JPH0928382A - 構成的にニトリラーゼを産生する微生物、構成化に関わる調節因子およびその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】培地に誘導物質を添加せずに高収量でニトリラ
ーゼを産生する微生物の探索。 【解決手段】培養時に培地へ誘導物質を添加することな
く構成的にニトリラーゼを産生する微生物、構成化に関
わる調節因子およびその遺伝子ＤＮＡ、ならびに構成化
に関わる調節因子をコードするＤＮＡ、ロドコッカス属
に属する菌株細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域、ある
いはさらにプロモーター・オペレーター領域を含むニト
リラーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミドによる。 【効果】工業的規模での菌体の培養において、培地の調
製が容易であり、また、培養液の廃水処理においては負
荷を低減できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ニトリラーゼを構
成的に産生する微生物に関する。ニトリラーゼはニトリ
ル類を加水分解して対応する酸類を生成させる酵素とし
て知られており、有機酸類を製造する触媒として工業的
に有用である。

【０００２】

【従来の技術】ニトリラーゼ酵素活性を有する微生物と
しては、例えばバチルス (Bacillus)属）、バクテリジ
ウム (Bacteridium)属、ミクロコッカス (Micrococcus)
属およびブレビバクテリウム (Brevibacterium) 属〔特
公昭58-15120号公報参照〕、アシネトバクター (Acinet
obacter)属〔特公昭63-2596 号公報参照〕、コリネバク
テリウム (Corynebacterium)属〔特公昭63-5680 号公報
参照〕、アルカリゲネス(Alcaligenes)属〔特開平1-132
392号公報参照〕およびロドコッカス (Rhodococcus)属
〔特開平3-251192号公報参照〕等に属する細菌が知られ
ている。

【０００３】しかし、このうち特公昭58-15120号公報記
載の方法では、その酵素活性が低く実用的ではない。そ
こで、微生物のニトリラーゼ酵素活性を高めるために、
前記した特公昭63-2596 号公報等には、アセトニトリ
ル、イソブチロニトリルなどのニトリル化合物をニトリ
ラーゼ誘導物質として培地に添加して微生物の培養を行
う方法が提案されている。しかしながら、このような方
法では、微生物がこれら培地中に添加されたニトリル化
合物を培養中に資化するために、ニトリル化合物をその
消費に応じて培地に追加する必要があり、常に高い酵素
活性を有する菌体を得ることは難しい。また、一部のニ
トリル化合物は揮発性、引火性が強く、また著しい悪臭
を放つものもあり、工業的規模において培養することは
困難である。特開平3-251192号公報では、ラクタム化合
物を添加した培地でロドコッカス属細菌を培養すること
によりニトリラーゼ酵素活性を有する菌体を製造する方
法が提案されている。この方法では、培養液中のラクタ
ム化合物はほとんど資化されず一定濃度を保つためにニ
トリラーゼ酵素の誘導効果が安定している点で優れてい
る。しかし、培地調製の簡易さおよび培養液の廃水処理
を考慮した場合、培地に何ら誘導物質を添加することな
しに高収量でニトリラーゼ活性菌体を調製し得る方法の
開発が望まれていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、培地に何ら誘導物質を添加することなしに高収量で
ニトリラーゼ産生し得る微生物を探索することを課題と
する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ニトリラ
ーゼ酵素活性を有する微生物の培養において、培地に何
ら誘導物質を添加することなしに高収量でニトリラーゼ
活性菌体を調製する方法について鋭意検討した結果、変
異処理をした微生物の中から選別された菌株がニトリラ
ーゼ酵素を構成的に生成することを見い出した。さら
に、ニトリラーゼ発現に関わる調節因子遺伝子内に構成
化に関わる変異が起こっていることを見い出し、本発明
を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、以下の（１）〜
（４）を要旨とするものである。 （１）培養時に培地へ誘導物質を添加することなくニト
リラーゼを産生する微生物。 （２）ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作
用をもち、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドおよび配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドの２成分より成る構成化に関わる調節因子およびそ
の遺伝子ＤＮＡ。 （３）上記構成化に関わる調節因子をコードするＤＮＡ
およびロドコッカス属に属する菌株細胞内で複製増殖可
能なＤＮＡ領域、あるいはさらにプロモーター・オペレ
ーター領域を含むニトリラーゼ遺伝子を含む組換え体プ
ラスミド。 （４）上記組換え体プラスミドにより形質転換された形
質転換微生物。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の培養時に培地へ誘導物質
を添加することなくニトリラーゼを産生する微生物は、
例えば、ロドコッカス属に属する微生物に変異処理した
ものの中からニトリラーゼを構成的に生成するものとし
て選別されたものを挙げることができる。変異処理方法
は特に限定されるものではなく、例えば、物理的変異源
としてＸ線や紫外線、化学的変異源としてエチルメタン
スルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグ
アニジン（ＮＴＧ）、亜硝酸やアクリジン系色素などを
利用することができる。変異処理を行うロドコッカス属
に属する微生物としては、ニトリラーゼを産生する能力
を有するものであれば特に限定されるものではなく、例
えば、ロドコッカス エスピー (Rhodococcus sp.)ＳＫ
９２株〔微工研条寄第3324号(FERM BP-3324)〕を、ま
た、変異株としては、該ＳＫ９２株の変異処理に係るロ
ドコッカス エリスロポリス (Rhodococcus erythropol
is) ＳＫ９２−Ｂ１株(FERM P-14853)を挙げることがで
きる。ＳＫ９２株はその菌学的性質よりロドコッカス属
と同定されていたが（特開平3-280889号公報参照）、さ
らに、以下の詳細な菌学的な性質より、ロドコッカス
エリスロポリス (Rhodococcuserythropolis) と同定さ
れた。

【０００８】 ＳＫ９２株 試験項目 試験結果 アデニン分解 ＋ チロシン分解 ＋ 尿素分解 ＋ 資化性 イノシトール ＋ マルトース − マンニトール ＋ ラムノース − ソルビトール ＋ m-ヒドロキシ安息香酸ナトリウム − 安息香酸ナトリウム ＋ クエン酸ナトリウム ＋ 乳酸ナトリウム ＋ テストステロン ＋ アセトアミド ＋ ピルビン酸ナトリウム ＋ 0.02% アジ化ナトリウム存在下での生育 ＋ 10℃での生育 ＋ 40℃での生育 − 0.001%クリスタルバイオレット存在下での生育 − 0.3%フェニルエタノール存在下での生育 − 5%NaCl存在下での生育 ＋ 7%NaCl存在下での生育 ＋

