CZ284048B6 - Fragment DNA kodující polypeptid s nitril-hydra tasovou aktivitou, transformant obsahující tento gen a způsob přípravy amidů použitím tohoto transformantu - Google Patents

Fragment DNA kodující polypeptid s nitril-hydra tasovou aktivitou, transformant obsahující tento gen a způsob přípravy amidů použitím tohoto transformantu Download PDF

Info

Publication number
CZ284048B6
CZ284048B6 CS91531A CS53191A CZ284048B6 CZ 284048 B6 CZ284048 B6 CZ 284048B6 CS 91531 A CS91531 A CS 91531A CS 53191 A CS53191 A CS 53191A CZ 284048 B6 CZ284048 B6 CZ 284048B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dna
transformant
nitrile hydratase
amides
nitrile
Prior art date
Application number
CS91531A
Other languages
English (en)
Inventor
Teruhiko Beppu
Hideaki Yamada
Toru Dr. Nagasawa
Sueharu Horinouchi
Makoto Dr. Nishiyama
Original Assignee
Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
Teruhiko Beppu
Hideaki Yamada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Rayon Co., Ltd., Teruhiko Beppu, Hideaki Yamada filed Critical Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
Publication of CS9100531A2 publication Critical patent/CS9100531A2/cs
Publication of CZ284048B6 publication Critical patent/CZ284048B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Popisuje se sekvence aminokyselin a sekvence nukleotidů alfa- a beta- podjednotek dvou typů nitril-hydratasy odvozené od Rhodococcus rhodochrous J-1. Fragment DNA kodující nitril-hydratasu je vložen do expresního vektoru a tento rekombinantní vektor se použije pro transformaci. Transformant obsahuje mnoho kopií genu a může produkovat mnohem vyšší hladinu nitril-hydratasy při srovnání s konvenčně používanými mikroorganismy.ŕ

Description

Oblast techniky
Předložený vynález se týká fragmentu DNA(H), odvozeného od Rhodococcus rhodochrous J-l a kódujícího polypeptid s nitrilhydratázovou aktivitou, který hydratuje nitrily na amidy. Vynález se také týká rekombinantní DNA, obsahující shora uvedený DNA(H) fragment, a transformantů transformovaného touto rekombinantní DNA. Vynález se dále týká způsobu přípravy nitrilhydratázy s použitím tohoto transformantů a způsobu přípravy amidů pomocí nitril-hydratázy.
Dosavadní stav techniky
Nitril-hydratáza nebo nitraláza je známa jako enzym, který hydratuje nitrily na amidy. Mezi mikroorganismy, které produkují nitril-hydratázu, patří mikroorganismy rodu Bacillus, rodu Bacterium, rodu Micrococcus a rodu Brevibacterium (viz japonský patent B—62—21517/1989, US patent č. 4001081), rodu Corynebacterium a rodu Nocardia (viz japonský patent B—56—17918/1989, US patent č. 4248968), rodu Pseudomonas (viz japonský patent 59-37951/1984, US patent č. 4637982), rodu Rhodococcus, rodu Arthrobacter a rodu Microbacterium (viz japonský patent A—61—162193/1986, evropská patentová přihláška č. 0188316) a rodu Rhodococcus rhodochrous (viz japonský patent 470/1990 a evropská patentová přihláška č. 0307926).
Nitril-hydratáza se používá pro hydratování nitrilů na amidy. Podle tohoto vynálezu se upraví mikroorganismy tak, aby obsahovaly více kopií rekombinantní DNA, kódující nitril-hydratázu podle technologie rekombinantní DNA. Rekombinant produkuje pozoruhodně vysoké hladiny nitril-hydratázy ve srovnání s konvečně používanými mikroorganismy.
Autoři tohoto vynálezu již dříve objevili fragment DNA, odvozený od Rhodococcus sp. N-774 (FERM BP-1936). který' také kóduje polypeptid s nitril-hydratázovou aktivitou (japonský patent č. A—2—119778/1988).
Na rozdíl od objevu, popsaného v předcházejícím odstavci, autoři tohoto vynálezu využívají pro přípravu nitril-hydratázy fragmentu DNA. odvozeného od Rhodococcus rhodochrous J-l. Byl izolován gen, kódující nitril-hydratázu, tento gen byl vložen do vhodného plazmidového vektoru a příslušný hostitel byl transformován tímto rekombinantním plazmidem. Byl tak úspěšně získán transformant, který produkuje nitril-hydratázu s vysokou aktivitou také k aromatickým nitrilúm.
Podstata vynálezu
Tento vynález se týká:
1) Fragmentu DNA<H), kódujícího polypeptid, který má nitril-hydratázovou aktivitu, vyznačující se tím, že uvedený peptid obsahuje (a)tH) - a P'H)-podjednotky následujících aminokyselinových sekvencí:
a(H-podjednotka:
$ 1015
MetSerGIuHisValAsnLysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr
Z O Z 53 0
LysAlalleGluThrLeuLeuTyrGIuArgGIyleulleThrPro
S «04 5
AlaAlaValAspArgValValSerTyrTyrGluAsnGluIleGly
0 5 54 0
ProMetGlyGlyAlaLysValValAlaLysSerTrpValAspPro
5 H15
GluTyrArgLysTrpleuGluGluAšpAlaThrAlaAlaMetAla
9 8 5H
SerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHisGInlleSerAlaVal ♦ 5 10 0I ts
PheAsnAspSerGInThrHisHisValValValCysThrLeuCys t I O 115I Z O
SerCysTyrProTrpProVaileuGlyLeuProProAIaTrpTyr
I Z 5 13 0I 3 5
LysSerřletGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgGIy
0 145150
ValLeuLysArgAspPheGlyPheAspIleProAspGluValGlu
155 140145
ValArgValTrpAspSerSerSerGIufleArgTyrlleValIle
I Ί O 17 518 0
ProGluArgProAlaGlyThrAspGlyTrpSerGIuGluGluLeu
185 17 0175
ThrlysLeuValSerArgAspSerMetlIeGlyValSerAsnAla
LeuThrProGlnGluVal 1 leVal
-2CZ 284048 B6
P(H)-podjednotka:
S I»i s
MetAspGlylleHisAspThrGIyGlyMetThrGIyTyrGlyPro z o ti3 0
ValProTyrGInLysAspGluProPhePheflisryrGIuTrpGIu
J S 4 «4 3
GlyArgThrLeuSerl leLeuThrTrpMetHtsLeuLysGIylle
S O S 3O ·
SerTrpTrpAspLysSerArgPhePheArgGluSerMetGIyAsn ' 0 5 7 97 3
GluAsnTyrValAsnGluIleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrp
0· S
LeuSerAlaAlaGluArglleLeuValAlaAspLyslIelleThr
