JPS6054686A - 遺伝子産物の分泌を促進するリ−ダ−配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細胞による遺伝子産物の分泌を促進づる特定
デオキシリボ核酸配列の断片、特に、これらの断片を含
む組換ＤＮＡ運搬ベクターに係る。

生化学の分野に於ける最近の進歩により、運搬ベクター
例えばプラスミドに外因ｔｌ　Ｉ）　Ｎ　Ａを担わ１！
て組換ＤＮＡ運搬ベクターを横築りることが可能に４７
９だ。成る場合には組換体には、組換ベヒクルにより形
質転換され得る生体が通常は産生じないポリペプチドを
コードする異種ＤＮＡが組込まれている。

微生物に新しいタンパクの合成能を〜える方法は基本的
に３つの一般ステップを含む。

（ａ）所望タンパク又はポリペプチドのアミノ酸配列の
遺伝的にコードされた情報を含む特定遺伝子又はヌクレ
オチド配列の１１１４１と精製。

（ｂ）単離した遺伝子又はヌクレオチド配列と曲型的に
はバクテリオファージ又はプラスミドの１）ＮＡの如ぎ
′適当な運搬ベクターとの組換による組換運搬ベクター
、即ち、所望のタンパク又はポリペプチドの産生をコー
ドする部分を含む組換運搬ベクターの作成。

（Ｃ，）適当な微生物へのベクターの転移と所望の遺伝
情報を含む受容微生物株の選択。

遺伝子又はヌクレオチド配列が選択しｌＪ微生物中でタ
ンパク又はポリペプチドを発現すれば、微生物の増殖に
伴って所望のタンパク又はポリベブチドが有意な開で産
生きれるであろう。

微生物を培養した後、タンパク又はポリペプチドを不委
の物質から単１１１Ｉｌする必要がある。所望のタンパ
ク又（５Ｌボリペプヂドの大部分が培地及び／又は微と
１：物の細胞質周辺領域（ｐｅｒｉｐｌａｓｌｃＳｐａ
ＣＯ，ペリプラズム空間）に存在１ノでいるならば単１
）ｌＩｌステップはかなり容易である。言い換えれば、
発現後のタンパク又はポリペプチドが細胞膜を通過し゛
（細胞質外部に存６していれば、精製がＪ：り効率的に
行なわれる。

タンパク又はポリペプチドの細胞膜通過は、主に以下の
２つの理由によって好ましい。第１の理由は、所望のタ
ンパク又はポリペプチドは一般には発現微生物に対して
外来であり、従って、多くの場合タンパク分解Ｎ索等に
よって細胞質中で魚速に分解され、そのため、細胞内で
の半減期が短いことである。タンパク又はポリペプチド
が発現後直ちに細胞質外に移動すると、タンパク又はポ
リペプチドの安定性は極めて増Ｊであろう。第２の理由
は、（所望のタンパク又はポリペプチドがらの分離が必
要な）不要の遁伝物質及び遺伝産物は培地及び／又は細
胞の細胞質周辺領域よりも細胞質内にはるかに多量に存
在するからである。ｉｆｉ記の２つの理由を考察すれば
、タンパク又はポリペプチドが細胞膜を通過して細胞質
外部に移行するとタンパク又はポリペプチドのＩＩｓ　
１ｔｌｌｌ　ｉｆｉ　１４ｉめで容易になることが理解
されよう。

細胞質からの遺伝子産物の分泌を促進づるだ釣の１つの
方法は、細胞質内にプレタンパク又はプレポリペプチド
、即ち所望のタンパク又はポリペプチドの前にシグナル
ポリペプチドの付いた物質を産生ずることである。主と
して疎水性のシグナルポリペプチドは所望のタンパク又
はポリペプチドを細胞質周辺領域に誘導し、所望のタン
パク又はポリペプチドが細胞膜を通過するどぎに除去さ
れる。

公知のジグノルペプチドの多くはシスティン残昼を含む
１．これらの残準ルは細胞膜内で反応し、これにより所
望の遺伝子産物の効率的な細胞外移行が１ｔＪ１害され
ることが知見された。

本発明の１−目的は、システィンを含まないシグナルペ
／ヂドを］−ドするリーダー配列ポリヌクレＡヂドを含
りする組換Ｄ　Ｎ　Ａ運搬ベクターを提供することであ
る。本発明の別の目的及び利点は以下の記載Ｊ：り明ら
かにされるであろう。

本発明によれば、式■ Ｍ　０１−Ａ　ｒｇ　−ｐ　ｒｏ−ｓ　ｃｒ−−Ｉ　ｌ
ｅ−ト１ｉｓ−ＡｒＯ−Ｔ　ｈｒ−Ａ　ｌａ−１ｌｅ−
Δ１ａ−ΔＩａ　−Ｖ　ａｌ　−１ｅｕ　−Δｌａ−丁
ｈｒ−Ａ　１ａ−Ｐ　ｈｅ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　Ｉａ　
−Ｇ　ｌｙ　−Ｔｈｒ　Ｉ のシグナルポリペプチドをコードするリーダー配列ボリ
ヌクレＡチドを含む組換Ｄ　Ｎ　Ａ運搬ベクターが提供
される。

運搬ベクターはバクテリＡ゛ノアージでもＪ、く又はプ
ラスミドでもよいが、後者が好ましい。

ヌクレオチド配列中の］トンの大部分がｆ！ｉり、物ゲ
ノムの発現に好適なコドン（゛あることが好ましい。適
当な＝１トンは英」ｉＪ特許第１，５６８，０４７号と
英国特ｒ１出願公開第２００７６７５Ａ　＠どに示され
ている。

従って、これらの刊行物は本明細出に含まれる一ｂのと
する。

本発明の運搬ベクターの好ましい１つの具体例は、式■ ５’　ＡＴＧ　ＣＧＣＣＣＡ　ＴＣＣＡｌ−ＣＧＡＣ−
ＣＧＯＡ’ＣＡ　ＧＣＣＡＴＣＧ　Ｇ　ＣＧ　ＣＣＧ　
Ｔ　Ｇ　Ｃ−ｒ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　ＣＡ　ＣＣＧ　ＣＧ　’
　１−　Ｔ　ＣＧ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　（’、　ＧＧ　Ｇ　Ｃ
Ａ　ＣＣ−３’　ＩＴ （・示されるヌクレオチド配列ぐある。

シグナルポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（
リーダー配列ポリヌクレオブト）１よ、好ましくは運搬
ベクター中に、細菌又は酵母のプロモーター及び原核生
物のリポソーム結合部位の下流側で且つこれらのプロモ
ーター及び結合部位に対しでＷＩ′ｔｌＡノー「−ズ（
ｒｅａｄｉｎｏ　ｐｈａｓｅ＞で存７Ｆ、Ｌ／ている。

更に、リーダー配列ポリヌクレオチ１ζ１よ構造遺伝子
の挿入部位の１流にあり、又はより好ましくは所望のタ
ンパク又はポリペプチドをコードする構造遺伝子の上流
側でこの遺伝子ｌこ対してＭ′読７丁−ズで存在する。

遺伝子が真核生物、１寺に１−１１乳動物のタンパク又
はポリペプチドを＝１−ドするものであるのが好ましい
。

構造遺伝子は例えば、ヒ１〜成艮ホルモン、ヒトインシ
１リン又はヒト絨毛膜ソマトマモトロピン（ｈｕｌｌａ
ｌｌｃｈｏｒｉｏｎｉｃ　５ＯＩｌａｔ０１１１ａｌｌ
ｌＯｔｒＯｐｉｎ）の如き真核生物タンパクを：１−ド
していてもよ（、又は、大腸菌（［、ｃｏｌｉ）β−ガ
ラク］・シダーゼ×はシュードモナス（ｐ　５ｅｕｄｏ
ｌｏｉｌａｓ　）カルボキシベプヂダーゼＧ２（ＣＰ　
Ｇ２）の如き原核生物タンパクを］−ドしていてもＪ：
い。（カルボキシペプブダーけＧＺはｐ　Ｓ、ｅｕｄｒ
ＪｍＯｎａ１種のＲ５−１６株ニＪ、ツー（産生され癌
の化学療法に使用される酵素である。この物質は、ｚ　
ｎ””ｉ含有−５ｒ　ル２Ｘ　４２，０００タルｌ−ン
（７）　Ｘ　ｋ１体であり、補乳動物に於（）る菓耐石
の主イｊ循環形である５−メチルテトラハイドロフオレ
ートと癌化学療法で広く使用される葉酸拮抗物質メト（
〜レキ上−１〜（ＭＴＸ）との双方に対して高い親和１
４（ＫＩＩＩ値：１０　又はＩＯＭ＞を有する。この酵
素は、プリン及び特にピリミジン生合成の：コファクタ
ーとして不可欠な還元菓Ｍ塩の血漿瀉血のために直接使
用され４１１る。ＣＰ　Ｇ２はＷａｌｋｅｒ　２５６　
ＴｈＨの　ｉｎ　ｖｉｖｏ増殖を阻害１ｙ　、患者の循
環からＭＴＸを除去Ｊ゛ることが判明した。高用用のＭ
ＴＸの長期間投句（よ患肖に有毒となる。） ＣＰ　Ｇ２をコードする本発明の運搬ベクターの例とし
て、ＩＩＮＭｌ、　ｌ’１ＮＭ１１１．　Ｉ）ＮＭ１４
．　ｌ）ＮＭ２１゜ｒｌＮＭ２２．　ｌｌＮＭ３１．　
ｒｌＮＭ３２及びＩ）１．−Ｅ、Ｇ３が挙げられる。

