KR20170099510A

KR20170099510A - 박테로이데스 속 미생물 유래의 ｇａｂａ 생성 고활성 글루탐산탈탄산효소 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20170099510A
Application number: KR1020160021644A
Authority: KR
Inventors: 김태집; 남경화; 오세광; 장명운; 한남수
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-02-24
Filing date: 2016-02-24
Publication date: 2017-09-01
Also published as: KR101778878B1

Abstract

본 발명은 고효율로 감마-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 생산할 수 있는 신규한 글루탐산탈탄산효소 및 이를 이용한 감마-아미노부티르산의 제조에 관한 것이다.

Description

박테로이데스 속 미생물 유래의 ＧＡＢＡ 생성 고활성 글루탐산탈탄산효소 및 이의 용도{Highly active GABA-producing glutamate decarboxylase from Bacteroides sp. and use thereof}

감마-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)은 L-글루탐산 또는 글루탐산염의 탈탄산반응에 의해 생성되는 억제성 신경전달 물질로, 혈압 상승 억제, 시력 증진 및 진정작용 등 다양한 건강기능성 효과를 나타내어 식품 및 의약품 소재로 널리 활용되고 있다. GABA 는 글루탐산탈탄산효소(glutamate decarboxylase; GAD) 또는 이 효소를 생산하는 미생물의 작용에 의해 L-글루탐산 또는 글루탐산염으로부터 생성되므로, 효소 또는 미생물을 이용한 생물전환공정을 통해 GABA 함량을 높일 수 있다. 종래 GABA 생산에 관여하는 GAD 효소는 대부분 유산균에서 주로 발견되었으며, 특히, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 등의 락토바실러스 속 미생물 유래의 GAD 효소가 주로 연구되었다.

그러나, 보다 경제적이고 효율적인 GABA 생산을 위해서는 비활성(specific activity)이 높은 신규 효소의 발굴이 필수적이며, 이러한 고활성 GAD 효소를 사용할 경우, GABA 생산 단가를 낮추어 경쟁력을 높일 수 있을 것이라 기대된다.

국내특허등록 10-0675955(2007.02.02)

따라서, 본 발명은 기존 사용되던 유산균의 효소에 비하여 활성이 높으며 GABA를 고효율로 생산할 수 있는 신규한 효소 및 이를 이용한 기술을 제공한다.

일예는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 글루탐산탈탄산효소(glutamate decarboxylase, GAD)를 제공한다.

다른 예는, 상기 글루탐산탈탄산효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.

다른 예는, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

다른 예는, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

다른 예는, 박테로이데스(Bacteroides) EFEL 002 균주 (기탁번호 KACC91919P)를 제공한다.

다른 예는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 글루탐산탈탄산효소, 상기 글루탐산탈탄산효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포, 또는 박테로이데스 EFEL 002 균주를 포함하는, 감마-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid) 제조용 조성물을 제공한다.

다른 예는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 글루탐산탈탄산효소 또는 상기 글루탐산탈탄산효소를 포함하는 균주를 L-글루탐산 또는 글루탐산염 기질에 처리하는 단계를 포함하는, 감마-아미노부티르산의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서는 인간의 분변으로부터 분리한 장내 미생물 중 박테로이데스 속(Bacteroides sp.) 미생물 EFEL 002 (기탁번호: KACC91919P) 균주로부터 신규 GAD 효소(BtGAD)를 분리하고, 대장균에서 과다 발현 및 정제한 후, 기존에 알려진 GAD 효소와 활성을 비교하였다. 그 결과, BtGAD 효소는 기존에 GABA 의 효소적 또는 미생물학적 생산에 주로 이용된 유산균들의 GAD 효소와 약 40% 정도의 낮은 서열 상동성을 나타낼 뿐만 아니라, 기존의 GAD 효소와 비교하여 월등히 높은 효소 활성을 나타내며 L-글루탐산 또는 글루탐산염으로부터 GABA로의 전환율이 우수하다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 신규한 글루탐산탈탄산효소 및 이를 이용한 GABA 제조에 관한 발명을 제공한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 글루탐산탈탄산효소에 관한 것이다.

