KR101202797B1 - 신규한 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염기성 pH에서도 활성을 띠는 신규 글루타메이트 디카르복실라아제 (glutamate decarboxylase, GAD)의 개발과 이 효소 자체나 효소를 함유한 세포를 촉매로 사용하여 고농도 L-글루타메이트(L-glutamate)로부터 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 신규 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 자연형의 글루타메이트 디카르복실라아제의 아미노 말단에 분리를 위한 히스티딘-택을 추가하고, 89번 위치의 아미노산을 글루타민으로 치환하였으며, 카르복시 말단의 2-15개 아미노산을 제거함으로써 제조하였다.
본 발명에 따른 신규 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체의 경우, 활성 pH 범위가 자연형에 비해 pH 단위로 2 이상 염기성으로 넓어졌으며, 감마-아미노부틸산 합성 효율도 자연형에 비해 약 2배 가까이 향상되었다.

Description

신규한 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체 {Novel Glutamate Decarboxylase Mutants}

본 발명은 염기성 pH에서도 활성을 띠는 신규 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase, GAD)의 개발과 이 효소 자체나 효소를 함유한 세포를 촉매로 사용하여 L-글루타메이트(L-glutamate)로부터 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

감마-아미노부틸산(GABA)은 비단백질성 아미노산으로 억제성 신경전달물질이다. 그 효능으로서 신경안정 작용, 스트레스 해소, 기억력 증진, 혈압강하작용, 우울증 완화, 중풍과 치매 예방 등이 알려져 있다. 또한, GABA는 유용한 플라스틱인 폴리아미드 4의 단량체인 피롤리돈의 전구체로 최근 바이오매스에서 GABA를 생산하는 방법의 중요성이 강조되고 있다.

GABA 생산을 위한 공업적 방법은 합성법, 추출법, 생물전환법 등이 있다. 합성법의 경우 사용하는 용매가 주로 유독하고, 추출법의 경우는 폐기물의 발생량이 많고, GABA의 제조단가가 높은 단점이 있다. 생물전환법은 바이오촉매(biocatalyst)인 분리 효소(isolated enzyme)나 효소를 함유한 전세포(whole cell)를 촉매로 사용하여 L-글루타메이트의 탈카르복시화 반응으로 GABA를 생산하는 방법이다. 산업적인 측면에서 볼 때 L-글루타메이트와 같은 값싼 원료로부터 환경친화적인 생물전환공정을 통해 GABA를 생산하는 것은 매우 합리적이고 가치 있는 공정이다.

GABA로의 전환 반응에 사용되는 효소는 피리독살 5-포스페이트 (PLP)-의존형 글루타메이트 디카르복실라아제(GAD) (EC 4.1.1.15)이며, 이 효소는 유산균, 대장균, 바실러스 등 미생물 유래의 것이 많이 사용된다. 박테리아 글루타메이트 디카르복실라아제가 작용하는 pH 범위는 3.5~6.0이며, 최적 pH는 3.8~4.6에 존재하며, pH가 3.5 이하 이거나 6.0 이상이 되면 반응은 거의 일어나지 않는다. 이 효소는 글루타메이트의 α-탄소에 결합되어 있는 카르복시 그룹으로부터 이산화탄소(CO₂)를 제거하는데, 이 과정에서 pH가 증가하게 된다 (도 1).