【０００９】本発明における構成化に関わる調節因子に
ついては、それをコードする遺伝子ＤＮＡを細菌細胞内
で複製増殖可能なＤＮＡ領域を含むベクタープラスミド
に組み込むことにより用いることができる。すなわち、
こうして作製した組換え体プラスミドをニトリラーゼを
誘導的に産生する微生物（例えば、ロドコッカス エリ
スロポリス ＳＫ９２株）に導入することにより、ニト
リラーゼを構成的に著量産生する組換え体微生物を作製
することができる。また、構成化に関わる調節因子をコ
ードするＤＮＡ、プロモーター・オペレーター領域を含
むニトリラーゼ遺伝子を上記ベクタープラスミドに導入
することにより組換え体プラスミドを作製し、これをニ
トリラーゼ非産生微生物（例えば、ロドコッカス ロド
クロウスATCC 12674 株）に導入すれば、ニトリラーゼ
を構成的に著量産生する組換え体微生物が作製できる。

【００１０】ここで用いるベクタープラスミドとして
は、ロドコッカス属細菌細胞内において複製増殖可能な
ものであれば何でもよく、例えば、複合プラスミドベク
ターｐＫ１、ｐＫ２、 ｐＫ３およびｐＫ４が挙げられ
る。これらのプラスミドは、ロドコッカス ロドロウス
ATCC 12674 に導入され、 R. rhodochrous ATCC 12674/
pK1(FERM BP-3728)、 R. rhodochrous ATCC 12674/pK2(F
ERM BP-3729)、 R. rhodochrous ATCC 12674/pK3(FERM B
P-3730) および R. rhodochrous ATCC 12674/pK4(FERM
BP-3731)として工業技術院 生命工学工業技術研究所に
寄託されている（特開平5-68556 号公報参照）。

【００１１】また、ロドコッカス属に属する細菌細胞内
で複製増殖可能なDNA 領域としては、例えば、プラスミ
ドｐＲＣ００１、 ｐＲＣ００２、 ｐＲＣ００３およびｐ
ＲＣ００４から選ばれるプラスミド由来のものが用いら
れ、これらはプラスミド全体であってもよく、あるいは
断片でもよい。上記プラスミドは、それぞれロドコッカ
ス ロドクロウス ATCC 4276 、 ATCC 14349、 ATCC 1434
8 およびIFO 3338株由来である（特開平5-68556 号公報
参照）。

【００１２】後記、ＳＫ９２株由来のニトリラーゼ遺伝
子および調節遺伝子を含むプラスミドｐＳＫ１０６は、
これを含有する形質転換体 E. coli JM109/pSK106(FERM
P-14856) として、 ＳＫ９２−Ｂ１株由来のニトリラー
ゼ遺伝子および調節遺伝子を含むプラスミドｐＢＳＫ２
０１は、これを含有する形質転換体 E. coli JM109/pBS
K201(FERM P-14855)として工業技術院 生命工学工業技
術研究所に寄託されている。

【００１３】以下、実施例により詳細に説明するが、本
発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

【実施例】

【００１４】実施例１ シュークロース２％(w/v) 、Hy-Soy (クウェストインタ
ーナショナル社製）０．５％(w/v) 、酵母エキス０．２
％(w/v) 、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．１％(w/v) 、Ｋ₂ＨＰＯ₄
０．１％(w/v) 、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．１％(w/v)
からなる液体培地(pH 7.2)を試験管に１０ｍｌ分注して
１２０℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。この培地
に、常法にてＮＴＧ処理したＳＫ９２株を植菌して３０
℃、１８時間振盪培養した。この培養液を適宜希釈し
て、シュークロース１％(w/v) 、クエン酸一水和物０．
１％(w/v) 、ベンゾニトリル０．０２％(w/v) 、ＫＨ₂
ＰＯ₄ ０．０５％(w/v) 、Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ０．１％(w/
v) 、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０５％(w/v) 、寒天
１．５％ (w/v)およびビタミン混液（チアミン・ＨＣ
ｌ、ニコチンアミド、リボフラビン、ピリドキシン、ｐ
−アミノ安息香酸各２ｍｇ／ｌ、パントテン酸・Ｃａ２
００ｍｇ／ｌ、葉酸、ビオチン各２ｍｇ）１％(v/v)か
らなるプレートに塗布した。このプレートを３０℃の恒
温槽に５日間置いたところ、大きなコロニーが出現した
ので、これをＳＫ９２−Ｂ１株として単離した。

【００１５】上記の液体培地を５００ｍｌ容三角フラス
コに１００ｍｌ分注した後、オートクレーブ滅菌し、こ
れにＳＫ９２−Ｂ１株を接種して３０℃にて２日間振盪
培養した。この培養液から遠心分離によって集菌した
後、培養液と同量の５０ｍＭＫＨ₂ ＰＯ₄ −Ｎａ₂ ＨＰ
Ｏ₄ 緩衝液(pH 7.7)で菌体を洗浄し、同量の同緩衝液に
菌体を懸濁した。

【００１６】ニトリラーゼ活性は次のようにして測定し
た。２００ｍＭアクリロニトリルを含む５０ｍＭＫＨ₂
ＰＯ₄ −Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 緩衝液(pH 7.7)０．５ｍｌ、５
０ｍＭＫＨ₂ ＰＯ₄ −Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 緩衝液(pH 7.7)
０．４５ｍｌからなる反応液に、前記菌体懸濁液０．０
５ｍｌを添加して３０℃、１５分間反応を行った。１Ｎ
塩酸０．２ｍｌを添加して反応を止めた後、遠心分離で
菌体を取り除き、反応液中に生成したアクリル酸をＨＰ
ＬＣによって定量した（和光純薬工業社製 Wakosil 5C8
カラム使用）。その結果、１ｍｌ反応液中に１０．６μ
ｍｏｌのアクリル酸が生成していた。