OS 10 919 3
GluGluGluArgLysHisArgValGlnGlulleleuGluGlyArg
IIO lis129
TyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaGInlIe
I 7 S 13 9I 3 S
GluLysAlalIeGlurtrgLeuHisGluProHisSerLeuAlaLeu
0 l 4 SISO
ProGlyAlaGluProSerPheSerLeuGIyAspLysHeLysVat
133 10 010 5
LysSerÍletAsnProLeuGlyHisThrArgCysProLysTyrVal
0 I 7 s11«
ArgAsnLyslleGlyGlulleValAlaTyrHisGlyCysGlnlle
105 1’0<’s
TyrProGluSerSerSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgPro
700 7 0 3710
LeuTyrThrValAlaPheSerAlaGInGluLeuTrpGlyAspAsp l S 7 7«273
GlyAsnGIylysAspValValCysValAspLeuTrpGluProTyr
Leu11 eSerA l a ;
2) Fragmentu DNA,H> podle bodu 1, který obsahuje sekvence nukleotidů a(H)podjednotek, kde DNA sekvence a(H)-podjednotky znamená
GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC aaggcgatcgaaaccttgctgtacgagcgagggctcatcacgccc gccgcggtcgaccgagtcgtttcgtactÁcgagaacgagatcggc ccgatgggcggtgccaaggtcgtggccaagtcctgggtggaccct
1,5 119 115 gagtaccgcaagtggctcgaagaggacgcgacggccgcgatggcg
Z « β Z S S Z 7 β tcattgggctatgccggtgagcaggcacaccaaatttcggcggtc ttcaacgactcccÁaacgcatcacgtggtggtgtgcactctgtgt
J39 34$3 6 0 tcgtgctatccgtggccggtgcttggtctcccgcccgcctggtac
115 3 0 040$ aagagcatggagtaccggtcccgagtggtagcggaccctcgtgga
420 43$4 $ O gtgctcaagcgcgatttcggtttcgacatccccgatgaggtggag
46$ 4,84,4
GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAáTCCGCTACATCGTCATC
519 S 2 S
CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG $5$
ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG
CTCACACCGCAGGAAGTGATCGTA β(Η)-4CZ 284048 B6 a DNA sekvence P'ří,-podjednotky znamená atggatggtatccacgacacaggcggcatgaccggatacggaccg « 7$ «4
GTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAG ggtcggaccctgtcaattctgacttggatgcatctcaagggcata
TCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAAC
GAAAACTACGTCAACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGG
Z * β ISSI’ «
CTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGATCATCACC
285 3 4 4315
GAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGAGATCCTTGAGGGTCGG
330 1453 4 4
TACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATC
375 3’4405
GAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTT
420 4354$0
CCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG
4 5 480405
AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTG
510 525540
CGGAACAACATCGGGCAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC
555 5 7 β5 · 5
TATCCCGAGAGCAGCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG
CTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGAC
GGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTAC CTGATCTCTGCG
Dále se vy nález týká DNA, která obsahuje e vektoru DNA(H\ jak je výše uvedena.
Ještě dále se vynález týká transformantu E.coli, který je transformován rekombinantní výše uvedenou DNA.
Ještě dále se vynález týká způsobu přípravy nitril-hydratázy kultivací výše uvedeného transformantu, a izolace nitril-hydratázy z kultury.
Dále se vynález týká způsobu přípravy amidů hydratací nitrilů pomocí nitril-hydratázy za vzniku amidů.
Dále se vynález týká způsobu přípravy amidů kultivací výše uvedeného transformantu a hydratací nitrilů výslednou kulturou izolovaných bakteriálních buněk, materiálem z nich zpracovaným nebo fixovaným, za vzniku amidů.
Dále bude předložený vynález podrobněji popsán. Postupuje se podle výše uvedených stupňů.
-5 CZ 284048 B6 stupeň : Izolace a čištění nitril-hydratázy a částečné aminokyselinové sekvenování nitril— hydratázy:
z Rhodococcus rhodochrous J-l (FERM BP-1478) se izolují a vyčistí dva typy nitril-hydratázy (označené jako typ H a L). Oba enzymy se rozdělí HPLC na podjednotky a a β. Určí se část aminokyselinové sekvence každé z podjednotek (obr. 1).
2. stupeň: Příprava DNA sondy (proby) na gen nitril-hydratázy
DNA sonda se připraví z JM105/pYUK121 (FERM BP-1937), jak je to popsáno v japonském patentu A-2-119778/1990, díky vysokému stupni homologie aminokyselinové sekvence nitril— hydratázové β-podjednotky z Rhodococcus sp. N-774 (popsané v uvedeném oficiálním časopisu japonských patentů „Japanese Patent Official Gazette“) a z Rhodococcus rhodochrous J-l. Plazmid zpYUK.121. obsahující gen nitril-hydratázy, odvozený od Rhodococcus sp. N-774, se připraví z kultury JM105/pYUK121. pYUK.121 DNA se rozštěpí působením Sphl a Sall. SphlSall fragment obsahuje gen nitril-hydratázy, odvozený od Rhodococcus sp. N-774 (obr. 2). Fragment DNA se radioaktivně označí.
3. stupeň: Detekce segmentu DNA, obsahující gen nitril-hydratázy z chromozomu Rhodococcus rhodochrous J-l
Chromozomová DNA se připraví z kultury Rhodococcus rhodochrous J-l. Chromozómová DNA se rozštěpí restrikčními enzymy a hybridizuje se sodnou, popsanou ve stupni 2 s použitím Southemovy hybridizační metody (Southem E. M.: J. Mol. Biol. 98, 503 (1975).). Testují se dva DNA fragmenty různé délky.
4. stupeň: Konstrukce rekombinantního plazmidu
Rekombinantní plazmid se zkonstruuje vložením chromozómového DNA fragmentu, připraveného podle stupně 3, do plazmidového vektoru.
5. stupeň: Transformace a testování transformantu, obsahujícího rekombinantní plazmid
Z rekombinantního plazmidu, popsaného ve stupni 4, se připraví transformanty. Transformant, obsahující rekombinantní plazmid, se vybere pomocí sondy, popsané ve stupni 2, způsobem hybridizace kolonií (R. Bruče Wallace a spol.: Nucl. Acids Res. 9, 879 (1981).). Přítomnost genu nitril-hydratázy v rekombinantním plazmidu se potvrdí Southemovou hybridizační metodou. Takto vybrané plazmidy se označí pNHJlOH a pNHJ20L.
