KR970001566B1

KR970001566B1 - 티로신 페놀리아제(Tyrosine phenollyase)를 코드(code)하는 유전자, 상기 유전자에 의해 형질전환된 대장균 및 이를 이용한 티로신 페놀리아제의 제조방법

Info

Publication number: KR970001566B1
Application number: KR1019940000081A
Authority: KR
Inventors: 김영준; 엄기남; 홍의극; 이광혁; 성문희; 오태광; 이규종; 왕지원; 태동년
Original assignee: 주식회사 유 공; 김항덕; 한국과학기술연구원; 김은영
Priority date: 1994-01-04
Filing date: 1994-01-04
Publication date: 1997-02-11
Also published as: JPH0823983A; KR950023722A

Abstract

내용없음.

Description

티로신 페놀리아제(Tyrosine Phenollyase)를 코드(code)하는 유전자, 상기 유전자에 의해 형질전환된 대장균 및 이를 이용한 티로신 페놀리아제의 제조방법

제1도는 재조합플라스미드 pGY1000의 내부에 함유된 시트로박터 프로인디 (Citrobacter freundii) 유래의 티로신 페놀리아제를 코드하는 유전자의 제한효소절단지도이다.

제2도는 디데옥시(dideoxy)법에 의한 DNA 염기서열 결정의 전략(stragegy)도이다.

제3도는 티로신 페놀리아제 유전자의 염기서열과 티로신 페놀리아제의 아미노산 배열도이다.

제4도는 티로신 페놀리아제의 제조를 위한 재조합플라즈미드 pGY4000의 개략 적인 제조공정도이다.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

B : BamHI A : AccI

C : ClaI Ap : ApaLI

N : NcoI Nd : NdeI

P : PstI Pv : PvuⅡ

본 발명은 시트로박터 프로인디의 티로신 페놀리아제의 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합플라즈미드, 상기 재조합플라즈미드로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 이용하여 티로신 페놀리아제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

티로신 페놀리아제는 페놀, L-세린 또는 암모니아, 및 피루빈산으로부터는 L-타이로신(Brot. H. et. al, (1965), Arch. Biochem. Biophys, 112, 1~6]을 카테콜, L-세린 또는 암모니아, 및 피루빈산으로부터는 L-도파(L-DOPA)[Yamada. H. et al., (1968), Biochem. Biophys. Res. Commun. 33. 10~14]를 합성하는 다기능 효소이며, 여러 박테리아가 티로신 페놀리아제 활성을 가지고 있는 것이 알려져 있다[Enei. et al., (1972), Agr. Biol. Chem. 36, 1861~1868].

특히, 앤테로박테리아(Entrobacteriaceae)에 속하는 에세리치아(Escherichia) 속. 시트로박터(Citrobacter)속, 에어로박터(Aerobacter)속, 프로테우스 (Proteus)속, 어비니아(Erwinia)속 등의 박테리아가 높은 티로신 페놀리아제 활성을 가지는 것으로 보고되었다[Yamada. H. and Kumagai. H, (1975), Adv. Appl. Microbiol. 19. 249~288].

그리고, 어비니아허비콜라(Erwinia herbicola) ATCC21434, 어비니아허비콜라(Erwinia herbicola) MT-10509, 에세리치아프로인디(Escherichia freundii) AJ-2608, 에세리치인터미디아(Escherichia intermedia) FKU0010N-7 등의 균주로부터 티로신 페놀리아제의 유전자를 포함하는 DNA 조각을 얻어, 각각의 DNA 조각을 함유하는 플라즈미드로부터 형질전환된 대장균이 티로신 페놀리아제 활성을 보유한다는 것이 알려져 있다[일본특개소 제62-259589호, 유럽특허 제0450920A2호, 일본특개소 제63-222682호 및 일본특개평 제3-94688호].

그러나, 이와같은 미생물을 공업적으로 이용하기에는 효소활성이 충분치 않고, 더욱이 배양시에는 배지에 유도물질로써 L-타이로신[일본특개소 제62-259589호 및 일본특개평 제3-94688호] 또는 아이피티지(IPTG, isopropylthiogalactoside)[일본특개소 제63-222682호]를 첨가시켜야만 한다. 배지에 L-타이로신을 첨가시키면 L-도파를 포함한 L-타이로신 이외의 아미노산 생산에 있어서 첨가시킨 L-타이로신의 제거가 문제가 되며, 아이피티지는 매우 고가이기 때문에 공업적으로 활용가치가 떨어지는 단점이 있었다.