【００１７】比較例１ ＳＫ９２株を実施例１と同様に培養してニトリラーゼ活
性を測定したが、アクリル酸の生成は認められなかっ
た。

【００１８】実施例２ ＳＫ９２−Ｂ１株における変異箇所の同定 （１）ＳＫ９２−Ｂ１株染色体ＤＮＡの調製 ＳＫ９２−Ｂ１株を１００ｍｌのＭＹ培地（０．５％ポ
リペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％
バクトモルトエキス）中、３０℃にて７２時間振盪培養
した後集菌し、この菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液
（０．１ＭＥＤＴＡ、０．１５ＭＮａＣｌ(pH 8.0)４ｍ
ｌに懸濁し、リゾチーム８ｍｇを加えて３７℃で１〜２
時間振盪した後凍結した。次に、１０ｍｌのＴｒｉｓ−
ＳＤＳ液（１％ＳＤＳS 、０．１ＭＮａＣｌ、０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH 9.0)）を穏やかに振盪しながら加
え、さらに、プロテイナーゼＫ（メルク社）（終濃度
０．１ｍｇ) を加え３７℃で１時間振盪後、さらに、６
０℃で振盪した。次に、等量のＴＥ飽和フェノールを加
え撹拌後（ＴＥ：１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ(pH 8.0)) 遠心し、上層をとり２倍量のエタノー
ルを加えたのち、ガラス棒でＤＮＡを巻きとり、９０
％、８０％、７０％のエタノールで順次フェノールを取
り除いた。次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解さ
せ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃、１５分間の加
熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるよう加え３７℃で３
０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫを加え３７
℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを
加え撹拌後、遠心し上層と下層に分離させた。上層につ
いて、この操作を２回繰り返した後、同量のクロロホル
ム（４％イソアミルアルコール含有）を加え同様の抽出
操作を繰り返した（以後、この操作をフェノール処理と
呼ぶ）。その後、上層に２倍量のエタノールを加えガラ
ス棒でＤＮＡを巻きとり回収し、染色体ＤＮＡ標品を得
た。

【００１９】（２）ＤＮＡライブラリーの作製 ＳＫ９２株ニトリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片がｐＵ
Ｃ１１８ベクターに組み込まれたプラスミドｐＳＫ００
２（特願平6-337652号明細書参照）を制限酵素ＳａｌＩ
で切断後、１．１ｋｂのＳａｌＩ断片を０．７％アガロ
ース電気泳動により分離し、ゲルより切り出し回収し
た。制限酵素による切断は以下のように行った。

【００２０】１０μｌのｐＳＫ００２に対し、１０倍濃
度制限酵素緩衝液１０μｌ、滅菌水７８μｌ、制限酵素
ＳａｌＩ２μｌを加え３７℃にて２時間反応させた。Ｓ
Ｋ９２−Ｂ１株染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩにより切断し
た標品についてアガロース電気泳動を行った。プラスミ
ドｐＳＫ００２由来の１．１ｋｂＳａｌＩ断片をDIGDNA
Labeling Kit（ベーリンガー・マンハイム株式会社）
を用いて標識し、これをプローブとしてサザンハイブリ
ダイゼーション法（Southern E.M.,Mol.Bionl.98 503(1
975)）により約１４ｋｂのＤＮＡ断片を検出した。プロ
ーブとハイブリダイズした１４ｋｂＥｃｏＲＩ断片を含
むＤＮＡ断片画分をアガロースゲルより切り出し、Ｅｃ
ｏＲＩで切断した複合プラスミドベクターｐＫ４〔ロド
コッカス属プラスミドｐＲＣ００４と大腸菌ベクターｐ
ＨＳＧ２９９を連結させたもの（特開平5-64589 号およ
び同5-68566 号公報参照）〕へ挿入した。

【００２１】ベクターに用いたｐＫ４断片は次のように
作製した。１０μｌのｐＫ４に対し、１０倍濃度制限酵
素緩衝液１０μｌ、滅菌水７７μｌ、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ２μｌを加え３７℃で２時間反応させた。フェノール
処理、エタノール沈澱させた後乾燥して５０μｌの滅菌
水に溶解した。さらに、アルカリフォスタファーゼ（宝
酒造株式会社）により、５’末端を脱リン酸化し、フェ
ノール処理、エタノール沈澱を行い乾燥後滅菌水に溶解
した。脱リン酸化反応は標品５０μｌにアルカリフォス
タファーゼ１μｌ、１０倍濃度緩衝液１０μｌ滅菌水３
９μｌを加え６５℃で１５分間行った。

【００２２】プローブとハイブリダイズした１４ｋｂＥ
ｃｏＲＩ断片を含むＤＮＡ断片画分１μｌを、上記のよ
うに調製したＥｃｏＲＩ切断ｐＫ４とライゲーションキ
ット（宝酒造株式会社）を用いて４℃で一晩反応させる
ことによりｐＫ４への挿入を行い、ＤＮＡライブラリー
とした。

【００２３】（３）形質転換体の作製および組換え体Ｄ
ＮＡの選別 大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１．０％バクトトリプ
トン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣ
ｌ）１ｍｌに接種し３７℃で５時間前培養し、この培養
物１００μｌを５０ｍｌのＳＯＢ培地（２％バクトトリ
プトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭＮａ
Ｃｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＳＯ₄ 、１ｍＭＭ
ｇＣｌ₂ ）に加え、１８℃で２０時間培養した。遠心に
より集菌した後、１３ｍｌの冷ＴＦ溶液（２０ｍＭＰＩ
ＰＥＳ−ＫＯＨ(pH 6.0)、２００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ
ＣａＣｌ₂ 、４０ｍＭＭｎＣｌ₂ ）に懸濁し、０℃で１
０分放置後、再度遠心した。上澄を除いた後、沈澱した
大腸菌を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌ
のジメチルスルホキシドを加え０℃で１０分間放置し
た。こうして作製したコンピテントセル２００μｌに工
程（２）で作製した組換え体プラスミドを含有する溶液
（ＤＮＡライブラリー）を１０μｌ加え、０℃で３０分
放置後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与え０℃で
２分間冷却後、ＳＯＣ培地（２％バクトトリプトン、
０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭＮａＣｌ、
２．５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＳＯ₄ 、１ｍＭＭｇＣｌ
₂ 、２０ｍＭグルコース）を０．８ｍｌ加え３７℃にて
６０分間振盪培養した。培養液２００μｌをアンピシリ
ン１００μｇ／ｍｌ含有のＬＢ寒天培地に塗布し、３７
℃で一晩培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コ
ロニーについて、コロニーハイブリダイゼーション法に
てニトリラーゼ遺伝子をもつ形質転換体を選別した。す
なわち、寒天培地上に生育した形質転換体をナイロンメ
ンブレン（バイオダインＡ：日本ポール株式会社）上に
移し、菌体を溶かしてＤＮＡを固定した後、これを工程
（２）で作製したプローブ（１．１ｋｂ断片）で処理
し、DIG Luminescent Detection Kit （ベーリンガー・
マンハイム株式会社）を用い、目的の組換え体ＤＮＡを
含むコロニーを選択した。