본원의 일 실시예에서, 상기 글루탐산탈탄산효소는 박테로이데스 (Bacteroides) EFEL 002 균주 (기탁번호 KACC91919P)로부터 분리되었다. 그러나, 본 발명에서 글루탐산탈탄산효소는 상기 균주에서 유래한 것뿐만 아니라, 화학적으로 합성하거나, 유전자 재조합 방법을 통해 생산된 것을 포함하며, L-글루탐산 또는 글루탐산염으로부터 GABA 를 생산하는 효소 활성이 유지되는 한 그 수득 방법이나 형태에 특별히 제한이 있는 것은 아니다. 바람직한 일예로, 본원의 글루탐산탈탄산효소는 상기 효소를 코딩하는 유전자를 세포에 도입한 후 이로부터 발현된 단백질을 분리 및 정제하여 수득할 수 있다.

또한, 본원의 글루탐산탈탄산효소는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소 뿐만 아니라, 이와 동등한 활성을 나타내는 범위에서 일정 범위의 서열 상동성을 가지는 효소도 포함할 수 있다.

이와 관련하여, 용어 "상동성" 이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 글루탐산탈탄산효소의 아미노산 서열과 바람직하게는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

또한, 본원의 글루탐산탈탄산효소 또는 이의 상동체는 효소 활성을 가지는 한 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 서열 변이체란 천연의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 변이체 단백질은 야생형 단백질과 동등한 생물학적 활성을 나타내나, 단백질의 특성이 변형된 변이체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증대될 수 있다. 예를 들어, 천연의 단백질이 효소 활성을 보이지 않는 강산성이나 강알카리에서도 효소활성을 나타낼 수 있고, 저온이나 고온에서도 효소 활성을 나타낼 수 있다. 또한 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 글루탐산탈탄산효소에 반응하는 기질 특이성이 강화되거나 단백질과 반응하는 기질의 종류가 확대된 변이체일 수 있다.

본원의 효소는 최적 온도가 40 내지 70℃, 또는 50 내지 70℃, 또는 60 내지 70℃일 수 있으며, 바람직한 예로는 70℃일 수 있다.

본원의 효소의 최적 pH는 pH 4.0 내지 5.5, 또는 pH 4.0 내지 5.0일 수 있으며, 바람직한 예로는 pH 5.0 일 수 있다.

본원의 효소는 기존에 보고된 글루탐산탈탄산효소들과 비교하여 L-글루탐산 또는 글루탐산염 기질로부터 감마-아미노부티르산를 생산하는 효율이 매우 높다. 바람직한 예로, 본원의 효소는 40℃ 및 pH 5.0 에서 4.5시간 반응시 L-글루탐산 또는 글루탐산염 기질로부터 감마-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid)으로의 전환율이 80% 이상, 또는 85% 이상일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 글루탐산탈탄산효소를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본원의 유전자는 서열번호 1로 기재되는 글루탐산탈탄산효소를 코딩하는 유전자, 또는 서열번호 1과 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 가지고 글루탐산탈탄산효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 바람직한 예로, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 유전자는 이를 발현하는 벡터에 의해 제공되어 단백질로 발현될 수 있다.

따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자는 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

재조합 발현 벡터란 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질, 본 발명에서는 글루탐산탈탄산효소를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주 세포에서 목적하는 유전자를 발현하고, 목적하는 단백질을 생산하는 기능을 하면 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 재조합 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자, 종결코돈 및 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코드하는 DNA, 인핸서 서열, 목적하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 비해독영역, 선별 마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.

본원에서 형질전환은 유전자를 세포로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 침전, 염화칼슘 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주 세포는 원핵 세포와 진핵 세포 모두를 포함하며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용될 수 있다. 예를 들어 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 곤충 세포, 또는 동물 세포 등을 예시할 수 있다. 바람직하게는 대장균이 사용될 수 있다. 또한, 바람직한 예로는, 감마-아미노부티르산을 생산하는 세포일 수 있으며, 이러한 숙주 세포에 본원의 글루탐산탈탄산효소를 형질전환하여 과발현을 유도할 경우 기질로부터 생산되는 감마-아미노부티르산의 양을 증대시킬 수 있다.

