhodotorula gracllis ATCC 26217, attivo su composti cefalosporanici (I) e praticamente privo di enzimi interferenti e successiva trasformazione dei glutaril derivati (II) in acidi 7-amminnocefalosporanici (III) mediante enzima Glutaril-7-ACA acilasi preparato da colture di microorganismi geneticamente ingegnerizzati non produttori di βlattamasi; detto procedimento essendo costituito dalle seguenti fasi: 1 a) preparazione di enzima D-amminoacido-ossidasi (DAO) mediante coltura di Rhodotorula gracilis ATCC 26217 effettuata a 26°+ 30‘C. a pH da 4,8 a 5*5· trattamento di lisi della pasta cellulare, separazione dell'enzima dalla dispersione acquosa, purificazione mediante cromatografia e immobilizzazione dell'enzima purificato su un supporto solido inerte insolubile in ambiente acquoso, avente gruppi funzionali idonei a formare, eventualmente tramite agenti bifunzionali adatti, legami di reticolazione con la proteina enzimatica; 1 b) trattamento di deamminazione ossidativa della Cefalosporina C o suoi derivati (I) effettuato ponendo a contatto l’enzima immobilizzato ottenuto in la) con una soluzione acquosa dei suddetti composti a concentrazioni comprese tra 20 e 60 g/1, a pH da 7 a 8. temperature comprese tra 20°C. e 30°C. in presenza di ossigeno o aria; 1 c) separazione dell'enzima supportato dalla miscèla acquosa di reazione e addizione a quest'ultima di acqua ossigenata in quantità teorica o in eccesso rispetto allò stechiometrico necessaria per la conversione dell’acido chetoadipilcefalosporanico in acido glutaril-7-amminocefalosporanico; 1 d) eliminazione dell'acqua ossigenata in eccesso mediante aggiunta alla soluzione di reagenti riducenti idonei come acido piruvico o suoi sali o solfiti alcalini; 1 e) preparazione di enzima G1-7-ACA acilasi da colture di microorganismi geneticamente ingegnerizzati ottenuti da ceppi di E. coli non produttori di β-lattamasi, in cui viene clonato il gene della Gl-7-ACA acilasi isolato da qualsiasi microorganismo appartenente alla specie Acinetobacter produttore di questo enzima, detto procedimento essendo caratterizzato da: fermentazione in condizioni aerobiche a temperatura compresa tra 21°C. e 28°C.. trattamento di lisi, della massa cellulare, purificazione mediante cromatografia su resina DEAE e successiva immobilizzazione dell'enzima purificato su un supporto solido inerte insolubile in ambiente acquoso, avente gruppi funzionali idonei a formare, eventualmente tramite agenti bifunzionali adatti, legami di reticolazione con la proteina enzimatica; 1 f) trattamento di deacilazione dell'acido glutaril-7-amminocefalosporanico e i suoi derivati (II) effettuato ponendo a contatto l'enzima immobilizzato ottenuto in le) con una soluzione acquosa del suddetto composto ad una concentrazione compresa tra 10 e 30 g/1. a temperatura compresa tra 20°0, e 30°C, e a pH da 7 a 9-2) Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui la fase la) e le) è caratterizzata da purificazione degli enzimi DAO e G1-7-ACA acilasi mediante cromatografia su resina tipo DEAE. 3) Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui la fase le) è caratterizzata dall’impiego di E.coli ATCC 9637 (pJC 200) discendente dal ceppo E.coll ATCC 9637 non produttore di (5-lattamasi in cui è stato clonato il gene di Gl-7-ACA acilasi di qualsiasi microorganismo della specie Acinetobacter produttore di G1-7~ACA acilasi. 4) Procedimento secondo la rivendicazione 3. in cui il microorganismo della specie Acinetobacter è ATCC 53891· 5) Procedimento secondo le rivendicazioni precedenti in cui la fase la) e le) di immobilizzazione degli enzimi DAO e GI-7-ACA acilasi si realizzano sui seguenti tipi di supporto: a) resina macroreticolare a scambio ionico di tipo amminico come: Duolite A 365· Duolite A7, Duolite A568, Amberlite IRA 900; b) resina poliacrilica con funzione legante epossidica del tipo Eupergit C; c) resina con matrice inorganica impregnata di poliamminaglutaraldeide del tipo UOP 1PS-200. 6) Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui la fase la) e le) sono caratterizzate dall'impiego di glutaraldeide come agente reticolante per l'immobilizzazione degli enzimi. 7) Procedimento secondo le precedenti rivendicazioni in cui la fase lb) è realizzata mantenendo l’enzima immobilizzato in dispersione nella soluzione acquosa del substrato. 8) Procedimento secondo le precedenti rivendicazioni in cui la fase lb) è realizzata facendo passare la soluzione acquosa del substrato sull'enzima immobilizzato disposto in colonna. 9) Procedimento secondo le precedenti rivendicazioni in cui la fase 1f) è realizzata mantenendo l'enzima immobilizzato in dispersione nella soluzione acquosa del substrato. 10) Procedimento secondo le precedenti rivendicazioni in cui la fase 1f) è realizzata facendo passare la soluzione acquosa del substrato sull'enzima immobilizzato disposto in colonna.
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