【００２４】（４）組換え体プラスミドの調製 工程（３）で選択した形質転換体を１００ｍｌのＬＢ培
地にて３７℃で一晩培養し、集菌後滅菌水により洗浄
し、溶液Ｉ（２ｍＭグルコース、１０ｍＭＥＤＴＡ、２
５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(pH 8.0)）を５ｍｌ、リゾチー
ムを２５ｍｇ加え、０℃で３０分間放置した。溶液II
（１ＮＮａＯＨ、５％ＳＤＳ）を１０ｍｌ加え０℃で５
分間放置し、溶液III （３Ｍ酢酸ナトリウム(pH 4.8)）
を７．５ｍｌ加え０℃で３０分間放置した。これを遠心
し、その上澄みに５０ｍｌのエタノールを加えさらに遠
心し上清を取り除き５ｍｌの溶液IV（１０ｍＭ酢酸ナト
リウム、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(pH 8.0)）とリボヌ
クレアーゼＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を２．５μｌ加え
室温で２０分間放置した。これに１２ｍｌのエタノール
を加え遠心後沈澱したプラスミドを乾燥し滅菌水に溶解
した。こうして得られたプラスミドをｐＢＳＫ２０１と
命名した。

【００２５】（５）ロドコッカス属細菌の形質転換およ
び形質転換体のニトリラーゼ活性 ロドコッカス ロドクロウス ATCC 12674 株の対数増殖
期の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅菌水にて
３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。工程（４）で得られた
プラスミドｐＢＳＫ２０１１μｌと菌体懸濁液１０μｌ
を混合し、氷冷した。チャンバーにＤＮＡと菌体の混合
液を入れ、遺伝子導入装置ＣＥＴ−２００型（日本分
光）により電場強度３．８ｋＶ／ｃｍ、パルス幅１ｍ
ｓ、パルス回数２０回で電気パルス処理を行った。電気
パルス処理液を氷冷下１０分間静置し、３７℃で、１０
分間ヒートショックを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリ
ペプトン、０．３％バクトモルトエキス、０．３％バク
トイーストエキス、０．２％ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．２％Ｋ
₂ ＨＰＯ₄ ）５００μｌを加え、２６℃、３時間振盪培
養した後、７５μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天
培地に塗布し２６℃、３日間培養した。

【００２６】こうして作製したロドコッカス属細菌組換
え体をＭＹＫ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有）
１０ｍｌに接種し、３０℃で２４時間前培養した。この
培養物１ｍｌを１００ｍｌの培地（１．５％グルコー
ス、０．１％バクトイーストエキス、１．０％グルタミ
ン酸ナトリウム、０．０５％ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．０５％
Ｋ₂ ＨＰＯ₄ 、０．０５％硫酸マグネシウム、７５μｇ
／ｍｌカナマイシン含有(pH 7.2)）に加え、３０℃で４
８時間培養した。遠心分離により集菌し、培養液と同量
の５０ｍＭＫＨ₂ ＰＯ₄ −Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 緩衝液(pH 7.
7)で菌体を洗浄した。その後、同量の同緩衝液に菌体を
懸濁しニトリラーゼ活性を測定した。

【００２７】ニトリラーゼ活性は次のように測定した。
２００ｍＭアクリロニトリルを含む５０ｍＭＫＨ₂ ＰＯ
₄ −Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 緩衝液(pH7.7) ０．５ｍｌ、５０ｍ
ＭＫＨ₂ ＰＯ₄ −Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 緩衝液(pH7.7) ０．４
５ｍｌからなる反応液に、前記菌体懸濁液０．０５ｍｌ
を添加して３０℃、２０分反応させた。１Ｎ塩酸０．２
ｍｌを添加して反応を止めた後、遠心分離で菌体を取り
除き、反応液中に生成したアクリル酸をＨＰＬＣによっ
て定量した（和光純薬工業社製 Wakosil５Ｃ８カラム使
用）。その結果、ロドコッカス属細菌組換え体ATCC1267
4/pBSK201 では、１ｍｌの反応液中に１１．９μｍｏｌ
のアクリル酸が生成していた。このことから、ＳＫ９２
−Ｂ１株同様、活性発現の構成化が起こっていることが
確認された。また、ＳＫ９２−Ｂ１株はＳＫ９２株の１
４ｋｂＥｃｏＲＩ断片上で変異が起こっていることが明
らかになった。

【００２８】（６）欠失プラスミドとニトリラーゼ活性 親株由来のプラスミドｐＳＫ１０６の調節因子をコード
する遺伝子を含む領域（約３ｋｂＥｃｏＲＶ断片）（特
願平6-337652号明細書参照）を、ＳＫ９２−Ｂ１株由来
のプラスミドｐＢＳＫ２０１の調節因子をコードする遺
伝子を含む領域（約３ｋｂＥｃｏＲＶ断片）とを置き換
えたプラスミドｐＢＳＫ３０１、ｐＢＳＫ３０２を作製
し（これらのプラスミドは、ＳＫ９２−Ｂ１株由来のプ
ラスミドｐＢＳＫ２０１の調節因子をコードする遺伝子
を含む領域（約３ｋｂＥｃｏＲＶ断片）の向きが異なっ
ている）、工程（５）と同様にしてニトリラーゼ活性を
測定した。ｐＢＳＫ３０１およびｐＢＳＫ３０２の作製
は次のように行った。

【００２９】ｐＳＫ１０６、 ｐＢＳＫ２０１をそれぞれ
１０μｌに対し１０倍濃度制限酵素緩衝液１０μｌ、滅
菌水７７μｌ、制限酵素ＥｃｏＲＶ２μｌを加え３７℃
で２時間反応後、エタノール沈澱によりＤＮＡ断片を回
収し、アガロース電気泳動により分離した。それぞれ約
１１ｋｂおよび３ｋｂのＤＮＡ断片をＤＮＡ ＰＲＥＰ
（株式会社ダイアヤトロン）を用いて回収した。これら
のＤＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造株式会
社）を用いて４℃で一晩反応させた。これを工程（３）
同様形質転換させ、寒天培地上に生育した形質転換体コ
ロニーについて工程（２）で作製したプローブ（１．１
ｋｂ断片）を用いてコロニーハイブリダイゼーションを
行い目的の形質転換体を選別した。

