ITMI952700A1 - Mutanti termostabili della d-m-alfa-carbamilasi - Google Patents
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Abstract
La presente invenzione riguarda mutanti termostabili della D-N-?-carbamilasi e mezzi e metodi per la loro preparazione.Detti mutanti termostabili esibiscono una attività inalterata o migliorata rispetto all'enzima wild type e sono particolarmente utili nella preparazione di D-?-amminoacidi.
Description
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda mutanti termostabili della D-N-a-carbamilasi, mezzi e metodi per la loro preparazione e loro impiego per la produzione di D-a-amminoacidi.
I D-a-amminoacidi sono importanti intermedi nella preparazione di sostanze farmacologicamente attive, di pesticidi e di dolcificanti. Ad esempio, la D-fenilglicina e la D-para-idrossifenilglicina sono utilizzate nella sintesi di penicilline e cefalosporine semisintetiche, mentre la D-valina nella preparazione dell'insetticida fluvanilato e la D-alanina nella produzione di dolcificanti.
E' noto nella tecnica preparare D-a-amminoacidi a partire da miscele raceme dei loro N-carbamil derivati o da miscele raceme delle corrispondenti idantoine 5-sostituite mediante idrolisi chimica od enzimatica .
I procedimenti chimici, che si basano generalmente sull'impiego dell'acido canfosolfonico, presentano tuttavia gli inconvenienti derivanti dalle complesse procedure richieste per la risoluzione e purificazione dei D-a-amminaocidi. Ne consegue che tali procedimenti sono economicamente poco interessanti da un punto di vista industriale.
D'altra parte i procedimenti che utilizzano enzimi o sistemi enzimatici ottenuti da microorganismi (EP-199,943, EP-309,310, US 4312948, FR 2456728) presentano delle limitazioni dovute non solo agli elevati costi di produzione e purificazione di tali enzimi, ma anche alla loro instabili-tà che, come è noto, può essere attribuita ad una serie di fattori quali ad esempio denaturazione termica, fenomeni ossidativi ed aggregazioni causa-te da legami di tipo idrofobico e/o covalente.
Individuare le cause di tale instabilità è quindi di fondamentale importanza al fine di trovare soluzioni per migliorare e rendere più competitivo un processo enzimatico. D’altra parte risulta spesso difficile poter individuare con esattezza (i) le cause di tale instabilità ed (ii) i rimedi possibili affinché l'instabilità stessa venga eliminata o ridotta senza alterare 1 'attività dell 'enzima.
Con il termine sistema enzimatico si fa riferimento ad un sistema costituito dagli enzimi D-idantoinasi e D-carbamilasi che trasformano, rispettivamente, le D-idantoine in D-carbamil derivati e questi ultimi in D-amminoacidi.
La D-N-a-carbamilasi mostra una stabilità inferiore all'idantoinasi nelle condizioni operative utilizzate per il processo di produzione di D-oc-amminoacidi.
Mutanti della D-N-a-carbamilasi con una stabilità migliorata sono stati ottenuti come riportato nella domanda di brevetto EP-A-677584.
E’ evidente che disporre di una carbamilasi più stabile alle alte temperature consentirebbe di migliorare la velocità di conversione del substrato nei corrispondenti amminoacidi e di conseguenza abbattere sensibilmente i costi di produzione.
Così ad esempio la domanda di brevetto EP-610517 descrive mutanti termostabili della D,N-α-carbamilasi ottenuti mediante una o più sostitu-zioni di residui amminoacidici in siti ben determi-nati. Tuttavia i mutanti più termostabili mostrano a parità di biomassa catalitica una ridotta attività in confronto ai mutanti della presente invenzione .
E’ stato ora trovato che è possibile ottenere mutanti termostabili della D-N-a-carbamilasi con una attività enzimatica inalterata o migliorata rispetto all’enzima wild type mediante sostituzione di uno o più residui in siti ben determinati della sequenza amminoacidica.
Detti mutanti consentono di operare a temperature più elevate di quelle attualmente impiegate in un procedimento convenzionale di produzione di D-ocamminoacidi, aumentando in tal modo la velocità di racemizzazione dell'isomero L, la solubilità e la velocità di idrolisi del substrato. Di conseguenza ciò permette una riduzione della quantità di biomassa o del tempo necessario per ottenere la conversione completa del substrato nei corrispondenti D-a-amminoacidi.