생물전환법의 경우, 효소촉매에 의해 GABA가 생성됨에 따라 pH가 증가하게 되고, 이로 인해 반응은 점점 늦어지다가 결국 반응이 멈추게 된다. 따라서 고농도 기질 반응의 경우 종래에는 완충용액이나 기질을 사용하여 최적 pH 로 맞춘 후, 반응이 진행함에 따라 염산, 황산, 질산, 초산 등과 같은 산을 pH 조절제로 투입하여 반응액의 pH를 맞추었다. 그러나, 기존 방법은 반응 중 생성되는 GABA의 양에 비례하여 산을 첨가함으로써 염(salt)이 다량으로 생성되는 문제점이 있다. 생성된 염을 제거하기 위해서는 이온교환수지 공정, 재결정과 같은 정제공정이 필요하게 되고, 반응액 중의 다량의 염은 수율 저하, 폐수 발생 등과 같은 문제를 수반하게 됨으로써, 염 발생은 GABA의 생산 단가를 높이는 중요한 원인이 되어 왔다. 따라서 중성 pH 더 나아가 염기성 pH에서도 활성을 띠는 글루타메이트 디카르복실라아제를 개발할 경우 산 첨가 및 염 생성을 방지할 수 있다.

글루타메이트 디카르복실라아제를 이용한 생물전환공정에의한 ＧＡＢＡ의 제조방법, KR 10-0851296, 2008.08.04.

본 발명은 L-글루타메이트를 기질로 하여 감마-아미노부틸산(GABA)을 효소적으로 제조함에 있어서, 효소의 활성 pH 범위를 확대하여 산 첨가를 통한 pH 조절 없이 고농도로 감마-아미노부틸산 생산하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 카르복시 말단으로부터 아미노산 잔기 2-15개가 결손되고, 89번째 글루타메이트가 글루타민 또는 알라닌으로 치환된 변이를 포함하는 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 형질전환체를 제공한다.

또한 본 발명은 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형질전환체에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 염기성 pH에서 활성을 나타내는 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 제공한다.

상기 변이체는 글루타메이트 및 글루타메이트 염의 감마-아미노부틸산으로의 탈카르복시화 반응을 촉매한다.

본 발명을 통해 조절제의 첨가 없이 고농도 전환 반응을 실시할 수 있어 경제적이고 친환경적인 감마-아미노부틸산의 제조가 가능하다.

도 1 은 글루타메이트 디카르복실라아제를 촉매로 사용하여 글루타메이트의 탈탄산 반응으로부터 감마-아미노부틸산을 생산하는 반응식이다.
도 2 는 글루타메이트 디카르복실라아제 카르복시 말단의 pH 의존적 구조변화를 나타낸 도면이다.
도 3 은 대장균 글루타메이트 디카르복실라아제의 86, 89번 아미노산의 pH의존적 구조변화를 나타낸 도면이다.
도 4 는 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체의 분리과정을 보여주는 도면이다. (1, uninduced control; 2, unduced whole cell lysate; 3, flow through in Ni-NTA column purification; 4, wash fraction; 5, elution; 6, after desalting)
도 5 는 89번 글루타메이트 치환 변이체들의 초기 활성을 보여주는 그래프이다. (Wt, C-말단 제거하지 않고 89번 치환하지 않음; WtE89A, C-말단 제거하지 않고 89번을 알라닌으로 치환; WtE89Q, C-말단 제거하지 않고 89번을 글루타민으로 치환)
도 6 은 카르복시 말단의 15개아미노산 제거 및 89번 글루타메이트 치환 변이체들의 초기 활성을 보여주는 그래프이다. (ΔC, C-말단 제거; ΔCE89A, C-말단 제거하고 89번을 알라닌으로 치환; ΔCE89Q, C-말단 제거하고 89번을 글루타민으로 치환)
도 7 은 카르복시 말단의 2개 아미노산 제거 및 89번 글루타메이트 치환 변이체들의 초기 활성을 보여주는 그래프이다. (Wt, C-말단 제거하지 않고 89번 치환하지 않음; E89Q, C-말단 제거하지 않고 89번 치환; ΔHT, C-말단 2개 아미노산 제거하고 89번 치환하지 않음; E89QDHT, C-말단 2개 아미노산 제거하고 89번 치환)
도 8 은 글루타메이트를 이용한 전환반응에 있어서 각 변이체들의 GABA 전환율을 비교한 그래프이다. (Wt, C-말단 제거하지 않고 89번 치환하지 않음; WtE89A, C-말단 제거하지 않고 89번을 알라닌으로 치환; WtE89Q, C-말단 제거하지 않고 89번을 글루타민으로 치환; DeltaC, C-말단 제거; DeltaCE89A, C-말단 제거하고 89번을 알라닌으로 치환; DeltaCE89Q, C-말단 제거하고 89번을 글루타민으로 치환)