6. stupeň: Izolace a čištění plazmidové DNA a konstrukce restrikční mapy
Plazmidové DNA pNHJlOH a pNHJ20L, které byly připraveny podle stupně 5, se izolují a vyčistí. Pro určené oblasti, obsahující gen nitril-hydratázy, se zkonstruuje restrikční mapa DNAs (obrázek 3).
7. stupeň: Sekvenování DNA
Příslušným restrikčním enzymem se vyštěpí z plazmidů pNHJlOH a pNHJ20L segment vloženého fragmentu DNA. Tento vložený fragment DNA se pak použije pro sekvenování. Nukleotidová sekvence fragmentu D (obrázek 4, 5) ukazuje, že fragment obsahuje sekvenci, odvozenou od aminokyselinové sekvence, popsané ve stupni 1.
-6CZ 284048 B6
8. stupeň: Příprava nitril-hydratázy pomocí transformantu a konverze nitrilů na amidy
Kultivuje se transformant, popsaný v bodě 8. Tyto bakteriální buňky se smíchají s nitrily. Připraví se tak substrát nitril-hydratázy a amidy.
Rhodococcus rhodochrous J-l byl uložen ve „Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology“ a byl označen číslem FERM-BP-1478. Transformant TGl/pNHJlOH, obsahující pNHJlOH, popsaný ve stupni 5. a transformant TGl/pNHJ20L, obsahující pNHJ20L, popsaný ve stupni 5, byl uložen ve shora uvedeném ústavu a označen číslem FERM BP-2777, respektive FERM BP-2778.
Lze používat jakékoliv vektory včetně plazmidového vektoru (např. pAT153, pMP9, pHC624, pKC7 atd.), fágového vektoru (např. λ gtll (Toybo), Charon 4A (Amersham) atd.). Mezi enzymy, které se mohou používat, patří Sphl, Sáli, EcoRI, BamHI, Sací a podobné, komerčně dostupné od Takara Shuzo. Pro transformaci lze použít různé hostitele včetně (ale bez omezení pouze na tyto). E. coli JMI05 a E.coli TG1. Jako kultivační média pro transformanty se používají taková kultivační média, které jsou obvykle v této oblasti používána.
Nitrily se na amidy převádějí pomocí nitril-hydratázy, surové nitril-hydratázy, kultury transformantů, izolovaných bakteriálních buněk nebo zpracovaných materiálů těchto buněk apod., připravených z kultury transformantů.
Mezi vhodné nitrily podle vynálezu patří aromatické nitrily se čtyřmi až deseti atomy uhlíku v aromatické části a alifatické nitrily se dvěma až šesti atomy uhlíku, které jsou popsány v evropské patentové přihlášce č. 0 307 926. Typickými příklady jsou 4-, 3- a 2-kyanopyridiny, benzonitril, 2,6-difluorbenzonitril, 2-thiofen-karbonitril. 2-furonitril, kyanpyrazin, akrylonitril, methakrylonitril, krotonitril, acetonitril a 3-hydroxypropionitril.
Tento vynález popisuje aminokyselinovou sekvenci a nukleotidovou sekvenci a- a βpodjednotek dvou typů nitril-hydratázy, odvozené od Rhodococcus rhodochrous J-l. Fragment DNA, kódující nitril-hydratázu, se vloží do expresního vektoru a rekombinantní vektor se použije pro transformaci. Transformant obsahuje více kopií genu a může produkovat mnohem vyšší hladiny nitril-hydratázy při srovnání s konvenčně používanými mikroorganismy .
V následujícím odstavci je uveden popis obrázků.
Obrázek 1 ukazuje N-koncové aminokyselinové sekvence a- a β-podjednotek dvou ty pů nitrilhydratázy, produkovaných Rhodococcus rhodochrous J-l.
Obrázek 2 ukazuje sekvenci DNA genu nitril-hydratázy z Rhodococcus sp. N-774, která se používá jako sonda DNA.
Obrázek 3 ukazuje restrikční mapy rekombinantních plazmidů pNHJlOH a pNHJ20L.
Obrázek 4 ukazuje DNA sekvenci fragmentu DNA v pNHJlOH, odvozeném od Rhodococcus rhodochrous J-l, a odvozenou aminokyselinovou sekvenci.
Obrázek 5 ukazuje DNA sekvenci fragmentu v pNHJ20L. odvozeném od Rhodococcus rhodochrous J-l, a odvozenou aminokyselinovou sekvenci.
Tento vynález bude dále podrobněji ilustrován v následujících příkladech, které nejsou zamýšleny tak, že by omezovaly rozsah tohoto vynálezu. V následujících příkladech jsou použity následující zkratky: TE znamená Tris-HCl (10 mM, pH 7,8) a EDTA (1 mM, pH 8,0), TNE
-7CZ 284048 B6 znamená Tris-HCl (50 mM, pH 8,0), EDTA (1 mM, pH 8,0) a NaCl (50 mM), STE znamená Tris-HCl (50 mM, pH 8,0), EDTA (5 mM, pH 8,0) a sacharózu (35 mM), 2xYT médium znamená 1,6 % Tryptonu, 1,0 % kvasinkového extraktu a 0,5 % NaCl.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace a čištění nitril-hydratázy a částečné sekvenování aminokyselin nitril-hydratázy
Rhodococcus rhodochrous J-l se kultivuje v médiu (3 g/1 kvasinkového extraktu, 0,5 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 síranu hořečnatého.4 H2O, 0,01 g/1 chloridu kobaltnatého a 3 g/1 krotonamidu, pH 7,2) 80 hodin při teplotě 28 °C. Izolují se bakteriální buňky. 50 gramů bakteriálních buněk se rozbije a frakcionuje se síranem amonným. Vzorek se dialyzuje a dialyzát se odstřeďuje. Supematant se nanese na chromatografíckou kolonu, naplněnou nosičem DEAE-Cellulofine, Phenyl-Sepharose, Sephadex G-150 a Octyl-Sepharose. Získají se dvě frakce s enzymovou aktivitou. Obě frakce se dialyzují. Dialyzáty se nanesou na kolonu s reverzní fází (Senshu Pak VP-304-1251, Senshu Kagaku) a chromatografují se vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii. Získají se dvě podjednotky (a a β). N-Koncová aminokyselinová sekvence α/313-, β/Η)-, a/1-'- a βΛpodjednotek byla stanovena na proteinovém sekvenátoru Applied Biosystems model 470A. Sekvence aminokyselin jsou uvedeny na obrázku 1.