상기 세포를 배지에서 배양하면 글루탐산탈탄산효소를 대량으로 제조 및 분리할 수 있다. 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양 시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 또한, 발현유도인자로 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 등을 사용하여 단백질 발현을 유도할 수 있고 유도시간은 효소의 양이 최대화될 수 있도록 조절할 수 있다.

상기의 방법으로 발현시킨 글루탐산탈탄산효소의 발현 여부는, 회수된 형질전환체 세포를 버퍼 수용액에 부유시킨 다음 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄하고, 파쇄된 세포의 일부를 포함하는 분액을 통상의 SDS-PAGE 상에서 확인할 수 있다.

재조합 효소는 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 재조합 효소의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 반복, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리 및 정제 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). 전기영동, 원심분리, 겔 여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역흡착 친화력크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 박테로이데스 EFEL 002 균주 (기탁번호 KACC91919P)에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 글루탐산탈탄산효소, 상기 글루탐산탈탄산효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포, 또는 박테로이데스 EFEL 002 균주를 포함하는, 감마-아미노부티르산 제조용 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 글루탐산탈탄산효소 또는 상기 글루탐산탈탄산효소를 포함하는 균주를 L-글루탐산 또는 글루탐산염 기질에 처리하는 단계를 포함하는, 감마-아미노부티르산의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 기질과의 반응은 40 내지 70℃, 또는 50 내지 70℃, 또는 60 내지 70℃에서 수행될 수 있으며, 바람직한 예로는 70℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 반응은 pH 4.0 내지 5.5, 또는 pH 4.0 내지 5.0에서 수행될 수 있으며, 바람직한 예로는 pH 5.0 에서 수행될 수 있다.

효소를 기질인 L-글루탐산 또는 글루탐산염에 처리하는 경우 조효소인 피리독살-5-포스페이트 등의 첨가에 의해 반응속도를 더욱 증가시킬 수 있다. 또한, 효소를 포함하는 균주를 이용하여 L-글루탐산을 발효하는 경우, 균주의 배양액 내 기질을 첨가하고 균주를 적절한 조건에서 배양하여 효소반응을 유도할 수 있다.

이렇게 생산된 감마-아미노부티르산은 식품 첨가물 또는 의약품이나 화학소재의 원료로 다양하게 사용될 수 있다.

본 발명의 고효율 GAD 효소를 사용하여 기능성 식의약품 소재 중 하나인 GABA를 경제적으로 생산할 수 있으며, 이는 제품화 추진 시에 가격 경쟁력의 강화로 이어져, 기업의 사업화 가능성을 높이는 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 pETBtGAD 플라스미드의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 Bacteroides 속 균주 및 기존 GABA 생성 균주인 Lactobacillus 속 균주들 간의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 BtGAD, Lactobacillus antri DSM 16041의 GAD (LbaGAD) 및 Lactobacillus brevis의 GAD (LbbGAD) 간의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸다.
도 4는 재조합 BtGAD 의 발현을 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 5는 온도에 따른 BtGAD 의 효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 pH에 따른 BtGAD 의 효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 BtGAD, Lactobacillus brevis의 GAD (LbbGAD), Lactobacillus antri DSM 16041의 GAD (LbaGAD) 및 Bifidobacterium dentium ATCC 27679의 GAD (BfdGAD)이 각각 L-글루탐산 또는 글루탐산염으로부터 GABA 를 생성하는 GABA 전환율(%)을 시간에 따른 변화로 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 BtGAD, Lactobacillus brevis의 GAD (LbbGAD), Lactobacillus antri DSM 16041의 GAD (LbaGAD) 및 Bifidobacterium dentium ATCC 27679의 GAD (BfdGAD)을 4시간 반 동안 L-글루탐산 기질과 반응시킨 후 GABA 전환율(%)을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

글루탐산탈탄산효소(GAD)의 유전자 클로닝 및 분석

1-1. 유전자 클로닝

박테로이데스(Bacteroides) EFEL 002 (기탁번호 KACC91919P)로부터 글루탐산탈탄산효소 유전자의 클로닝을 위한 프라이머(표 1)를 Bioneer (Korea)에 의뢰하여 단일가닥 DNA 단편으로 화학 합성하였다. 상기 박테로이데스(Bacteroides) EFEL 002는 2014년 01월 14일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC91919P를 부여받았다.