In accordo con ciò in un suo primo aspetto la presente invenzione riguarda mutanti termostabili della D-N-a-carbamilasi caratterizzati dal fatto che almeno uno dei residui amminoacidici in posizione 184, 212, 262 e 304 è sostituito con un residuo differente scelto nel gruppo degli amminoacidi naturali .
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione una sequenza nucleotidica che codifica almeno un mutante della D-N-a-carbamilasi con una stabilità termica migliorata.
Costituisce anche uno scopo della presente invenzione un vettore ricombinante replicabile ad espressione comprendente detta sequenza.
Costituisce un ulteriore scopo della presente invenzione un microorganismo trasformato con detto vettore .
Costituisce inoltre uno scopo della presente invenzione un procedimento per la preparazione di almeno un mutante della D-N-a-carbamilasi con una stabilità termica migliorata che comprende il coltivare in opportune condizioni un microorganismo trasformato ed il separare il mutante così ottenuto .
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione l'impiego di detti microorganismi trasformati o di un mutante della D-N-a-carbamilasi ottenuto da detto microorganismo in un procedimento per la produzione di D-a-amminoacidi.
Ulteriori scopi della presente invenzione appariranno evidenti dalla lettura del testo e dagli esempi che seguono.
Mutanti della D-N-a-carbamilasi secondo la presente invenzione sono caratterizzati dal fatto che almeno uno dei residui in posizione 184, 212, 262 e 304 della sequenza amminoacidica dell'enzima wild type è sostituito con un residuo differente scelto tra L-alanina, L-serina, L-lisina, L-arginina, L-acido aspartico, L-acido glutammico, L-asparagina, L-glutamina, L-istidina, L-glicina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-tirosina, L-treonina, L-triptofano, L-fenilalanina, L-metionina o L-prolina .
Preferiti secondo la presente invenzione sono mutanti della D-N-a-carbamilasi in cui il residuo Metl84 è sostituito con L-leucina (Leu), i residui Thr2 12 e Thr262 con L-alanina (Ala) ed il residuo Phe304 con L-isoleucina (Ile).
Particolarmente preferiti secondo la presente invenzione sono i mutanti della D-N-a-carbamilasi in cui almeno due dei residui amminoacidici nelle posizioni 184, 212, 262 e 304 sono sostituiti.
Mutanti della D-N-a-carbamilasi secondo la presente invenzione possono essere preparati mediante un procedimento che comprende:
a) l'introdurre una o più mutazioni nel gene che codifica la D-N-a-carbamilasi;
b) il clonare il gene mutagenizzato ottenuto nello stadio a) in un vettore di clonaggio;
c) il trasformare un ceppo ospite con il vettore ricombinante ottenuto nello stadio b);
d) il coltivare in ambiente di coltura adatto il ceppo ospite trasformato come nello stadio c); ed infine
e) il separare e purificare il mutante della D-N-cx-carbamilasi così ottenuto.
Per quanto riguarda il gene della D-N-a-carbamilasi da mutagenizzare, questo può essere isolato da microorganismi quali Pseudomonas, Hansenula, Agrobacterium, Aerobacter, Aeromonas, Bacillus, Moraxella, Brevibacterium, Flavobacterium, Serratia, Micrococcus, Arthrobacter o Paracoccus. Specifici esempi di tali microorganismi sono Bacillus macroides ATCC 12905, Aerobacter cloacae IAM 1221, Agrobacterium so. IP 1-671, Aarobacterium radiobacter NRRLB 11291, Pseudomonas so■ FERM BP 1900. Secondo una forma di attuazione della presente invenzione è stato mutagenizzato il gene isolato da Aarobacterium radiobacter NRRLB 11291.
L'introduzione di una mutazione nel gene può essere effettuata utilizzando una delle tecniche note di mutagenesi in vitro quale ad esempio mutagenesi sito-specifica o, preferibilmente, mutagenesi random. Quest'ultima può essere effettuata sfruttando la tecnica PCR (Polymerase chain reaction) secondo le indicazioni riportate da Leung D.W. et al., 1989, Technique, 1, 11-15 e che possono essere così schematizzate:
(1) sintesi di due oligonucleotidi (forward e reverse) a monte ed a valle del frammento da amplificare; ed
(2) amplificazione del frammento in condizioni nelle quali l'enzima polimerasi inserisce con una frequenza intorno all'1-2% basi non complementari al templato utilizzato.
Secondo una forma di attuazione della presente invenzione è stato sottoposto a mutagenesi random il gene della D-N-a-carbamilasi fuso all'estremità 3' ad una sequenza che codifica una coda di poliistidina (Poly-his), e ciò allo scopo di consentire un'eventuale purificazione mediante la tecnica IMAC (Immobilized Metal Xon Affinity Chromatography) e contemporanea immobilizzazione su un supporto solido .