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 카르복시 말단으로부터 아미노산 잔기 2-15개가 결손되고, 89번째 글루타메이트가 글루타민 또는 알라닌으로 치환된 변이를 포함하는 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 제공한다.

GAD의 카르복시 말단 부위는 3차원적으로 루프 구조를 형성하여 GAD의 산성-의존성에 기여한다. GAD의 카르복시 말단은 산성 조건에서 구조를 지니지 못하지만 중성 조건에서는 잘 정돈된 구조를 가지며 동시에 조효소인 피리독살 5'-포스페이트가 존재하는 기질 결합 부위를 막는다(도 1). GAD의 카르복시 말단 아미노산 부위를 제거하면 중성 pH에서 루프를 형성하는 것을 억제시켜 GAD가 중성 pH에서 활성이 떨어지는 것을 방지할 수 있다.

본 발명에 따른 GAD 변이체는 카르복시 말단 부위로부터 아미노산 잔기 2-15개, 2-13개, 2-8개, 2개 또는 15개가 결손 된 것일 수 있다.

GAD의 86번 아미노산은 아스파테이트이고 89번 아미노산은 글루타메이트이다. 상기 두 아미노산은 pH에 따라 큰 구조적 변화를 나타낸다(도 3). 본 발명자는 이러한 구조적 변화가 아스파테이트와 글루타메이트가 중성에서 모두 음전하를 띠게 되어 서로 반발하는 원리에 의한 것이라는 것을 밝히고 본 발명의 일 실시예에서 89번의 글루타메이트를 글루타민 또는 알라닌으로 치환하였다.

본 발명의 일 실시예에서 GAD 변이체 제작과정 중 89번 아미노산의 치환은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하는 위치선택적 돌연변이(Site-directed mutagenesis) 방법을 사용할 수 있다. 위치선택적 돌연변이란, 단백질에서 변경시키고자 하는 특정 아미노산만을 정확히 원하는 대로 변경시키는 유전자 조작기술로써 유전자의 특정 서열을 변화시켜 단백질 내의 원하는 아미노산을 다른 아미노산으로 변경시키는 기술이다. 그러나 여기에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 변이체 제작이 가능하다.

본 발명의 실시예에서 이용된 GAD는 유전자를 클로닝하여 적합한 숙주세포에서 발현된 것을 정제하여 얻은 것이다. 본 발명의 실시예에서 이용된 GAD는 대장균에서 유래된 것이나 이에 제한되지 않으며 다양한 미생물에서 유래될 수 있다. 예를 들면, 락토바실러스 (Lactobacillus plantarum , Lactobacillus brevis , Lactobacillus pentosus , Lactobacillus sakei), 리스테리아 ( Listeria monocytogenes ), 이스트 (Saccharomyces cerevisiae ), 박테로이드 (Bacteroides fragilis ), 디바리오마이시스 ( Debaryomyces hansenii ), 마이코박테리움 (Mycobacteriumbovis, Mycobacterium tuberculosis ), 아스퍼질러스 ( Aspergillus nidulans ), 락토코코스 ( Lactococcuslactis ), 캔디다 ( Candida glabrata ) 등이 있다.

본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체의 아미노 말단에 친화성 태그가 삽입된 것인 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 제공한다.

본 발명에서 “친화성 태그”란 폴리펩티드 또는 단백질의 정제나 검출을 제공하거나 기질에 대한 폴리펩티드 또는 단백질의 부착을 위한 부위를 제공하기 위하여 폴리펩티드 또는 단백질에 부착할 수 있는 폴리펩티드 단편을 의미한다.