好ましいブ［１モーターは、種々の宿主中での構造ｉＷ
仏子の発現性の高い細菌プロモーター又は酵Ｂ１プロモ
ーターである。特定プロ玉−ターの選択は、形質転換１
′べぎ微生物に左右される。例えば、１：、ｃｏｌｉの
形質転換は通常、Ｅ、Ｃ吋↓プロモーターにＪ：つて４
１４造遁伝子の発現がコントロールされている運搬ベク
ターににって行なわれる。旦。

ｃｏｌｉブ［１モーターの例としては、プラスミドｒ＋
Ｆ３Ｒ３２２及びＤＡ　Ｔ　１５３の中に存在するプロ
モーターがある。対照的に、ｐ　５ｅｌｌ（ｔｏ鼾ｔｎ
ａｓ種の形質転換は通常、ｌ）　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
プＣ１−Ｅ−ターによって構造遺伝子の発現がフン１〜
ロールされている運搬ベクターにＪ：ッて行なわれる。

１）　ｓ　ｅ　ｕ　ｄ　ｏｔｔｒ　ｏ　ｎ　ａ　ｓプ１
」モーターの例どして、プラスミドＩＮＫ　Ｔ’　２３
０又は、巳ｓ　ｅ　ｕ　ｄ　ｏｒｎ　ｏ０旺染色体ｒ）
ＮＡ中に存在するブ［１モーターがある。

構造遺伝子を発現Ｊるために本発明の運搬ベクターは適
当な微生物を形質転換さＵるであろう３゜従って、本発
明の別の］］的は、本発明のＩＩＩ換Ｄ　ＮＡ運搬ベク
ターによって形質転換された微生物を提供することであ
る。好ましい微」−物は、運搬ベクター内で構造遺伝子
を高疫に発現させる細菌又は酵母であろう。ブ［１モー
ターの選択次第で、Ｌ工竺柱、ハ憇Ｉ犯咀ジ、バチルス
（障シ」↓リー）の如ぎ細菌又は゛リッ力ロミセス・ヒ
レヒシ］（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｃｖ
ｉｓｉａｅ　）の如き醇１りｌのいずれかから選択され
た菌株を微生物どして選択する。

微生物の形質転換後、構造遺伝子によりコードされるタ
ンパク又はポリペプチドは、形質転ｙｉｐｍ生物を培地
中で培養すると発現し得る。本発明の主要４Ｔ利点は、
形質転換微生物の培養によってプレタンパク又はプレポ
リペプチド、即ち本発明のシグナルポリペプチドの付い
た所望のタンパク又はポリペプチドが得られることであ
る。このことは、発現後直ちにシグナルポリペプチドが
所望のタンパク又はポリペプチドを細胞質周辺領域に誘
尋し、所望のタンパク又はポリペプチドが細胞膜を通過
するとぎにシグナルポリペプチドが除去されることを意
味Ｊ”る。本発明のシグナルポリペプチドはシスティン
残塁を含有していないので、所望の辿伝子産物は膜を通
って有効に分泌されるであろう。

本発明の運搬ベクターは、組換Ｉ）ＮＡ技術に於い“Ｃ
公知のいかなる方法によって調製してもよい。

例えば、リーダー配列ポリヌクレオチドは、Ｋ。

ｌ　ｔａ＋ｔｕｒａ等、ＪＡＣ８，１９７５，９７，７
３２７の修ｉ【トリエステル法、又はｌｌ：ＰＡｍ許出
願公開第２００７６７５Ａ号に記載の改良Ａリゴデオキ
シヌクレＡチド調製法によって合成され得る。これらの
参考文献の開示内容は、本明細書に含まれるものとする
。合成されたポリヌクレオチドを次に、運搬ベクター好
ましくはプラスミドに挿入し得る。運搬ベクター中でポ
リヌクレオチドは、細菌プロモーター又は酵母プロモー
ターど原核生物リポソーム結合部位との下流に解読フェ
ーズで存在するのが好ましいであろう。また、リーダー
配列ポリヌクレオヂドは、構造遺伝子挿入部位の上流に
存在−づるか、叉は、構造遺伝子の上流に解読フェーズ
で存在しなければならない。

又、リーダー配列ポリメクレオチドを含むＤＮＡ断片を
、天然ソース、特に２６０１１６０１１００８５株の菌
株Ｒ３−１６の染色体ＤＮＡから得てもよい。この場合
、本発明のシグナルポリペプチドを＝１−ドタるポリヌ
クレオチド（前出の式■）は、ＣＰ　Ｇ２を」−ドｆる
４ＪＩＪ造遭伝子の直前に存在覆る。従って、このリー
ダー配列ポリヌクレオチドを含む多数の１）　Ｎ　Ａ断
片は、プラスミドに組込まれて得られた肩１換ベクター
で微生物を形質転換さ１！るとき、莱酸塩存イｊ十で微
生物を増殖Ｖしめる能力によって１トされ得る。本発明
のシグナルポリペプチドをｍｌ−ド覆るポリヌクレオチ
ド（前出の式■）とＣ「〕Ｇ２を］−臼る構造遺伝子と
の双方を含むような組換運搬ベクターの例として、ｒｌ
ＮＭｌ、　ｐＮＭｌｌｌ、　ｐＮＭ１４．　ｐＮＭ２１
．　ＤＮＭ２２．　ｐＮＭ３１゜ｒｌＮＭ：１２及ｕ　
ｐ＋−Ｆｃ　３がある。Ｆｏｆ１１１換ベクターをこの
」、うにし−Ｃ調製してからりアク１−１−ニングし”
’（’　、　ヤ）はり本発明のシグナルポリペプチドを
］−ドするポリヌクレオチドを含む別のベクター　（Ｆ
ｏ　１又はＦＯρ−）を得ることも勿論ｉｉ）能−（・
ある。

適当なりＮＡ断ハは、０１１ｉ１１１後に運１ｉｔｕベ
クタークｆましくはプラスミドに：挿入され臂る。運搬
ベクター中で、挿入断ハ上のリーダー配列ポリヌク１）
Ａチドは、＃ｌ菌プ［１モ一ターＹ番よ酵母ブ１−１七
−ターと原核生物リポソーム結合部位との下流に解読）
Ｌ−ズで存在ずべぎである。リーダー配列ボリヌクレＡ
チドはまた、構造遺伝子挿入部位の上流に存在づるか、
又は構造遺伝子の上流にＮ読フＴ−ズで存在すべきであ
る。

本発明のリーダー配列ポリヌクレＡヂドの下流側に解読
フＪ−ズで挿入される構”４Ｍ仏子をＩＩるために、例
えば前出の合成方法を使用し得る（これは、ヒ１〜成長
ホルモン、インシコリン、ヒ１〜絨毛膜ソマトマモトロ
ビンの如き小ざいタンパクをコードする遺伝子の製造に
特に好適である）。又、逆転写酵素を使用してｌｌｌＲ
ＮＡから構造遺伝子を調製しくもよく、又は、天然ソー
ス（染色体ＤＮＡ）から構造遺伝子を単離し−Ｃもよい
。

最後の方法の例としては、（第１図にアミノ酸配列を示
した）酵素ＣＰ　Ｇ２をコードする（第１図の）ポリヌ
クレオチド配列を含むＤ　Ｎ　Ａ断片をｐ　ｓ　ｅ　ｕ
　ｄ　（ｌ　ｍ　ｏ　ｎ　ａ　ｓ　ＩＪの菌株Ｒ３−１
６染色体ＤＮＡから１１１１ｉｌｌｌ　ｄる。ＣＰ　Ｇ
２構造道伝子と（前出の式■の）本発明のシグナルポリ
ペプチドをコードＪるポリヌクレＡヂドとを含有”する
プラスミドの例として、ｐＮＭｌ、　ＩＩＮＭｌｊｌ、
　１１ＮＭ１．４；　ｌ）ＮＭ２１．　ＩＩＮＭ２２、
ｒｌＮＭ３１．　ｒ）ＮＭ３２及び１１１．−ＥＣ３が
ある。

リーダー配列ポリヌクレＡチドと構造遺伝子とは、調製
父はｌ）１１ｉｌｌ後に本発明の組換Ｄ　Ｎ　Ａ運搬ベ
クターを形成すべく運搬ベクター好ましくはプラスミド
に挿入されるであろう。１つ以−トの挿入ステップは、
例えば英国特許出願公開第２０９０６００Ａ号に記載の
方法の如き制限エンドヌクレアーゼを・使用する当業界
で公知の技術の１つを用いて行なわれるのが好ましい。

