JP3570784B2 - 新規なるフィターゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規なフィターゼ、該フィターゼを構成するサブユニットをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを含む形質転換微生物及び該微生物により生産されたフィターゼを用いたフィチン酸塩をミオ−イノシトールに変換する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フィターゼは、フィチン酸を脱リン酸させるホスファターゼであり、フィチン酸の６位のリン酸を加水分解するものを６−フィターゼ（ＥＣ．３．１．３．２６．）、フィチン酸の３位のリン酸を加水分解するものを３−フィターゼ（ＥＣ．３．１．３．８．）と呼び、通常単にフィターゼと称されるものは６−フィターゼである。フィターゼは、高等植物、動物および微生物に存在する。例えば高等植物由来のものとしては、マング・ビーン（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）（Ｎ．Ｃ．Ｍａｎｄａｌら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１１：ｐｐ．４９５−５０２，（１９７２））、小麦（Ｐ．Ｅ．Ｌｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，ｖｏｌ．３０２：ｐｐ．３１６−３２８，（１９７３））由来のものが知られており、微生物由来のものとしては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Ｇ．Ｃ．Ｊ．Ｉｒｖｉｎｇら、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４：ｐｐ．５４７−５５７，（ １９７１）），枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｖ．Ｋ．Ｐａｖｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．，ｖｏｌ．１５１：ｐｐ．１１０２−１１０８，（１９８２）），クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（Ｖａｒｓｈａ Ｓｈａｈら、Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ｖｏｌ．２７：ｐｐ．９８−１０２，（１９９０））， アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（Ａｂｕｌ Ｈ．Ｊ．Ｕｌｌａｈら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１７：ｐｐ．６３−９１，（１９８７）（欧州特許公開０３２１００４、欧州特許公開０４２０３５８、欧州特許出願９２−２００４１４、ＷＯ９４０３６１２），シュワニオミセス カステリ（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ Ｃａｓｔｅｌｌｉ）ＣＢＳ ２８６３，（Ｐ．Ｇａｌｚｙら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．７４．１：ｐｐ．７−１１，（１９９２）由来のものが知られている。尚、Ｇａｌｚｙらに開示されている、シュワニオミセス カステリ ＣＢＳ ２８６３は現在シュワニオミセス オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）ＩＦＯ １８４０に再分類されている（Ｋｒｅｇｅｒｍ ｖａｎ Ｒｉｊ ｅｔ ａｌ．：ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ， ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ， ３ｒｄ ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｔｈｅ Ｎｅｒｔｈｅｒｌａｎｄｓ，（１９８４））（ＬＩＳＴ ＯＦ ＣＵＬＴＵＲＥ ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ， ９ｔｈ ｅｄ．：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｏｓａｋａ，ｐｐ７５−７６，（１９９２））。
フィターゼの基質であるフィチン酸（イノシトールヘキサキスリン酸）はミオ−イノシトール（以後単にイノシトールということがある）の６リン酸であり、フィチン酸のカルシウム−マグネシウム混合塩であるフィチンは全てのナッツ、穀物、豆類、種子、胞子、及び花粉にリン酸の主要貯蔵物質として１〜３％含まれる（Ｅ．Ｇｒａｆら、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．６０：ｐｐ．１８６１−１８６７，（１９８３））。
【０００３】
近年、穀物、種子を多く含む飼料を用いて飼育される家畜（単胃動物）の排せつ物中のリン酸が河川等を汚染することが問題化している。その対策として、フィターゼを飼料添加剤として家畜飼料中に混入させ、飼料中のフィチン酸塩をフィターゼにより分解することにより排せつ物中のリン酸源濃度を低減させる試みがなされている。
しかし、従来知られているフィターゼは、６８℃、１０分間の処理により活性が４０％に減少する（Ａｂｕｌ Ｈ．Ｊ．Ｕｌｌａｈら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１８：ｐｐ．４８３−４８９，（１９８８））。そのため、飼料添加物として使用する場合、飼料成形中の温度（７５−８５ ℃）では大部分の活性が失われてしまうため飼料形成が不可能であるか、乾燥工程を大幅に変更する必要がある。
【０００４】
一方、フィターゼを用いてミオ−イノシトールの製造に利用する試みがなされている。従来、コーンスティープリカーや米ぬかなどからフィチンを抽出し、さらに高温高圧下でフィチンを加水分解することによりミオ−イノシトールが工業的に生産されている。しかしフィチンの加水分解は、特殊な装置や大量のエネルギーを必要とするため、生産コストの点で問題がある。
そこで、常温常圧下でフィチン酸塩を加水分解することのできる酵素を用いてイノシトールを生産する方法が考案され、アスペルギルス属に属する微生物（Ａｂｕｌ Ｈ．Ｊ．Ｕｌｌａｈら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１８：ｐｐ．４８３−４８９，（１９８８））やシュワニオミセス オキシデンタリス（前出）などの微生物を用いてのフィチンの加水分解反応が報告されている。
しかし、これらの反応を触媒する酵素のうち、アスペルギルス属に属する微生物の産生するフィターゼは、フィチン酸またはその塩からイノシトールモノリン酸までは加水分解するが、それ以上すなわちミオ−イノシトールまでは加水分解することができない。そのためミオ−イノシトールまで加水分解するためには他の酵素、例えば酸性ホスファターゼなどの併用が必要である。このことはイノシトールの製造において経済性の点から好ましくない。
最近になって、フィチン酸のナトリウム塩をミオ−イノシトールまで完全に分解することが可能で、しかも熱安定性が７４℃と比較的高いフィターゼをシュワニオミセス オキシデンタリスが生産することが見いだされた。
【０００５】
一般に、フィターゼは脱リン酸酵素（ホスファターゼ）の一種であるからその誘導にはネガティブな調節を解除するためリン酸濃度を低くした培地、もしくはポジティブな調節である誘導の強化の観点からフィチン酸の塩を唯一のリン酸源とした培地を使用すればよい。Ｐ．Ｇａｌｚｙら（前出）は、シュワニオミセス オキシデンタリスの培養液中のリン酸濃度を低く保つためケモスタットによる連続培養を行いフィターゼの生産を行っている。しかし該酵素の分泌量は、Ｐ．Ｇａｌｚｙら（前出）によれば０．１５ ｍｇ／ｌと極めて低かった。この様な場合遺伝子工学的手法を用いて該酵素の大量生産を試みることが考えられる。しかし、当該フィターゼをコードする遺伝子は未だ未同定である。また、Ｐ．Ｇａｌｚｙら（前出）によれば該フィターゼの分子構成は、α（１２５ｋＤ）及びβ（７０ｋＤ）の２つのサブユニットからなる４量体（α：β＝１：３）であるため、遺伝子工学的手法を用いて該酵素を大量生産するためには同一細胞内で２種のサブユニットを発現させる必要がある。このことは２種のサブユニッットをコードする２種の遺伝子の発現をコントロールするために、高度な遺伝子工学的手法を必要とし、また異種宿主での高次（４次）構造形成の点から必ずしも望ましくない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、フィチン酸塩或いはその塩をミオ−イノシトールまで完全に分解することが可能で、熱安定性に優れ、しかも従来知られているフィターゼよりも構造的に単純で、該酵素の遺伝子工学的手法を用いた大量生産が可能なフィターゼ提供することにある。
また、本発明の他の目的は、上記フィターゼをコードするの遺伝子、該遺伝子を含む形質転換微生物を提供することにある。
さらに、本発明の他の目的は、該形質転換微生物を用いてフィチン酸塩をミオ−イノシトールに変換する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、既にフィターゼを生産することが報告されているシュワニオミセス オキシデンタリスを弱酸のカルシウム塩を含むリン酸源濃度の低い培地で培養することにより、公知のフィターゼとは異なる単一サブユニットからなる新規なフィターゼが分泌生産されることを見いだし、該知見に基づき本発明に至った。
【０００８】
即ち、本発明はフィチン酸塩をミオ−イノシトールまで加水分解することができ、単一のサブユニットよりなるフィターゼ、シュワニオミセス オキシデンタリス由来の脱糖鎖後の分子サイズがＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で５０ｋＤ±５ｋＤであるフィターゼサブユニットをコードする遺伝子、該遺伝子を含む形質転換微生物、該微生物が生産するフィターゼを用いたフィチン酸塩をミオ−イノシトールに変換する方法を提供するものである。
【０００９】
本発明のフィターゼはフィチン酸塩をミオ−イノシトールまで加水分解すること、即ち、フィチン酸に結合している６つのリン酸を完全に加水分解することが出来る酵素であり、１種類のサブユニットから構成されている。
本発明のフィターゼの例として、シュワニオミセス オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）由来のものが挙げられる。このフィターゼは糖蛋白質である。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼを構成するサブユニットは、脱糖鎖後の分子サイズがＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で５０ｋＤ±５ｋＤである。また、該サブユニットは少なくとも配列表の配列番号：１あるいは、及び配列番号：２のアミノ酸配列を含んでいる。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼは上記サブユニットを３〜５個、通常は４個会合した４量体として存在しているものと思われる。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼは耐熱性を有する。即ち、該酵素は７０℃以下の温度で３０分間の処理条件で約９０％の残存活性が確認され、７５℃で３０分間の処理条件でも約５０％の残存活性が確認される。この様に耐熱性を有するフィターゼは、該酵素を飼料添加剤に混合する場合、高温での飼料の成形が可能になるので有効である。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼはまた、該酵母をＣａＣＯ３等の弱酸のカルシウム塩を含むリン酸濃度の低い培地で培養することにより誘導分泌される。例えば、通常の酵母の培養に使用される培地にカルシウム塩を０．０１〜１％、好ましくは０．０５〜０．５％程度添加した培地で培養することにより、培地中に誘導的に蓄積してくる。