본 발명의 한 구체예에서 상기 친화성 태그는 히스티딘(Histidine, His), 말토스 결합 단백질(Maltose Binding Protein, MBP), 티오레독신(thioredoxin, Trx), NusA(N utilization substance A) 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-transferase, GST) 태그일 수 있다.

상기 GAD 변이체는 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열로 이루어진 디카르복실라아제 변이체일 수 있다.

서열번호 2는 카르복시말단의 15개 아미노산이 결손되고 89번째 글루타메이트가 글루타민으로 치환되었으며 히스티딘 태그를 가지는 디카르복실라아제 변이체이다.

서열번호 4는 카르복시말단의 15개 아미노산이 결손되고 89번째 글루타메이트가 알라닌으로 치환되었으며 히스티딘 태그를 가지는 디카르복실라아제 변이체이다.

서열번호 6은 카르복시말단의 2개 아미노산이 결손되고 89번째 글루타메이트가 글루타민으로 치환되었으며 히스티딘 태그를 가지는 디카르복실라아제 변이체이다.

서열번호 8은 카르복시말단의 2개 아미노산이 결손되고 89번째 글루타메이트가 알라닌으로 치환되었으며 히스티딘 태그를 가지는 디카르복실라아제 변이체이다.

본 발명은 일 실시예에서 글루타메이트 디카르복실라아제(GAD)의 정제를 용이하게 하기 위하여 GAD의 아미노 말단에 히스티딘-태그(His-tag)를 도입하는 단백질 정제방법을 사용할 수 있다. 이것은 친화 크로마토그래피 원리를 이용하는 것으로 히스티딘이 5개 내지 6개가 붙어있는 히스티딘-태그를 이용하여 정제한다. 히스티딘-태그는 기질과 강한 친화력을 가진다는 것에 착안해서 유전자에 의해서 발현되어 자신이 정제하고자 하는 단백질 앞에 융합 단백질을 만들어 정제를 하는 용도에 많이 사용된다. 히스티딘-태그를 사용하는 이유는 히스티딘-태그의 경우 아미노산이 6개밖에 되지 않기 때문에 크기도 작고 원래의 단백질 구조에 영향도 별로 주지 않으므로 재조합 단백질을 만든 후에 따로 잘라주지 않아도 된다는 편의성을 가지기 때문이다. GST-tag의 경우 히스티딘-태그에 비해 특이성이 훨씬 높지만 태그의 크기 자체가 워낙 커서 융합 단백질을 만들었을 때 정제 후 태그를 잘라줘야 하는 번거로움이 있다. 이런 태그는 벡터의 종류에 따라 표적 단백질의 아미노 말단, 카르복시 말단 어느 쪽 에도 만들 수 있다. 또한 히스티딘-태그를 포함하는 벡터를 이용하면, 발현하는 단백질이 불용성일지라도 His-Bind Resin을 이용하여 변성조건하에서 정제할 수 있으므로 편리하다. 히스티딘-태그는 아미노산 중의 하나인 히스티딘이 5개 내지는 6개가 연속으로 오는 펩티드로 His-His-His-His-His-His의 아미노산 서열을 가진다. 히스티딘-태그는 2가의 금속이온과 친화력을 가진다. 정제시에는 주로 Nickel immobilized bead, Cobalt immobilized bead 등을 사용하게 되는데, 이 방법을 약자로 IMAC (immobilized Metal Affinity Chromatography)이라고 한다. 히스티딘-태그가 도입된 단백질을 용출하는 방법은 첫째로, 금속 이온에 대한 affinity competitor를 넣어주는 방법과 둘째로, pH의 변화를 주는 방법 등이 있다. 금속 이온에 대한 affinity competitor를 넣어주는 방법은, 금속 이온이 히스티딘의 이미다졸 링과 친화력(affinity)을 가지고 있으므로 이미다졸을 고농도로 흘려 보내주면 히스티딘이 붙어 있는 단백질이 금속 이온으로부터 떨어지는 원리이다. pH의 변화를 주는 방법은 금속 이온의 전하 상태가 달라지면 친화력을 가지지 못하게 되어 히스티딘-태그가 금속으로부터 떨어지는 원리이다. 하지만 이 경우에는 단백질의 구조에도 영향을 줄 수 있기 때문에 주로 affinity competitor첨가 방법을 사용한다. 그러나 여기에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 단백질 정제가 가능하다.