Ｊ−’？２特許文献は、本明細書に含まれるものとする
。運搬ベクターの選択は、内部でリーダー配列ボリヌク
レＡチドと構造遺伝子とを発現させる微生物によって決
定されるであろう。一般に運搬ベクターは、被選択微生
物の形質転換に適しており目つ抗生物質耐ｆ！　＝如き
表現型形質を示すクローニングベヒクルであろう。組換
運搬ベクターは、抗生物質耐１りの如き表現型形質に基
いて選択され得る。従って、微生物と１ノでＦ、ｃ１月
−を選択するど、適当な運搬ベクターは［−ｃｏｌｉプ
ラスミド＋１８　Ｒ３２２及びＤＡ　Ｔ　１５３　’−
（−あろう。また、微生物どしてＰ　５ｅｌｌｄ０１！
１ＯＱａΣが選択されると、適当な運搬ベクターは氏並
吋明倶すエジｐＫＴ２３０であろう。

本発明の組ｙＡＤ　Ａ　Ｎ運搬ベクターと、該組換ＤＡ
Ｎ運搬ベクターによって形質転換された微４°物と、こ
れらのベクター及び微生物との調製プロセスとを添附図
面に示１特定例に基いて非限定的に以下にｄ１明する。

第１８乃金１ｄ図に、ｐ　５ｅｕｄｏＩｌｌｏｎａｓ種
Ｒ８−１６株の染色体Ｄ　Ｎ　Ａから０１１＠ＩＩ　し
たＣ　Ｐ　ＧｚＤ−ドポリヌクレＡヂド配列を示す。第
１図中アミノＭ１乃乃２２が本発明のシグナルポリペプ
チドであり、アミノＭ２３乃至４１５はＣＰ　Ｇ２構造
盾伝子である。第１図のリーダー配列ポリヌクレオチド
は式■に示しｌ、：好ま（］いボリメクレオチドである
、。

使用細菌株は１．Ｅ」４猥ｒ　ｉｃｔ＋ｉａ　ｃｏｌ　
Ｉ　Ｗ　５４４５及びＰ」μ、４ｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ
菌株Ｒ３−ｉｓであった。

使用プラスミドは、ｐＢＲ３２２（Ｆ　、　Ｂｏｌｉｖ
ａｒ等、Ｇｅｎｅ、１９７７、　２．　９５）　、ＩＩ
Ａ−１’１５３　（Ａ、Ｊ。

Ｔ　ｗｉｇｇ等　、　Ｎ　ａｔｕｒｅ、　１９ｇ０．　
２８３．　２１６　＞　、　ｐＫ　１−２３０　（Ｍ、
　Ｂａｇｄａｓａｒｉｎ等、　Ｇｅｎｅ　１９８１．１
６゜２３１）及びＤＲＯＧ５　（Ｒ，Ｆ、　Ｓｈｅｒｗ
ｏｏｄ　９ノ％。

Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　
Ｙｅａｓｔ、１９７９゜Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎｏト１ａ
ｒｂｏｒ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　）であ−）だ。

１地及び培養条月２ ［ミ、　ｃｏｌｉはし一ブロス（１％１〜リブ１〜ン、
０．５％酵母抽出物、０．５％、ＮａＣ＆＋）中で普通
に培養した。１−−ブロスに２（重量／容量）％の寒天
（Ｂ　ａｃｔｏ−１）　１ｆｃｏ）を加えて固形培地（
＋−１天培地）を構成１ノだ。形質転換体の選択に使用
１ノだ抗生物質ｍ度は５０１１９／ｍ（ｌのアンピシリ
ン、１５１１！ｌ／−のテトラサイクリン°及び３０ｎ
　／　ｒｔｒＲのカブマイシンであった。Ｅ、ｃｏｌｉ
の場合、１％のグルコースと適宜Ｌ　０　、０５％の葉
酸塩とを加えた２ＹＴ液体培地（１，６％１−リブトン
、　１％Ｍ　ｆ１１抽出物、０．５％Ｎａ　Ｇ１）中に
抗生物質を入れた。Ｐ　ｓｅｕｃｌｏｍｏｎａｓのｊｔ
４５ｖＪには１ｇ当りＭ　（ｌ　Ｓ　０４０．０５（１
：　Ｃａ　Ｃｉ’２・２１’１２０　０，０５０：　Ｆ
ｅ　ＳＯ４・７Ｈ２０，ｏ、ｏｏ５ｇ；　Ｍｎ　ｓｏ。

０．００１５０　：　Ｎ　８２Ｍ　ｂ　０４４Ｈ２０’
０．００１５０　：　Ｋ　Ｈ２Ｐ’０４５（１：　Ｋ２
１１　Ｐ　０４・３１」２０１２ｇ；グルタミン酸塩ｉ
ｏｇを含む最小塩溶液を用いた。Ｅ、ｃｏｌｉの最小培
地どしては、Ｍ９培地（Ｊ、　Ｍｔｌｌｅｒ、Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔｓｉｎ　ｇ＋ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒＬ
　ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏｌｄ　Ｓ　ｐｒｉｎａ　
Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ　ｅｗＹｏｒｋ、　１９７２　）を
使用した。

肘五匁に暫− クロラムフェニコール増幅培地（ｃｈｌｏｒａｍｐｂａ
−ｎｉｃｏｌ　ａｍｐｌＢｉｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ、ｒ
）　、　Ｂ、　Ｃｌｅｗｅｌｌ、　Ｊ　。

ＲａｃＬｅｒｉｏｌ、、１９７２．−ｕＯ，６６７）に
対し、Ｂｒ１ｊ−Ｉｙｓｉｓ　（Ｄ、　Ｂ、　Ｃｌｅｗ
ｅｌ１等、　Ｐ　ｒｏｃＪＪ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、３ｃｉ、、ＬＪＳＡ、　１９６９．６２．１
１５９）と石化【？シウムー臭化エチジウム密１α勾配
遠心分ｔｈ１１（Ａ。

Ｃｏｌｍａｎ等、　Ｅｕｒ、　Ｊ　、　１３　ｉｏｃｈ
ｅｍ、、１９７８．９１，３０３）とを順次行なってプ
ラスミドを精製した。スクリーニングのために高速小規
模プラスミドＩＩＩ　１ｉｌｌｌ技術（Ｂ　ｕｒｎｂｏ
ｉｍ等、Ｎｕｃ、八〇１（Ｉｓ　ＲＯ５，、１９７９，
７゜１５１３）も使用した。ドナー’ｊ’　８０１１１
０ｍ０１８８株（ＲＳ−１６）からの染色体ＤＮＡは、
主としてＪ　。

Ｍａｒｍａｒ、Ｊ、　Ｍｏ１．、Ｂｉｏｌ、、１９６１
．　３．　２０８の記載に準じて調製された。

紐ｌ工覧血え丈朋１転換の方法 制御エンドヌクレアーゼと１’）　Ｎ　Ａリガーげとを
３ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｂ　１−ａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｃｓがら購入し、製造業者が勧める条件下緩衝
液中で使用した。Ｆ。

竺則の形質転換は主とし’Ｃ８，Ｎ、　ｃｏｈｅｎ等。

Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａ口、Ａｃａｄ、３ｃｉ、、ＬＪＳＡ
、　１９７２．６９゜２１１０の方法に準じて行ない、
ハ、　ｐｕｔｉｄａの形質転換にはＭ　、　Ｆ３　ａｇ
ｄａｓａｒｉａｎ及びに、　Ｎ、　Ｔｉ＋ｕ＋ｉｓ。

にｕｒｒｅｎｔ　１ｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ　ａｎｄｌ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｅ　ｄ
ｓ　Ｐ　、　＠　、　ｆ−１ｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ及
びＷ、Ｇｏｅｄｅｌ、５ｐｒｉｎｏｅｒ　Ｖｅｒｌａｏ
、Ｂｅｒｌｉｎ、１９８１゜４７ページの方法を用い１
．：。

乙がロースゲル電気泳動 トリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液を使用し標準鉛直系
（Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｖｅｒｔｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍ
、　Ｒａｖｅｎ）　。

０．８％アガ［１−ス平板ゲル（１０ｃＩｌｌｘ２０ｃ
ｎ＋ｘ　００５ｃｍ）ｅ消化物を電気泳動にかけた。未
消化１）　Ｎ　Ａは１２５Ｖ　、５０ｍＡ　、３時間Ｃ
１消化ＤＮＡは１５Ｖ。

１０１１１Ａ、１６肋間で電気泳動【ノた。且ユｎｄ　
ｍで消化したλＤＮＡ断片と１ｌｉｎｄＩＩＩど１匹Ｒ
１との双方で切断したλｌ）　Ｎ△断片とに比較するこ
とにＪ：って、断片サイズを推定した。電気溶出を使用
して・ゲルから断片を１１１１１１また（Ｍ、　Ｗ、　
Ｍａ　Ｄｏｎｎｅｌｌ等　、　ｐ１’　Ｏｃ、　Ｎ　ａ
　口、Ａ　ｃａｄ、３　ａｔ、、　（〕　ＳＡ、１９７
７、　７４゜４８３５）　。

カルポキシベプチダ−ｉｉ　Ｇｇ」１へ虹地細菌を１ｐ
のバッチ培養で増殖させ、種々の増殖期段階で１００　
ｍｒｌずつのサンプルを採取した。リンプルを氷冷し、
１３，０００ｘ　ｇで１０分間遠心し、０．２ｍ１ｙｊ
のＺｎＳＯ４を加えた５ｍＡ（Ｄ　Ｏ，ＩＭ　トＵ　ス
ＨＣ；１　、ｐ＋−＋　７．３に再懸濁させて凍結した
。中波。