프라이머	서열(5'->3')	서열번호
정방향(27mer)	5'-TTCATATGGAAGATTTGAATTTCAGAA-3' (NdeⅠ)	3
역방향(27mer)	5'-TTTTCTCGAGTTTTTTATGAGTACGGC-3' (XhoⅠ)	4

글루탐산탈탄산효소 유전체를 주형으로 상기 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 Pyrobest ^TMDNA polymerase (TaKaRa Biomedical Inc., Japan)와 C1000^TM Thermal cycler (Bio-Rad, USA)를 사용하여 98℃에서 1분, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초로 30회 반복하였으며 최종적으로 10분간 추가로 증폭한 후 반응을 종료하였다. 반응이 끝난 PCR 산물은 0.8% agarose gel (w/v) 에서 확인하였다. 이후, PCR purification kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하였다. 정제한 증폭 단편을 Nde I과 Xho I으로 처리하여 동일 제한 효소로 처리한 pET-21a vector (Novagen, USA)에 ligation하고, 대장균 MC1061로 형질전환 하였고, 이후 DNA 추출 및 제한 효소 mapping을 통해 원하는 재조합체를 선발하였다.

그 결과, 1,437 bp 크기의 글루탐산탈탄산효소 증폭 유전자 단편을 pET-21a (Novagen, USA) 발현벡터에 클로닝하여 pETBtGAD로 명명한 plasmid DNA를 제조하였다(도 1).

1-2. 글루탐산탈탄산효소 유전자의 분석

상기 과정을 통해 분리한 박테로이데스 속 유래 GAD 를 BtGAD 라고 명명하였다. BtGAD 의 아미노산 서열은 서열번호 1로, 이를 코딩하는 유전자의 염기서열은 서열번호 2로 나타내었다.

미국 국립생물공학정보센터(NCBI) 에서 사용 가능한 BLAST 유전자 검색 프로그램을 이용하여 기존에 보고된 균주들(도 2)의 GAD 와 유전자 상동성을 비교한 결과, 본 발명에서 동정한 BtGAD 는 GABA를 생성하는 것으로 보고된 락토바실러스 속 균주 유래의 GAD 와는 약 40.9 ~ 41.7%의 서열 상동성을 나타내었고(표 2 참조), 종래 알려지지 않은 서열로 이루어진 신규 단백질임을 알 수 있었다.

분류	균주명	기탁번호	상동성 (%) AA ( NT )
Other 속	Lactobacillus antri DSM 16042	EEW54005	41.7 (55.2)
	Lactobacillus brevis	AAZ95185	41.3 (53.4)
	Bifidobacterium dentium ATCC 27679	EFM42529	42.9 (53.3)

(AA: 아미노산 서열 상동성, NT: 뉴클레오티드 서열 상동성)

실시예 2. 글루탐산탈탄산효소의 과다 발현 및 정제

BtGAD 유전자를 포함한 pETBtGAD 플라스미드를 발현 숙주인 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다. 그 다음 pETBtGAD를 포함하는 콜로니를 10 μg/mL 암피실린 항생제를 포함하는 액체배지 (Luria-Bertani media, LB medium; Tryptone 10 g/L, NaCl 10g/L, Yeast extract 5g/L) 5 ml에 접종하여 37℃ 및 220 rpm으로 12시간 동안 배양한 후, 균체만을 회수하여 상기 액체 배지 500 mL에 재접종하고 37℃ 및 220 rpm으로 중간-대수기 (OD₆₀₀=0.4~0.6)까지 배양 후 1 mM IPTG를 첨가하여 15℃ 및 220 rpm으로 추가 배양하여 글루탐산탈탄산효소를 유도 발현하였다.