본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제(GAD) 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 한 구체예에서 상기 유전자는 서열번호 3, 5, 7 또는 9의 핵산서열로 이루어진 유전자일 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 GAD 변이체를 코딩하는 핵산서열로 이루어진 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제(GAD) 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET, pGEM-T Easy, pQE30 등), 파지 (예: λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서 GAD 변이체가 친화성 태그를 포함하지 않는 경우 본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 GAD의 정제를 용이하게 하기 위하여, 친화성 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 히스티딘(Histidine, His), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), 티오레독신(thioredoxin, TrX), NusA(Nutilization substance A) 또는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-transferase, GST) 등 일 수 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다. 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼을 이용하여 소망하는 GAD 단백질을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.

본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제(GAD) 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 된 형질전환체를 제공한다.

글루타메이트 디카르복실라아제(GAD) 유전자를 포함하는 벡터가 제작되면, 벡터를 적합한 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 제조할 수 있다. 이러한 형질전환체는 당업계에 공지되어있는 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, E. coli DH5α, E. coli M15, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환 시키는 경우에는 숙주세포로서, 이스트(예컨대, Saccharomyces cerevisiae) 곤충 세포 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc.Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다. 숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 글루타메이트 디카르복실라아제(GAD) 단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주세포에 IPTG(isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside)를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제(GAD) 변이체에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산(GABA)의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 반응은 pH 4.0-9.0에서 실시될 수 있다. 야생형 GAD는 활성을 나타내기 위해서는 산성 조건을 요구하지만, 본 발명의 GAD 변이체는 산성-의존성이 없어 넓은 pH범위에 걸쳐 활성을 나타낼 수 있는 이점을 갖게 된다.

본 명세서의 방법에서 이용되는 글루타메이트 디카르복실라아제(GAD)의 기질은 글루타메이트 또는 글루타메이트의 염이다. 본 발명의 방법에 있어서, 반응에 첨가되는 GAD의 글루타메이트 또는 글루타메이트의 소듐염이 이용될 수 있으며, 소듐염 중에서, MSG (monosodium glutamate)일 수 있다. 본 발명의 방법이 산업적인 스케일로 실시되는 경우에 MSG가 비용 측면에서 유리하다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 GAD 변이체는 고체 지지체 (solid support)에 고정화(immobilized)된 것일 수 있다.

효소 고정화는 효소를 화학적 또는 물리적 방법에 의하여 불용성 담체(matrix)에 고정하여 이동성을 제한하는 것이다. 고정화된 글루타메이트 디카르복실라아제 효소는 유리 효소 (free enzyme)와 비교하여 생물전환공정에서 상당한 장점을 발휘한다. 효소를 고정하면 재사용이 가능하기 때문에 비용이 절감되고 사용 후 분리할 필요가 없다. 또한 고정화 효소는 불용성이기 때문에 연속 반응기에서도 이용이 가능하며 외부 조건 변화에 대한 효소의 민감성을 감소시킬 수 있다는 장점이 있다.

그러나 산성 pH범위에서 활성을 나타내는 야생형 GAD를 이용하는 경우에는 세포고정화를 할 수 없다. 세포 고정화에 이용되는 지지체(예컨대, 알기네이트)가 산성범위에서 안정성이 확보되기 어렵고 이에 세포의 고정화 담체에서 유출되는 현상이 야기되거나 불안정성으로 인해 고정화 세포의 재사용측면에서 경제성이 떨어지기 때문이다. 본 발명의 GAD 변이체 고정화를 통하여 GABA 생산이 가능한 것은, 변이체의 활성이 pH4.0-9.0과 같이 넓은 범위에 걸쳐 나타나기 때문이다.