振幅２のＭＳＥ超音波破砕装置（１５０Ｗ）を氷トて３
０秒間ずつ３回作用させて細胞を破砕した。

１ｏ、ｏｏｏｘ　ａで５分間遠心して細胞破片を除去し
た。

Ｊ　、　ｌ　、　Ｍ　ＯＣＩｌｌＩＯＬＩｇｈ　％　、
Ｊ　、　Ｂ　ＩＯｌ、Ｃｔｉｅｄ。

１９７１、ユ阻、　７２０７に準じてＣＰ　Ｇ２活性を
泥足した。

０．２ｍＭ　１７）　Ｚ　ｎ　Ｓ　Ｏｔ、’ｆｉ加ｆｉ
、　ｆ、＝　０．９ｄ１７）　０．ＩＭ　ｔ・リス−Ｈ
Ｃｊ　、１１＋−１７，３ど０，１ｍｅ　（７）　０．
６１１１Ｍメト１〜レキセードとを入れた１ｍｌの反応
キコベツ１〜を３７℃で平衡ざｔ！ｔこ。テストキュベ
ラ１〜に酵素抽出物を添加し、Ｐ　ｙｅ−Ｕ　ｎ１ｃａ
ｉ＋　３　Ｐ　１８００ダブルビームスベりトロボ１−
メーターを用いて３２０ｎｍの吸光度の減少を測定した
。抽出物１＃Ｉｉ！当りの酵素活性を、Δ３２０ｎｍ吸
光度／分を８．３で除算して算出した。

ｌ；、３の値は、３７℃での１μモルのＭＴＸの毎分の
加水分解に等しい。Ｍ、　Ｍ、　Ｂｒａｌｏｒｄ、Ａｎ
ａｌ　Ｂｉｏｃｌ＋ｃｍ、　１９７６、７２．　２４８
の方法でタンパク濃度を測定した。

租−ＩＩ　ｆｋ画１１ 細菌Ｊ８差物をＩｌ、　Ｃ，Ｎｅｕ及びｌ−、Ａ。

１−１０ｐｐ０１　（Ｊ、ｌ’３ｉｏ１．ｃｈｅｍ、、
１９６４．　２４０．　３６８５）の低リン酸塩培地に
１００．Ｆｌａｍｅのアンピシリンを加えた中で（’）
　Ｉ）Ｇｏ　＝　１　、０になるまで増殖した。４０艷
の培養物を５．００００で１０分間遠心し５ＩｎＩｌの
１０１１１Ｍ１〜リス−１−目’、（１、ｐＬｌ　７．
０で洗い、０．９ｍｅの０．５８Ｍシヨ糖、　０，２１
１１Ｍ　ＤＴＴ、３０１１１Ｍトリス−１１０ｇ、＋１
１−１８．０に再懸濁させた。２０ＩＪ１のリゾチーム
（２ｍ＜１／ｍｅ）　、　４ＯＮの０．１Ｍ　Ｅ　ＯＴ
　Ａを添加し、２３℃で１０分間インキコベー１−シて
スフ１〔］ブラストニ転換させｋ　（１」、　Ｃ，Ｎｅ
ｕ等９、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｉ、、　１９６４．　２３９．３８９
３）　。スフエロプラストを氷に載せ、０．１ｍｌの３
０（ｆ［／容ｔｉｔ　＞％のＢＳＡ、５ａｄ！のシ］糖
−トリス緩簡液を順次添加した。ｓ　、　０００（＋で
１０分間遠心してスフ１日プラストを沈降さぜ、上清を
゛′細胞質周辺（ｐｅｒｉｐｌａｓ−ｍｉｃ）”画分と
して維持した。、ペレットを５ｍｌ！０）１０ＩＩＩＭ
　ｔ〜リス−１−Ｉ　ＣＩ、　０．２１１ＭのＩ）１’
　１”　、ｐｉ−１１，０とに再懸濁させ、２０Ｋｃ／
秒、２Ａｍｐｓ　Ｔ：１！ｉ秒間超音波処即した。１，
０ＯＯＸＣＩで１０分間遠心して残りの全細胞を除去（
）た。１００，０００ｘ　ｇ、　４℃で１時間遠心り、
で、可溶（細胞質）タンパクを顆粒く膜結合）タンパク
から分離した。膜ペレットを１ｍｌ？（７）　１０１１
Ｍト！Ｊスー１−１０１．０．２ＩＩＩＭ　ＤＴ’Ｔ’
。

ｐｌ（７，０に再懸濁させた。

前記の方法でＣＰ　ＧＺを検定した。アルカζ月１ホス
ファターピは１．Ｊ　、　Ｍｉｌｌｅｒ、Ｆｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ｏｅｎｅｊｉｃ
ｓ、Ｇｏｌｄ　３ｐｒｉｎｇ　ｌ−１ａｒｂｏｒｉ　ａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏｌｄ　Ｓ　ｐｒｉｎｏ　ｌ−
１ａｒｂｏｒ、　Ｎ　ｅｗＹｏｒｋ、１９７２の方法、
ＮＡＤＨオキシダーゼ番よＭ。

Ｊ、　０３ｂＯｒｌｌ　笠、　Ｊ　、　［３ｉ’ｏｆ、
ｃｈｃｍ、、１９７２．２４７゜３９６２のｌｊ法、グ
リレルアルデヒドー３−リン酸１１１２水索酵素はＫ　
、　Ｓ　ｕｚｕｋｉ等、　ＦＥＭＳ：　１９７１．旦。

２１１の方法にＷ、じて検定した。

に濃Ｊ、１ カルボキシベブチダ−Ｕ　Ｇ２！ｌ！仏子をリーダー配
列ポリヌクレＡチドと共に単離するために、Ｐ　３　ｅ
　ｕ　ｄ　ａ　Ｉｌｌ　（ｌ　Ｉｔ　ａ　ｓ宿主（菌株
Ｒ８１６）から［７した染色体１）ＮΔを５ａｕ３Ａで
部分消化し６−８Ｍｄの断片を電気溶出によってアガロ
ースゲルから単離シタ。”　Ｕ　イＸ分画した（　５ｉ
ｚｅｄ）　”　ＤＮＡをアルカリ性ホスファターぜ処理
３　ａｎ＋、ｌ−１１切断ｐａ　Ｒ３２２と結合し、Ｅ
　、　ｃｏｌｉＷ　５４４５を形質転換させ、Ａｌ１ｒ
形質転換体を選択した。得られた３、５００個ノＡｐｒ
−、＋１＝　７７）ウチ（７）約７０％カＴｃ５テあっ
た。５０個のＡＶｌｒＴＣｓに高速Ｊ５ジミドＩｈｋ術
を使用すると、遺伝子バンクの９０％が所望１ノイズの
プラスミドに含まれていることが判明しＩこ、１遺伝子
バンクの信頼性を、更に検査するテスト方法としては、
個々のクローンな１−ｅ−表現型のＩｍ　ｌ！Ｉｌご関
してスクリーニングする方法がある。このようにして前
記の如きクローン２種を同定した。双方のり【］−ンが
Ｉｅｕ　［３（Ｂ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酊索）
Ｌユリ↓突然変異株を原栄養株（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈ
Ｖ）に形質転換し得るプラスミドを担持していた。

機能性ｃ　ｐ　ａ２３ｉ伝子をＩ　ｌ）’７−Ｊ゛るど
Ｆ、ｃｏｌｉは、炭素源として葉酸を利用し得るはずで
ある。

２，４００個の遺伝子バンククローンを唯一の炭素源と
して莱Ｍ塩を含む最小培地での増殖能力（即らＦｏｌ）
に基いニスクリーニングした。１つのＦｏｆｌ＋り［１
−ンが検出され、これは、プラスミドを欠いＣいる（　
ｐｌａｓｍｉｄ−ｍｉｎｕｓ）　Ｗ５４４５をＦｏｉｌ
＋表規型に形質転換し得るプラスミドを含１．でいた。

このプラスミド（ｐＮＭｌ　）の制限マツプ作成を従来
通りに行なうと、１）Ｆ３　Ｒ３２２内に５．９Ｍｄの
ｐ　ｓｃｕｄｏｍｏｎａｓｌ）　Ｎ　ＡインＩナー１−
が存在づ゛ることが判明した。ＩＩＮ　Ｍ　１の制限酵
素開裂部位マツプを第２図に示Ｊ０リーダー配列ポリヌ
クレオチドとＣＰ　Ｇ２構３Ｗ　３Ｗ伝子とのヌクレオ
チド配列を第１図に示づ。

実施例−２− ５，９Ｍｄインサート内のＣＰ　０２遺伝子とリーダー
配列ポリメクレオチドとの正確な位１ｔ！決定のために
、種々の制限酵素断片をｐＢ　Ｒ３２２にサブクローニ
ングした。機能性Ｇ　Ｐ　Ｇ２遺伝子は、ｌ’ｌＮＭ１
インザートの〆」四−■又は５ｌｌｈＩ断片トでなく、
３、ＩＭｄの１３（ｌＩＩ［断片上に存在Ｊることが判
明した。この後者の断片を１１８　Ｒ３２２のＢ　ａｌ
ｌｊｌ−Ｉ　Ｔ部位にクローニングして　ｐＮＭｌｌ（
６，ＯＭｒｌ　）を得た。