이에 본 발명자들은 미생물로부터 티로신 페놀리아제를 효과적으로 제조하는 방법에 관해 광범위한 연구를 수행한 결과, 시트로박터프로인디 KCTC2006 유래의 티로신 페놀리아제를 가지는 DNA 조각을 분리시키고, 이 유전자의 구조를 명확히 밝혀, 그 구조해석을 기초로 하여 티로신 페놀리아제의 구조유전자를 발현벡타에 결합시킨 새로운 재조합플라즈미드를 제조하였으며, 이것에 의해 형질전환된 새로운 재조합 대장균을 제조하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 시트로박터프로인디 KCTC2006 유래의 티로신 페놀리아제의 누클레오티드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 누클레오티드에 대응하는 아미노산 서열을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 누클레오티드를 함유하는 DNA 염기 서열을 플라즈미드벡타에 결합시켜서 된 재조합플라즈미드를 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 재조합플라즈미드로 형질전환시킨 대장균을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 대장균을 이용하여 티로신 페놀리아제를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 시트로박터 프로인디 KCTC2006 유래의 누클레오티드는 하기 식(I)으로 구성된다.

식(I)

여기서 상기 누클레오티드에서 A는 아데닌, T는 티민, C는 시토신 그리고 G는 구아닌을 의미한다.

이하 본 발명을 좀더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

티로신 페놀리아제를 코드하는 유전자를 가지고 있는 DNA를 채취할 목적으로 이용되는 미생물은 티로신 페놀리아제 활성을 가지고 있는 미생물이면 어느 것이나 이용 가능하나, 본 발명에서는 시트로박터프로인디 KCTC2006을 선택하였다. 티로신 페놀리아제 유전자를 가지고 있는 DNA를 채취하기 위해서는 하기의 방법을 사용하였다. 티로신 페놀리아제 활성을 가지고 있는 시트로박터프로인디 KCTC2006을 배양하고, 그 균체로부터 염색체 DNA를 추출, 정제한 다음, 그 염색체 DNA를 적절한 제한효소로 절단해, 대장균에서 증식가능한 플라즈미드 벡타에 DNA 리가제(ligase)로 연결시켜 얻어진 재조합플라즈미드를 이용해 티로신 페놀리아제 생산능이 없는 대장균을 형질전환시킨 뒤에, 티로신 페놀리아제 생산능을 가지게 된 균주를 선택하여 그 균주로부터 티로신 페놀리아제 유전자를 갖는 플라즈미드를 분리하였다. 상기 티로신 페놀리아제를 코드하는 누클레오티드 서열은 상기 식(I)에서 5'에서 3'방향으로 유전자의 코드화된 가닥을 따라 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여졌다.

상기 식(I)에 의해 표현되는 티로신 페놀리아제의 아미노산 서열을 하기 식(Ⅱ)에 기재하였다.

식(Ⅱ)

본 발명에 있어서, 상기 식(I)로 코드화된 전체 단백질은 화학적으로 합성된 펩타이드 또는 어떤 형태의 발현벡터에서 재조합 단백질로써 제조된 상기 식(Ⅱ) 또는 그것의 단편으로 표현되는 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, 상기 식(Ⅱ)로부터 유도된 합성 펩타이드 또한 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명에서 염색체 DNA 절단에 사용되는 제한효소는 효소사용량과 반응시간 등을 조절하여 DNA의 절단정도를 조절하면서 여러종류의 제한효소의 사용이 가능하며, 예를들어, PstI, Sau3AI, SspI, HinCⅡ, HaeⅢ 및/또는 EcoRI 등이 사용된다. 또한 , 본 발명에 사용된 프라즈미드 벡타로는 에세리치아콜리(Escherichiacoli, 이하 대장균이라 함)내에서 증식 가능한 것이면 어느 것이든 이용 가능하며, 예를들어 pUC19, pHT12, pHT12I 또는 pKK233-2 등을 사용했다. 플라즈미드 벡타는 염색체 DNA를 절단시키기 위해 사용했던 제한효소로 절단하거나, 같은 끝말단을 형성시키는 제한효소로 절단시킨 뒤에 리가제를 이용하여 염색체 DNA 조각과 연결시켰다.