【００３０】また、同様にｐＳＫ１０６の５．３ｋｂＢ
ｇｌII断片とｐＢＳＫ２０１の５．３ｋｂＢｇｌII断片
を置き換えたプラスミドｐＢＳＫ３０４およびｐＢＳＫ
３０１より約２ｋｂＮｃｏＩ断片（ｐＢＳＫ２０１由来
断片上）を取り除いたプラスミドｐＢＳＫ３０３を作製
し、ＭＹＫ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有）で
培養した組換え体についてニトリラ−ゼ活性を測定し
た。

【００３１】

【００３２】その結果、ATCC 12674/pBSK301、ATCC 126
74/pBSK302においてＳＫ９２−Ｂ１株と同等レベルのニ
トリラーゼ活性が認められた。一方、ATCC 12674/pBSK3
03、ATCC 12674/pBSK304においてはニトリラーゼ活性が
認められなかった。これらの結果より、構成化に関わる
変異は、ニトリラーゼ遺伝子発現の調節因子をコードす
る遺伝子内で起こっていることが明らかになった。

【００３３】（７）塩基配列の決定 工程（６）で明かになった変異が起こっている領域の塩
基配列を、ファルマシア社蛍光シーケンサーＡＬＦＩＩ
を用いて決定した。その結果、配列番号５に示される塩
基配列（この配列中には、配列番号３および４で示され
る２つのオープンリーディングフレームが存在し、その
アミノ酸配列はそれぞれ配列番号１および２で示され
る。）が得られ、変異は1344番目（配列番号４の 613番
目）のＧからＡへの置換によるものであることが明らか
となった。この置換により、配列番号２に示されるよう
に、ＳＫ９２株における２０５番目のアミノ酸アラニン
がＳＫ９２−Ｂ１株ではスレオニンに置きかわってい
た。

【００３４】実施例３ 変異型調節因子を導入したＳＫ９２株におけるニトリラ
ーゼの構成化 （１）変異型調節因子を含む領域およびロドコッカス属
において複製可能なベクタープラスミドからなる組換え
体プラスミドの作製 ｐＢＳＫ３０１を制限酵素ＥｃｏＲＶで切断した。ｐＢ
ＳＫ３０１１０μｌに対し１０倍濃度制限酵素緩衝液１
０μｌ、滅菌水７８μｌ、制限酵素ＥｃｏＲＶ２μｌを
加え３７℃にて２時間反応させ、フェノール処理、エタ
ノール沈澱を行ない乾燥して滅菌水に溶解した。このよ
うに調製したＥｃｏＲＶ切断ｐＢＳＫ３０１を、リンカ
ーＥｃｏＲＩ（５’末端リン酸化済み、宝酒造株式会
社）とライゲーションキットを用いて４℃で一晩反応さ
せたのち、７０℃で１０分間処理させエタノール沈澱に
よりＤＮＡを回収し滅菌水に溶解した。この標品をＥｃ
ｏＲＩで切断した後、アガロース電気泳動により分離
し、３．０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をＤＮＡ ＰＲＥＰ
（株式会社ダイアヤトロン）を用いて回収した。このＤ
ＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造株式会社）を
用いて複合プラスミドベクターｐＫ４のＥｃｏＲＩ部位
に挿入した。（ライゲーションに用いたｐＫ４断片の作
製は実施例１工程（２）参照）

【００３５】（２）組換え体プラスミドの調製 工程（１）で作製した組換え体プラスミドを含有する溶
液を実施例１工程（３）同様形質転換させ、寒天培地上
に生育した形質転換体コロニーについてコロニーハイブ
リダイゼーション法にて目的の形質転換体を選別した。
プローブには、ｐＢＳＫ３０１を制限酵素ＥｃｏＲＶで
切断し切り出した３．０ｋｂ断片を用いた。選別した形
質転換体のプラスミドの調製を、実施例１工程（４）同
様に行った。

【００３６】（３）ロドコッカス属細菌の形質転換およ
び形質転換体のニトリラーゼ活性 ロドコッカスエリスロポリスＳＫ９２株の対数増殖期の
細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回
洗浄し、滅菌水に懸濁した。工程（２）で調製したプラ
スミドｐＢＳＫ２０５１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混
合し、氷冷した。チャンバーにＤＮＡと菌体の混合液を
入れ、ジーンパルサー（バイオラッド社）により、電場
強度２５ｋＶ／ｃｍ、静電容量２５μＦ、抵抗１００オ
ームで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷
冷下１０分間静置し、３７℃で、１０分間ヒートショッ
クを行い、ＭＹＫ培地５００μｌを加え、２６℃、一晩
振盪した。７５μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天
培地に塗布し２６℃、３日間培養した。

【００３７】こうして作製したロドコッカス属細菌組換
え体をＭＹＫ培地（５０μg/mlカナマイシン含有）１０
ｍｌに接種し３０℃で２４時間前培養し、この培養物１
ｍｌを培地１００ｍｌ（２％サッカロース、０．５％ポ
リペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．１％
ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．１％Ｋ₂ ＨＰＯ₄ 、０．１％硫酸マ
グネシウム(pH 7.2)）（５０μg/mlカナマイシン含有）
に加え、３０℃で６５時間培養した。集菌後、培養液と
同量の５０ｍＭＫＨ₂ ＰＯ₄ −Ｎａ₂ ＨＰＯ₄緩衝液(pH
7.7) で菌体を洗浄し、同量の同緩衝液に菌体を懸濁
し、実施例工程（５）に記したようにニトリラーゼ活性
を調べたところ、１１．５μｍｏｌのアクリル酸生成が
認められた。このことより、ＳＫ９２株にＳＫ９２−Ｂ
１株由来の変異型調節因子を導入することによりニトリ
ラーゼ発現の構成化が起こることが明らかになった。

【００３８】

【発明の効果】本発明の微生物は、培地に何ら誘導物質
を添加することなしに高収量でニトリラーゼを産生する
ことが可能であり、したがって、工業規模での菌体の培
養においては、培地の調製が容易であり、また培養液の
廃水処理においても負荷を低減できる。