배양을 마친 균체를 원심분리로 회수하여 50 mL lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 500 mM NaCl, 10 mM imidazole]로 재혼합 하였다. 이 혼합 균체액을 ultrasonicator (VCX750, Sonics&Materials, Inc., Newtown, CT, USA)로 파쇄한 후, 원심분리로 얻은 상등액을 HisTrap-FF column (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)에 통과시켜 결합된 재조합 BtGAD를 elution buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 500 mM NaCl, 500 mM imidazole]를 흘려주어 분리하였다.

위 과정을 통해 순수한 재조합 BtGAD를 얻었고, SDS-PAGE 분석을 수행한 결과, 약 54.8 kDa의 예상 크기와 동일한 재조합 단백질을 확인하였고, 단일 밴드를 통해 높은 정제도를 예상할 수 있었다(도 4).

또한, Ni-NTA 친화적 크로마토그래피로 정제된 BtGAD의 정제도를 알아보기 위해 crude extract 를 포함한 정제 단계별 활성을 분석하였다. 결과적으로 정제된 재조합 BtGAD는 3.37의 정제도(purification fold)로 90% 가까운 수율(yield)을 보였다(표 3).

BtGAD 의 정제
BtGAD	Crude extract	Ni - NTA 친화적 크로마토그래피
Total volume (mL)	50	5
Total protein (mg)	128.88 ± 2.42	34.03 ± 2.39
U/ml	225.15 ± 18.47	2,002.04 ± 90.69
Total activity (U)	11,257.23 ± 923.31	10,010.20 ± 453.47
Specific activity (U/mg)	87.34 ± 7.35	294.19 ± 24.61
Purification fold	1	3.37 ± 0.40
Yield (%)	100	88.92 ± 8.33

실시예 3. 효소의 최적 온도 측정

재조합 BtGAD의 글루탐산탈탄산효소 활성이 최대로 나타날 수 있는 최적 반응 온도를 찾기 위해 효소 활성을 온도 변화에 따라 분석하였다. 이를 위해 20 mM L-글루탐산, 0.2 mM 피리독살-5-포스페이트, 20 ㎕ 글루탐산탈탄산효소, 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) 혼합 용액을 35℃~ 80℃ 온도에서 10분간 반응하였다. 글루탐산탈탄산효소의 열 안정성에 대한 실험은 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0)에 25℃~70℃에서 60 분간 열을 가해 준 후, 20 mM L-글루탐산, 0.2 mM 피리독살-5-포스페이트, 20 ㎕ 열반응한 글루탐산탈탄산효소, 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) 반응용액을 70℃에서 10 분간 반응하였다.

그 결과, 70℃의 반응 온도에서 글루탐산탈탄산효소 활성이 가장 높았고 이때의 효소 활성을 기준으로 했을 때, 50℃에서는 약 55%의 상대 활성을 보였다. 반응 온도가 낮아지면 그에 비례하여 활성도 감소하였다(도 5). 또한, 열처리 전 후의 BtGAD의 활성값을 비교한 결과, 70℃에서 열처리 60분 후에는 활성이 잔존하지 않았고, 40℃에서 열처리 60분 후에는 약 50%의 잔존활성을 보였다.

실시예 4. 효소의 최적 pH 측정

pH 변화에 대한 글루탐산탈탄산효소 활성 변화를 실험하였다. 20 mM L-글루탐산나트륨(monosodium glutamate), 0.2 mM 피리독살-5-포스페이트, 20 ㎕ 글루탐산탈탄산효소 반응 용액에 pH 3.0 ~ pH 9.0 범위의 50 mM citric acid (pH 3.0~5.0) buffer, 50 mM sodium acetate (pH 4.0~6.0) buffer, 50 mM sodium phosphate (pH 6.0~8.0) buffer, 50 mM Tris-HCl (pH 7.0~9.0) buffer를 넣어주어 40 ℃에서 30 분 동안 반응하여 측정하였다.