염색체 DNA는 제한효소로 절단하고 슈크로즈 밀도분배 원심분리, 아가로즈 전기영동 등을 이용하여 특정 크기의 DNA만을 분획, 회수해 플라즈미드 벡타에 연결시켰다. 이와 같이해서 얻어진 염색체 DNA 단편과 플라즈미드 벡타와의 제조합 플라즈미드를 대장균에 넣는 방법에는 균체를 염화칼슘으로 처리하는 방법[Mandel. O. et al (1970) J. Mol. Biol., 53, 159~162]을 이용하였다. 본 발명에 사용된 대장균은 티로신페놀리아제 활성이 없는 대장균으로서 예로들면, 대장균 JM-83, 대장균 HB101 등이 있다.

본 발명에서는 티로신 페놀리아제 생산능을 획득한 형질전환부를 선택하기 위해서 다음과 같은 방법을 이용하였다. L-타이로신을 넣은 LB 배지의 한천평판 상에 형질전환부의 콜로니를 배양하고, 4-아미노안티피린 용액을 뿌려 콜로니 주위가 적색으로 되는 형질전환부를 선택했다. 재조합플라즈미드를 갖고 있는 대장균에서 재조합플라즈미드를 분리하는 데에는 알칼리 추출법[Brinboim, H. C. and J. Doly, (1979), Nucleic Acid Res. 7, 1513~1523]을 이용하였고, 분리한 재조합플라즈미드는 균체를 염화칼슘으로 처리하는 방법에 의해 다시 대장균에 도입시켰다.

이상과 같이 해서 제조된 티로신 페놀리아제 유전자를 갖는 DNA와 플라즈미드 벡타가 연결된 재조합플라즈미드를 pGY1000으로 명명하였다.

본 발명에서는 티로신 페놀리아제 유전자를 높은 효율로 발현시키기 위해 중합사슬반응(이하 PGR이라 함)을 이용하여 상기 pGY1000에서 티로신 페놀리아제의 구조유전자 부분만을 선택적으로 증폭시켜 이를 강력한 프로모터를 갖는 발현벡타의 프로모터 하류에 연결하였다. 이 때, 하기 식(Ⅲ) 및 (Ⅳ)로 표현되는 화합물을 PCR반응시의 프라이머로 사용하였다.

5'-AATTATCCGGCAGAACCCTTC-3' (Ⅲ)

5'-CGGATCCAAGCTTATTAGATATAGTCAAAGCGTGCAGT-3' (Ⅳ)

본 발명에 사용된 고발현 플라즈미드벡터의 프로모터는 trc 프로모터가 바람직하며, 티로신 페놀리아제 유전자의 밑부분에 터미네이터(terminator)를 접속시킨 것이 유용한 경우도 있다. 이와같이 제조합된 플라즈미드를 pGY4000로 명명하였고, 상기 pGY4000로 형질전환시킨 대장균을 한국과학기술원 유전공학센터 유전자은행에 1993년 11월 3일자로 기탁하여 기탁번호 번호 제KCTC 8538P호를 부여받았다.

본 발명에 따르면, 상기 방법으로 제조된 재조합플라즈미드로 대장균을 형질전환시켜 티로신 페놀리아제를 제조할 수 있다. 대장균의 배양은 통상적으로 행하는 방법이면 가능하다. 즉, 탄소원, 질소원, 무기이온, 필요에 따라 아미노산, 비타민 등을 넣은 배지에서 호기적으로 배양하면 된다. 또한, 본 발명에 의하면 배지내에 L-타이로신 또는 IPTG 등의 유도물질을 넣어줄 필요가 없다. 본 발명에 의한 대장균을 배양할 때에는 배지내에 상기 유도물질을 첨가시키지 않아도 대량으로 티로신 페놀리아제를 제조하는 것이 확인되었다. 즉, 본 발명은 배지에 유도물질의 첨가없이 티로신 페놀리아제를 생성해 낼 수 있는 유전자, 그 유전자를 함유하는 재조합플라즈미드, 그 재조합플라즈미드로 형질전환된 재조합 대장균 및 그 재조합 대장균을 이용하여 티로신 페놀리아제를 대량 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이와 같은 방법으로 제조된 배양물은 그 자체로서 티로신 페놀리아제의 효소원으로써 사용 가능하고, 조효소 추출액, 정제효소, 분리생균체, 분리균체의 처리물 등도 효소원으로써 사용이 가능하다. 또한, 상기 티로신 페놀리아제는 통상의 효소정제법을 이용하여 정제가 가능하다.