この様なシュワニオミセス オキシデンタリスのフィターゼの誘導的分泌の原因は必ずしも明らかではないが、本発明者らがＰ．Ｇａｌｚｙら（前出）を参考にフィチン酸の塩を唯一のリン酸源とした培地を用いたバッチ法による培養を検討したところ、培養液中にフィターゼ活性はほとんど検出されず、炭酸カルシウムを培地に添加して培養したところ、培地中のフィターゼ活性が顕著に上昇したことから、フィターゼが誘導される原因は、フィチンの分解によりわずかに遊離したリン酸によるフィターゼの発現の抑制が弱酸のカルシウム塩で解除されるためでないかと考えらる。
【００１０】
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子は、シュワニオミセス オキシデンタリスから種々の方法でクローニングすることができるが、該遺伝子が真核生物由来のため、イントロンが存在する可能性があることを考慮すれば、例えばシュワニオミセス オキシデンタリスＩＦＯ １８４０のｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを大腸菌の発現ベクターに組み込み作製したｃＤＮＡ発現ライブラリーから該サブユニットと特異的に反応する抗体をプローブとしてクローンを得ることができる。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子のｃＤＮＡの長さは１６３１ｂｐであり、該ＤＮＡは、具体的には例えば配列表の配列番号：５に記載の塩基配列であり、少なくとも配列表の配列番号：３、配列番号：４のＤＮＡ塩基配列を含んでいる。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子は、宿主細胞中で複製可能なベクターに連結することにより組換えプラスミドを作製し、これを適当な微生物に形質転換することにより異種生物中で発現させることができる。本発明のシュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼサブユニットをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドとしてはＹＥｐＧＰＨ １（図−８（［図８］））が例示できる。
また、シュワニオミセス オキシデンタリスの染色体遺伝子を部分分解して作成したゲノムライブラリーからｃＤＮＡとハイブリダイズするフラグメントを含むクローンが得られる。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドは、適当な宿主に例えば形質転換などの方法で導入することにより、該遺伝子を発現させ、更に多くのフィターゼを菌体内或いは菌体外に生産させることができる。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子を発現させるためには、異種タンパク質生産が可能な系がすでに開発されている大腸菌、枯早菌、酵母、糸状菌を宿主とする宿主ベクター系を利用することが有効である。そして、該宿主の中で機能することが知られている適当なプロモーター、分泌シグナルの直後にフィターゼの成熟蛋白をコードする遺伝子を接続し、適当なベクターに連結することより形質転換するか、染色体に組み込むことにより本酵素を生産することができる。
本発明者らは、得られたゲノムＤＮＡフラグメントをサッカロミセス セルビッシェのベクタープラスミドであるＹＥｐ２４中に組み込み、このプラスミドでサッカロミセス セルビッシェを形質転換することによりシュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼ酵素を生産することに成功した。
上記組換えプラスミドにより形質転換することにより得られた微生物としては、大腸菌、酵母が例示され、具体的には大腸菌の中でも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０７４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０８）、酵母としてはサッカロミセス セルビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＴ−４０５３９ （ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０９）が例示される。これらの微生物は、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約に基づいて寄託されており、ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０８或いはＦＥＲＭ ＢＰ−５１０９はその寄託番号を表している。
尚、本発明の元の明細書においてＦＥＲＭ ＢＰ−５１０８はＦＥＲＭ Ｐ−１４２８７として、ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０９はＦＥＲＭ Ｐ−１４２８７として記載されている。寄託番号の相違は、これら菌株が共に平成７年５月２５日をもって原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管手続きがなされたため、これに伴い寄託番号が上記のとおりに変更されたことによる。
【００１１】
上記の形質転換された微生物を培養してフィターゼを製造するための培養方法は、通常の微生物の培養方法を用いることができる。
培地としては、形質転換された微生物に好適なものであれば特に制限はないが、遊離したリン酸によるフィターゼの発現の抑制を解除するために弱酸のカルシウム塩を含有することが好ましい。
上記培地を用いて通常の培養条件（温度・ｐＨ・通気・時間）で培養することにより、フィターゼを製造することができる。フィターゼを種々の用途に使用するためには、上述の通り培養して得られた培養液、菌体及びその処理物はフィターゼ酵素源として利用することができる。菌体の処理物としては、菌体を自己消化や有機溶媒による溶菌、超音波処理、ホモジナイズなどの処理により破壊したもの、及び該破壊物の粗精製物、並びに培養液、菌体から分離精製されたフィターゼ酵素蛋白質、更には培養により得られた菌体、菌体或いは培養液から分離精製された酵素蛋白質をアルギン酸ナトリウム、κ−カラギーナン、ポリアクリルアミドなどの固定化剤を用いて固定化したものを含む。
【００１２】
以上の通りにして得られたフィターゼ或いはシュワニオミセス オキシデンタリス由来の、脱糖鎖後の分子サイズがＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で５０ｋＤ±５ｋＤであるサブユニットよりなるフィターゼはフィターゼ酵素源として種々の用途、例えば飼料添加物或いはイノシトールの生産に使用可能である。
上記のフィターゼ酵素源の存在下、フィチン酸塩をミオ−イノシトールに変換するためには、フィチン酸カルシウムなどのフィチン酸塩を含むバッファー中にフィターゼ酵素源を添加して反応させればよい。
【００１３】
【実施例】
本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の内容を何等限定するものではない。
【００１４】
実施例１ 炭酸カルシウム添加によるフィターゼの高発現誘導
１リットルあたりｇｌｕｃｏｓｅ １０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３ｇ、 ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ、 ＫＣｌ ０．５ｇ， ＣａＣｌ２ ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３ ０．１３５ｇ、微量金属、イノシトール以外の各種ビタミン類、初期増殖のためにｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．０３ｇ、唯一のリン酸源としてＣａｌｃｉｕｍ Ｐｈｙｔａｔｅ ０．６ｇ、高発現誘導のためＣａＣＯ３ １ｇを含む培地を調製した。この培地３０ｍｌをバッフル付き三角フラスコに入れ、シュワニオミセス オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ） ＩＦＯ １８４０を植菌し、２８℃で２日間培養した。対照として上記培地からＣａＣＯ３を除いた培地を使用して比較した。
培養の終わった培養液をａｍｉｃｏｎ ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０ ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを用いて限外濾過することにより１０倍に濃縮した後、透析した。透析された液のフィターゼ活性を以下のように測定した。即ち、透析された液１００μｌに基質水溶液（６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ４．４）、 ５ｍＭフィチン酸ナトリウムを含む）９００μｌを加え、７０℃で３０分間反応した。反応終了後、反応液に５Ｎ Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ添加して反応を停止した。対照として基質を含むバッファー液に予め５Ｎ Ｈ２ＳＯ４ １００μｌを加えたものに酵素液を加えた画分を用意した。反応停止後、反応液を９６穴マイクロタイタープレート上で１〜２０４８倍に希釈し、希釈液１００μｌあたり５０μｌのリン酸検出液（Ａ液；１．４７ｇ／ｌ マラカイトグリーン， ２０％ Ｈ２ＳＯ４： Ｂ液；７．５％ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｍｏｌｙｂｄａｔｅ： Ｃ液；１１％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０とし、使用直前にＡ液：Ｂ液：Ｃ液＝５０：１２．５：１に混合したもの） を加え３０分間振とう後、ＡＢＳ６２０を測定した。１〜１０ｎＭの範囲のリン酸校正曲線により、得られた測定値から、放出されたリン酸量を決定した。フィターゼ活性の単位は１分間にリン酸を１μｍｏｌｅ放出する活性を１ｕｎｉｔとした。結果を図−１［図１］に示す。炭酸カルシウムを加えた誘導培地で培養した培養液中にはフィターゼ活性が検出され、炭酸カルシウムを加えない非誘導培地で培養した培養液からはフィターゼ活性は殆ど検出されなかった。
【００１５】
実施例２ フィターゼ酵素活性の測定と分子サイズの測定
（１） 酵素の脱糖鎖
次に本発明者らは実施例１に記載の培養条件で誘導され、培地中に分泌・蓄積したフィターゼの酵素学的な性状を明らかにするために酵素の精製を試みた。
本酵素は糖蛋白であることが予備的な実験より明らかになった。この様な蛋白質は電気泳動で明瞭なバンドを与えにくいことが多い。そのため、電気泳動により単一のバンドを得るため、予めＥｎｄｏ Ｈにより脱糖鎖処理を行った。酵素の脱糖鎖は、酵素を終濃度１０ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ ５．２）、１００ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．００２５％ ＳＤＳを含む溶液中で９５℃で５分間処理して変性させた後ゆっくりと室温に戻し、蛋白量１ｎｇ当り４μＵのＥｎｄｏ Ｈ（Ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｈ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を加え、３７℃で１晩反応を行った。
尚、以下の実験で活性を測定するものと電気泳動する試料は、１０ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ ５．２）の溶液に、蛋白量１ｎｇあたり４μＵのＥｎｄｏ Ｈを加え、３７℃で１晩反応する処理を行った。