그 결과, pH 5.0 에서 효소 활성이 가장 높았고, pH 7.0~9.0에서는 BtGAD의 활성이 확인되지 않았으며, pH 5.5에서는 약 30%, pH 4.0~4.5에서는 약 80%의 활성이 잔존하였으며 pH 3에서는 활성을 확인하기 어려웠다(도 6).

실시예 5. 효소 활성 비교

본 발명의 BtGAD 및 기존의 GABA 생성 유산균들의 GAD 에 대하여 글루탐산탈탄산효소 활성, 즉, L-글루탐산나트륨(monosodium glutamate)으로부터 GABA 를 생성하는 활성을 측정하였다. GAD 활성을 표시하는 단위는 'U (unit)' 으로, 1U 는 1분당 1μmol 의 GABA 를 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의된다.

표 4는 각 GAD 효소의 최적 pH 및 온도 조건에서 효소 활성을 측정한 결과이며, 표 5는 동일한 조건, 즉 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) 및 40℃ 에서의 효소 활성을 측정한 결과를 나타낸다.

그 결과, 종래 알려진 락토바실러스 또는 비피도박테리움 유래 GAD 에 비하여, 본 발명의 BtGAD 가 월등히 우수한 효소 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

효소명	pH	온도 (℃)	Specific activity (U/ mg )	Relative activity (%)
BtGAD	5.0	70	294.19 ± 24.61	100.00 ± 11.83
LbbGAD	5.0	45	16.49 ± 0.89	5.61 ± 0.56
LbaGAD	5.0	60	9.22 ± 1.52	3.13 ± 0.58
BfdGAD	4.5	45	6.88 ± 0.88	2.34 ± 0.36

균주명	효소명	Specific activity (U/ mg )	Relative activity (%)
Bacteroides sp. EFEL 002	BtGAD	40.75 ± 3.04	100.00 ± 10.56
Lactobacillus brevis	LbbGAD	8.75 ± 0.84	21.46 ± 2.61
Bifidobacterium dentium ATCC 27679	BfdGAD	4.57 ± 0.68	11.21 ± 1.68
Lactobacillus antri DSM 16041	LbaGAD	0.77 ±0.06	1.88 ± 0.20

실시예 6. GABA 생성율

최적 조건에서, 정제된 BtGAD에 의한 GABA 전환 능력을 분석하였다. 0.2 mM 피리독살-5-포스페이트 및 20 ㎕ 글루탐산탈탄산효소 반응 용액에 기질인 글루탐산나트륨을 20 mM 농도로 첨가 후, pH 5.0 및 40℃에서 5시간 반 동안 반응하였다.

BtGAD의 GABA 전환율을 측정한 결과, 40℃에서 4시간 반을 반응하였을 때 20 mM 글루탐산나트륨을 약 85%까지 GABA로 전환하였고, 다른 기존 GAD와 비교했을 때 GABA 전환 속도가 빨라 효과적인 효소임을 확인하였다(도 7 및 도 8).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