Příklad 2
Příprava DNA sondy pro gen nitril-hydratázy
E.coli JM105 (FERM BP-1937), obsahující pYUK121, se kultivuje ve 100 ml média 2xYT, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při 30 °C přes noc (12 hodin). Bakteriální buňky se izolují. K buňkám se přidá TNE. Suspenze buněk se pak odstřeďuje. K peletě se přidá 8 ml STE a 10 mg lysozymu. Směs se inkubuje pět minut při teplotě 0 °C. Potom se přidají 4 ml 0,25M EDTA. Ke směsi se za teploty místnosti přidají 2 ml 10% SDS a 5 ml 5M chloridu sodného. Výsledná směs se inkubuje tři hodiny při teplotě 0 až 4 °C. Potom se směs odstřeďuje na ultraodstředivce. K supematantu se přidá 1/2 objemu 30% PEG 6000. Směs se inkubuje přes noc (12 hodin) při 0 až 4 °C a odstřeďuje se. K peletě se přidá tolik TNE, aby objem roztoku byl 7,5 ml. K suspenzi se přidá CsCl. Odstřeďováním směsi se odstraní proteiny. K supematantu se pak přidá 300 až 500 mg/ml ethidiumbromidu. Směs se přenese do ultracentrifugační zkumavky. Zkumavka se zataví a potom se odstřeďuje v ultraodstředivce. cccDNA se extrahuje peristaltickou pumpou. K extraktu se přidá trochu více než stejné množství isopropylalkoholu nasyceného vodou, abychom se zbavili ethidiumbromidu. Vzorek se dialyzuje proti TE. Získají se tak asi 3 ml vyčištěného pYUK 121.
pYUK121 DNA se rozštěpí působením Sphl a Sall. Získá se tak fragment DNA o 2070 nukleotidech, obsahující gen nitril-hydratázy, odvozený od Rhodococcus sp. N-774. Označením fragmentu 32P se získá sonda. Sekvence nukleotidů sondy je uvedena na obrázku 2.
-8CZ 284048 B6
Příklad 3
Příprava fragmentu DNA, obsahující gen nitril-hydratázy chromozomu
Rhodococcus rhodochrous J-l se kultivuje ve 100 ml média (10 g/1 glukózy, 0,5 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného. 0,5 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 síranu hořečnatého (.7 H2O), 1 g/1 kvasinkového extraktu, 7,5 g/1 peptonu, 0,01 g/1 chloridu kobaltnatého, 7,5 g/1 močoviny, 1 % glycinu nebo 0,2 pg/ml ampicilinu, 1 litr vody, pH 7,2). Bakteriální buňky se izolují a pelety se promyjí TNE. Pelety se suspendují v 10 ml TE. K suspenzi se přidají 4 ml 0,25M EDTA, 10 až 20 mg lysozymu, 10 až 20 mg achromoproteázy a 10 ml lOxSDS. Suspenze se inkubuje tři hodiny při 37 °C. K suspenzi se přidá 15 ml fenolu. Směs se inkubuje patnáct minut při teplotě místnosti, odstřeďuje se, horní vrstva se odstraní a k supematantu se přidá 0,7 ml 2,5M octanu sodného a diethylether. Směs se odstřeďuje. Horní vrstva se odstraní. Ke spodní vrstvě se přidají dva objemy ethanolu a DNA se odebere skleněnou tyčinkou. DNA se promývá po pět minut směsí TE:ethanol 2:8, 1:9 a 0:10 (objemové díly : objemovým dílům). Potom se DNA suspenduje ve dvou až čtyřech ml TE (37 °C). K suspenzi se přidá 10 μΐ směsi RNA-sy A a Tb Směs se inkubuje při teplotě 37 °C. Ke směsi se přidá stejné množství fenolu a výsledná směs se odstřeďuje. K supematantu se přidá více než stejné množství etheru. Směs se opět odstřeďuje. Horní vrstva se odstraní. Spodní vrstva se přes noc dialyzuje proti dvěma litrům TE, obsahujícího malé množství chloroformu, potom se dialyzuje tři až čtyři hodiny proti čerstvému TE. Získají se tak 4 ml surové chromozomové DNA.
K 15 μΐ surové chromozomové DNA se přidá 10 μΐ TE. 3 μΐ reakčního pufru (lOx) a 2 μΐ Sací. Směs se inkubuje jednu hodinu při teplotě 37 °C. Potom se elektroforezuje na agarosovém gelu tři hodiny při 60 V. Southemova hybridizace chromozomové DNA se provádí sondou, která je popsána v příkladu 2. Silnou hybridizaci vykazovaly fragmenty s asi 6000 nukleotidy a 9400 nukleotidy.
Působením Sací se rozštěpí 15 μΐ chromozomové DNA. Směs se elektroforezuje na agarosovém gelu, jak shora popsáno. Z gelu se vyříznou fragmenty DNA se 6000 a 9400 nukleotidy a přenesou se do třech objemů 8M chloristanu sodného. Po rozpuštěni se každý roztok natečkuje na filtrační papír GF/C (Whatman) (o průměru 6 mm). Na filtrační papír se pak přidá 10 kapek (přibližně 100 mikrolitrů) TE, obsahujícího 6M chloristan sodný, a 10 kapek (přibližně 100 mikrolitrů) 95% ethanolu. Papír se suší tři minuty na vzduchu, přenese se do 0,5ml Eppendorfovy zkumavky, přidá se 40 mikrolitrů TE a vše se inkubuje třicet minut při teplotě 47 °C. Zkumavka se pak odstřeďuje. Získá se asi 40 mikrolitrů supematantu, který obsahuje fragmenty DNA o 6000 a 9400 nukleotidech, které obsahují gen nitril-hydratázy chromozomové DNA.
Dále je popsán způsob inzerce fragmentu DNA o 6000 nukleotidech do vektoru. Stejný způsob se použije také pro inzerci fragmentu DNA o 9400 nukleotidech do vektoru.