【００３９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２４４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：SK92−B1 配列： MetAlaGlyAlaAspValHisAlaGlnGlyGlyThrAsnArgArg 15 AlaArgIleLeuValValAspAspGluLysHisValArgThrMet 30 ValThrTrpGlnLeuGluSerGluAsnPheAspValValAlaAla 45 AlaAspGlyAspAlaAlaLeuArgGlnValThrGluSerAlaPro 60 AspLeuMetValLeuAspLeuSerLeuProGlyLysGlyGlyLeu 75 GluValLeuAlaThrValArgArgThrAspAlaLeuProIleVal 90 ValLeuThrAlaArgArgAspGluThrGluArgIleValAlaLeu 105 AspLeuGlyAlaAspAspTyrValIleLysProPheSerProArg 120 GluLeuAlaAlaArgIleArgAlaValLeuArgArgThrThrAla 135 GluProProHisGluAlaAlaValGlnArgPheGlyAspLeuGlu 150 IleAspThrAlaAlaArgGluValArgLeuHisGlyIleProLeu 165 GluPheThrThrLysGluPheAspLeuLeuAlaTyrMetAlaAla 180 SerProMetGlnValPheSerArgArgArgLeuLeuLeuGluVal 195 TrpArgSerSerProAspTrpGlnGlnAspAlaThrValThrGlu 210 HisValHisArgIleArgArgLysIleGluGluAspProThrLys 225 ProThrIleLeuGlnThrValArgGlyAlaGlyTyrArgPheAsp 240 GlyGluArgAla 244

【００４０】配列番号：２ 配列の長さ：５３４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：SK92−B1 配列： MetMetThrAspThrLeuProSerSerSerArgTrpThrLeuGlu 15 GlyProHisLeuGlnProLeuGlnGlyGluAlaLeuAlaAspLeu 30 HisAlaArgThrLeuGluMetIleThrSerGlyArgGluLeuHis 45 GluThrLeuGluValValAlaArgGlyIleGluGluLeuMetPro 60 GlyLysArgCysAlaIleLeuLeuLeuAspAsnThrGlyProVal 75 LeuArgCysGlyAlaAlaProThrMetSerAlaProTrpArgArg 90 TrpIleAspSerLeuValProGlyProMetSerGlyGlyCysGly 105 ThrAlaValHisLeuGlyGluProValIleSerTyrAspValAla 120 AspAspProLysPheArgGlyProPheArgAlaAlaAlaLeuHis 135 GluGlyIleArgAlaCysTrpSerThrProValThrSerGlyAsp 150 GlyThrIleLeuGlyThrPheAlaIleTyrGlySerValProAla 165 PheProAlaGlnGlnAspValAlaLeuValThrGlnCysThrAsp 180 LeuThrAlaAlaValIleThrThrHisLysLeuHisGlnAspLeu 195 SerMetSerGluGluArgPheArgArgThrPheAspSerAsnVal 210 ValGlyMetAlaLeuLeuAspGluSerGlySerSerIleArgVal 225 AsnAspThrLeuCysAlaLeuThrAlaAlaProProArgArgLeu 240 LeuGlyHisProMetGlnGluIleLeuThrAlaAspSerArgGlu 255 ProPheAlaAsnGlnLeuSerSerIleArgGluGlyLeuThrAsp 270 GlyGlyGlnLeuAspGlyArgIleGlnThrThrGlyGlyArgTrp 285 IleProValHisLeuSerIleSerGlyMetTrpThrThrGluArg 300 GluPheMetGlyPheSerValHisValLeuAspIleSerGluArg 315 LeuAlaAlaGluArgAlaArgGluGluGlnLeuGluAlaGluVal 330 AlaArgHisThrAlaGluGluAlaSerArgAlaLysSerThrPhe 345 LeuSerGlyMetThrHisGluValGlnThrProMetAlaValIle 360 ValGlyPheSerGluLeuLeuGluThrLeuAspLeuAspGluGlu 375 ArgArgGlnCysAlaTyrArgLysIleGlyGluAlaAlaLysHis 390 ValIleSerLeuValAspAspValLeuAspIleAlaLysIleGlu 405 AlaGlyAlaIleThrLeuGlnAspGluAspIleAspLeuSerGlu 420 GluValAlaThrIleValGluMetLeuGluProIleAlaArgAsp 435 ArgAspArgAspValCysLeuArgTyrValProProGlnThrPro 450 ValHisValCysSerAspArgArgArgValArgGluValLeuLeu 465 AsnIleValSerAsnGlyIleLysTyrAsnArgLeuGlyGlyVal 480 ValAspProProThrGlySerGlyAlaAlaArgProArgGlnThr 495 ArgAlaProAspTyrProAlaThrProThrThrAsnSerSerSer 510 ProSerThrGlyTrpGluSerArgProArgGlyCysLysGlyArg 525 GlySerValLeuArgSerProAlaArg 534

【００４１】配列番号：３ 配列の長さ：７３５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：SK92−B1 配列： ATG GCC GGA GCG GAC GTC CAC GCC CAG GGT GGC ACG AAT CGA CGT 45 GCA CGC ATC CTC GTC GTC GAC GAC GAA AAA CAC GTG CGC ACG ATG 90 GTG ACG TGG CAA CTC GAA TCG GAG AAT TTC GAT GTT GTC GCT GCG 135 GCA GAC GGA GAT GCG GCA CTG CGT CAG GTC ACT GAG AGC GCA CCC 180 GAT TTG ATG GTG CTC GAT CTG TCG CTC CCG GGG AAA GGT GGG TTG 225 GAA GTG CTC GCT ACG GTC CGC AGA ACC GAT GCA CTG CCT ATC GTC 270 GTG CTC ACA GCA CGC CGC GAT GAA ACC GAA CGG ATC GTC GCG CTG 315 GAT CTC GGC GCC GAT GAC TAC GTC ATC AAA CCG TTC TCC CCG CGG 360 GAA TTG GCC GCC CGT ATC CGG GCA GTG CTT CGT CGA ACC ACA GCT 405 GAA CCC CCA CAC GAG GCG GCG GTT CAG CGA TTC GGT GAC CTA GAG 450 ATC GAC ACC GCT GCG CGC GAG GTT CGG CTC CAC GGG ATA CCG CTC 495 GAG TTC ACC ACC AAG GAG TTC GAT CTG CTG GCC TAT ATG GCC GCA 540 TCA CCG ATG CAG GTC TTC AGC CGA CGC AGA TTG TTG CTC GAG GTG 585 TGG CGA TCG TCG CCC GAC TGG CAG CAG GAC GCC ACC GTG ACC GAG 630 CAC GTG CAC CGC ATT CGC CGC AAG ATC GAA GAA GAT CCC ACC AAA 675 CCG ACG ATC CTG CAG ACA GTG CGG GGA GCC GGT TAC CGT TTC GAC 720 GGA GAG CGT GCA TGA 735