기탁기관명 : 농업생명공학연구원

수탁번호 : KACC91919P

수탁일자 : 20140114

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chungbuk National University <120> Highly active GABA-producing glutamate decarboxylase from Bacteroides sp. and use thereof <130> PN1602-050 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 478 <212> PRT <213> BtuGAD aminoacid sequence <400> 1 Met Glu Asp Leu Asn Phe Arg Lys Gly Asp Ala Lys Thr Glu Val Phe 1 5 10 15 Gly Ser Asn Arg Met Leu Gln Pro Ser Pro Val Glu Lys Ile Pro Asp 20 25 30 Gly Pro Thr Thr Pro Glu Ile Ala Tyr Gln Met Val Lys Asp Glu Thr 35 40 45 Phe Ala Gln Thr Gln Pro Arg Leu Asn Leu Ala Thr Phe Val Thr Thr 50 55 60 Tyr Met Asp Glu Tyr Ala Thr Lys Leu Met Asn Glu Ala Ile Asn Ile 65 70 75 80 Asn Tyr Ile Asp Glu Thr Glu Tyr Pro Arg Ile Ala Val Met Asn Gly 85 90 95 Lys Cys Ile Asn Ile Val Ala Asn Leu Trp Asn Ser Pro Glu Lys Glu 100 105 110 Thr Trp Lys Thr Gly Ala Leu Ala Ile Gly Ser Ser Glu Ala Cys Met 115 120 125 Leu Gly Gly Val Ala Ala Trp Leu Arg Trp Arg Lys Lys Arg Gln Ala 130 135 140 Gln Gly Lys Pro Phe Asp Lys Pro Asn Phe Val Ile Ser Thr Gly Phe 145 150 155 160 Gln Val Val Trp Glu Lys Phe Ala Gln Leu Trp Gln Ile Glu Met Arg 165 170 175 Glu Val Pro Leu Thr Leu Asp Lys Thr Thr Leu Asp Pro Glu Glu Ala 180 185 190 Leu Lys Met Cys Asp Glu Asn Thr Ile Cys Ile Val Pro Ile Gln Gly 195 200 205 Val Thr Trp Thr Gly Leu Asn Asp Asp Val Glu Ala Leu Asp Lys Ala 210 215 220 Leu Asp Ala Tyr Asn Ala Lys Thr Gly Tyr Asp Ile Pro Ile His Val 225 230 235 240 Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Ile Leu Pro Phe Leu Tyr Pro Glu Lys 245 250 255 Lys Trp Asp Phe Arg Leu Lys Trp Val Leu Ser Ile Ser Val Ser Gly 260 265 270 His Lys Phe Gly Leu Val Tyr Pro Gly Leu Gly Trp Val Cys Trp Lys 275 280 285 Gly Lys Glu Tyr Leu Pro Glu Glu Met Ser Phe Ser Val Asn Tyr Leu 290 295 300 Gly Ala Asn Ile Thr Gln Val Gly Leu Asn Phe Ser Arg Pro Ala Ala 305 310 315 320 Gln Ile Leu Gly Gln Tyr Tyr Gln Phe Ile Arg Leu Gly Phe Gln Gly 325 330 335 Tyr Lys Glu Val Gln Tyr Asn Ser Leu Thr Ile Ala Lys Tyr Ile His 340 345 350 Asp Glu Ile Gly Lys Met Ala Pro Phe Val Asn Tyr Ser Asp Glu Val 355 360 365 Val Asn Pro Leu Phe Ile Trp Tyr Leu Lys Pro Glu Tyr Ala Arg Ala 370 375 380 Ala Lys Trp Thr Leu Tyr Asp Leu Gln Asp Lys Leu Ser Gln His Gly 385 390 395 400 Trp Met Val Pro Ala Tyr Thr Leu Pro Ser Lys Leu Glu Asp Tyr Val 405 410 415 Val Met Arg Val Val Val Arg Gln Gly Phe Ser Arg Asp Met Ala Asp 420 425 430 Met Leu Leu Gly Asp Ile Lys Asn Ala Ile Thr Glu Leu Glu Lys Leu 435 440 445 Asp Tyr Pro Thr Pro Thr Arg Met Ala Gln Glu Lys Asn Leu Pro Val 450 455 460 Glu Thr Lys Ile Phe Asn His Gly Cys Arg Thr His Lys Lys 465 470 475 <210> 2 <211> 1437 <212> DNA <213> BtuGAD DNA sequence <400> 2 atggaagatt tgaatttcag aaaaggagat gcaaaaactg aagtattcgg ttcaaaccgt 60 atgttacaac cctcacccgt agaaaagatt cccgacggac ctactacccc ggaaatcgcc 120 tatcagatgg tgaaagacga gaccttcgcc caaacgcagc ctcgcttgaa tctggctaca 180 ttcgtcacta cctatatgga cgaatatgca accaagctga tgaacgaagc catcaacatc 240 aactacattg acgagaccga atatccgcgc atcgccgtaa tgaacggtaa atgtatcaac 300 atcgtggcca acctctggaa ctctcctgaa aaagaaacct ggaaaaccgg cgcacttgcc 360 atcggttcct cggaggcatg tatgctgggt ggtgtggcag cctggttgcg ctggcgcaag 420 aaacgtcagg cgcaaggcaa accgttcgac aaaccaaact tcgttatttc aactggtttc 480 caggtggtat gggaaaaatt cgcccaattg tggcagattg aaatgcgtga agtgcctttg 540 acactggaca agaccacgct cgaccccgaa gaagccttga agatgtgtga tgagaacacc 600 atctgtatcg tgcctatcca aggcgttaca tggacaggac tgaacgatga cgtcgaagcc 660 ctcgacaaag ccctcgatgc ctacaatgcg aagaccggct acgacattcc tatccacgta 720 gatgccgcca gcggcggttt catcctcccg ttcctctatc ccgaaaagaa atgggacttc 780 cgtctgaagt gggtactctc catcagcgtc agcggacaca aattcggtct ggtttatccg 840 ggtctgggct gggtttgctg gaaaggcaag gaatatctgc ccgaagaaat gtcattcagc 900 gtaaactacc tcggtgccaa cattactcag gtaggcctga acttctcccg tcctgccgca 960 cagattctgg gtcaatatta ccagttcatc cgtttgggat tccagggtta caaggaagta 1020 cagtacaact ctctgaccat cgccaagtat atccatgacg aaatcggcaa gatggctccg 1080 ttcgtaaact attccgacga ggttgtgaac ccgctgttta tctggtattt gaaaccggaa 1140 tatgcaagag ctgccaaatg gactctgtat gacctgcagg acaagctgtc acaacacggt 1200 tggatggtac ccgcctatac actgccttca aagctggaag actacgtcgt aatgcgcgtc 1260 gttgttcgcc aaggattcag ccgcgacatg gcagacatgc tgctgggtga catcaagaat 1320 gccatcacgg agctggagaa actggattac ccgactccta cccgtatggc acaggaaaag 1380 aacctgccgg tggaaaccaa aatattcaac cacggatgcc gtactcataa aaaataa 1437 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> F primer <400> 3 ttcatatgga agatttgaat ttcagaa 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> R primer <400> 4 ttttctcgag ttttttatga gtacggc 27