Příklad 4
Inzerce fragmentu chromozomové DNA do vektoru
K 10 μΐ pUC19 se přidá 10 μΐ TE, 3 μΐ reakčního pufru (lOx) a 2 μΐ Sací. Směs se inkubuje jednu hodinu při 30 °C. Pro zastavení reakce se ke směsi přidají 2 μΙ 0,25M EDTA. Potom se ke směsi přidá 7 μΐ 1M Tris-HCl (pH 9) a 3 μΐ BAP (bakteriální alkalická fosfatáza). Směs se inkubuje jednu hodinu při teplotě 65 °C. Ke směsi se přidá tolik TE, aby konečný objem byl 100 mikrolitrů. Směs se extrahuje 3x stejným množstvím fenolu. K extraktu se přidá stejné množství etheru. Spodní vrstva se odebere a přidá se k ní 10 mikrolitrů 3M octanu sodného a 250
-9CZ 284048 B6 mikrolitrů ethanolu. Směs se inkubuje třicet minut při teplotě -80 °C, odstřeďuje, vysuší a resuspenduje v TE.
Pět mikrolitrů takto získané pUC19 DNA se smíchá se 40 μΐ fragmentu DNA o 6000 nukleotidech, který byl popsán v příkladu 3. Ke směsi se přidá 6 μΐ ligačního pufru, 6 μΐ ATP (6 mg/ml) a 3 μΐ T4 DNA ligázy. Směs se inkubuje přes noc (12 hodin) při 4 °C. Získá se tak rekombinantní plazmid, obsahující fragment DNA o 6000 nukleotidech, kódující žádaný enzym v místě Sací pUC19.
Příklad 5
Transformace a testování transformantů
Do 10 ml média 2xYT se naočkuje E. coli TG1 (Amersham) a inkubuje se dvanáct hodin při 37 °C. Po inkubaci se výsledná kultura přidá k čerstvému médiu 2xYT na koncentraci asi 1 % a směs se inkubuje 2 hodiny při teplotě 37 °C. Kultura se odstřeďuje a peleta se suspenduje v 5 ml chladného 50mM chloridu vápenatého. Suspenze se vloží do ledu na dobu 40 minut a potom se odstřeďuje. K peletě se přidá 0,25 ml chladného 50mM chloridu vápenatého a 60 mikrolitrů rekombinantní DNA, která je popsána v příkladu 4. Směs se inkubuje 40 minut při teplotě 0 °C, vystaví se dvouminutovému působení tepelného šoku (42 °C), vloží se na pět minut do ledu a přidá se k 10 ml média 2xYT. Směs se inkubuje 90 minut při 37 °C za třepání. Potom se odstřeďuje. Peleta se suspenduje v 1 ml média 2xYT. Na agarosovou desku (2xYT), obsahující 50 pg/ml ampicilinu, se jednotlivě vysejí dva podíly (po 10 mikrolitrech) suspenze. Deska se inkubuje při teplotě 37 °C. Kolony, vyrostlé na desce, se vyberou způsobem hybridizace kolonií: Kolonie se přenesou na nitrocelulózový filtr a rozštěpí. DNA zůstala fixována na filtru. Byla hybridizována sodnou, jak je to popsáno v příkladu 2. Filtr se autoradiografuje. Vybere se rekombinantní kolonie. Přítomnost genu nitril-hydratázy v transformantů byla potvrzena také Southemovou hybridizační metodou.
Příklad 6
Izolace a čištění rekombinantního plazmidu a konstrukce restrikční mapy vložených fragmentů DNA
Transformant, který se vybere jak shora popsáno v příkladu 5, se nechá růst ve 100 ml média 2yYT, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu, přes noc (12 hodin) při 37 °C. Izolují se bakteriální buňky. K buňkám se přidá TNE. Buňky se opět odstřeďují. K buňkám se přidá 8 ml STE a 10 mg lysozonu. Směs se inkubuje pět minut při 0 °C. Ke směsi se přidají 4 ml 0,25M EDTA, 2 ml 10% SDS (za teploty místnosti) a 5 ml 5M chloridu sodného. Směs se inkubuje tři hodiny při teplotě 0 až 4 °C a odstřeďuje se na ultraodstředivce. K supematantu se přidá 1/2 objemu 30% PEG. Směs se inkubuje přes noc (12 hodin) při teplotě 0 až 4 °C a opět se odstřeďuje. K peletě se přidá tolik TNE, aby konečný objem byl 7,5 ml. K suspenzi se přidá CsCl. Tím se suspenze zbaví proteinů. K supematantu se potom přidá 300 až 500 mg/ml ethidiumbromidu a směs se přenese do centrifugační zkumavky. Zkumavka se zataví a odstřeďuje se na ultracentrifuze. Peristaltickou pumpou se odstraní cccDNA. K cccDNA se pro odstranění ethidiumbromidu přidá trochu víc než stejné množství isopropylalkoholu, nasyceného vodou. Vzorek DNA se dialyzuje proti TE. Získají se asi 3 ml vyčištěné rekombinantní DNA. Takto získaný rekombinantní plazmid. obsahující fragment DNA o 6700 nukleotidech, se označí pNHJlOH (Rekombinantní plazmid, obsahující fragment DNA o 9400 nukleotidech, se označí pNHJ20L.).
- 10CZ 284048 B6
Tyto plazmidové DNA se rozštěpí působením EcoRI, BamHI, Pstl, Sací, respektive Sáli. Zkonstruované restrikční mapy jsou uvedeny na obrázku 3.
Příklad 7
Sekvenování DNA
Umístění gen nitril-hydratázy ve fragmentu DNA pNHJlOH bylo stanoveno podle zkonstruované restrikční mapy a podle Southemovy hybridizační metody. Přidaný segment v pNHJlOH byl štěpen působením Pstl a Sáli. Fragment DNA o 6000 nukleotidech poskytl fragment o 1970 nukleotidech. Podobně byl štěpen působením EcoRI a Sací přidaný fragment v pNHJ201. Z fragmentu o 9400 nukleotidech byl získán fragment o 1730 nukleotidech.
Tyto fragmenty DNA byly sekvenovány způsobem podle Sangera (Sanger F.: Science 214, 1205 až 1210 (1981).) pomocí M13 fágového vektoru. Sekvence nukleotidů fragmentu DNA o 1970 nukleotidech (pNHJlOH) a sekvence nukleotidů fragmentu DNA o 1730 nukleotidech (pNHJ20L) jsou uvedeny na obrázcích 4 a 5.
Bylo zjištěno, že sekvence aminokyselin, odvozená od sekvence nukleotidů, je plné identická se sekvencí aminokyselin, která byla stanovena v příkladu 1. Sekvenční analýza také odhalila, že fragment DNA obsahoval sekvenci, kódující a- a β-podjednotky.