본 발명에 사용된 약어의 의미는 다음과 같다.

Ala는 알라닌, Arg는 알지닌, Asn은 아스파라진, Cys는 시스틴, Gly는 글리신, Glu는 글루타믹 엑시드, Phe는 페닐알라닌, Leu는 루이신, Val은 발린, Tyr는 티로신, Thr은 쓰레오닌, Met는 메싸이오닌, His는 히스티딘, Lys는 리신, Pro는 프롤린, Ser은 세린, Ile은 이소루이신, Asp는 아스파틱 엑시드, Gln은 글루타민, Trp는 트립토판.

이하 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

시트로박터프로인디의 티로신 페놀리아제의 유전자의 클로닝

[실시예 (1-1)]

시트로박터프로인디의 염색체 DNA의 분리

시트로박터프로인디 KCTC 2006을 100㎖의 LB배지(박토트립톤 10g/l, 효모엑기스 5g/l, 염화나트륨 5g/l, pH 7.2)에 접종 후, 30℃에서 18시간 동안 진탕배양하고, 원심분리해 균체를 회수하였다. 균체를 TE 용액(10mM Tris-HCl, pH7.6, 1mM EDTA)으로 세척한 뒤에, 9.5㎖의 TE 용액으로 현탁시키고, 10% 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 용액 0.5㎖과 프로티나제 K(proteinase K)를 1㎎ 넣고, 37℃에 1시간 동안 방치하였다.

TE 용액으로 포화시킨 페놀/클로로포름(1 : 1) 혼합액을 동량 첨가시켜 혼합한 후, 상층액을 분리하는 추출과정을 3회 반복하였다. 상층액에 2배 부피의 에탄올을 혼합시키고, 유리봉으로 저으면서 실모양의 염색체 DNA를 감아 올렸다. 이를 70% 에탄올에 담구어 세척하고 건조시킨 뒤에 TE 용액에 녹여 0.8㎎의 염색체 DNA를 분리, 정제하였다.

[실시예 (1-2)]

염색체 DNA 단편의 정제

상기 실시예(1-1)에서 얻어진 염색체 DNA를 함유한 TE 용액 100㎕(DNA 20㎍을 포함)에 제한효소 Sau3AI(Boeringer Mannheim사 제품)을 5 단위(unit) 넣은 최종반응액 120㎕를 37℃에서 10분간 반응시켜 염색체 DNA를 부분적으로 절단하였다. 상기 반응액에 TE 용액으로 포화된 페놀/클로로포름(1:1) 혼합액을 동량 가해 잘 섞어준 뒤, 원심분리(15,000rpm, 5분)하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액에 0.1배량의 3M 초산칼륨(potassium acetate)용액을 넣고 2배량의 에탄올을 넣어 원심분리시켜 생긴 침전물을 건조시킨 뒤에 100㎕의 TE 용액에 용해시켰다. 그 DNA 용액을 10~40% 슈크로즈 밀도분배 원심분리(26,000rpm, 2시간, 20℃)시켜 크기별로 DNA 조각을 분리하였다(2~10Kbp). 각각의 DNA 조각을 TE 용액으로 투석한 뒤에 에탄올에 침전시킨 다음, DNA를 회수해 TE 용액에 용해시켰다.

[실시예 (1-3)]

염색체 DNA 단편과 플라즈미드 벡터의 결합

pUC19(clontech사 제품) 50㎍을 제한효소 BamHI(Boeringer Mannheim사 제품)으로 완전히 절단한 뒤에 포스파타제(CIP, Promega사 제품)로 처리했다. 이 플라즈미드 벡타 1㎍씩과 상기 실시예 (1-2)에서 얻은 염색체 DNA 조각의 분획 0.5㎍씩을 각각 섞은 뒤에 T4 DNA 리가제(Boeringer Mannheim사 제품)를 4 단위 넣은 최종반응액 30㎕를 16℃에서 15시간 반응시켰다.