【００１６】
（２） 粗酵素中の加水分解活性の検出と分子サイズの測定
実施例２でＥｎｄｏ Ｈによる脱糖鎖処理を行った粗酵素標品をＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥにより電気泳動した。銀染色、及び加水分解活性染色を行い単一で加水分解活性を示すバンドを検出した。
加水分解活性染色は、電気泳動が終了したゲルを０．１％ α−ナフチルホスフェート、０．２％ ファーストガーネットＧＢＣ塩、０．６Ｍ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）の溶液中で一晩インキュベートした。その際加水分解活性のあるバンドは黒色のバンドとして検出される。上記バンドにあたるポリペプチドのフィターゼ活性を確認するためにこのバンドに当たるポリペプチドをフィチン酸ナトリウムと反応させ、生成するリン酸量及びミオ−イノシトール量を定量しフィターゼ活性を測定したところ、リン酸及びミオ−イノシトールの生成が認められた。
また、該ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子サイズを測定したところ、当該酵素の分子サイズは５０ｋＤ±５ｋＤであることが分かった（図−５［図５］）。これはシュワニオミセス オキシデンタリスのフィターゼサブユニットとして既に知られているα、βサブユニットとは明らかに異なっていた。
さらに詳しく解析するためにこのポリペプチドを精製し、家兎に免疫し、アフィニティーカラムにより精製することで目的のポリペプチドに特異的な抗体を得た。該抗体を用いたウエスタンブロットの解析から、該抗体はシュワニオミセスオキシデンタリスのフィターゼサブユニットとして既に知られているα、βサブユニットとは明らかに分子サイズの異なる５０ｋＤのバンドと反応した。
以上のことから、炭酸カルシウムを加えた誘導培地で培養した際に培養液中に検出されるフィターゼ活性を有する酵素は、これまで知られていない新規のものであると結論した。
【００１７】
実施例３ 培養上清液からのフィターゼの精製
シュワニオミセス オキシデンタリスを実施例１に記載の培地２０ｍｌに植菌し、２８℃で一晩培養した。培養後、培養液全量を２ｌの同一培地に無菌的に加え、２８℃で２日間培養した。最終的に得られた培養液を遠心分離することにより培養上清約２ｌを得た。得られた培養上清はエバポレーターにより５０〜６０℃で２００ｍｌまで濃縮した後、濃縮液を透析した。この透析液を再びエバポレーターにより２０ｍｌまで濃縮し、透析した。得られた粗酵素溶液を１０ｍｌのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗカラム（ファルマシア社製）にアプライし、カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ， ｐＨ ７．５， ５０ ｍｌにより洗浄した。溶出は、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ， ｐＨ ７．５各２０ｍｌを順次流して行った。２０ｍｌ毎に溶出液を分取し、各溶出画分を透析後、フィターゼ活性を測定した。
得られた酵素の至適ｐＨ、至適温度、温度耐性を調べた。
酵素の至適ｐＨは、実施例１に記載の活性測定法に準じて活性測定を行い、その際２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーと２０ｍＭフタル酸バッファーを用い、活性測定中のＰＨを変えた。実験の結果、本酵素の至適ｐＨはｐＨ ２．７−５．０の範囲であることがわかった（図−２［図２］）。
酵素の至適温度は、実施例１に記載の活性測定法に準じて活性測定を行い、その際酵素反応の温度を変化させた。実験の結果、本酵素の至適温度は約７０℃であることがわかった（図−３［図３］）。
酵素の温度耐性は、酵素を２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ４．４）中で３０分間インキュベートした後、該処理酵素液を用いて実施例１に記載の活性測定法に準じて活性測定をして行った。その結果、酵素の残存活性は７０℃で約９０％、７５℃で５０％あった（図−４［図４］）。
【００１８】
実施例４ フィターゼによるミオ−イノシトールの生産
１００ ｇ／ｌのフィチン酸カルシウムを含む溶液（ｐＨ ４．０）に実施例３で精製されたフィターゼを８Ｕ／ｍｌになるように添加し、５０℃で反応を行った。蓄積したミオ−イノシトールは高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を図−６［図６］に示す。
【００１９】
実施例５ Ｎ末端アミノ酸配列の決定
精製した酵素をＥｎｄｏ Ｈにより脱糖鎖した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｅｐ−Ｃｅｌｌ Ｍｏｄｅｌ ４９１ により脱糖鎖が不完全であるものを取り除いた。この酵素を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより泳動し、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｂｌｏｔｔｉｎｇ装置によりＰＶＤＦブロッティングメンブレンフィルター（イムノビロン；ミリポア社）へ電気泳動的に移した。メンブレンフィルターを洗浄した後、ポンソー試薬による発色で蛋白の位置を検出した。目的のバンドを切り出し、乾燥させた後、アミノ酸シークエンサー（島津製作所製）により分析を行った。結果を配列表の配列番号：１に示す。
【００２０】
実施例６ Ｖ８ ｐｒｏｔｅａｓｅによる部分分解産物のＮ末端アミノ酸配列の決定
実施例２に記載の方法により脱糖鎖した５０ｋＤの分子サイズを示す酵素２００−４００μｇをサンプルバッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ６．８）， ０．１％ ＳＤＳ， １０％ グリセロールを含む）に溶解し、Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｕｕｓ属細菌由来のＶ８（Ｇｌｕ−ｃ）ｐｒｏｔｅａｓｅ １μｇをｐｒｏｔｅａｓｅ用バッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ６．８）， ０．１％ ＳＤＳ， ５％ グリセロール）に溶解した。
１７％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにまず酵素を溶解したサンプルをのせ、つぎにＶ８ ｐｒｏｔｅａｓｅを溶解したサンプルを静かに重層した。これを泳動し、Ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌとＳｅｐａｒａｔｉｏｎ ｇｅｌの境界付近にＢＰＢマーカーが来たところで３０分間泳動を止め、Ｐｒｏｔｅａｓｅと酵素を反応させた。その後、再び泳動し、部分分解した酵素のＮ末端アミノ酸配列を実施例４に記述した方法により決定した。結果を配列表の配列番号：２に示す。
【００２１】
実施例７ フィターゼｃＤＮＡのスクリーニング
（１） 抗体の作製
実施例２（１）に記載の方法により脱糖鎖した５０ｋＤの分子サイズを示す酵素溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌと完全アジュバンド（Ｆｒｅｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｄ）（ＤＩＦＣＯ社製）１００μｌを混合してエマルジョン化し、これを接種液とした。
接種はうさぎの皮下に数回に分けて行い、２、４、６週間後に追免疫を行った。抗体価の上昇はＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法により免疫前に採取した血清と比較することにより観察した。
最終的に得られた血清は０．１ｇのＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂに１ｍｇの脱糖鎖後の精製酵素をｃｏｕｐｌｉｎｇして作製したアフィニティーカラムにより精製した。
精製された抗体はウエスタンブロット法により、脱糖鎖後の粗酵素から５０ｋＤ、及びその分解産物と思われる約３０ｋＤのバンドを示した。結果を図−７［図７］に示す。
【００２２】
（２） フィターゼｃＤＮＡのクローニング
実施例４に記載の方法でＯＤ６６０＝１．０まで菌体を培養し、遠心集菌後、同時に沈澱するＣａＣＯ３を除くためｐＨ３．５の酢酸ナトリウムバッファーで菌体を洗浄し、次に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ ７．０により洗浄して菌体を得た。
得られた菌体は、液体窒素を用いて凍らせた後、海砂とともにすり鉢を使用して破砕した。この粉にＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ファルマシア社）のｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加え均一に混合した後、４℃、２０００Ｇで遠心分離して上清を取り、全ＲＮＡを得た。この後、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔの使用法に従いｍＲＮＡを得た。以後、ＵｎｉＺＡＰ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いてｃＤＮＡを合成、ＧＩＧＡＰＡＣＫ ＧＯＬＤ ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いてパッケージングしてｃＤＮＡライブラリーを作製した。
ＩＰＴＧ誘導によりｃＤＮＡを発現させた５０，０００個のプラークをＵｎｉＺＡＰ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の使用法に従いＰＶＤＦブロッティングメンブレン（イムノビロン；ミリポア社）に転写し、作製した抗体をプローブにスクリーニングを行った。得られたクローンのｃＤＮＡは、ＵｎｉＺＡＰ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔの使用法に従い、ＩＮ ＶＩＶＯ ＥＸＣＩＳＩＯＮによりｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−にサブクローニングした。得られた組換え大腸菌ＭＴ−１０７４３は工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０８として寄託されている。サブクローニングされたｃＤＮＡの塩基配列を決定したところ配列表の配列番号：５に記載の通りであった。該塩基配列には、配列表の配列番号：３及び４に記載のＤＮＡ塩基配列がそれぞれ第１１−３４番目と第３７７−４００番目に存在することが確認された。
【００２３】
実施例８ フィターゼゲノムＤＮＡのクローニング
５ｍｌ ＹＥＰＤ培地（１０％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、 ２０％ ポリペプトン、２０％ グルコースを含む）にシュワニオミセス オキシデンタリスを１白金耳植菌し、３０℃で一晩培養し、この培養液を１ｌのＹＥＰＤ培地に無菌的に植菌した。これをＯＤ６６０＝５．０まで培養し、２０００ｇで遠心分離して菌体を得た。得られた菌体を３０ｍｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ， ２５ｍＭ ＥＤＴＡ， ５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ ５．５）， ４ｍｇ／ｍｌ Ｎｏｖｏｚｙｍｅ２３４；Ｎｏｖｏ ＢｉｏＬａｂｓ， ２０ｍｇ／ｍｌ Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ；Ｓｅｉｋａｇａｋｕ） に懸濁して３０℃で１時間インキュベートした。プロトプラスト化を確認後、 Ｄｉｅｔｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ ５００μｌ， ０．５Ｍ ＥＤＴＡ １．２ｍｌ， ０．２Ｍ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ １．６ｍｌ， １０％ ＳＤＳ １．６ｍｌを加え、よく混合した後４℃で３０分間静置した。