Příklad 8
Příprava nitril-hydratázy pomocí transformantu a konverze nitrilů na amidy pomocí nitrilhydratázy
Do 10 ml média 2xYT, které obsahuje 50 pg/ml ampicilinu, se naočkuje TG-l/pNHJ10H a TG-l/pNHJ20L. Směs se inkubuje přes noc při teplotě 30 °C (12 hodin). Jeden mililitr výsledné kultury se přidá ke 100 ml média 2xYT (50 pg/ml ampicilinu, 0,1 g CoCL.6 FFO/l). Směs se inkubuje čtyři hodiny při 30 °C. Ke směsi se přidá IPTG na konečnou koncentraci 1 mM. Směs se inkubuje 10 hodin při 30 °C. Po izolování buněk se buňky suspendují v 5 ml 0,lM fosforečnanového pufru (pH 7,5). Suspenze se rozbije sonikací (pět minut) a odstřeďuje 30 minut při 12 000 g. Výsledné supematanty se použijí pro enzymovou analýzu.
Enzymová analýza se provádí v reakční směsi (12 ml), obsahující 50 mM pufru fosforečnanu draselného (pH 7,5), 6 ml benzonitrilu a příslušné množství enzymu. Reakce se nechá probíhat 30 minut při 20 °C. Reakce se zastaví přidáním 0,2 ml 1M HC1. Množství vytvořeného benzamidu v reakční směsi bylo stanoveno HPLC. Jako kontrola se používá reakční směs získaná stejným postupem, jak shora popsáno z E. coli TG-l. Hladiny nitril-hydratázy v bezbuněčných extraktech E. coli, obsahujících pNHJlOH a pNHJ20L, byly 1,75.10 3 a 6,99.10-3 jednotek na mg při kultivování v médiu 2xYT za přítomnosti CoCL a IPTG. V reakční směsi s TG-l/pNHJ10H a pNHJ20L byl nalezen benzamid, zatímco v reakční směsi s TG-l žádný benzamid nebyl nalezen.
- II CZ 284048 B6

Claims (7)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Fragment DNA(H), kódující polypeptid, který má nitril-hydratázovou aktivitu, vyznačující se tím, že uvedený polypeptid obsahuje a(H)- a β(Η)- podjednotky s následující sekvencí aminokyselin:
    ίο a(H - podjednotka:
    10I 5
    MetSerGIuHisValAsnlysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr i 510
    LysAlalleGluThrLeuleuTyrGluArgGlyLeulleThrPro
    S «0<5
    AlaAlaValAspArgValValSerTyrlyrGIuAsnGlulleGly
    0 5 5n
    ProMetGlyGlyAlalysValValAlaLysSerTrpValAspPro ks ioi $
    GluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAlaThrAlaAlaMetAla
    B 0 8 59 0
    SerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHisGlnlIeSerAlaVal ♦ 5 10 919 5
    PheAsnAspSerGlnThrHisHisValValValCysThrLeuCys
    I1O tisI z o
    SerCysTyrProTrpProValLeuGlyleuProProAlaTrpTyr
    I Z 5 110(35
    LysSerřletGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgGIy
    9 I 4SISO
    ValLeuLysArgAspPheGlyPheAspIleProAspGluValGlu
    155 150105
    ValArgVaITrpAspSerSerSerGluíI e A r g T y r I leVallle
    0 17 5ISO
    ProGluArgProAlaGlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeu
    195 (90(95
    ThrLysLeuValSerArgAspSerMetIleGlyValSerAsnAla
    LeuThrProGInGluValI leVal β(Η - podjednotka:
    19 (5
    HetAspGlylleHisAspThrGIyGlyMetThrGlyTyrGIyPro
    Z 0 Z 5 30
    ValProTyrGlnLysAspGluProPhePheHisTyrGluTrpGlu
    5 4 0 «5
    GlyArgThrleuSerlleLeuThrTrpUetHisLeuLysCIylle
    55oo
    SerTrpTrpAspLysSerArgPhePheArgGIuSerMetGlyAsn
    5 7 0 7$
    GluAsnTyrValAsnGlulleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrp
    0 9 5 99
    LeuSerAlaAlaGluArgl leleuValAlaAspLysl lei leThr
    - 12CZ 284048 B6 ♦ s u« tes
    GIuGluGluArgLysHisArgValGlnGlulleLeuGluGlyArg i i o tis t z a
    TyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaGlnlle
    I ZS 11« i 3 $
    GluLysAlalleGluArgLeullisGluProHtsSerLeuAIaleu
    0 I 4 5I S 0
    ProGlyAlaGluProSerPheSerLeuGlyAspLyslleLysVal > s s I »«| « s
    LysSerMetAsnProLeuGlyHisThrArgCysProLysTyrVal iio i 1 si a o
    ArgAsnLysIleGlyGlulleValAlaTyrHisGlyCysGInlle a s i a ai ? s
    TyrProGluSerSerSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgPro zoo zoszio
    LeuTyrThrValAlaPheSerAlaGlnGluLeuTrpGlyAspAsp Z I S Z Z O Z z s
    GlyAsnGlyLysAspValValCysValAspLeuTrpGluProTyr
    Leu 1leSerA I a;
  2. 2. Fragment DNA(H) podle nároku l, vyznačující se tím, že obsahuje sekvence nukleotidů a(H)- a p(H)-podjednotek, kde DNA sekvence a(H-podjednotky znamená:
    li 30 <s
    GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC
    0 7 S 0 0
    AAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC gccgcggtcgacČgagtcgtttcgtactacgagaacgagatcggc
    CCGATGGGCGGTGCCAAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCT <» S Z I o z z s
    GAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCG z < o zss z ? a
    TCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCCGTC
    S 5 3 0 03 I S
    TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGT
    TCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTAC
    37S 39040S
    AAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGA
    Z 0 43S« S O
    GTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG
    46S 4804«S
    GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATC s i o s z ss « o
    CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG
    SSS S 7 OSSS
    ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG
    CTCACACCGCAGGAAGTGATCGTA
    - 13 CZ 284048 B6 a DNA sekvence β(Η)- podjednotky znamená:
    atggatggtatccÁcgacacacgcggcatgaccggatacggaccg gtcccctatcagaaggacgagcccttcttccactacgagtgggag ggtcggaccctgtcaattctgacttggatgcatctcaagggcata tcgtggtgggacaagtcgcggttcttcČgggagtcgatggggaac 1’5 2 10 2 2 5 gaaaactacgtcaacgagattcgcaactcgtactacacccactgg ctgagtgcggcagaacgtatcctcgtcgČcgacaagatcatcacČ 285 3003IS gaagaagagcgaaagcaccgtgtgcaagagatccttgagggtcgg
    330 1 4 S3 & 0 tacacggacaggaagccgtcgcggaagttcgatccggcccagatc
    375 3*0«OS gagaaggcgatcgaacggcttcacgagccccactccctagcgctt «20 «35«50 ccaggagcggagccgagtttctctctcggtgacaagatcaaagtg fc 5 480495 aagagtatgaacccgctgggacacacacggtgcccgaaatatgtg sto 525540
    CGGAACAAGATCGGGCAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC TATCCCGAGAGCAGCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG CTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGAC
    GGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTAC
    CTGATCTCTGCG
  3. 3. Rekombinantní DNA. obsahující ve vektoru DNA(H) podle nároků 1 a 2.