[실시예 (1-4)]

라이게이션(ligation) 혼합액을 이용한 대장균의 형질전환 및 티로신 페놀리아제 유전자가 도입된 형질전환체의 선별

상기 실시예 (1-3)에서 제조된 반응액을 이용하여 대장균을 형질전환시켰다. 티로신 페놀리아제 생산능이 없는 대장균으로서는 대장균 HB101을 사용했다. 상기 대장균을 500㎖의 LB배지에 접종해 37℃에서 진탕배양한 후 원심분리시켜 분리한 균체를 20㎖의 염화칼슘용액(5mM Tris-HCI, pH7.5, 75mM CaCl₂, 250mM KCl, 5mM MgCl₂6H₂O)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 0℃에서 20분간 방치한 후 원심분리시켜 0.1M의 염화칼슘 용액 4㎖에 현탁시키고, 상기 현탁액 200㎍에 상기 실시예 (1-3)에서 제조된 라이게이션 혼합액 20㎕를 혼합시키고 0℃에서 1시간 방치 후 42℃에서 90초간 처리하여 DNA를 도입시켰다. 이 용액에 LB 배지를 0.8㎖ 넣어 37℃에서 50분간 배양한 뒤에 50㎍/㎖의 앰피실린을 넣은 매콩키(MacConkey agar, Difco사 제품) 배지의 한천평판상에 도말하여 37℃에서 15시간 배양했다. 그리고, 플라즈미드 벡타내에 DNA 조각이 삽입되어 생긴 흰색의 콜로니를 L-타이로신(0.2%)과 앰피실린(50㎍/l)을 넣은 LB배지 한천평판상에 투쓰픽(toothpick)하여 37℃에서 20시간 배양하였다. 상기 콜로니에 1.4%의 탄산수소 나트륨(sodium bicarbonate) 용액, 0.85%의 4-아미노안티피린, 5.4%의 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide) 용액 등을 순차적으로 분무해 콜로니 주위가 적색으로 변하는 콜로니를 선별하였다. 상기 실험 결과 약 5~7Kbp의 염색체 DNA 단편의 분획을 이용하여 제조된 재조합플라즈미드로 형질전환된 대장균을 도말한 하천평판에서 1주의 티로신 페놀리아제 생산균주를 얻었다. 이 대장균을 에세리치아 콜리(Escherichia coli) GY1000이라고 명명하였다.

[실시예 (1-5)]

대장균이 갖는 재조합플라즈미드의 분리 및 분석

상기 실시예 (1-4)에서 제조된 형질전환체를 50㎖의 LB 배지에 접종 후 37℃에서 15시간 배양한 뒤에 원심분리시켜 균체를 분리하였다. 균체를 4㎖의 A용액(50mM glucose, 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA)에 현탁한 뒤, B용액(0.2N NaOH, 1% SDS)을 8㎖ 넣어 잘 섞어주고 얼음에 10분 방치했다. 냉각된 C용액(3M potassium acetate, pH5.2)을 6㎖ 넣고 얼음에 10분 방치했다. 원심분리(15,000rpm, 15분)하여 상등액을 취하고 페놀-클로로포름(1 : 1) 혼합액을 동량 첨가시켜 원심분리한 뒤 수용액을 취하였다. 수용액에 동량의 이소프로필알코올(iospropyl alcohol)을 넣어 얼음에 15분 방치해 원심분리시켜 플라즈미드를 침전시키고 70% 에탄올로 세척한 후, 건조시킨 뒤에 이를 TE용액 400㎕에 용해시켰다. 리보누클리아제(RNAse A)를 넣어 37℃에 방치한 후, 13% PEG-1.5M NaCl 용액을 400㎕ 넣고 얼음에 1시간 방치시켰다. 상기 용액을 원심분리시키고 70% 에탄올로 세척한 후, 건조시킨 뒤에 TE용액 200㎕에 용해시켰다. 이와 같이 하여 600㎍의 재조합플라즈미드를 분리해낸 다음, 이를 pGY1000이라 명명하였다.

상기 재조합플라즈미드는 약 8.7Kbp의 크기이며, 제한효소 BamHI으로 절단해서 약 6.0Kbp의 DNA 단편이 삽입되어 있음을 확인했다. 상기 pGY1000내에 삽입된 DNA 단편의 제한효소 지도를 제1도에 나타내었다.