災蛙■で消化１ノ（１）ＮＭ１１０′リ−イズを更に縮
小し、得られた断片を再結合してｌ）Ｎ　Ｍ　１１１を
得た。更に、より小ざい０，９５Ｍ　ｄのＳａｌ：［断
片が親プラスミド（ｐＮＭｌｌ）に対して反対方向で挿
入されたプラスミドは「０ρ−であった。これらの１ｙ
ブク［１−ユングの結果を総合Ｊると、ＣＰ　Ｇ２遺伝
子とリーダー配列ポリヌクレオブトとは、ＩＩＮＭＩに
於いて４．１４のＢ　ｏ　ｌ　Ｉｆ部位と６．０３の５
ａｌＴ部位との間に位置することが判明づる。更に遺伝
子は、５ｐｈＴ　（５，１７）と望ａｌｊ　（５，０７
）と少なくとも１つのＸｈｏＴ　（４，５６及び／又は
５．５６）部位とを含む。第３図にｐＮ　Ｍ　１１１の
制限酵素開裂部位マツプを示す。

実施例３ １配実ｈ’ｓ　例２　”ＣＩ！ｊ　ラした３、ＩＭ（＋
の１３ｏ１１ｒ断片を３ａｕ３Ａで部分消化した。次に
これらの断片を１３Ａ　−１−１５：（のＷ規１−１１
部位にり【１−ユングし、ＬＩＣｏ１ｉＷ５４４５を形
質転換【〕Ｉこ。得られた２つのＡｌｌ’Ｓ十 １”　ＣＦ（ｌ　ｐ：１０ニーのうち、１つが付加的な
３ａ＋■及びＩ（ａ＋ｎ−１−ｌ　Ｔ部位を得たプラス
ミドを含有しており、このプラスミドをＩＩＮ　Ｍ　１
４とした。ｐＮＭ１４の制限ｌｌｖ索ｉｆｆ裂部位マツ
プを第４図に示す。ｐＮＭＩＩＩ中に存在するリーダー
配列ポリヌクレオブトとＣＰ　Ｇ２構造道伝子の配列決
定にＪ、−）て第１図に示すヌクレオチド構造が得られ
た。ｐＮ　Ｍ　１４のＤＮＡ配列決定によって更に、シ
１−■−■ａｇ、ＨＩ断片が、隣り合う２つの５工３Δ
断片から成るインサー１へ（第４図の＊印）の内部から
ｉ／られた］）ＮＡセグメントの複製であることも判明
ｌノた。

実施例２で得た３、ＩＭｄの■土■断片をｐＡ−１−１
５３のＢａｌ１ｌｌ−ＩＩ部位にり［１−ユングしＦ、
ｃｏｌｉＷ５４４５を形質転換した。２つのΔｐ７’ｃ
Ｆｏ＃：］口二一が得られた。１つのコロニーは、ｐＮ
Ｍｌに対して逆向きの方向で断片が挿入されたプラスミ
ドｐＮＭ２１を含んでおり、１つのコロニーは、ｐＮＭ
ｌと同じ方向で断片が挿入されたプラスミドｐＮＭ２２
を含んでいた。ｌ）ＮＭ’２１とｐＮ　Ｍ　２２の制限
酵素開裂部位マツプを第５図及び第６１図に夫々示ず。

２つのプラスミドｐＮＭ２１とＯＮ　Ｍ　２２とは双方
ＪＵ　、　（ｑ　、　ｃｏｌｉをＦ０１＋に形質転換し
た。このことは、ｐ　５ｅｕｄｏＢｏｎａｓプロモータ
ーが３．ＩＭｄの断片十に存在することを示Ｊ０しかし
ながら、Ｂ（ＩＩＩＩ断片がｒ）ＮＭｌに対しで逆向ぎ
の方向でクローニングされているプラスミドρＮＭ２１
を１０う細胞は、葉酸をＩＩｌ〔−の炭素源としてにり
急速なｉＨ殖を示した。この違いは寒天培地に於いては
っきりと見えた。即ち、コロニーは、葉酸塩加水分解の
不溶性産物である沈澱ブチロイン酸の同心円状の黄色い
゛ハｎ　−”を生じた。

１）Ｎ　Ｍ　２１のＣＰ　０２発現性がｌ）Ｎ　Ｍ　２
２よりも侠れていることは、各プラスミドを含む細胞の
バッチ増殖中の酵素産生を検定することによって確認さ
れた（１（！１／容量）％のグルコースと退官０．０５
　（重ω／容凹）％の葉酸とを加えた複合培地（ｃｏｉ
＋ｐｌｅｘ　１ｌｅｄｉｌｌｌ）　ｒ細胞を増殖させた
ｕｌｊ１代１１．１間は５θ〜６６分１２！１であった
。培養物のり一ンブルを毎＠間採取し、超音波処Ｊ更に
よって全細胞を破砕した。遠心抽出物中の酵素活性を定
損１ノた）、１結果を表１に示す。

プラスミド１１ＮＭ２２とｒ）ＮＭＩ　トニにルＣＰＧ
２の発現は、培養物１ｐ当り２．５ユニツトであり、０
．００５％の可溶タンパクを示した。対照的にｔ）ＮＭ
　２１ニよる発現は培養物１ｐ当す３，０００〜３，５
００ユニットであり、４．７％の可溶タンパクを示した
。

クローン遺伝子は、１ＩＡＴ１５３の堕１−１１部位に
挿入されるので、ＩＩＮＭ２１で観察された高い発現性
がＴｃプロモーターを介する転写解読（読み過ごし転写
、　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅａｄ　ｔｈ
ｒｏｕｇハ）に起因することはほぼ確実である。プラス
ミドｐＮＭ１ど　ｐＮ　Ｍ　２２にＪ：るＣ　Ｐ　Ｇ２
の発現（’ｌが低いことは■こ５助並和４４プロモータ
ーの［、ｃｏｌｉ中での機能が弱いことと符合する。更
に、葉酸塩のγｆ存在下はＩＩＩ胞超八波へ理物中で測
定された特異的酵素活１／１が倍ｉ！Ｊｉすることも表
１より明らかである。この現象は全ての実験に於いＣ観
察されたが、酵素の総収量は菓１ＳＩＩ塩の有無に関わ
りなく培養物１１当り約３，０００−″−ニットに維持
されるので、従来のＣＰＧ２遺伝子の誘発（１ｎｄｕｃ
ｔｉｏｎ）には結びつかないとｌＳえられる。実際、こ
の現象は、菓ｍ塩の存在中で増殖しＩこ細胞からの超音
波処裡物中で測定されＩこ可溶タンパクレベルの一様な
低下を反映している。＜１￥酸塩と共に増殖させた細胞
の増殖速度に明らか４丁差異はなく、このような結束が
生じる理由は明白でｔイい。

表１ プラスミドｐＮＭ１．ｐＮＭ２１及びＩ）ＮＭ２２を含
有するＦ、＄ｉ　Ｗ５１１４５によるカルボキシペブチ
ダーＬ’ＧＺの産生ＰＳ、回置ｄａ中゛で゛のクローン
゛　−の　−現一（’；　Ｐ０２ｍ仏子がベタター内で
の遺伝子の配向に関わりなくｌ’：、ｃｏｌｉ中で発現
したことは、ＣＰＧ２眉伝了のブ［二１モーター領域が
構造遺伝子及びり一ター配＋１１ポリメクレＡヂドと）
Ｌにり［１−ユングされたことを示唆覆る。天然プロモ
ーター（ｐＮＭｌ、　ＤＮＭ２２．　ρＮＭ１１１　）
によるｌ’：、ｃｏｔユ内でのＣＰ　Ｇ２の発現性が但
いことは、ＰＳｅ【１ｄＯＩＩ１分更リーブ［１モータ
ーが「、　ｃｏｌｉＲＮ　ＡポリメラーＵににっｌ認識
（きれ勤いという別の知見の確認となる。遺伝ｆが氏昶
甚（１９ｍ興…の細胞環境に戻されると１、巳」９史頃
ｊｎ　ｏ　ｎ　ａ　ｓ　ｌＩＴ＋モーターによる発現性
が向トすると予想される。、３ｉＭｄのＢ　ＣＩ　Ｉ　
ＩＴ断片をｐｓｅｕ−４９託旦長−りに１−ユングベク
ター＋１ＫＴ２３０のｐト一つのｐ　ａ、ｍ　Ｌｉ　Ｉ
部位にリブクｌ］−ユングした。これにより２つのプラ
スミド、即ちクローン遺伝子の可能な２つの配向を示す
プラスミドＩＩＮＭ３１とｐＮＭ３２が４ｑられた。日
ａｇｄａｓａｒｉａｎどＴｉｍｍ１ｓの方法によってこ
れらのプラスミドでＰｓ、回ｔｉｄａ２４４０を形質転
換した。双方のプラスミドを損うｐ　５ｅｌｌｄＯＩＩ
ｌＯｎａＳ細胞を最小地培地で培毎し、酵素産生をモニ
ターした。