  4. 4. Transformant TGl/pNHJ10H /FERM BP-2777/, který je transformován rekombinantní DNA podle nároku 3.
  5. 5. Způsob přípravy nitril-hydratázy, vyznačující se tím, že se kultivuje transformant podle nároku 4 a z kultury se izoluje nitril-hydratáza.
  6. 6. Způsob přípravy amidů vybraných ze skupiny, zahrnující 4-pyridinkarboxamid, nikotinamid, 2-pyridinkarboxamid, benzamid, 2,6-difluorbenzamid, 2-thiofenkarboxamid, 2furankarboxamid, pyrazinamid, akrylamid, methakrylamid, krotonamid, acetamid a 3hydroxypropionamid, vyznačující se tím, že se aromatické nitrily, mající 4 až 10 atomů uhlíku v aromatické skupině, a alifatické nitrily, mající 2 až 6 atomů uhlíku, hydratují nitril-hydratázou, získanou z kultury transformantů podle nároku 4.
  7. 7. Způsob přípravy amidů vybraných ze skupiny, zahrnující 4-pyridinkarboxamid, nikotinamid, 2-pyridinkarboxamid, benzamid, 2,6-difluorbenzamid, 2-thiofenkarboxamid, 2- 14CZ 284048 B6 furankarboxamid, pyrazinamid, akrylamid, methakrylamid, krotonamid, acetamid a 3-hydroxypropionamid, vyznačující se tím, že se kultivuje transformant podle nároku 4 a aromatické nitrily, mající 4 až 10 atomů uhlíku v aromatické skupině, a alifatické nitrily, mající 2 až 6 atomů uhlíku, se hydratují výslednou kulturou izolovaných bakteriálních buněk, materiálem 5 z nich zpracovaným nebo fixovaným za vzniku odpovídajících amidů.
    výkresů
    - 15 CZ 284048 B6 : Met-Asp-íí 1y-11e~His-Asp-Leu-G1y G1y Arg A1 a-Leu -?-Pro~11e-Lys-Pro-G 1 u16
CS91531A 1990-02-28 1991-02-28 Fragment DNA kodující polypeptid s nitril-hydra tasovou aktivitou, transformant obsahující tento gen a způsob přípravy amidů použitím tohoto transformantu CZ284048B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4807890 1990-02-28
US08/028,463 US5731176A (en) 1990-02-28 1993-03-09 DNA fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS9100531A2 CS9100531A2 (en) 1991-10-15
CZ284048B6 true CZ284048B6 (cs) 1998-07-15

Family

ID=26388301

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ943170A CZ284017B6 (cs) 1990-02-28 1991-02-28 Fragment DNA(L), kodující polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou, transformant, obsahující tento gen a způsob přípravy nitril-hydratasy a amidů použitím tohoto transformantu
CS91531A CZ284048B6 (cs) 1990-02-28 1991-02-28 Fragment DNA kodující polypeptid s nitril-hydra tasovou aktivitou, transformant obsahující tento gen a způsob přípravy amidů použitím tohoto transformantu

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ943170A CZ284017B6 (cs) 1990-02-28 1991-02-28 Fragment DNA(L), kodující polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou, transformant, obsahující tento gen a způsob přípravy nitril-hydratasy a amidů použitím tohoto transformantu

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5731176A (cs)
EP (1) EP0445646B1 (cs)
JP (1) JP3162091B2 (cs)
KR (1) KR950002004B1 (cs)
CN (1) CN1054639C (cs)
AT (1) ATE138101T1 (cs)
AU (1) AU627648B2 (cs)
CA (1) CA2037291C (cs)
CZ (2) CZ284017B6 (cs)
DE (1) DE69119454T2 (cs)
DK (1) DK0445646T3 (cs)
ES (1) ES2089044T3 (cs)
FI (1) FI102539B (cs)
MX (1) MX193790B (cs)
NO (1) NO306684B1 (cs)
PL (1) PL166201B1 (cs)
RU (1) RU2081173C1 (cs)
SK (1) SK280199B6 (cs)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2907479B2 (ja) * 1990-02-28 1999-06-21 輝彦 別府 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体及びアミド類の製造法
DE69231939T2 (de) * 1991-03-04 2002-04-04 Mitsubishi Rayon Co Hybrid-Plasmid-Vektoren, die für Nitril-abbauende Enzyme kodierende Gene enthalten und Verfahren zur Herstellung von Amiden und Säuren
AU3692593A (en) * 1992-04-28 1993-11-04 Mitsubishi Kasei Corporation Novel protein having nitrile hydratase activity and the gene encoding the same, and a method for producing amides from nitriles via a transformant containing the gene
JP3828590B2 (ja) * 1994-10-03 2006-10-04 昌 清水 ニトリルヒドラターゼ遺伝子発現のための調節遺伝子
JP3154633B2 (ja) * 1994-12-28 2001-04-09 三菱レイヨン株式会社 ニトリラーゼ遺伝子発現のための調節因子およびその遺伝子
WO1997012964A2 (en) * 1995-10-06 1997-04-10 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragments encoding stereospecific nitrile hydratase and amidase enzymes and recombinant microorganisms expressing those enzymes useful for the production of chiral amides and acides
CN1243825C (zh) * 1996-02-14 2006-03-01 三井化学株式会社 新型腈水合酶
US5866379A (en) * 1997-01-28 1999-02-02 Novus International Enzymatic conversion of α-hydroxynitriles to the corresponding .alpha.