その後、５Ｍ 酢酸カリウムを３．５ｍｌ混合し、２０００ｇ、１０分間の遠心分離を行い、上清を得た。等量のフェノール／クロロホルムで３回処理をした後、等量の２−プロパノールを加え、−２０℃で２時間静置した。その後、３０００ｇで１０分間遠心分離した後、沈澱を７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥後２ｍｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶かした。これに１／１００容量の１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。
等量のフェノール／クロロホルムで２回処理を行った後、１／１０容量の３Ｍ 酢酸ナトリウムを加え、２倍容量のエタノールを加えて−２０℃で２時間静置した。
得られたＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解し、９−２３ｋｂ断片を用いてＬＡＭＤＡ ＥＭＢＬ３／ＢａｍＨ Ｉ ＶＥＣＴＯＲ ＫＩＴ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）の使用法に従いゲノムライブラリーを作製した。
作製したゲノムライブラリーを用いてＬＡＭＤＡ ＥＭＢＬ３／Ｂａｍ ＨＩ ＶＥＣＴＯＲ ＫＩＴ ；ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥの使用法に従い目的のフィターゼをコードする遺伝子を含むフラグメントをクローニングした。プローブには実施例７で得られたｃＤＮＡを用いた。
得られたフラグメント中の約５．３ ｋｂのＸｈｏＩ断片をベクタープラスミドＹＥｐ２４のｓａｌＩ部位にサブクローニングし、ＹＥｐＧＰＨ １を作製した（図−８［図８］）参照）。尚、プラスミドＹＥｐ２４はアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）ＡＴＣＣ−３７０５１から常法により抽出した。
【００２４】
実施例９ シュワニオミセス オキシデンタリス由来フィターゼ分泌酵母の育種 Ｉｔｏらの方法（Ｉｔｏ，Ｈ．， Ｙ．Ｊｕｋｕｄａ， Ｋ．Ｍｕｒａｔａ， ａｎｄ Ａ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１５３，ｐ．１６３−１６８，（１９８３）．）に従い実施例８で得られたプラスミド（ＹＥｐＧＰＨ １）を用いてサッカロミセス セルビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３−１Ｂ株（Ｍａｔα ａｄｅ２−１ ｈｉｓ３−１１，１５ ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−１ ｔｒｐ１−１ ｃａｎ１−１００）の形質転換を行った。その結果、形質転換株ＭＴ−４０５３９が得られた。形質転換株ＭＴ−４０５３９は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０９として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。形質転換株ＭＴ−４０５３９とＹＥｐ２４を実施例１に記載の培地に必要なアミノ酸（２０ｍｇ／ｌ ａｄｅｎｉｎｅ， ２０ｍｇ／ｌ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ， ３０ｍｇ／ｌ ｌｅｕｃｉｎｅ， ２０ｍｇ／ｌ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）を加えた培地で培養し、培養菌体のフィターゼ活性を測定したところ、ＭＴ−４０５３９はＹＥｐ２４で形質転換したサッカロミセス セルビッシェＷ３０３−１Ｂ株よりも高いフィターゼ活性を示した。また、ＭＴ−４０５３９培養上清中に、ウエスタンブロット法により、実施例７（１）で作製した抗体で認識される蛋白質が検出された。結果を図−９［図９］に示す。
【００２５】
【発明の効果】
本発明のフィターゼは１種類のポリペプチドによって構成される酵素であって、これにより、これまで２種類のポリペプチドを生産しなければならなかった他のフィターゼと比較して経済的に有利な酵素生産、ミオ−イノシトール生産が可能となる。
また、本発明のフィターゼは高い至適温度および高い耐熱性を有しているため、従来技術では使用できなかった温度範囲での酵素反応が可能になる。
また、この酵素をコードする遺伝子をクローニングすることにより酵素の大量生産、変異技術（例えば部位特異的突然変異誘発など）で本発明の方法で生産した野生型または組換えフィターゼとは性質（最適ｐＨ、最適温度、熱安定性、対溶媒安定性、比活性、基質親和性、分泌能、翻訳速度、転写制御など）の異なるフィターゼ（第二世代酵素）の作出を容易にする。
また、この遺伝子は類似の性質を持つフィターゼのスクリーニングにも利用することが出来る。
また、本発明によれば、より効率的なミオ−イノシトールの生産が可能となる。
【００２６】
【配列表】
【００２７】
【００２８】
【００２９】
【００３０】
【図面の簡単な説明】
【図１】シュワニオミセス オキシデンタリスの培養液中に含まれるフィターゼ活性の経時変化を示す図である。黒丸はＣａＣＯ３を含まない低リン酸フィターゼ誘導培地での培養液中のフィターゼ活性の変化を示し、白丸はＣａＣＯ３を含む低リン酸フィターゼ誘導培地での培養液中のフィターゼ活性を示している。
【図２】シュワニオミセス オキシデンタリス由来の５０ｋＤ±５ｋＤの精製フィターゼの各ｐＨにおける相対活性を示す図である。活性は２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ４．４）中で反応を行った場合の活性を１００％とした相対活性を示し、黒丸は反応に２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを用いた場合、白丸は２０ｍＭフタル酸バッファーを用いた場合の活性を示す。
【図３】シュワニオミセス オキシデンタリス由来の５０ｋＤ±５ｋＤの精製フィターゼの活性に対する温度依存性を示す図である。活性は７０℃での値を１００とした相対活性で示される。
【図４】シュワニオミセス オキシデンタリス由来の５０ｋＤ±５ｋＤの精製フィターゼの温度耐性を示す図である。値はインキュベート前の活性を１００％として相対活性で示した。
【図５】シュワニオミセス オキシデンタリス由来の５０ｋＤ±５ｋＤの精製フィターゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した場合の電気泳動写真である。レーン１は分子サイズマーカーＨ（ＢＩＯＲＡＤ）、レーン２は分子サイズマーカＬ（ＢＩＯＲＡＤ）、レーン３は脱糖鎖前の精製酵素、レーン４は実施例２に示す方法で脱糖鎖した精製酵素、レーン５はＥｎｄｏ Ｈを２０ ｕｎｉｔ使用して脱糖鎖を行った精製酵素、レーン６はＥｎｄｏ Ｈ反応前に行う変性処理を行わずに２０ｕｎｉｔのＥｎｄｏ Ｈにより脱糖鎖を行った精製酵素、レーン７はＥｎｄｏ Ｈのみをそれぞれ泳動したものであることを示している。
【図６】精製酵素による反応後の反応液中のミオ−イノシトールの蓄積濃度の経時変化を示す図である。
【図７】シュワニオミセス オキシデンタリスの培養上清及び菌体破砕物のウエスタンブロット法による解析を示す電気泳動写真である。レーン１は分子サイズマーカＬ（ＢＩＯＲＡＤ社）、レーン２及び３はそれぞれＥｎｄｏ Ｈ処理を施した培養上清及び菌体破砕物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、レーン４及び５は同泳動条件における培養上清及び菌体破砕物のウエスタン解析をそれぞれ示している。
【図８】ＹＥｐ２４およびＹＥｐＧＰＨ １のプラスミドマップを示す。
【図９】ＭＴ−４０５３９の培養上清の銀染色法およびウエスタンブロット法による解析を示す電気泳動写真である。レーン１及びレーン６は分子サイズマーカＬ（ＢＩＯＲＡＤ社）、レーン２及びレーン７はシュワニオミセス オキシデンタリスの培養上清より精製したフィターゼをＥｎｄｏ Ｈにより脱糖鎖を行ったサンプル、レーン３及びレーン８は空きレーン、レーン４及びレーン９はサッカロミセス セルビッシェＷ３０３−１Ｂ株にＹＥｐ２４を形質転換した菌体の培養上清をＥｎｄｏ Ｈにより脱糖鎖を行ったサンプル、レーン５及びレーン１０はＭＴ−４０５３９の培養上清をＥｎｄｏ Ｈにより脱糖鎖を行ったサンプルをそれぞれ示している。
【産業上の利用分野】
本発明は新規なフィターゼ、該フィターゼを構成するサブユニットをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを含む形質転換微生物及び該微生物により生産されたフィターゼを用いたフィチン酸塩をミオ−イノシトールに変換する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フィターゼは、フィチン酸を脱リン酸させるホスファターゼであり、フィチン酸の６位のリン酸を加水分解するものを６−フィターゼ（ＥＣ．３．１．３．２６．）、フィチン酸の３位のリン酸を加水分解するものを３−フィターゼ（ＥＣ．３．１．３．８．）と呼び、通常単にフィターゼと称されるものは６−フィターゼである。フィターゼは、高等植物、動物および微生物に存在する。例えば高等植物由来のものとしては、マング・ビーン（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）（Ｎ．Ｃ．Ｍａｎｄａｌら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１１：ｐｐ．４９５−５０２，（１９７２））、小麦（Ｐ．Ｅ．Ｌｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，ｖｏｌ．３０２：ｐｐ．３１６−３２８，（１９７３））由来のものが知られており、微生物由来のものとしては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Ｇ．Ｃ．Ｊ．Ｉｒｖｉｎｇら、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４：ｐｐ．５４７−５５７，（ １９７１）），枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｖ．Ｋ．Ｐａｖｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．，ｖｏｌ．１５１：ｐｐ．１１０２−１１０８，（１９８２）），クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（Ｖａｒｓｈａ Ｓｈａｈら、Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ｖｏｌ．２７：ｐｐ．９８−１０２，（１９９０））， アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（Ａｂｕｌ Ｈ．Ｊ．Ｕｌｌａｈら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１７：ｐｐ．６３−９１，（１９８７）（欧州特許公開０３２１００４、欧州特許公開０４２０３５８、欧州特許出願９２−２００４１４、ＷＯ９４０３６１２），シュワニオミセス カステリ（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ Ｃａｓｔｅｌｌｉ）ＣＢＳ ２８６３，（Ｐ．Ｇａｌｚｙら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．７４．１：ｐｐ．７−１１，（１９９２）由来のものが知られている。尚、Ｇａｌｚｙらに開示されている、シュワニオミセス カステリ ＣＢＳ ２８６３は現在シュワニオミセス オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）ＩＦＯ １８４０に再分類されている（Ｋｒｅｇｅｒｍ ｖａｎ Ｒｉｊ ｅｔ ａｌ．：ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ， ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ， ３ｒｄ ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｔｈｅ Ｎｅｒｔｈｅｒｌａｎｄｓ，（１９８４））（ＬＩＳＴ ＯＦ ＣＵＬＴＵＲＥ ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ， ９ｔｈ ｅｄ．：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｏｓａｋａ，ｐｐ７５−７６，（１９９２））。