[실시예 (1-6)]

재조합플라즈미드의 재현성 확인

상기 실시예 (1-5)에서 분리한 재조합플라즈미드 pGY1000을 티로신 페놀리아제 생산능이 없는 대장균 HB101을 상기 실시예 (1-4)와 같이 형질전환시켜 50㎍/㎖의 앰피실린 및 0.2%의 L-타이로신이 함유된 LB 배지 한천평판에 도말해 37℃에서 배양 후 상기 실시예 (1-4)와 같은 4-아미노 안티피린법에 의해 티로신 페놀리아제 생산능을 검사했을 때 모든 콜로니의 주위가 붉게 변하였고, 이로부터 pGY1000 상에는 티로신 페놀리아제의 유전자를 갖는 DNA가 존재함을 확인했다.

[실시예 (1-7)]

클로닝된 DNA 단편의 염기서열 결정 및 분석

상기 pGY1000 플라즈미드를 여러 제한효소로 처리하여 대략적인 제한효소지도를 작성하였다. 여러 종류의 제한효소를 사용하여 삽입된 DNA 크기를 DNA 단편들을 제조한 뒤에 pUC19의 폴리링커 영역(polylinker region)에 삽입시켰다. 이러한 재조합플리즈미드 대장균 HB101을 상기 실시예 (1-4)와 같은 방법으로 형질전환시켜 50㎍/㎖의 앰피실린과 0.2%의 L-타이로신을 첨사시킨 LB 배지 한천평판상에 도말해 배양한 다음, 상기 실시예 (1-4)와 같이 4-아미노안티린피린법에 의해 티로신 페놀리아제 생산능을 확인한 결과, BamHI-Pvull DNA 단편(약 3.0Kbp)내에 티로신 페놀리아제 유전자를 갖고 있는 서브클론(sunclone)을 획득하였다. 상기 플라즈미드를 디아데옥시누클레오티드 시퀀싱(dideoxynucleotide sequencing)방법(미국 USB Co.에서 구입한 중합효소인 시쿼네이즈와 실험절차를 이용)을 사용하여 제2도에 도시된 것과 같은 전략(strategy)으로 시퀀싱하였다.

염기배열을 결정한 결과 DNA 단편 내에는 자체의 프로모터와 티로신 페놀리아제를 코드(code)하고 있는 1371bp의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 존재함을 확인하였다. 이러한 염기서열로부터 티로신 페놀리아제의 아미노산 배열을 추론할 수 있었으며 이는 총 456개의 아미노산으로 이루어져 있었다.

[실시예 2]

티로신 페놀리아제의 고발현 재조합플라즈미드 제조 및 대장균 형질전환체로부터의 티로신 페놀리아제의 제조

[실시예 (2-1)]

티로신 페놀리아제의 고발현 재조합플라즈미드 제조

상기 실시예 (1-7)에서 정한 티로신 페놀리아제의 DNA 염기서열에 근거해 2종류의 프라이머(primer)를 합성하여 PCR 반응을 시켰다. 프라이머1의 염기서열은 5'-AATTATCCGGCAGAACCCTTC-3'이고, 프라이머2의 염기서열은 5'-CGGATCCAAGCTTATTAGATATAGTCAAAGCGTGCAGT-3'이다. 100㎕의 반응액 안에 100pmole씩의 프라이머1과 프라이머2 및 0.7㎍의 시크로박터로인디 염색체 DNA, 0.2mM의 누클레오타이드 혼합액, 5 단위의 DNA 중합효소(Tag polymerase)를 넣은 뒤, 미네랄 오일을 100㎕ 넣었다. 25싸이클(cycles)을 반복한 뒤에 클로로포름으로 추출해 미네랄 오일을 제거했다. 3배 부피의 에탄올을 넣고 원심분리시켜 건조한 뒤, 클레나우 조각(klenow fragment)을 이용해 양쪽 끝을 메꾸어 준 뒤에 폴리뉴클레오티드 키나제(T4 polynucleotide kinase)를 이용해 인산을 붙였다. 발현벡타인 pKK233-2 벡타를 제한효소인 NcoI으로 절단하고 알칼린 포스포타제를 처리한 후에, 상기에서 제조된 PCR 반응액을 넣고 T4 DNA 리가제를 이용해 라이게이션시켰다.