FR2770214B1 (fr) * 1997-10-24 1999-12-31 Rhodia Chimie Sa Procede de preparation d'un benzamide halogene
JP2000050866A (ja) * 1998-08-06 2000-02-22 Rikagaku Kenkyusho ニトリルヒドラターゼの生産方法
JP4185607B2 (ja) 1998-12-15 2008-11-26 ダイセル化学工業株式会社 新規な微生物及びアミド化合物の製造方法
ATE450607T1 (de) * 1999-10-26 2009-12-15 Showa Denko Kk Rhodococcus-stamm, nitrilase-gen aus rhodococcus, nitrilhydratas-gen und amidase-gen und verfahren zur herstellung carboxylsäuren unter deren verwendung
KR100547080B1 (ko) 2000-12-20 2006-01-31 다이야니트릭스 가부시키가이샤 미생물 촉매를 이용한 아미드 화합물의 제조 방법
HU229283B1 (en) * 2001-01-09 2013-10-28 Lonza Ag Microbiological method for producing amides
JP2002325587A (ja) * 2001-03-02 2002-11-12 Daicel Chem Ind Ltd ニトリルヒドラターゼ、およびアミドの製造方法
JP2004194588A (ja) 2002-12-19 2004-07-15 Mitsui Chemicals Inc 新規なニトリルヒドラターゼ
WO2004067738A2 (en) * 2003-01-27 2004-08-12 Degussa Ag Nitrile hydratases from rhodococcus erythropolis and their application
EP1689861B1 (en) * 2003-12-02 2011-11-09 Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited Strain of rhodococcus rhodochrous ncimb 41164 and its use as producer of nitrile hydratase
EP1767624B1 (en) * 2004-05-26 2013-11-06 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Improved nitrile hydratase
JP2006187257A (ja) 2005-01-07 2006-07-20 Daiyanitorikkusu Kk アミド化合物の製造方法およびアクリルアミド系ポリマー
EP1842907A1 (en) 2006-04-07 2007-10-10 B.R.A.I.N. Ag A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity
JP5120852B2 (ja) * 2006-07-06 2013-01-16 国立大学法人 筑波大学 新規タンパク質複合体、該タンパク質複合体を用いたコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ、及び該ニトリルヒドラターゼを用いた方法
WO2008056827A1 (en) 2006-11-09 2008-05-15 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Process for production of betaine
AU2012264058B2 (en) 2011-05-31 2015-10-22 Mitsubishi Chemical Corporation Improved nitrile hydratase
CN104531654B (zh) * 2011-06-07 2018-06-12 三菱化学株式会社 改良型腈水合酶
FR3002542B1 (fr) * 2013-02-28 2016-01-22 Servier Lab Procede de synthese enzymatique de l'acide (7s) 3,4-dimethoxybicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene 7-carboxylique et application a la synthese de l'ivabradine et de ses sels
CN116536293A (zh) 2014-06-06 2023-08-04 三菱化学株式会社 改良型腈水合酶
WO2018085493A1 (en) * 2016-11-04 2018-05-11 Georgia State University Research Foundation, Inc. Endotoxin free asparaginase
JPWO2022172880A1 (cs) 2021-02-10 2022-08-18
CN114934006A (zh) * 2022-06-02 2022-08-23 无锡新晨宇生物工程有限公司 一种腈水合酶催化乙腈生成乙酰胺的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD274631A5 (de) * 1987-09-18 1989-12-27 Kk Verfahren zur biologischen herstellung von amiden
JP2840253B2 (ja) * 1988-07-06 1998-12-24 輝彦 別府 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法

Also Published As

Publication number Publication date
ATE138101T1 (de) 1996-06-15
CS9100531A2 (en) 1991-10-15
NO910797L (no) 1991-08-29
EP0445646A2 (en) 1991-09-11
EP0445646A3 (en) 1992-01-08
MX193790B (en) 1999-10-19
KR950002004B1 (ko) 1995-03-08
RU2081173C1 (ru) 1997-06-10
NO306684B1 (no) 1999-12-06
EP0445646B1 (en) 1996-05-15
CA2037291A1 (en) 1991-08-29
PL166201B1 (pl) 1995-04-28
CN1054639C (zh) 2000-07-19
FI102539B1 (fi) 1998-12-31
PL289239A1 (en) 1992-03-23
AU7129391A (en) 1991-09-12
KR910021473A (ko) 1991-12-20
FI910960A0 (fi) 1991-02-27
US5731176A (en) 1998-03-24
DE69119454D1 (de) 1996-06-20
CZ284017B6 (cs) 1998-07-15
AU627648B2 (en) 1992-08-27
NO910797D0 (no) 1991-02-27
FI910960A (fi) 1991-08-29
CN1054616A (zh) 1991-09-18
CA2037291C (en) 2001-07-24
DE69119454T2 (de) 1996-09-26
FI102539B (fi) 1998-12-31
JPH04211379A (ja) 1992-08-03
SK280199B6 (sk) 1999-09-10
JP3162091B2 (ja) 2001-04-25
DK0445646T3 (da) 1996-09-30
CZ317094A3 (cs) 1998-05-13
ES2089044T3 (es) 1996-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ284048B6 (cs) Fragment DNA kodující polypeptid s nitril-hydra tasovou aktivitou, transformant obsahující tento gen a způsob přípravy amidů použitím tohoto transformantu
US5922583A (en) Methods for production of recombinant plasmids
JP2840253B2 (ja) ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法
EP0719862B1 (en) A regulatory factor for expression of nitrilase gene and a gene thereof
US6730508B1 (en) Protein participating in the activation of nitrile hydratase and gene encoding the same
EP0444639B1 (en) A gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
US5648256A (en) Gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
EP0713914B1 (en) A regulatory gene for the expression of nitrile hydratase gene
US5314819A (en) Protein having nitrile hydratase activity obtained from rhizobium, gene encoding the same, and a method for producing amides from nitriles via a transformant containing the gene
ES2307746T3 (es) D-hidantoinasa de ochrobactrum anthropi&#39;.
US5753472A (en) DNA fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
US5789211A (en) Gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
US5830693A (en) Gene encoding a regulatory factor involved in activating expression of the nitrilase gene promoter
RU2173708C2 (ru) Фрагмент днк, кодирующий полипептид с активностью нитрилгидратазы, рекомбинантная плазмидная днк рnhj20l, кодирующая полипептид, штамм escherichia coli tg1/рnhj20l, способ получения полипептида со свойствами нитрилгидратазы
JPH08205864A (ja) 新規セファロスポリンｃアシラーゼおよびその製造方法
EP0394479A1 (en) Gene coding for tyrosine phenol-lyase and its utilization
JPH0272878A (ja) 組換えｄｎａ、それを含む形質転換体及びそれを用いたグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法
JPH0928382A (ja) 構成的にニトリラーゼを産生する微生物、構成化に関わる調節因子およびその遺伝子
JP2005151999A (ja) ニトリルヒドラターゼ遺伝子発現のための調節遺伝子
JPH0568551A (ja) 新規なｇｌ−７ａｃａアシラーゼ

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20110228