단백질, 특히 효소를 고체 지지체에 고정화하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다 (Weetall, H.H., Preparation of immobilized proteins covalently coupled through silane coupling agents to inorganic supports. Appl. Biochem. Biotech. 41:157-188(1993); Weetall, H. H., Methods in Enzymology. 44:134-148(1976)). 본 발명의 글루타메이트 디카르복실라아제가 고정화 되는 고체 지지체는 다공성 실리카, 실리카, 다공성 유리 비드, 조절-동공 유리(controlled-pore glass), 다공성 세라믹, 다공성 알루미나 및 다공성 티타니아를 포함한다.

본 발명은 상기 형질전환체에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산(GABA)의 제조방법을 제공한다. 구체예에서 상기 방법은 상기 형질전환체를 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 포함하는 배지에서 배양하여 실시하는 것인 감마-아미노부틸산(GABA)의 제조방법일 수 있다.

이 제조방법은 GAD 변이체를 발현하는 세포에 반응기질을 직접 접촉시켜 GABA를 생산한다는 측면에서 효소를 이용하는 상기한 방법과 차이가 있다.

이와 같이 세포를 직접 GABA 생산에 이용하는 방법은 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫 번째 방법은 배양방법이고, 두 번째 방법은 고정화된 세포를 이용하는 방법이다.

배양방법에 따르면, GABA의 제조방법은 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 포함하는 배지에서 배양하여 실시한다.

배양에 이용되는 배지로는 숙주세포의 종류에 따라 당업계에 공지된 어떠한 배지도 선택할 수 있다. 예를 들어, LB(Luria-Bertani) 배지, MRS (deMan Rogosa Sharpe) 브로스 배지, APT (All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지를 이용할 수 있다. 본 발명의 방법의 배지에 있어서, 이용되는 탄소원은 다양한 탄수화물이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 수크로스, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 아라비노스 및 락토스이다. 본 발명의 방법이 배지에 이용되는 질소원은 유기 질소원이 이용되며, 바람직하게는 이스트 추출물, 프로테오스 펩톤 No.3 및 펩톤이다. 상기 배지 내에서 그리고 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질의 존재 하에서 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 숙주세포를 배양하여 GABA를 생산한다.

세포고정화 방법에 따르면, GAD 변이체를 발현하는 형질전환체는 세포고정화용 고체 지지체에 고정화된다. 상기 설명과 같이 본 발명의 형질전환체가 고체 지지체에 고정화 할 수 있는 것은 GAD 변이체의 활성이 pH4.0-9.0과 같이 넓은 범위에 걸쳐 나타나기 때문이다.

세포고정화에 이용되는 고체 지지체는 알기네이트 (alginate), 폴리아크릴아마이드, 아가로스 및 키토산을 포함하고, 통상적으로 알기네이트를 이용한다. 세포고정화는 당업계에 공지된 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다(Fukui, S. and A. Tanaka, Immobilized microbial cells. Annu. Rev. Microbiol., 36:145-172(1982); Kierstan, M. and Bucke, C. The immobilization of microbial cells, subcellular organelles, and enzymes in calcium alginate gels, Biotechnol. Bioeng., 19:387-397(1977); Kierstan, M. and Coughlan, P., Immobilization of cells and enzymes by gelentrappment. In Immobilized cells and Enzymes , ed. J. Woodward, pp. 39-48. IRL Press, Oxford.(1985)).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 글루타메이트 디카르복실라아제의 변이체 제작