【００４２】配列番号：４ 配列の長さ：１６０５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：SK92−B1 配列： ATG ATG ACC GAC ACA CTG CCC TCC TCG TCC CGT TGG ACC CTT GAA 45 GGC CCG CAT CTC CAG CCG CTG CAG GGT GAG GCC CTG GCG GAT CTC 90 CAC GCC CGT ACG CTC GAG ATG ATC ACT TCC GGG AGA GAA TTG CAC 135 GAG ACA CTC GAG GTG GTC GCC CGC GGC ATC GAG GAA CTG ATG CCG 180 GGC AAA CGT TGC GCA ATT CTG TTG CTC GAC AAC ACC GGA CCG GTA 225 TTG CGC TGC GGC GCG GCC CCA ACA ATG AGC GCG CCG TGG CGC CGG 270 TGG ATC GAC AGC CTC GTC CCT GGT CCG ATG TCG GGT GGC TGC GGC 315 ACA GCG GTT CAC CTC GGC GAG CCG GTT ATT TCC TAT GAC GTG GCC 360 GAT GAC CCG AAA TTC CGC GGC CCC TTC CGC GCC GCA GCC CTC CAC 405 GAG GGC ATA CGT GCC TGC TGG TCC ACC CCC GTC ACA AGC GGA GAC 450 GGC ACG ATC CTC GGC ACT TTC GCG ATC TAC GGA TCC GTG CCG GCG 495 TTC CCC GCA CAA CAG GAC GTT GCC CTG GTC ACC CAA TGC ACC GAC 540 CTG ACC GCT GCC GTC ATC ACC ACC CAC AAA CTT CAT CAA GAT CTG 585 AGC ATG AGC GAG GAG CGG TTC CGA CGC ACC TTC GAT TCC AAT GTC 630 GTC GGC ATG GCA CTT CTC GAC GAA TCC GGC TCC AGC ATC CGC GTC 675 AAC GAC ACC CTG TGC GCG TTG ACC GCA GCT CCG CCA CGG CGC CTC 720 CTC GGC CAC CCC ATG CAG GAG ATA CTC ACC GCC GAC TCC CGG GAA 765 CCG TTC GCC AAT CAG TTG TCC TCC ATC CGT GAG GGA TTG ACC GAC 810 GGC GGA CAG CTC GAC GGA CGA ATC CAA ACC ACC GGA GGT CGG TGG 855 ATT CCG GTG CAC CTG TCC ATC AGC GGT ATG TGG ACC ACG GAG CGG 900 GAG TTC ATG GGA TTC AGC GTC CAT GTC CTG GAC ATC TCC GAG CGC 945 CTG GCC GCC GAA CGC GCC CGC GAG GAA CAA CTC GAG GCC GAG GTT 990 GCC CGC CAT ACC GCG GAG GAA GCC AGT CGC GCC AAG TCC ACG TTC 1035 CTG TCC GGC ATG ACG CAC GAG GTC CAA ACG CCC ATG GCC GTT ATC 1080 GTC GGA TTC AGT GAG CTA CTC GAG ACG CTG GAC CTG GAT GAA GAA 1125 CGT CGT CAG TGC GCC TAC CGC AAG ATC GGC GAA GCC GCG AAA CAC 1170 GTG ATC TCC CTG GTC GAC GAC GTT CTC GAT ATA GCC AAG ATC GAA 1215 GCC GGC GCT ATC ACT CTG CAG GAC GAA GAC ATC GAC CTG TCC GAA 1260 GAA GTT GCC ACC ATC GTG GAG ATG CTC GAG CCC ATC GCC CGT GAC 1305 CGT GAC CGT GAC GTC TGC CTG CGG TAC GTC CCG CCG CAG ACA CCG 1350 GTG CAC GTG TGC TCG GAC CGG CGG CGG GTG CGG GAA GTG CTG CTC 1395 AAC ATC GTC TCC AAC GGG ATC AAG TAC AAT CGG CTC GGT GGT GTC 1440 GTC GAC CCC CCA ACA GGA TCA GGG GCT GCT CGT CCG CGT CAG ACG 1485 AGG GCC CCG GAC TAC CCA GCG ACG CCG ACG ACG AAC TCT TCG AGC 1530 CCT TCA ACC GGC TGG GAG TCG AGG CCA CGG GGG TGC AAG GGT CGG 1575 GGC TCG GTC TTG CGC TCT CCC GCG CGC TGA 1605