상기 반응액으로 상기 실시예 (1-4)와 같이 해서 제조된 대장균을 형질전환시키고 0.2%의 L-타이로신과 50㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 LB 배지 한천평판상에 도말 후 37℃에서 배양하였다. 상기 실시예 (1-4)와 같이 4-아미노안티피린법에 의해 콜로니 주위가 적색으로 변하는 콜로니를 선별한 후 상기 실시예 (1-5)와 같이 재조합플라즈미드를 분리하고 여러 제한효소로 절단하여 제한효소 위치를 비교하였다. 이와 같이 하여 제조된 재조합플라즈미드를 pGY4000이라 명명하였으며, 상기 pGY4000으로 형질전환된 대장균을 GY4000로 명명하였고, 이를 1993년 11월 3일자로 한국과학기술원 유전자은행에 기탁하여 기탁번호 제KCTC 8538P호를 부여받았다.

[실시예 (2-2)]

대장균 형질전환체로부터 티로신 페놀리아제의 제조

상기 대장균 GY4000을 LB배지(50㎍/㎖의 앰피실린 포함) 50㎖에 접종해 37℃에서 23시간 진탕배양 후 원심분리시켜 균체를 분리하였다. 이같은 균체의 티로신 페놀리아제 활성을 다음과 같은 방법으로 측정했다.

균체를 세척 후 50mM의 피리독살인산(pyridoxal phosphate)을 넣은 인산 완충용액(pH7.2) 10㎖에 현탁해 초음파로 균체를 파쇄하고 원심분리해 조효소액을 제조하였다. 70g/l의 L-세린, 17g/l의 페놀, 17g/l의 초산암모늄이 있는 반응액(pH8.0)을 90㎖ 넣고 37℃에서 1시간을 흔들면서 반응시켰다. 생성된 L-타이로신의 양은 HPCL로 정량분석하였다.

본 발명에 따른 균주의 티로신 페놀리아제의 활성을 비교하기 위하여 대장균 및 시트로박터프로인디 KCTC2006을 같이 배양하여 티로신 페놀리아제의 활성을 측정하였다. 각 균주의 티로신 페놀리아제의 활성은 하기 표 1에 기재하였다.

1)은 배지내에 L-타이로신을 0.2% 첨가

2)는 배지내에 L-타이로신을 첨가하지 않음.

3)은 티로신 페놀리아제 1 단위로서 37℃에서 1분에 1umole의 L-타이로신을 생성하는 효소량을 의미함.

상기 표 1에서 알 수 있는 바와같이, 본 발명에 있어서 제조된 대장균은 배지내에 L-타이로신을 첨가시키지 않아도 배지내에 L-타이로신을 0.2%첨가시킨 시트로박터프로인디 KCTC2006보다 약 33배 많게 티로신 페놀리아제를 생산했다.

Claims

하기 식(Ⅰ)로 표현되는 티로신 페놀리아제를 코드하는 올리고누클레오티드.

식(Ⅰ)
하기 식(Ⅱ)로 표현되는 티로신 페놀리아제의 아미노산 서열.

식(Ⅱ)
제1항의 누클레오티드를 함유하는 DNA를 플라즈미드벡타에 연결시켜서 된 재조합 플라즈미드 pGY1000.
제3항의 재조합플라즈미드 pGY 1000을 PCR 반응(중합사슬반응)시켜 제1항의 누클레오티드를 고발현 플라즈미드벡타의 프로모터 하류에 연결시켜서 된 재조합 플라즈미드.
제4항에 있어서, 상기 고발현 플라즈미드벡타가 pKK 233-2임을 특징으로 하는 재조합 플라즈미드.
제4항에 있어서, 상기 프로모터가 trc 프로모터임을 특징으로 하는 재조합 플라즈미드.
티로신 페놀리아제 유전자를 함유하는 신규한 재조합 플라즈미드 pGY4000.
제4항 내지 제7항의 어느 한 항의 재조합 플라즈미드로 형질전환된 대장균.
제8항에 있어서, 상기 형질전환된 대장균이 한국과학기술원 유전공학센터 유전자은행에 제KCTC 8538P호로 기탁된 티로신 페놀리아제 합성 대장균임을 특징으로 하는 재조합 플라즈미드로 형질전환된 대장균.
제8항 또는 제9항의 어느 한 항의 대장균을 이용하여 유도물질의 첨가없이 티로신 페놀리아제를 제조하는 방법.