フィターゼの基質であるフィチン酸（イノシトールヘキサキスリン酸）はミオ−イノシトール（以後単にイノシトールということがある）の６リン酸であり、フィチン酸のカルシウム−マグネシウム混合塩であるフィチンは全てのナッツ、穀物、豆類、種子、胞子、及び花粉にリン酸の主要貯蔵物質として１〜３％含まれる（Ｅ．Ｇｒａｆら、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．６０：ｐｐ．１８６１−１８６７，（１９８３））。
【０００３】
近年、穀物、種子を多く含む飼料を用いて飼育される家畜（単胃動物）の排せつ物中のリン酸が河川等を汚染することが問題化している。その対策として、フィターゼを飼料添加剤として家畜飼料中に混入させ、飼料中のフィチン酸塩をフィターゼにより分解することにより排せつ物中のリン酸源濃度を低減させる試みがなされている。
しかし、従来知られているフィターゼは、６８℃、１０分間の処理により活性が４０％に減少する（Ａｂｕｌ Ｈ．Ｊ．Ｕｌｌａｈら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１８：ｐｐ．４８３−４８９，（１９８８））。そのため、飼料添加物として使用する場合、飼料成形中の温度（７５−８５ ℃）では大部分の活性が失われてしまうため飼料形成が不可能であるか、乾燥工程を大幅に変更する必要がある。
【０００４】
一方、フィターゼを用いてミオ−イノシトールの製造に利用する試みがなされている。従来、コーンスティープリカーや米ぬかなどからフィチンを抽出し、さらに高温高圧下でフィチンを加水分解することによりミオ−イノシトールが工業的に生産されている。しかしフィチンの加水分解は、特殊な装置や大量のエネルギーを必要とするため、生産コストの点で問題がある。
そこで、常温常圧下でフィチン酸塩を加水分解することのできる酵素を用いてイノシトールを生産する方法が考案され、アスペルギルス属に属する微生物（Ａｂｕｌ Ｈ．Ｊ．Ｕｌｌａｈら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１８：ｐｐ．４８３−４８９，（１９８８））やシュワニオミセス オキシデンタリス（前出）などの微生物を用いてのフィチンの加水分解反応が報告されている。
しかし、これらの反応を触媒する酵素のうち、アスペルギルス属に属する微生物の産生するフィターゼは、フィチン酸またはその塩からイノシトールモノリン酸までは加水分解するが、それ以上すなわちミオ−イノシトールまでは加水分解することができない。そのためミオ−イノシトールまで加水分解するためには他の酵素、例えば酸性ホスファターゼなどの併用が必要である。このことはイノシトールの製造において経済性の点から好ましくない。
最近になって、フィチン酸のナトリウム塩をミオ−イノシトールまで完全に分解することが可能で、しかも熱安定性が７４℃と比較的高いフィターゼをシュワニオミセス オキシデンタリスが生産することが見いだされた。
【０００５】
一般に、フィターゼは脱リン酸酵素（ホスファターゼ）の一種であるからその誘導にはネガティブな調節を解除するためリン酸濃度を低くした培地、もしくはポジティブな調節である誘導の強化の観点からフィチン酸の塩を唯一のリン酸源とした培地を使用すればよい。Ｐ．Ｇａｌｚｙら（前出）は、シュワニオミセス オキシデンタリスの培養液中のリン酸濃度を低く保つためケモスタットによる連続培養を行いフィターゼの生産を行っている。しかし該酵素の分泌量は、Ｐ．Ｇａｌｚｙら（前出）によれば０．１５ ｍｇ／ｌと極めて低かった。この様な場合遺伝子工学的手法を用いて該酵素の大量生産を試みることが考えられる。しかし、当該フィターゼをコードする遺伝子は未だ未同定である。また、Ｐ．Ｇａｌｚｙら（前出）によれば該フィターゼの分子構成は、α（１２５ｋＤ）及びβ（７０ｋＤ）の２つのサブユニットからなる４量体（α：β＝１：３）であるため、遺伝子工学的手法を用いて該酵素を大量生産するためには同一細胞内で２種のサブユニットを発現させる必要がある。このことは２種のサブユニッットをコードする２種の遺伝子の発現をコントロールするために、高度な遺伝子工学的手法を必要とし、また異種宿主での高次（４次）構造形成の点から必ずしも望ましくない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、フィチン酸塩或いはその塩をミオ−イノシトールまで完全に分解することが可能で、熱安定性に優れ、しかも従来知られているフィターゼよりも構造的に単純で、該酵素の遺伝子工学的手法を用いた大量生産が可能なフィターゼ提供することにある。
また、本発明の他の目的は、上記フィターゼをコードするの遺伝子、該遺伝子を含む形質転換微生物を提供することにある。
さらに、本発明の他の目的は、該形質転換微生物を用いてフィチン酸塩をミオ−イノシトールに変換する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、既にフィターゼを生産することが報告されているシュワニオミセス オキシデンタリスを弱酸のカルシウム塩を含むリン酸源濃度の低い培地で培養することにより、公知のフィターゼとは異なる単一サブユニットからなる新規なフィターゼが分泌生産されることを見いだし、該知見に基づき本発明に至った。
【０００８】
即ち、本発明はフィチン酸塩をミオ−イノシトールまで加水分解することができ、単一のサブユニットよりなるフィターゼ、シュワニオミセス オキシデンタリス由来の脱糖鎖後の分子サイズがＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で５０ｋＤ±５ｋＤであるフィターゼサブユニットをコードする遺伝子、該遺伝子を含む形質転換微生物、該微生物が生産するフィターゼを用いたフィチン酸塩をミオ−イノシトールに変換する方法を提供するものである。
【０００９】
本発明のフィターゼはフィチン酸塩をミオ−イノシトールまで加水分解すること、即ち、フィチン酸に結合している６つのリン酸を完全に加水分解することが出来る酵素であり、１種類のサブユニットから構成されている。
本発明のフィターゼの例として、シュワニオミセス オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）由来のものが挙げられる。このフィターゼは糖蛋白質である。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼを構成するサブユニットは、脱糖鎖後の分子サイズがＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で５０ｋＤ±５ｋＤである。また、該サブユニットは少なくとも配列表の配列番号：１あるいは、及び配列番号：２のアミノ酸配列を含んでいる。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼは上記サブユニットを３〜５個、通常は４個会合した４量体として存在しているものと思われる。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼは耐熱性を有する。即ち、該酵素は７０℃以下の温度で３０分間の処理条件で約９０％の残存活性が確認され、７５℃で３０分間の処理条件でも約５０％の残存活性が確認される。この様に耐熱性を有するフィターゼは、該酵素を飼料添加剤に混合する場合、高温での飼料の成形が可能になるので有効である。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼはまた、該酵母をＣａＣＯ３等の弱酸のカルシウム塩を含むリン酸濃度の低い培地で培養することにより誘導分泌される。例えば、通常の酵母の培養に使用される培地にカルシウム塩を０．０１〜１％、好ましくは０．０５〜０．５％程度添加した培地で培養することにより、培地中に誘導的に蓄積してくる。
この様なシュワニオミセス オキシデンタリスのフィターゼの誘導的分泌の原因は必ずしも明らかではないが、本発明者らがＰ．Ｇａｌｚｙら（前出）を参考にフィチン酸の塩を唯一のリン酸源とした培地を用いたバッチ法による培養を検討したところ、培養液中にフィターゼ活性はほとんど検出されず、炭酸カルシウムを培地に添加して培養したところ、培地中のフィターゼ活性が顕著に上昇したことから、フィターゼが誘導される原因は、フィチンの分解によりわずかに遊離したリン酸によるフィターゼの発現の抑制が弱酸のカルシウム塩で解除されるためでないかと考えらる。
【００１０】
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子は、シュワニオミセス オキシデンタリスから種々の方法でクローニングすることができるが、該遺伝子が真核生物由来のため、イントロンが存在する可能性があることを考慮すれば、例えばシュワニオミセス オキシデンタリスＩＦＯ １８４０のｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを大腸菌の発現ベクターに組み込み作製したｃＤＮＡ発現ライブラリーから該サブユニットと特異的に反応する抗体をプローブとしてクローンを得ることができる。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子のｃＤＮＡの長さは１６３１ｂｐであり、該ＤＮＡは、具体的には例えば配列表の配列番号：５に記載の塩基配列であり、少なくとも配列表の配列番号：３、配列番号：４のＤＮＡ塩基配列を含んでいる。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子は、宿主細胞中で複製可能なベクターに連結することにより組換えプラスミドを作製し、これを適当な微生物に形質転換することにより異種生物中で発現させることができる。本発明のシュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼサブユニットをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドとしてはＹＥｐＧＰＨ １（図−８（［図８］））が例示できる。
また、シュワニオミセス オキシデンタリスの染色体遺伝子を部分分解して作成したゲノムライブラリーからｃＤＮＡとハイブリダイズするフラグメントを含むクローンが得られる。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドは、適当な宿主に例えば形質転換などの方法で導入することにより、該遺伝子を発現させ、更に多くのフィターゼを菌体内或いは菌体外に生産させることができる。
シュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子を発現させるためには、異種タンパク質生産が可能な系がすでに開発されている大腸菌、枯早菌、酵母、糸状菌を宿主とする宿主ベクター系を利用することが有効である。そして、該宿主の中で機能することが知られている適当なプロモーター、分泌シグナルの直後にフィターゼの成熟蛋白をコードする遺伝子を接続し、適当なベクターに連結することより形質転換するか、染色体に組み込むことにより本酵素を生産することができる。
本発明者らは、得られたゲノムＤＮＡフラグメントをサッカロミセス セルビッシェのベクタープラスミドであるＹＥｐ２４中に組み込み、このプラスミドでサッカロミセス セルビッシェを形質転換することによりシュワニオミセス オキシデンタリス由来のフィターゼ酵素を生産することに成功した。
上記組換えプラスミドにより形質転換することにより得られた微生物としては、大腸菌、酵母が例示され、具体的には大腸菌の中でも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０７４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０８）、酵母としてはサッカロミセス セルビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＴ−４０５３９ （ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０９）が例示される。これらの微生物は、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約に基づいて寄託されており、ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０８或いはＦＥＲＭ ＢＰ−５１０９はその寄託番号を表している。
尚、本発明の元の明細書においてＦＥＲＭ ＢＰ−５１０８はＦＥＲＭ Ｐ−１４２８７として、ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０９はＦＥＲＭ Ｐ−１４２８７として記載されている。寄託番号の相違は、これら菌株が共に平成７年５月２５日をもって原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管手続きがなされたため、これに伴い寄託番号が上記のとおりに変更されたことによる。
【００１１】
上記の形質転換された微生物を培養してフィターゼを製造するための培養方法は、通常の微生物の培養方法を用いることができる。
培地としては、形質転換された微生物に好適なものであれば特に制限はないが、遊離したリン酸によるフィターゼの発現の抑制を解除するために弱酸のカルシウム塩を含有することが好ましい。
上記培地を用いて通常の培養条件（温度・ｐＨ・通気・時間）で培養することにより、フィターゼを製造することができる。フィターゼを種々の用途に使用するためには、上述の通り培養して得られた培養液、菌体及びその処理物はフィターゼ酵素源として利用することができる。菌体の処理物としては、菌体を自己消化や有機溶媒による溶菌、超音波処理、ホモジナイズなどの処理により破壊したもの、及び該破壊物の粗精製物、並びに培養液、菌体から分離精製されたフィターゼ酵素蛋白質、更には培養により得られた菌体、菌体或いは培養液から分離精製された酵素蛋白質をアルギン酸ナトリウム、κ−カラギーナン、ポリアクリルアミドなどの固定化剤を用いて固定化したものを含む。
【００１２】
以上の通りにして得られたフィターゼ或いはシュワニオミセス オキシデンタリス由来の、脱糖鎖後の分子サイズがＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で５０ｋＤ±５ｋＤであるサブユニットよりなるフィターゼはフィターゼ酵素源として種々の用途、例えば飼料添加物或いはイノシトールの生産に使用可能である。
上記のフィターゼ酵素源の存在下、フィチン酸塩をミオ−イノシトールに変換するためには、フィチン酸カルシウムなどのフィチン酸塩を含むバッファー中にフィターゼ酵素源を添加して反応させればよい。
【００１３】
【実施例】
本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の内容を何等限定するものではない。
【００１４】
実施例１ 炭酸カルシウム添加によるフィターゼの高発現誘導
１リットルあたりｇｌｕｃｏｓｅ １０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３ｇ、 ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ、 ＫＣｌ ０．５ｇ， ＣａＣｌ２ ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３ ０．１３５ｇ、微量金属、イノシトール以外の各種ビタミン類、初期増殖のためにｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．０３ｇ、唯一のリン酸源としてＣａｌｃｉｕｍ Ｐｈｙｔａｔｅ ０．６ｇ、高発現誘導のためＣａＣＯ３ １ｇを含む培地を調製した。この培地３０ｍｌをバッフル付き三角フラスコに入れ、シュワニオミセス オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ） ＩＦＯ １８４０を植菌し、２８℃で２日間培養した。対照として上記培地からＣａＣＯ３を除いた培地を使用して比較した。
培養の終わった培養液をａｍｉｃｏｎ ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０ ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを用いて限外濾過することにより１０倍に濃縮した後、透析した。透析された液のフィターゼ活性を以下のように測定した。即ち、透析された液１００μｌに基質水溶液（６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ４．４）、 ５ｍＭフィチン酸ナトリウムを含む）９００μｌを加え、７０℃で３０分間反応した。反応終了後、反応液に５Ｎ Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ添加して反応を停止した。対照として基質を含むバッファー液に予め５Ｎ Ｈ２ＳＯ４ １００μｌを加えたものに酵素液を加えた画分を用意した。反応停止後、反応液を９６穴マイクロタイタープレート上で１〜２０４８倍に希釈し、希釈液１００μｌあたり５０μｌのリン酸検出液（Ａ液；１．４７ｇ／ｌ マラカイトグリーン， ２０％ Ｈ２ＳＯ４： Ｂ液；７．５％ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｍｏｌｙｂｄａｔｅ： Ｃ液；１１％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０とし、使用直前にＡ液：Ｂ液：Ｃ液＝５０：１２．５：１に混合したもの） を加え３０分間振とう後、ＡＢＳ６２０を測定した。１〜１０ｎＭの範囲のリン酸校正曲線により、得られた測定値から、放出されたリン酸量を決定した。フィターゼ活性の単位は１分間にリン酸を１μｍｏｌｅ放出する活性を１ｕｎｉｔとした。結果を図−１［図１］に示す。炭酸カルシウムを加えた誘導培地で培養した培養液中にはフィターゼ活性が検出され、炭酸カルシウムを加えない非誘導培地で培養した培養液からはフィターゼ活性は殆ど検出されなかった。
【００１５】
実施例２ フィターゼ酵素活性の測定と分子サイズの測定
（１） 酵素の脱糖鎖
次に本発明者らは実施例１に記載の培養条件で誘導され、培地中に分泌・蓄積したフィターゼの酵素学的な性状を明らかにするために酵素の精製を試みた。
本酵素は糖蛋白であることが予備的な実験より明らかになった。この様な蛋白質は電気泳動で明瞭なバンドを与えにくいことが多い。そのため、電気泳動により単一のバンドを得るため、予めＥｎｄｏ Ｈにより脱糖鎖処理を行った。酵素の脱糖鎖は、酵素を終濃度１０ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ ５．２）、１００ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．００２５％ ＳＤＳを含む溶液中で９５℃で５分間処理して変性させた後ゆっくりと室温に戻し、蛋白量１ｎｇ当り４μＵのＥｎｄｏ Ｈ（Ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｈ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を加え、３７℃で１晩反応を行った。
尚、以下の実験で活性を測定するものと電気泳動する試料は、１０ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ ５．２）の溶液に、蛋白量１ｎｇあたり４μＵのＥｎｄｏ Ｈを加え、３７℃で１晩反応する処理を行った。
【００１６】
（２） 粗酵素中の加水分解活性の検出と分子サイズの測定
実施例２でＥｎｄｏ Ｈによる脱糖鎖処理を行った粗酵素標品をＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥにより電気泳動した。銀染色、及び加水分解活性染色を行い単一で加水分解活性を示すバンドを検出した。
加水分解活性染色は、電気泳動が終了したゲルを０．１％ α−ナフチルホスフェート、０．２％ ファーストガーネットＧＢＣ塩、０．６Ｍ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）の溶液中で一晩インキュベートした。その際加水分解活性のあるバンドは黒色のバンドとして検出される。上記バンドにあたるポリペプチドのフィターゼ活性を確認するためにこのバンドに当たるポリペプチドをフィチン酸ナトリウムと反応させ、生成するリン酸量及びミオ−イノシトール量を定量しフィターゼ活性を測定したところ、リン酸及びミオ−イノシトールの生成が認められた。
また、該ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子サイズを測定したところ、当該酵素の分子サイズは５０ｋＤ±５ｋＤであることが分かった（図−５［図５］）。これはシュワニオミセス オキシデンタリスのフィターゼサブユニットとして既に知られているα、βサブユニットとは明らかに異なっていた。
さらに詳しく解析するためにこのポリペプチドを精製し、家兎に免疫し、アフィニティーカラムにより精製することで目的のポリペプチドに特異的な抗体を得た。該抗体を用いたウエスタンブロットの解析から、該抗体はシュワニオミセスオキシデンタリスのフィターゼサブユニットとして既に知られているα、βサブユニットとは明らかに分子サイズの異なる５０ｋＤのバンドと反応した。
以上のことから、炭酸カルシウムを加えた誘導培地で培養した際に培養液中に検出されるフィターゼ活性を有する酵素は、これまで知られていない新規のものであると結論した。
【００１７】
実施例３ 培養上清液からのフィターゼの精製
シュワニオミセス オキシデンタリスを実施例１に記載の培地２０ｍｌに植菌し、２８℃で一晩培養した。培養後、培養液全量を２ｌの同一培地に無菌的に加え、２８℃で２日間培養した。最終的に得られた培養液を遠心分離することにより培養上清約２ｌを得た。得られた培養上清はエバポレーターにより５０〜６０℃で２００ｍｌまで濃縮した後、濃縮液を透析した。この透析液を再びエバポレーターにより２０ｍｌまで濃縮し、透析した。得られた粗酵素溶液を１０ｍｌのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗカラム（ファルマシア社製）にアプライし、カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ， ｐＨ ７．５， ５０ ｍｌにより洗浄した。溶出は、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ， ｐＨ ７．５各２０ｍｌを順次流して行った。２０ｍｌ毎に溶出液を分取し、各溶出画分を透析後、フィターゼ活性を測定した。