【００４３】配列番号：５ 配列の長さ：２３３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：SK92−B1 配列： ATGGCCGGAG CGGACGTCCA CGCCCAGGGT GGCACGAATC GACGTGCACG 50 CATCCTCGTC GTCGACGACG AAAAACACGT GCGCACGATG GTGACGTGGC 100 AACTCGAATC GGAGAATTTC GATGTTGTCG CTGCGGCAGA CGGAGATGCG 150 GCACTGCGTC AGGTCACTGA GAGCGCACCC GATTTGATGG TGCTCGATCT 200 GTCGCTCCCG GGGAAAGGTG GGTTGGAAGT GCTCGCTACG GTCCGCAGAA 250 CCGATGCACT GCCTATCGTC GTGCTCACAG CACGCCGCGA TGAAACCGAA 300 CGGATCGTCG CGCTGGATCT CGGCGCCGAT GACTACGTCA TCAAACCGTT 350 CTCCCCGCGG GAATTGGCCG CCCGTATCCG GGCAGTGCTT CGTCGAACCA 400 CAGCTGAACC CCCACACGAG GCGGCGGTTC AGCGATTCGG TGACCTAGAG 450 ATCGACACCG CTGCGCGCGA GGTTCGGCTC CACGGGATAC CGCTCGAGTT 500 CACCACCAAG GAGTTCGATC TGCTGGCCTA TATGGCCGCA TCACCGATGC 550 AGGTCTTCAG CCGACGCAGA TTGTTGCTCG AGGTGTGGCG ATCGTCGCCC 600 GACTGGCAGC AGGACGCCAC CGTGACCGAG CACGTGCACC GCATTCGCCG 650 CAAGATCGAA GAAGATCCCA CCAAACCGAC GATCCTGCAG ACAGTGCGGG 700 GAGCCGGTTA CCGTTTCGAC GGAGAGCGTG CATGATGACC GACACACTGC 750 CCTCCTCGTC CCGTTGGACC CTTGAAGGCC CGCATCTCCA GCCGCTGCAG 800 GGTGAGGCCC TGGCGGATCT CCACGCCCGT ACGCTCGAGA TGATCACTTC 850 CGGGAGAGAA TTGCACGAGA CACTCGAGGT GGTCGCCCGC GGCATCGAGG 900 AACTGATGCC GGGCAAACGT TGCGCAATTC TGTTGCTCGA CAACACCGGA 950 CCGGTATTGC GCTGCGGCGC GGCCCCAACA ATGAGCGCGC CGTGGCGCCG 1000 GTGGATCGAC AGCCTCGTCC CTGGTCCGAT GTCGGGTGGC TGCGGCACAG 1050 CGGTTCACCT CGGCGAGCCG GTTATTTCCT ATGACGTGGC CGATGACCCG 1100 AAATTCCGCG GCCCCTTCCG CGCCGCAGCC CTCCACGAGG GCATACGTGC 1150 CTGCTGGTCC ACCCCCGTCA CAAGCGGAGA CGGCACGATC CTCGGCACTT 1200 TCGCGATCTA CGGATCCGTG CCGGCGTTCC CCGCACAACA GGACGTTGCC 1250 CTGGTCACCC AATGCACCGA CCTGACCGCT GCCGTCATCA CCACCCACAA 1300 ACTTCATCAA GATCTGAGCA TGAGCGAGGA GCGGTTCCGA CGCACCTTCG 1350 ATTCCAATGT CGTCGGCATG GCACTTCTCG ACGAATCCGG CTCCAGCATC 1400 CGCGTCAACG ACACCCTGTG CGCGTTGACC GCAGCTCCGC CACGGCGCCT 1450 CCTCGGCCAC CCCATGCAGG AGATACTCAC CGCCGACTCC CGGGAACCGT 1500 TCGCCAATCA GTTGTCCTCC ATCCGTGAGG GATTGACCGA CGGCGGACAG 1550 CTCGACGGAC GAATCCAAAC CACCGGAGGT CGGTGGATTC CGGTGCACCT 1600 GTCCATCAGC GGTATGTGGA CCACGGAGCG GGAGTTCATG GGATTCAGCG 1650 TCCATGTCCT GGACATCTCC GAGCGCCTGG CCGCCGAACG CGCCCGCGAG 1700 GAACAACTCG AGGCCGAGGT TGCCCGCCAT ACCGCGGAGG AAGCCAGTCG 1750 CGCCAAGTCC ACGTTCCTGT CCGGCATGAC GCACGAGGTC CAAACGCCCA 1800 TGGCCGTTAT CGTCGGATTC AGTGAGCTAC TCGAGACGCT GGACCTGGAT 1850 GAAGAACGTC GTCAGTGCGC CTACCGCAAG ATCGGCGAAG CCGCGAAACA 1900 CGTGATCTCC CTGGTCGACG ACGTTCTCGA TATAGCCAAG ATCGAAGCCG 1950 GCGCTATCAC TCTGCAGGAC GAAGACATCG ACCTGTCCGA AGAAGTTGCC 2000 ACCATCGTGG AGATGCTCGA GCCCATCGCC CGTGACCGTG ACCGTGACGT 2050 CTGCCTGCGG TACGTCCCGC CGCAGACACC GGTGCACGTG TGCTCGGACC 2100 GGCGGCGGGT GCGGGAAGTG CTGCTCAACA TCGTCTCCAA CGGGATCAAG 2150 TACAATCGGC TCGGTGGTGT CGTCGACCCC CCAACAGGAT CAGGGGCTGC 2200 TCGTCCGCGT CAGACGAGGG CCCCGGACTA CCCAGCGACG CCGACGACGA 2250 ACTCTTCGAG CCCTTCAACC GGCTGGGAGT CGAGGCCACG GGGGTGCAAG 2300 GGTCGGGGCT CGGTCTTGCG CTCTCCCGCG CGCTGA 2336

【００４４】

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＢＳＫ３０１、ｐＢＳＫ３０２、
ｐＢＳＫ３０３およびＢＳＫ３０４の構築図

【図２】組換え体プラスミドｐＳＫ１０６およびｐＢＳ
Ｋ２０５の制限酵素地図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 湯 不二夫 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 日 東化学工業株式会社中央研究所内

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 培養時に培地へ誘導物質を添加すること
   なくニトリラーゼを産生する微生物。
2. 【請求項２】 微生物の産生するニトリラーゼの基質と
   なり、かつ誘導物質とはならないニトリル化合物を唯一
   窒素源とする培地で生育する請求項１記載の微生物。
3. 【請求項３】 微生物がロドコッカス (Rhodococcus)属
   に属する請求項１記載の微生物。
4. 【請求項４】 微生物がロドコッカス エリスロポリス
   (Rhodococcus erythropolis) ＳＫ９２株の変異株であ
   る請求項３記載の微生物。
5. 【請求項５】 変異株がＳＫ９２−Ｂ１株である請求項
   ４に記載の微生物。
6. 【請求項６】 変異株の構成化に関わる変異箇所がニト
   リラーゼ遺伝子発現の調節因子をコードする遺伝子内で
   あることを特徴とする請求項４に記載の微生物。
7. 【請求項７】 ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性
   化する作用をもち、配列番号１のアミノ酸配列を有する
   ポリペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列を有する
   ポリペプチドの２成分より成る構成化に関わる調節因子
   およびその遺伝子ＤＮＡ。
8. 【請求項８】 ポリペプチドをコードする遺伝子が配列
   番号３および配列番号４の塩基配列を有する請求項７記
   載の構成化に関わる調節因子およびその遺伝子ＤＮＡ。
9. 【請求項９】 請求項７または８に記載の構成化に関わ
   る調節因子をコードする遺伝子を有する請求項１〜６の
   いずれかに記載の微生物。
10. 【請求項10】 請求項７または８記載の構成化に関わる
    調節因子をコードするＤＮＡおよびロドコッカス属に属
    する菌株細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域を含む組換
    え体プラスミド。
11. 【請求項11】 さらに、プロモーター・オペレーター領
    域を含むニトリラーゼ遺伝子を含む請求項10記載の組換
    え体プラスミド。
12. 【請求項12】 請求項10または11記載の組換え体プラス
    ミドにより形質転換された形質転換微生物。