プラスミド内での）Ｗ仏子の配向に関わり％　＜　Ｉｉ
’：俗物１１！当り５００〜１，０００コニツ１〜の収
がか得られた。細胞超音波処理物中の酵素の特異活性は
、タンパクｌｌｌ１ｇ当り１．５〜４．０コニツ１〜で
あり、こ′れは０．３％乃至０．１％のｉ１溶タンパク
に相当づる（ドナー菌株ＲＳ　−１６１１）可溶夕＞　
ハ’ｌ　ハ０．０５％より小さい）。この結果は、ＣＰ
　Ｇ２プ［１＋ニーターが存在しｌ］　５Ｏ１ｌｄ０＋
１１０ｎａＳ−バックグラウンド中で機能していること
をはっぎりと示す。同じプラスミドでＥ　、　ｃｏｌｉ
Ｗ５４４５を形質転換すると、１２〜４１１ニツト／ρ
が＜　０．０７コーニツト／ＩＩＩ（ｌの特異的活性（
く０．０１％の可溶タンパク）で得られた。

Ｑ−Ｐ−Ｑｇ’７ｊ　ｍ　Ｊｌｌ−＊周辺局在ＣＰＧＺ
が氏並叩旦亜菌株Ｒ８−１６の細胞質周辺領域内又【ま
その近傍に局在することは明らかである。ＣＰ　Ｇ２に
Ｊ：る葉酸の加水分解産物ｐあるブチ「１イン酸は極め
（不溶性であり、液体培地及び固体培地のいずれに於い
Ｃも主として細胞外で見られる１、培地中に葉酸が存在
すると、クローン遺伝子を含むＦ、ｃｏｌｉ培養物中に
外因性ブチロイン酸も観察さｉする。このことは、＋１
８　Ｒ３２’２のＴｃブ［１七−ターに、Ｊ、つでｃ　
ｐ　ａ２を発現せしめるプラスミド（例えばｐＮ　Ｍ　
２１　）を担うコロニー周囲で沈澱ブチ［ｊイン酸の゛
ハｌ：Ｉ　−”が観察されることから明らかである。

１１ＮＭ２１を担う［ｇ、ｃｏｌｉ細胞により産生され
たＣ　Ｐ　Ｇｌの局在性をテストするために、細胞タン
パクを細胞質ど細胞質周辺ど金膜の各両分に分離した。

コントロールとして、３つのマーカー酵素、即ちアルカ
リ性ボスファターゼ（細胞質周辺）とグリレルアルデヒ
ド−３−リン酸脱水素酵素（細胞質）とＮＡＤＩ−１，
０２４キシドレダクターゼ（膜結合）のレベルも測定し
た。表２から明らかな如く、９７％のＣＰ　Ｇ２活１ｊ
１は細胞質周辺で生じる。これはマーカー周辺細胞質酵
素であるアルカリ（４１小スフアターゼと同等である。

このことは、細胞質から細胞質周辺領域へのＣＰ　Ｇ２
の分泌を促進りる本発明のシグナルポリペプチドをコー
ドづるり一ダー配列ポリヌクレＡチドがＣＰＯ２に隣接
しＩｃ形でＩ）ＮＭ２１中に存在することを確証づ゛る
。

表２ カルボキシベプヂダーゼの局在性 ＡＰ＝アルカリ竹、小スフ１ターゼ ＧＡＰＩ］ｌ−グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素
酵素ＮＡＤ　Ｈ０Ｘ＝ＮＡＤ　Ｈ，０２オキシドレダク
ターゼＥ、ｃｏｌｉ中でＡル゛されたカールポキシベプ
チ　−Ｕ−Ｆ１ＮＭ２１を担う細胞の粗細胞抽出物中の
ＣＰ　Ｇ２の特異活性は、ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＲ
５−１６株からの同等抽出物の５０倍にもなった。旦、
ｃｏｌｉ中のり［−１−ン遺伝子産物がｐ　５ｅｌｌｄ
Ｏ１ｌｌＯｎａＳによるＣ　Ｐ　Ｇ２と同じ特性を有す
るか否かを決定するために、ｌ’ｌＮ　Ｍ　２１を損う
Ｅ、ｃｏｌｉから得た酵素をｙｉ製した。粕ＩＪＩＪＣ
Ｐ　Ｇ２（Ｓ　Ｄ　Ｓ−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅで中−バンド）
の特異粘性は、タンパク　１１ＩｌＯ当り　５３５ユニ
ツトであっ１．：ｇこれはｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの
揚台のタンパク　１ｍｇ当り５５０ユニツトに比肩する
。ｉ：、ｃｏｌｉり［」−ンＩＩＮＭ２１から精製した
Ｃ　Ｐ　Ｇ２を、サブコニツ１〜分子品値４２，０００
ダルトンのＰ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＲ５−１６株から
のＣＰ　Ｇ２と同時にクロマトグラフにかけた。基質と
してメトトレキセートを使用したＫ　Ｉｌｌ値は夫々７
．４ｘｌＯ＝Ｍ及びａ、ｏｘ　１０−’　Ｍであった。

更に、＆と凹迫ｍｏｎ旦且酵素に対して生成された抗血
清によれば、０１１０　ｔ＋　ｔ　ｅ　ｒ　Ｉ　ｏ　ｎ
　ｙ二重拡散分析でコンフルエン１〜な沈降線が形成さ
れるので、Ｅ、ｃｏｌｉとｐｓｅｕ−ｄｏｍｏｎａｓど
のＣＰ　Ｇ２が免疫学的に同一であることがポされｌこ
。

害」Ｌ例−漫＝ プラスミドｒｌＮＭ１４（実施例３）を３ａｕ３Ａ（Ｇ
　Ａ　Ｔ　Ｃ）で処理し、断片をＭ　１３ＩＩｌｐ７鋳
型ＤＮＡ（中鎖ｒ）ＮＡ）のＬ！見１−（■にクローニ
ングした（第７図のステップＡ）。本発明のシグナルポ
リペプチドとＣＰ　Ｇ２の最初の２２個のアミノ酸とを
コードする３１８１１１１の鉗隻３Ａ断片（この断片の
ヌクレオヂドｈ１！列を表３に示す）を担う産物を選択
し二本鎖にした。次に、シグナルポリペプチド（及びＣ
Ｐ　Ｇ２の最初の部分）を＝１−ドＪるｌ’）ＮＡをＥ
Ｃ０ＲＩ断片として切除した。この誇１（１断片を、β
−ガラク］・シダーゼの構３ｉ！１Ｍ仏子（１８ｃ７）
のみを１０う（即ち、プロ・し−ターとＡ［Ｇ開始：］
トンとを含まない）ブ［１モータークローニングベクタ
ーＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＭｃ１４（１３（Ｍ、　、］、　
ｃａｓａｄａｌｌａｎ等、　Ｊ、　３ａｃｔｅｒｉｏｌ
、　１９８（１，１４３，９７１）　ニ／７ｎ−ユング
した（第７図のステップＢ及び０）。

ＥＣ０ＲＩ断片が２つの配列で挿入されたプラスミドが
得られたが、β−ガラク１−シダーゼ配列に対ＪるＣ　
Ｐ　Ｇ２配列の融合が生じたプラスミドのみが、＜　＋
）　ｒｇａｍＨ丁消化ニ、ｊ：　ッＴ　Ｏ，３４Ｋ　ｂ
断ハを生じ、（１１）宿主細胞を、無色ラフ１ヘースア
ナログＢＣＩＧを加水分解してコロニーに青色を与える
ようにすることができた。０，３４Ｋｂの１３ａｍｌ−
１ｆ断片をＭ　１３ｍｐ７に青石り［１−ユングし、配
列決定して融合をＭｔ認した。生じた″ブレカーリ−融
合は、シグノルペプチド、ＣＰＧ２の最初の２２個のア
ミノ酸、Ｍ１３１１１ｐ７及びｒｌＭ　Ｃ１４０３リン
カ−］ニット由来の６個のアミノ酸、並びにその先の８
番目のアミノ酸から始まるβ−ガラクｌ〜シダーゼで構
成されるであろう。

１、′３イｉ’　ｉ！ｌデストは、細胞タンパクを細胞
質周辺と細胞質と膜どの両分に分画し、°′融合遺伝子
″を］−ド−するプラスミドを担う細胞に対して行なっ
た。これらの実験に於いては、１ａｃＺ遺伝子の欠失し
た生物（Ｅ、　ｃｏｌｉ−ＭＣ１０６１）をリン酸塩培
地（１−１，Ｃ，Ｎｃｕ等、Ｊ　、ＩＩ　ｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、、１９６４゜２４０、３６８５）で増殖させ、ス
フエロプラストに転換することによって細胞質周辺領域
を採取細胞から３！！１１ｉ１１［Ｌ／た５、採取スフ
ェロプラストの超音波処理ど１００，０００ｏの遠心１
時間とを順次行なって、細胞膜を沈降Ｉしめるプロレス
によつ°Ｃ可溶（細胞質）タンパクを顆粒（膜結合）タ
ンパクから分離した（　Ｔ　、ＬＪ　、Ｓ　１ｌ１１ａ
ｒｙ等、ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａ口、Ａｃａｄ。