글루타메이트 디카르복실라아제의 카르복시 말단은 산성 조건에서 구조를 지니지 못하지만 중성 조건에서는 잘 정돈된 구조를 가지며 동시에 조효소인 피리독살 5'-포스페이트가 존재하는 기질 결합 부위를 막는 것으로 알려져 있다 (도 2). 따라서, 대장균 DH5α 유래 글루타메이트 디카르복실라아제의 카르복시 말단 의 2개 또는 15개 아미노산을 제거하여 중성 조건에서 활성이 떨어지는 것을 방지하고자 하였다. 동시에 기질 결합 부위를 문헌 조사한 결과 대장균 글루타메이트 디카르복실라아제의 86번 아미노산인 아스파테이트와 89번 아미노산인 글루타메이트가 pH에 따라 큰 구조적 변화를 나타냄을 알 수 있었다 (도 3). 이 구조적 변화는 아스파테이트와 글루타메이트가 중성에서 모두 음전하를 띠게 되어 서로 반발하는 원리에 의한 것으로 생각되어 89번의 아미노산을 글루타민으로 치환하였다. 원래의 효소와 새롭게 디자인 된 효소의 아미노산 서열을 서열목록에 나타내었다.

변이체 제작은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하는 통상적인 위치선택적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 방법을 사용하였다. 실험의 대조를 위해 카르복시 말단 아미노산이 2개 또는 15개 제거된 변이체와 그렇지 않은 변이체, 그리고 89번 글루타메이트를 알라닌으로 치환한 변이체와 글루타민으로 치환한 변이체 등의 조합으로 변이체를 제작하였다. 예를 들어 89번 글루타메이트를 글루타민으로 치환한 변이체를 제작하기 위해 E89Q_F (5'-CTGGATCGACAAAGAA CAG TATCCGCAATCCGCAGCC-3')과 E89Q_R (5'-GGCTGCGGATTGCGGATA CTG TTCTTTGTCGATCCAG-3')을 이용하여 pET-28b에 클로닝된 글루타메이트 디카르복실라아제 및 벡터 서열을 모두 PCR로 변이 증폭하였다. 89번 글루타메이트를 알라닌으로 치환한 변이체 제작을 위해서는 E89A_F (5'- CTGGATCGACAAAGAA GCG TATCCGCAATCCGCAGCC-3')과 E89A_R (5'-GGCTGCGGATTGCGGATA CGC TTCTTTGTCGATCCAG-3')을 이용하였다 (밑줄로 나타낸 부분이 변이가 도입된 부분임). 원래의 서열을 모두 제거하기 위해 PCR 반응액을 제한효소 DpnI으로 처리하고 이를 대장균 JM109에 형질전환하였다. 카르복시 말단의 2개 아미노산 제거를 위해 dHT_F (5'- ACAGAACAGCTTTAAATAACTCGAGCACCACCACCACCA -3')과 dHT_R (5'- GGTATTGCCCAACAGAACAGCTTTAAA -3')을 이용하여 PCR하였다. 이후의 과정은 89번 변이체 제작의 과정과 동일하다. 카르복시 말단의 15개 아미노산 제거를 위해서는 dC_F (5'- TAACTCGAGCACCACCA-3')와 dC_R (5'- GTGATCGCTGAGATATTTCAGG-3')을 PCR 반응에 이용하였다. PCR 산물을 T4 DNA ligase를 이용하여 blunt-end ligation하고 제한효소 DpnI을 이용하여 원래의 서열을 모두 제거하였다. 마찬가지로 대장균 JM109에 형질전환하였다. 모든 유전자는 핵산서열 분석을 통해 확인하였고, 자연형과 원하는 변이가 도입된 클론을 대장균 BL21(DE3)에서 발현하고, Ni-NTA 아가로즈를 이용하여 거의 순수한 형태로 분리하였다. 실험에는 ultrafiltration으로 이미다졸을 제거한 효소를 사용하였다 (도 4).