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 글루탐산탈탄산효소(glutamate decarboxylase, GAD).
제1항에 있어서,
상기 글루탐산탈탄산효소는 박테로이데스(Bacteroides) EFEL 002 균주 (기탁번호 KACC91919P)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 글루탐산탈탄산효소.
제1항에 있어서,
상기 글루탐산탈탄산효소는 최적 온도가 40 내지 70℃ 인 것을 특징으로 하는 글루탐산탈탄산효소.
제1항에 있어서,
상기 글루탐산탈탄산효소는 최적 pH가 pH 4 내지 5 인 것을 특징으로 하는 글루탐산탈탄산효소.
제1항에 있어서,
상기 글루탐산탈탄산효소는 40℃ 및 pH 5 에서 4.5시간 반응 시 L-글루탐산 기질로부터 감마-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid)으로의 전환율이 80% 이상인 것을 특징으로 하는 글루탐산탈탄산효소.
제1항의 글루탐산탈탄산효소를 코딩하는 유전자.
제6항에 있어서,
상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
제7항의 유전자는 포함하는 재조합 벡터.
제8항의 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 글루탐산탈탄산효소, 상기 글루탐산탈탄산효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포, 또는 박테로이데스 EFEL 002 균주 (기탁번호 KACC91919P)를 포함하는, 감마-아미노부티르산 생산용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 글루탐산탈탄산효소 또는 상기 글루탐산탈탄산효소를 포함하는 균주를 L-글루탐산 또는 글루탐산염 기질에 처리하는 단계를 포함하는 감마-아미노부티르산의 생산방법.