Ｓ　Ｏｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、１９７６、　Ｚ３．３４２
３）　、。

表４に示した結果は、−細胞質周辺領域にβ−ガラク１
−シダーゼ活性の５０％が存在することを示Ｊ０この結
果は、別の細胞質周辺タンパクシグナル配列どβ−ガラ
ク１−シダーＵとの融合を含む同様の操作の結果と極め
て対照的（゛ある。後者の場合には融合タンパクが膜外
に導出されないで膜内に据えられる（Ｐ、　Ｊ、　Ｂａ
５ｓｒｏｒｄｃｔ等、　、Ｊ　、　Ｂ　ａｃ−ｔｅｒｉ
ｏｌ、、１９７９．　１３９．　１９及びＳ、Ｉ）、Ｅ
ｍｒ等、Ｊ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　１９８０．８６．　７０１＞
。

表 組換プラスミドｌ）ＮＭ１４からの３１８ｂｌｌ旦坦３
１５’−Ｇ　ＡＴＣＣＡＣＧＣＡ　ＣＴＧ　ＡＡ（：ｌ
　ＧＣＧ　ＣＧ（ＧＧ（ ＧＧ（ １１（ ＭＥＩ’　ＡＲＧ　ＰＩでＯＳＥＲ目−Ｅ　ｌ−１１８
ＡＲ（ＡＴＧ　ＣＧＣＣＣＡ　ＴＣＣＡＴＣＣＡＣＣＧ
（ＡＩＡ　Ｉ　１−ＦＥ’　ＡＩ−Ａ　ＡＬＡ　ＶＡＩ
−１［Ｕ　Δｌ−Ａ　ＴＨＦＧＯＯＡｌ−ＣＧＣＣＧＣ
ＣＧ−ＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣＡＣ（１）ｌＩ［Ｅ　ＶＡ
Ｉ　ＡＬＡ　にＩＹ　ＴＩＩＲＡＩＡ　ＬＥＵ　ＡＬＩ
Ｔ’ＴＣＧ−ｒＧ　ＧＣＧ　ＧＧＣＡＣＣＧ（ＣＣＣＴ
Ｇ　ＧＣ（１、Ｙｓ　Ａｔ’＜Ｇ　ＡＳＰ　ＡＳＮ　Ｖ
ＡＬ、　ＬＥＵ　円」Ｅ　Ｇ１−１ＡＡＧ　ＣＧＣＧＡ
ＣＡＡＣＧＴＧ　ＣＴＧ　１−ＴＣＣＡ（ＡＩ−、Ａ　
刊」ＲＡＳＰ　Ｇｌ−Ｕ　Ｇｌ−Ｎ　ＰＲＯＡＬＡ　Ｖ
ＡＩＧｅｌ’　ＡＣＣＧＡＧ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＣＣＧ
　ＧＣＣＧＴ（（注）　このＩＩ？ｉ　）’＋は、シグ
ナルポリペプヂドをコードするリーダー配列、タンパク
質０ＡＴＧ開始コドン、ＣＰＧ２リポソーム結合部位（
△ＧＧＡ）及びＣＰＧ２ブ［（断片のポリヌクレオチド
配列 ＣＧＧＣＡＡＧ　ＡＣＧ　ＣＧＣＧＧＣＧＴＧ；　ＧＡ
Ａ　ＧＧＣＡＣＣＧＣＡ　Ｇ’ｌ−Ｇ　ＧＣＡＣＴＧＧ
　ＧＧＡ　ＣＧＣＣＣＧ　ＡＣＡ　ＡＣ’ＡＥ　ＣＧＡ
　ＣＡＡ　ＣＣＣＧＡＡ　、ＣＧＡ　ＡＣＡｅ　Ｔｔ（
Ｒ ：：　ＡＣＡ ＜　ＡＬＡ ＣＧＣＧ （Ｇｌ−Ｎ ’：　ＣＡＧ Ｊ　ＡＬ、Ａ ３　、ＧＣへ −ＩＩＥ ３　ＡＴ（Ｃ ）最初の２２個のアミノ酸を］−ドするＣＰＧ２構造遺
伝子の一部。

コモ−ター領域の別の成分と、を担持している。

表４ シグノールペチブドーβ−ガラクトシダーゼ融合タンパ
クの局在性ａ　＝４つの実験の平均結果 にＰＧ２／β−ＧＡＩ−一カルポキシペブヂダーぜＧ２
−β−ガラクトシダ−１融合タンパク ＡＰ−アルカリ性小スファターピ ＧＡＰＩ）ｌｉ−グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水
素酵素ＮＡＤＩ−ＩＯＸ＝ＮＡＤｌ−１，０２Ａキシド
レダクターゼ犬濃［ 盈一 本発明のシグナルボリベブブドと金ＣＰ　０２分子とを
コードする２、０３ｋｌｌＤのＲａｍｆ−ＩＩ断片を２
つの配向でＥ　、　ｐｏｌｉ／　Ｓ　、　ｃｅｒｅｖｉ
４ｉａｅシｔｙ　ｌ−ルベクター　ｐＲｏａｓ　（Ｒ，
Ｆ、　Ｓｈｅｒｗｏｏｄ及びＲ，Ｋ。

Ｇｉｂｓｏｎ、Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ　ｏｆ　Ｙｅａｓｔ。

１９７９、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ−１ａｒｂｏ
ｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　）のＦ３ａｌｌｌＨＩ
部位にクローニングし、プラスミドｐｌＦｃ３（第８図
）ど１）ｌ−ＩＥｃ４どを得た。ｌｔ。

等、Ｊ　、Ｂ　ａｃｔ、、　１９８３．−υｉ３．　Ｉ
Ｏ２にＪ：る酢酸リチウム誘発形質転換法により上記の
プラスミドでＳ　、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＬ　Ｌ、　
２０株を形質転換した。フラスミド内での遺伝子の配向
に関わりなく、培養物容Ｑ４１１１当り１０へ一２０１
ニットに等しい収昂が得られた３、全細胞抽出物中の酵
素の特異活性は、タンノ＼り　１１ｎＯ当り０．２〜０
．３コニツ（へであり、０．００５％の可溶タンパクを
承り。酵母バックブラウン１：中のＰ　５ｅｌｌ（１０
１１１０ｎａｓ　、／’　Ｉ’ｌ　’Ｅ−ターによるこ
の発現レベルは、遺伝子が３ｃｏｌｊ−中で自身のプロ
モーターから読取られたときのレベル（０，（１１％の
可溶タンパク）と同様である。

Ｊ　、　Ｂ、　Ｄ、　Ｂｅ（１（ｉｓ、　Ｎａｔｕｒｅ
、１９７８．　２７５゜１０：）にＪ、る標準技術を用
いた細胞のスフェロプラスト化によって、上記プラスミ
ドを担持する酵母細胞に対する局在性テストを行なった
。細胞膜外に局イ１１ノた細胞質周辺酵素は、細胞壁が
除去さｔしるど遊ｍｌ　ｔ・Ｉこ。次に、浸透圧安定剤
（１，２Ｍのツルｔ”　＋−−ル）を０．２ｍＭのＺｎ
Ｃｊ！２を加えたｏ　、　ｉ　ｆｖｌのトリス−１−Ｉ
　ＣＤ緩衝液、Ｆｉｌｌ　７．３で置換してスフェロプ
ラストを溶解し、全体を１００，０ＯＯＸ　ｇで１時間
遠心して、可溶細胞質両分中のタンパクを膜結合タンパ
クから分離した。表５の結果は、細胞質周辺画分中に６
４％のＣＰ　Ｇ２活１（１が存在し、別の１６％が卵１
胞膜画分に結合１）でいることを承り、。