得られた酵素の至適ｐＨ、至適温度、温度耐性を調べた。
酵素の至適ｐＨは、実施例１に記載の活性測定法に準じて活性測定を行い、その際２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーと２０ｍＭフタル酸バッファーを用い、活性測定中のＰＨを変えた。実験の結果、本酵素の至適ｐＨはｐＨ ２．７−５．０の範囲であることがわかった（図−２［図２］）。
酵素の至適温度は、実施例１に記載の活性測定法に準じて活性測定を行い、その際酵素反応の温度を変化させた。実験の結果、本酵素の至適温度は約７０℃であることがわかった（図−３［図３］）。
酵素の温度耐性は、酵素を２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ４．４）中で３０分間インキュベートした後、該処理酵素液を用いて実施例１に記載の活性測定法に準じて活性測定をして行った。その結果、酵素の残存活性は７０℃で約９０％、７５℃で５０％あった（図−４［図４］）。
【００１８】
実施例４ フィターゼによるミオ−イノシトールの生産
１００ ｇ／ｌのフィチン酸カルシウムを含む溶液（ｐＨ ４．０）に実施例３で精製されたフィターゼを８Ｕ／ｍｌになるように添加し、５０℃で反応を行った。蓄積したミオ−イノシトールは高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を図−６［図６］に示す。
【００１９】
実施例５ Ｎ末端アミノ酸配列の決定
精製した酵素をＥｎｄｏ Ｈにより脱糖鎖した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｅｐ−Ｃｅｌｌ Ｍｏｄｅｌ ４９１ により脱糖鎖が不完全であるものを取り除いた。この酵素を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより泳動し、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｂｌｏｔｔｉｎｇ装置によりＰＶＤＦブロッティングメンブレンフィルター（イムノビロン；ミリポア社）へ電気泳動的に移した。メンブレンフィルターを洗浄した後、ポンソー試薬による発色で蛋白の位置を検出した。目的のバンドを切り出し、乾燥させた後、アミノ酸シークエンサー（島津製作所製）により分析を行った。結果を配列表の配列番号：１に示す。
【００２０】
実施例６ Ｖ８ ｐｒｏｔｅａｓｅによる部分分解産物のＮ末端アミノ酸配列の決定
実施例２に記載の方法により脱糖鎖した５０ｋＤの分子サイズを示す酵素２００−４００μｇをサンプルバッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ６．８）， ０．１％ ＳＤＳ， １０％ グリセロールを含む）に溶解し、Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｕｕｓ属細菌由来のＶ８（Ｇｌｕ−ｃ）ｐｒｏｔｅａｓｅ １μｇをｐｒｏｔｅａｓｅ用バッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ６．８）， ０．１％ ＳＤＳ， ５％ グリセロール）に溶解した。
１７％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにまず酵素を溶解したサンプルをのせ、つぎにＶ８ ｐｒｏｔｅａｓｅを溶解したサンプルを静かに重層した。これを泳動し、Ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌとＳｅｐａｒａｔｉｏｎ ｇｅｌの境界付近にＢＰＢマーカーが来たところで３０分間泳動を止め、Ｐｒｏｔｅａｓｅと酵素を反応させた。その後、再び泳動し、部分分解した酵素のＮ末端アミノ酸配列を実施例４に記述した方法により決定した。結果を配列表の配列番号：２に示す。
【００２１】
実施例７ フィターゼｃＤＮＡのスクリーニング
（１） 抗体の作製
実施例２（１）に記載の方法により脱糖鎖した５０ｋＤの分子サイズを示す酵素溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌと完全アジュバンド（Ｆｒｅｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｄ）（ＤＩＦＣＯ社製）１００μｌを混合してエマルジョン化し、これを接種液とした。
接種はうさぎの皮下に数回に分けて行い、２、４、６週間後に追免疫を行った。抗体価の上昇はＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法により免疫前に採取した血清と比較することにより観察した。
最終的に得られた血清は０．１ｇのＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂに１ｍｇの脱糖鎖後の精製酵素をｃｏｕｐｌｉｎｇして作製したアフィニティーカラムにより精製した。
精製された抗体はウエスタンブロット法により、脱糖鎖後の粗酵素から５０ｋＤ、及びその分解産物と思われる約３０ｋＤのバンドを示した。結果を図−７［図７］に示す。
【００２２】
（２） フィターゼｃＤＮＡのクローニング
実施例４に記載の方法でＯＤ６６０＝１．０まで菌体を培養し、遠心集菌後、同時に沈澱するＣａＣＯ３を除くためｐＨ３．５の酢酸ナトリウムバッファーで菌体を洗浄し、次に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ ７．０により洗浄して菌体を得た。
得られた菌体は、液体窒素を用いて凍らせた後、海砂とともにすり鉢を使用して破砕した。この粉にＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ファルマシア社）のｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加え均一に混合した後、４℃、２０００Ｇで遠心分離して上清を取り、全ＲＮＡを得た。この後、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔの使用法に従いｍＲＮＡを得た。以後、ＵｎｉＺＡＰ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いてｃＤＮＡを合成、ＧＩＧＡＰＡＣＫ ＧＯＬＤ ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いてパッケージングしてｃＤＮＡライブラリーを作製した。
ＩＰＴＧ誘導によりｃＤＮＡを発現させた５０，０００個のプラークをＵｎｉＺＡＰ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の使用法に従いＰＶＤＦブロッティングメンブレン（イムノビロン；ミリポア社）に転写し、作製した抗体をプローブにスクリーニングを行った。得られたクローンのｃＤＮＡは、ＵｎｉＺＡＰ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔの使用法に従い、ＩＮ ＶＩＶＯ ＥＸＣＩＳＩＯＮによりｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−にサブクローニングした。得られた組換え大腸菌ＭＴ−１０７４３は工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０８として寄託されている。サブクローニングされたｃＤＮＡの塩基配列を決定したところ配列表の配列番号：５に記載の通りであった。該塩基配列には、配列表の配列番号：３及び４に記載のＤＮＡ塩基配列がそれぞれ第１１−３４番目と第３７７−４００番目に存在することが確認された。
【００２３】
実施例８ フィターゼゲノムＤＮＡのクローニング
５ｍｌ ＹＥＰＤ培地（１０％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、 ２０％ ポリペプトン、２０％ グルコースを含む）にシュワニオミセス オキシデンタリスを１白金耳植菌し、３０℃で一晩培養し、この培養液を１ｌのＹＥＰＤ培地に無菌的に植菌した。これをＯＤ６６０＝５．０まで培養し、２０００ｇで遠心分離して菌体を得た。得られた菌体を３０ｍｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ， ２５ｍＭ ＥＤＴＡ， ５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ ５．５）， ４ｍｇ／ｍｌ Ｎｏｖｏｚｙｍｅ２３４；Ｎｏｖｏ ＢｉｏＬａｂｓ， ２０ｍｇ／ｍｌ Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ；Ｓｅｉｋａｇａｋｕ） に懸濁して３０℃で１時間インキュベートした。プロトプラスト化を確認後、 Ｄｉｅｔｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ ５００μｌ， ０．５Ｍ ＥＤＴＡ １．２ｍｌ， ０．２Ｍ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ １．６ｍｌ， １０％ ＳＤＳ １．６ｍｌを加え、よく混合した後４℃で３０分間静置した。
その後、５Ｍ 酢酸カリウムを３．５ｍｌ混合し、２０００ｇ、１０分間の遠心分離を行い、上清を得た。等量のフェノール／クロロホルムで３回処理をした後、等量の２−プロパノールを加え、−２０℃で２時間静置した。その後、３０００ｇで１０分間遠心分離した後、沈澱を７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥後２ｍｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶かした。これに１／１００容量の１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。
等量のフェノール／クロロホルムで２回処理を行った後、１／１０容量の３Ｍ 酢酸ナトリウムを加え、２倍容量のエタノールを加えて−２０℃で２時間静置した。
得られたＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解し、９−２３ｋｂ断片を用いてＬＡＭＤＡ ＥＭＢＬ３／ＢａｍＨ Ｉ ＶＥＣＴＯＲ ＫＩＴ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）の使用法に従いゲノムライブラリーを作製した。
作製したゲノムライブラリーを用いてＬＡＭＤＡ ＥＭＢＬ３／Ｂａｍ ＨＩ ＶＥＣＴＯＲ ＫＩＴ ；ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥの使用法に従い目的のフィターゼをコードする遺伝子を含むフラグメントをクローニングした。プローブには実施例７で得られたｃＤＮＡを用いた。
得られたフラグメント中の約５．３ ｋｂのＸｈｏＩ断片をベクタープラスミドＹＥｐ２４のｓａｌＩ部位にサブクローニングし、ＹＥｐＧＰＨ １を作製した（図−８［図８］）参照）。尚、プラスミドＹＥｐ２４はアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）ＡＴＣＣ−３７０５１から常法により抽出した。
【００２４】