실시예 2. 대장균 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체의 활성 분석

여러 변이체들의 반응 초기 속도 확인을 위하여 citrate-phosphate 완충 시스템을 이용하였다. 완충 용액은 0.1 M의 citrate에 0.2 M의 disodium phosphate을 적정한 비율로 섞어 여러 pH 완충액을 제조하였다. 각 완충 용액에 100 mM L-monosodium glutamate (MSG), 1 mM PLP (pyridoxal-5'-phosphate), 0.1 mM DTT (dithiothreitol), 0.01 mg의 정제 효소를 넣고 37°C에서 10분간 반응시켰다. 반응 용액 0.01 mL를 취하여 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) 0.09 mL와 혼합하고 95°C에서 10분간 가열하여 반응을 중지시켰다. 이를 Gabase (SigmaAldrich, USA)를 이용하여 정량하였다.

도 5에 카르복시 말단의 제거 없이 89번 아미노산인 글루타메이트를 알라닌이나 글루타민으로 치환한 변이체의 pH에 따른 초기 반응을 나타내었다. 보는 바와 같이 카르복시 말단이 제거되지 않은 효소에 대한 89번 글루타메이트에 대한 변이체는 오직 부정적인 효과만을 나타내고 있다. 활성 pH 범위 역시 자연형에 비해 전혀 변화하지 않았다.

도 6에 카르복시 말단의 15개 아미노산이 제거되고 89번 글루타메이트가 치환된 변이체들의 초기 활성을 나타내었다. 이 변이체들은 비록 산성에서의 활성은 자연형에 비해 낮아졌으나 활성 pH 범위가 매우 넓어졌음을 알 수 있다. 특히 카르복시 말단 제거와 89번 글루타민 변이를 동시에 가지고 있는 변이체 ΔC E89Q는 자연형에 비해 pH 단위로 2 이상 활성 범위가 염기성으로 넓어졌음을 알 수 있다.

도 7에 카르복시 말단의 2개 아미노산이 제거되고 89번 글루타메이트가 글루타민으로 치환된 변이체들의 초기 활성을 나타내었다. 이 변이체는 도 6에 나타낸 변이체와 마찬가지로 산성에서의 활성은 자연형에 비해 낮아졌으나 활성 pH 범위가 pH 단위로 2 이상 염기성으로 넓어졌음을 알 수 있다.

실시예 3. 고농도 감마-아미노부틸산 합성에의 응용

여러 변이체들의 고농도 반응을 위하여 1 M의 글루타메이트와 0.02 mg의 효소, 그리고 0.1 M citrate/0.1 M phosphate에서 시간에 따른 전환율을 도 8에 나타내었다. 자연형에 비해 카르복시 말단의 15개 아미노산이 제거되고 89번 글루타메이트가 글루타민으로 치환된 변이체가 50% 정도 높은 전환율을 나타내었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 카르복시 말단으로부터 아미노산 잔기 2-15개가 결손되고, 89번째 글루타메이트가 글루타민 또는 알라닌으로 치환된 변이를 포함하는 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체.
2. 제1항에 있어서,
   상기 변이체는 아미노 말단에 친화성 태그가 삽입된 것인 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체.
3. 제2항에 있어서,
   상기 친화성 태그는 히스티딘(Histidine, His), 말토스 결합 단백질(Maltose Binding Protein, MBP), 티오레독신(thioredoxin, Trx), NusA(N utilization substance A) 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-transferase, GST) 태그인 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체.
4. 제3항에 있어서,
   상기 변이체는 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열로 이루어진 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 코딩하는 유전자.
6. 제5항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3, 5, 7 또는 9의 핵산서열로 이루어진 유전자.
7. 제5항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
8. 제7항의 재조합 벡터로 형질전환 된 형질전환체.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산의 제조방법.
10. 제8항의 형질전환체에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산의 제조방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 방법은 상기 형질전환체를 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 포함하는 배지에서 배양하여 실시하는 것인 감마-아미노부틸산의 제조방법.

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