表　５ ３　、ｃｅｒｃｖｉｓ−ｉａｅ中のＣＰ　Ｇ　２　（Ｄ
　８」」ＬＣＰ　Ｇ２２古」牛の　％ 細胞質周辺　６４ 細　胞　質　２０ 膜　結　合　１６

【図面の簡単な説明】

第１ａ乃至１（１図は、ｐ　ｓ　ｅ　ｕ　ｄ　ｏ　ｍ、
ｏ　ｎ　ａ　ｓ−４重のＲ５−１６菌株染色体ＤＮＡか
ら単一１したＣ　Ｐ　ＧＺを］−ドＪるボリヌクレＡヂ
ド配列を示す図、第２図はｐＮＭｌの制限酵素開裂部位
マツプ、拘′４３図はｌｌＮＭ１１＋の制限酵素開裂部
位マツプ、第４図はｐＮ　Ｍ　１４の制限酵素開裂部位
マツプ、第５図はＩＮＮ　Ｍ　２１の制限酵素開裂部位
マツプ、１３６図はＩＩＮ　Ｍ　２２の制限酵素開裂部
位マツプ、第７図ＩＪ１、本発明のリーダー配列ポリヌ
クレＡチドどβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子との双方
を含む組換プラスミドの調製プロセスの説明図、第８図
はｌＩＬ［Ｅｃ３の１限酵素開裂部位マツプである。 占ロ　１属　４３　ヨ鍔　白目　占目 ｆｇ　Ｊｕ　、ｉＨ５３Ｂ　ｊ！ 」慕　１属　Ｓ葺　消Ｅ　１葺　ｄ属 占局　５？　１属　、Ｉ　χ葺バ綽 ｎ苓　−属　８５舅　ミ３　ξ梵　５蔚−５鳴ｉ目　）
Ｎ　町基　調１　自り ’　ｍｃｘ　ａ ム　■　餌ｈ　、ｈ＝１　１８　テ１ 々属　５３ｄリ　１番　３目 層Ｎ　ｇｊ局　−１〃埒　１属 ｓ１葺　ａ　ｊｉ　々葺　１葺　ｄ膜 ミ３　月３１属　Ｘ絡　１弓 Ｕ膨　Ｕ属　コ菖　９１　月ｌ Ｊｕ　４目　３目　１篭　５′３ Ｒ基　４克　５属　、ｉｇ　、＞ｊ 占目　１基　古詩　ｈｌ　ノ属 四３　ゴ弓　１属　〆属ｇノ袴 ５將　ｄ属　１属　１属　ル目　占す １目　８翳　３鴫　Ｘ　！　５＋　３　２八３１　当３
１葺　ミ篤　首浅　Ｎ属 、Ｃｈ　Ｃ！属　−３白目　β古３　白目　ｄ属頃 ｎ属　Ｘ絡鮪属　ｄ属　５″基　１膜 ｈ’ａ　”ｉｉ　Ｂ！　、ｉ６　Ａｏ　５ｃＡ鍼Ｉ　５
綽　５転　」Ｅ　Ｒ属　Ｈ属 白目　５と　お目　ｋ目　お目　灯基 ｄ日　口綽　ｙ絡　贋１５芹　５′３ 鞘図　ｄ跨　々目　２日　２日　Ｕ基 ｊ５　Ｗ　ａｕ　、：ｇ　ａ’ｕ　、ｉｇ　、Ｅ、ｉ月
４　二？　月４　ばＰ　片賞　シ８ （５ｒ３　Ｐ４−４　Ｃ５Ｃ！ｌ　＋−ＩＣ）　−１１
（ｊｌ　Ｉｈ４３目　８翳　贋３　ξ慕　１葺　劉具 Ｓ綽　〃属　ミ３　ｎ葺　１？　」基 ５綽　凋菖　５具　１院　３目　旧３ ９１　芽３　月３　灯属　卜１基　ａ　ｊｊｊ　ｇ　、
ｉｊ、　ｊｌ　＠ｊｋ：　５Ｊ　５８Ｕ属　Ｒ葺　ノ袴
　綽Ｕ　灯Ｉ ｎ基　占３　鼠弓践　ダＩ　８騎 ８媚　蛇目　３鴫　Ｈ囮　５翳 〕鉤目　Ｅｏ５３，１ｏｆｆ基 、昏　白目　月１８　ａ４　古３ （・ ２日　謂Ｉ　Ｓ蔚　３１５　＋ｉ ３１４目　３１５Ｍ　’３日 ｄ属　月ｉ　３目　５菖　灯属 ミＱ　、ＩＺ３　、ｈ基　４騎　５底 ５’ｌ：　５”６　Ｍ’ｊ＝　：Ａ’＜　ａＨ”：Ａ’
ｄ」院　ｙ革　１３　占目　諷目　Ｈ葺 １葺　賢３　お菖　言３　お艷　Ｓ１ 易ｋ　１ｄ’　ａＦｊ４　２ｇ　５ｇｇ、、ｉ４葺　ｄ
賊　ｋｌ　おｉ　■目　ｙ目 １目　月ｇ　５葺　間３　町基　刊　−！４．ｉ−片４
　スぷ８　四８　月番　Ｓ目　巨Ｊ　Ｏ祐Ｕ　ｊｇ　、
Ｆ、ｒ、Ａ　、Ｅａ　ＢＨ５Ｃ４鮎践　ｘｌ　ｕ囮　百
３４目　４基　Ｈ騎ｐ　ＢＲ３２２ 堕りＡ断ハ ［３ＡＴ（：Ｃ、、ＧＡＴＣ ｍａｌ Ｆｉｇ、７ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、４　識別記号　庁内整理番号＠発明者
　ナイジエル・ピーク　イギリス国、・−・ミントン　
−・エックス、 ユ争６ ［相］発　明　者　ロジャー・フランクリ　イギリス国
、１ン・シェアウッド　−・エックス、

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　式（１） ％式％ （） のシグナルポリペプチドをコードしているリーダー配列
   ポリヌクレＡチドを含んで（Ｘることを１η（致どＪる
   組換１’）　Ｎ　Ａ運搬ベクター。 （２）　リーダー配列ポリヌクレオチドが、ｊ父（１１
   ） ｂ′Ａ　ｌ’Ｇ　ＣＧＣＣＣＡ　丁ＣＣＡＴＣＣＡＣＣ
   ＧＣ八ＣＡ　ＧＣＣＡＴＣ （２ＣＣＧ　ＣＣＧ　Ｔ　Ｇ　ＣＴ’　Ｇ　Ｇ　ＣＣＡ
   ＣＣＧＧＣ；　ＴＴＣＧＴＧ　ＧＣＧＧＧＣＡＣＣ−３
   ’　（Ｕ） であることを特徴とする特許請求の範囲第１３Ｆに記載
   の組換ＤＮＡ運搬ベクター。 （３）　リーダー配列ボリヌクレＡブトが、細菌又は酵
   母のプ［コモ−ター及び原核生物リポソーム結合部位の
   下流側にありこれらと共に解読）Ｊ−ズにあることを特
   徴とする特許請求の範９０第１項又は第２項に記載の絹
   ′！ＡＤＮＡ運搬ベクター。 （４）　リーダー配列ポリヌクレＡヂドが４ｖｉ造遺伝
   子の上流にありこれど共に解読フェーズにあることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに
   記載の組換ＤＮＡ運搬ベクター。 （５）　構造遺伝子がと１〜成長ホルモン、ヒトインシ
   コリン又はヒト絨毛１１！　１／ｌ−ソマトマモトＯピ
   ンをコードしていることを特徴とする特許請求の範囲第
   ４項に記載の組換ＤＮＡ運搬ベクター。 （６）　構造遺伝子が大胆菌（口止）　β−ガラクトシ
   ダーゼをコードしていることを特徴とする特ｊ′！ｌ−
   請求の範囲第４項に記載の組換ＤＮＡ運搬ベクター。 （７）　構造遺伝子がシュードモナス（Ｐ　５ｅｕｄｏ
   −訓ｐ旦邊−）カルボ４シベプチダ−１ｉ　Ｇ２（ＣＰ
   　Ｇ２）を°］−ドしていることを特徴とする特許請求
   の範囲第４項に記載のｌｌｉ換Ｄ　Ｎ’Ａ運搬ベクター
   。 、（８）式 ］ ％式％ ししく、：　ＧらＬ：　ＡＡＬ；　ＬｉＬ：も　ぜｌ“
   し　八’ｉ’（、：　Ｌ：“ｌｏも　し八し　ハ（−６
   ０ １Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　
   工ｌｅ　Ａｌａ　ＬｙｓＣＴＧ　ＣＧＣＴＴＣＡＡＣＴ
   ＧＧ　ＡＣＣＡＴＣＧＣＣＡＡＧ８０ Ｇもし　Ａしし　しハし　もしＩｊ　もＬＬ　ＴＡＬ；
   　ｌｊしし　ＬｉＵも　しｌしで示されるポリヌクレオ
   チドを含むことを特徴とする特に１請求の範囲第７項に
   記載の組ｌ！ｉＩ！ＤＮＡ運搬ベクター。 （９）　運搬ベクターがプラスミドであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項乃芋第８項のいり゛れかに記
   載の組換ＤＮＡ運搬ベクター。 （１０）　ＤＮＭｌ、　ＩＩＮＭｌｌｌ、　ｌｌＮＭ１
   ４．　ｌｌＮＭ２１゜１）ＮＭ２２．　１）ＮＭ３１．
   　ｌＩＮＭ３２又は１）ＬＥＣ３の名称を有し特許請求
   の範囲Ｍ７項に記載の４？４造遺伝子を含むことを特徴
   とする特ｎ品求の範囲第９項に記載の組換ＤＮＡ運搬ベ
   クター。 （１１）　特許請求の範囲第１項に記載の組換Ｉ）ＮＡ
   運搬ベクターによって形質転換された微生物。 （１２）　運搬ベクターが特許請求の範囲Ｍ４項に記載
   の組換ＤＮＡ運搬ベクターであることを特徴とする特許
   請求の範囲第１１項に記載の微生物。 （１３）　大腸菌、シュードモナス若しくはバチルス（
   ３ａｃｉｌｌｕｓ　）種の細菌又はザッカロミセス・セ
   レどシエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
   ｉｓｉａｅ　）種の酵母であることを特徴とする特許請
   求の範＃１１第１１項又は第１２項に記載の微生物。 ・　（１４）　Ｉ包子産物の製造方法であって、（ａ）
   特許請求の範囲第１２項に記載の微生物を培地中で培養
   して培地中又は微生物の細胞質周辺領域に遺伝子産物を
   産生さゼ、 （１））培地又は微生物の細胞質周辺領域から遺伝子産
   物を単離Ｊる ことを特徴とする遺伝子産物のＭＡ造方法。 （１５）　Ｍ転子産物がシュードモナスカルボキシペブ
   ブダ−１ｆｆｉＧ２又は大腸菌β−ガラクトシダーゼで
   あることを特徴とする特約請求の範囲第１４項に記載の
   方法。