実施例９ シュワニオミセス オキシデンタリス由来フィターゼ分泌酵母の育種 Ｉｔｏらの方法（Ｉｔｏ，Ｈ．， Ｙ．Ｊｕｋｕｄａ， Ｋ．Ｍｕｒａｔａ， ａｎｄ Ａ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１５３，ｐ．１６３−１６８，（１９８３）．）に従い実施例８で得られたプラスミド（ＹＥｐＧＰＨ １）を用いてサッカロミセス セルビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３−１Ｂ株（Ｍａｔα ａｄｅ２−１ ｈｉｓ３−１１，１５ ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−１ ｔｒｐ１−１ ｃａｎ１−１００）の形質転換を行った。その結果、形質転換株ＭＴ−４０５３９が得られた。形質転換株ＭＴ−４０５３９は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０９として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。形質転換株ＭＴ−４０５３９とＹＥｐ２４を実施例１に記載の培地に必要なアミノ酸（２０ｍｇ／ｌ ａｄｅｎｉｎｅ， ２０ｍｇ／ｌ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ， ３０ｍｇ／ｌ ｌｅｕｃｉｎｅ， ２０ｍｇ／ｌ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）を加えた培地で培養し、培養菌体のフィターゼ活性を測定したところ、ＭＴ−４０５３９はＹＥｐ２４で形質転換したサッカロミセス セルビッシェＷ３０３−１Ｂ株よりも高いフィターゼ活性を示した。また、ＭＴ−４０５３９培養上清中に、ウエスタンブロット法により、実施例７（１）で作製した抗体で認識される蛋白質が検出された。結果を図−９［図９］に示す。
【００２５】
【発明の効果】
本発明のフィターゼは１種類のポリペプチドによって構成される酵素であって、これにより、これまで２種類のポリペプチドを生産しなければならなかった他のフィターゼと比較して経済的に有利な酵素生産、ミオ−イノシトール生産が可能となる。
また、本発明のフィターゼは高い至適温度および高い耐熱性を有しているため、従来技術では使用できなかった温度範囲での酵素反応が可能になる。
また、この酵素をコードする遺伝子をクローニングすることにより酵素の大量生産、変異技術（例えば部位特異的突然変異誘発など）で本発明の方法で生産した野生型または組換えフィターゼとは性質（最適ｐＨ、最適温度、熱安定性、対溶媒安定性、比活性、基質親和性、分泌能、翻訳速度、転写制御など）の異なるフィターゼ（第二世代酵素）の作出を容易にする。
また、この遺伝子は類似の性質を持つフィターゼのスクリーニングにも利用することが出来る。
また、本発明によれば、より効率的なミオ−イノシトールの生産が可能となる。
【００２６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】シュワニオミセス オキシデンタリスの培養液中に含まれるフィターゼ活性の経時変化を示す図である。黒丸はＣａＣＯ３を含まない低リン酸フィターゼ誘導培地での培養液中のフィターゼ活性の変化を示し、白丸はＣａＣＯ３を含む低リン酸フィターゼ誘導培地での培養液中のフィターゼ活性を示している。
【図２】シュワニオミセス オキシデンタリス由来の５０ｋＤ±５ｋＤの精製フィターゼの各ｐＨにおける相対活性を示す図である。活性は２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ４．４）中で反応を行った場合の活性を１００％とした相対活性を示し、黒丸は反応に２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを用いた場合、白丸は２０ｍＭフタル酸バッファーを用いた場合の活性を示す。
【図３】シュワニオミセス オキシデンタリス由来の５０ｋＤ±５ｋＤの精製フィターゼの活性に対する温度依存性を示す図である。活性は７０℃での値を１００とした相対活性で示される。
【図４】シュワニオミセス オキシデンタリス由来の５０ｋＤ±５ｋＤの精製フィターゼの温度耐性を示す図である。値はインキュベート前の活性を１００％として相対活性で示した。
【図５】シュワニオミセス オキシデンタリス由来の５０ｋＤ±５ｋＤの精製フィターゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した場合の電気泳動写真である。レーン１は分子サイズマーカーＨ（ＢＩＯＲＡＤ）、レーン２は分子サイズマーカＬ（ＢＩＯＲＡＤ）、レーン３は脱糖鎖前の精製酵素、レーン４は実施例２に示す方法で脱糖鎖した精製酵素、レーン５はＥｎｄｏ Ｈを２０ ｕｎｉｔ使用して脱糖鎖を行った精製酵素、レーン６はＥｎｄｏ Ｈ反応前に行う変性処理を行わずに２０ｕｎｉｔのＥｎｄｏ Ｈにより脱糖鎖を行った精製酵素、レーン７はＥｎｄｏ Ｈのみをそれぞれ泳動したものであることを示している。
【図６】精製酵素による反応後の反応液中のミオ−イノシトールの蓄積濃度の経時変化を示す図である。
【図７】シュワニオミセス オキシデンタリスの培養上清及び菌体破砕物のウエスタンブロット法による解析を示す電気泳動写真である。レーン１は分子サイズマーカＬ（ＢＩＯＲＡＤ社）、レーン２及び３はそれぞれＥｎｄｏ Ｈ処理を施した培養上清及び菌体破砕物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、レーン４及び５は同泳動条件における培養上清及び菌体破砕物のウエスタン解析をそれぞれ示している。
【図８】ＹＥｐ２４およびＹＥｐＧＰＨ １のプラスミドマップを示す。
【図９】ＭＴ−４０５３９の培養上清の銀染色法およびウエスタンブロット法による解析を示す電気泳動写真である。レーン１及びレーン６は分子サイズマーカＬ（ＢＩＯＲＡＤ社）、レーン２及びレーン７はシュワニオミセス オキシデンタリスの培養上清より精製したフィターゼをＥｎｄｏ Ｈにより脱糖鎖を行ったサンプル、レーン３及びレーン８は空きレーン、レーン４及びレーン９はサッカロミセス セルビッシェＷ３０３−１Ｂ株にＹＥｐ２４を形質転換した菌体の培養上清をＥｎｄｏ Ｈにより脱糖鎖を行ったサンプル、レーン５及びレーン１０はＭＴ−４０５３９の培養上清をＥｎｄｏ Ｈにより脱糖鎖を行ったサンプルをそれぞれ示している。
Claims (26)
- フィチン酸塩をミオ−イノシトールまで加水分解することができ、７０℃以下の温度で３０分間の熱処理で少なくとも９０％の残存活性を有し、脱糖鎖後の分子サイズがSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で50kD±5kDである単一のサブユニットよりなるフィターゼ。
- 微生物由来であることを特徴とする請求項１に記載のフィターゼ。
- 微生物が酵母であることを特徴とする請求項２に記載のフィターゼ。
- 酵母がシュワニオミセス属(Schwanniomyces)に属する酵母であることを特徴とする請求項３に記載のフィターゼ。
- シュワニオミセス属に属する酵母がシュワニオミセスオキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)であることを特徴とする請求項４に記載のフィターゼ。
- シュワニオミセスオキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)を培養することにより誘導的に発現されることを特徴とする請求項５に記載のフィターゼ。
- 該酵素が弱酸のカルシウム塩を含み、リン酸源濃度の低い培地でシュワニオミセスオキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)を培養することにより誘導的に発現されることを特徴とする請求項６に記載のフィターゼ。
- 弱酸のカルシウム塩がCaCO3である請求項７に記載のフィターゼ。
- 少なくとも配列番号：１および／または配列番号：２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１〜８の何れか一項に記載のフィターゼ。
- 配列表の配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項９に記載のフィターゼ。
- 大腸菌(Escherichia coli)FERM BP-5108により生産されるフィターゼ。
- サッカロミセスセルビッシェ(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-5109により生産されるフィターゼ。
- シュワニオミセスオキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)由来の遺伝子であり、脱糖鎖後の分子サイズがSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で50kD±5kDである請求項１に記載のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子。
- 遺伝子のＤＮＡ配列が配列表の配列番号：５に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である請求項１３に記載の遺伝子。
- 配列表の配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５に記載のＤＮＡ配列のうち、少なくとも１種のＤＮＡ配列を含む請求項１４に記載の遺伝子。
- ＤＮＡ配列が配列表の配列番号：５に記載のＤＮＡ配列である請求項１５に記載の遺伝子。
- シュワニオミセスオキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)由来の遺伝子であり、脱糖鎖後の分子サイズがSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で50kD±5kDである請求項１に記載のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子を含む組換えプラスミド。
- 請求項13に記載のフィターゼサブユニットをコードする遺伝子を有する組換えプラスミドYEpGPH 1。
- シュワニオミセスオキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)由来の遺伝子であり、脱糖鎖後の分子サイズがSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で50kD±5kDである請求項１に記載のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドにより形質転換された微生物。
- 微生物が大腸菌(Escherichia coli)である請求項１９に記載の微生物。
- 請求項１記載のフィターゼを生産する大腸菌(Escherichia coli)FERM BP-5108。
- 微生物が酵母である請求項１９に記載の微生物。
- 酵母がサッカロミセス セルビッシェ(Saccharomycescerevisiae)である請求項２２に記載の微生物。
- 請求項1記載のフィターゼを生産するサッカロミセス セルビッシェ(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-5109。
- シュワニオミセスオキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)由来の遺伝子であり、脱糖鎖後の分子サイズがSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で50kD±5kDである請求項１に記載のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドにより形質転換された微生物を培養して得られた培養液或いは菌体の処理物。
- シュワニオミセスオキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)由来の遺伝子であり、脱糖鎖後の分子サイズがSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で50kD±5kDである請求項１に記載のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドにより形質転換された微生物を培養して得られた培養液、菌体あるいは菌体の処理物を用いて、フィチン酸塩をミオ−イノシトールに変換する方法。
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