In particolare per l'amplificazione è stata utilizzata la seguente coppia di oligonucleotidi: a)5 'CTC GGC TTC CCG GTC TAT GAC GTC GAC3' (forward) b)5 ’GGC TTA CTT GTC TGC TTT C 3' (reverse).
Gli oligonucleotidi possono essere sintetizzati secondo metodiche note utilizzando una delle apparecchiature disponibili in commercio.
Il prodotto dell'amplificazione, dopo taglio con opportuni enzimi di restrizione è stato purificato e ligato ad un vettore digerito con gli stessi enzimi di restrizione. La reazione di ligasi può essere condotta utilizzando metodiche convenzionali in presenza dell’enzima T4 DNA ligasi.
La miscela di ligasi è stata quindi impiegata per trasformare cellule ospiti, preferibilmente E .coli. rese competenti ad esempio per elettroporazione (Dower W.J., Miller J.F. and Ragsdale C.W., N.A.R. (1988), 16, 6127) ed i trasformanti sono stati coltivati su un opportuno terreno di coltura in presenza di un antibiotico.
La selezione dei cloni contenenti delle mutazioni termostabilizzanti è stata condotta effettuando da ciascuna piastra di trasformazione delle repliche su membrana di nitrocellulosa (MFS, Sartorius) . Tali repliche sono state sottoposte a cicli di congelamento-scongelamento per lisare le colonie e, successivamente, sono state poste a 48,5°C per 16 ore. Dopo tale trattamento di inattivazione le membrane sono state trasferite su piastre contenenti come substrato il carbammile di un D-amminoacido, tampone sodio-fosfato pH 7, agarosio (BioRad) e rosso fenolo ed incubate a 37-40*C. Dopo poche ore le colonie contenenti attività carbamilasica termostabile rivelavano una colorazione rosso-violetto, mentre le colonie wild-type non mostravano più attività .
Mediante tale screening sono stati isolati alcuni cloni termostabili. Il DNA plasmidico estratto da detti cloni è stato quindi sequenziato per identificare a livello di DNA le mutazioni introdotte mediante mutagenesi random.
L'analisi della sequenza può essere condotta utilizzando tecniche note basate sul metodo enzimatico di Sanger (Sanger, F. & Coulson, A. R., (1975), J. Mol. Biol., 94, 441-443).
Per ciascun clone sono state individuate le seguenti mutazioni:
Metl84 --> Leu, Thr212 --> Ala, Thr262 --> Ala e Phe304 --> Ile.
Una volta identificate le mutazioni termostabilizzanti, queste sono state introdotte nel gene della carbamilasi privo della coda Poly-His. L'introduzione di una mutazione in siti ben determinati del gene può essere effettuata utilizzando una delle tecniche note di mutagenesi in vitro. Fra le diverse tecniche che producono modificazioni mirate su una sequenza di DNA, le più diffuse sono quelle che impiegano oligonucleotidi sintetici a singola elica.
In particolare è stata impiegata una modifica del metodo descritto da Zoller, M.J. e Smith, M.,(1982 ), Nucl.Acid.Res. , 10, 6487-6500) che comprende :
1) l’inserire il gene della D-N-a-carbamilasi o parte di questo (sequenza bersaglio) in un fago tipo M13 od in un plasmide da esso derivato e prepararlo nella forma a singolo filamento utile come "stampo" (templato) per la sintesi di quello mutato;
2) il sintetizzare un oligonucleotide complementare alla sequenza da mutagenizzare ad eccezione di una porzione interna che determina la mutazione; 3) il procedere all'accoppiamento ( "annealing" ) dell 'oligonucleotide sintetico allo "stampo". Esso farà da "primer" per la sintesi del secondo filamento modificato;
4) il ricostituire, mediante un passaggio di polimerizzazione e ligazione in vitro, la struttura circolare a doppia elica, di cui un filamento è quello parentale, mentre l'altro porta la mutazione desiderata;
5) l’eliminare il filamento parentale ed il ripristinare, mediante un passaggio di polimerizzazione e ligazione in vitro, la struttura circolare a doppia elica in cui entrambi i filamenti contengono la mutazione desiderata;
6) l'impiegare la forma a doppia elica per trasformare cellule ospiti rese competenti ottenendo una popolazione di cloni mutanti e wild type; ed infine
7) il selezionare i cloni mutanti.
Operando come sopra riportato sono stati costruiti mutanti singoli e multipli della D-N-acarbamilasi, nei quali i residui in posizione 184, 212, 262 e 304 della sequenza amminoacidica dell'enzima wild type erano sostituiti con un residuo differente.
In accordo con la presente invenzione il gene mutagenizzato come sopra riportato può essere introdotto in un vettore di clonaggio posizionando correttamente detto gene sotto il controllo di sequenze che ne regolano l'espressione nel ceppo ospite. Vettori adatti allo scopo possono essere scelti tra plasmidi, fagi e cosmidi disponibili in commercio o presso centri di raccolta autorizzati.
Un esempio non limitativo di vettori adatti agli scopi della presente invenzione è il plasmide pSM671 CBS 205.94.
Per verificare le caratteristiche di attività e termostabilità dei mutanti secondo la presente invenzione, cellule di E.coli trasformate con un vettore contenente il gene mutagenizzato come sopra riportato sono state coltivate in un terreno adatto, a 37°C per 16 ore. Quindi gli estratti proteici ottenuti dai lisati cellulari sono stati analizzati mediante SDS-PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide contenente sodiododecilsolfato) . I risultati hanno mostrato che i mutanti erano espressi in forma solubile ed in quantità paragonabili sia tra loro che al livello di espressione dell'enzima wild type. Il saggio di attività eseguito sugli estratti grezzi, come descritto da Weatherburn, M.W., (1967), (Anal. Chem., 39: 971), ha rivelato per tutti i mutanti una attività paragonabile o migliorata rispetto all'enzima wild type.
Gli studi di stabilità condotti a temperature da 50 a 80’C per 30 minuti hanno evidenziato per i mutanti saggiati una stabilità termica superiore a quella della D-N-a-carbamilasi wild type.
Secondo un'ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione il gene mutagenizzato della D-N-a-carbamilasi può essere associato in tandem con il gene dell'idantoinasi per costituire sistemi di espressione ad operone regolati da un unico promotore.
I vettori ricombinanti, contenenti il gene D-N-α-carbamilasi mutagenizzato o 11operone idantoinasi-carbamilasi mutagenizzata, possono essere introdotti in un microorganismo ospite scelto tra B .subtilis o E.coli.
Detti microorganismi vengono quindi coltivati in condizioni aerobiche, in un mezzo acquoso contenente sorgenti assimilabili di carbonio e di azoto nonché diversi cationi, anioni ed, eventualmente, tracce di vitamine, quali biotina o tiamina, o di amminoacidi .
Sorgenti di carbonio assimilabili includono carboidrati come glucosio, amidi idrolizzati, melassa, saccarosio od altre sorgenti di carbonio convenzionali .
Esempi di sorgenti di azoto possono essere scelti, ad esempio, tra sali d'ammonio minerali, quali nitrato di ammonio, solfato di ammonio, cloruro di ammonio o carbonato di ammonio e urea o materiali contenenti azoto organico o inorganico come peptone, estratto di lievito o estratto di carne.
I seguenti cationi ed anioni sono ugualmente adatti per gli scopi della presente invenzione; potassio, sodio, magnesio, ferro, calcio, fosfati acidi, solfati, cloruri, manganese, e nitrati.
La fermentazione è condotta, sotto agitazione, ad una temperatura compresa tra 25°e 40°C, ad un pH compreso tra 6 e 7,5, preferibilmente tra 6,5 e 7,0.
Le cellule (biomassa) recuperate dal mezzo di coltura mediante tecniche convenzionali come centrifugazione o filtrazione vengono impiegate nella produzione di D-cc-amminoacidi mediante conversione di miscele raceme di N-carbamil amminoacidi o, nel caso in cui le cellule esprimono gli enzimi idantoinasi e carbamilasi mutata, di miscele raceme di idantoine 5-sostituite.
Alternativamente si può utilizzare l'estratto cellulare ottenuto dalla disintegrazione delle cellule mediante sonicazione o French-Press , oppure gli enzimi purificati o parzialmente purificati o ancora gli enzimi immobilizzati su supporti solidi insolubili .
La purificazione può essere condotta utilizzando una delle tecniche convenzionali come ad esempio cromatografia a scambio ionico, gel filtrazione, cromatografia idrofobica o cromatografia di affinità tipo IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) .
Esempi di supporti solidi adatti all'immobilizzazione degli enzimi della presente invenzione possono essere impiegati prodotti già attivati disponibili in commercio quali ad esempio 1'EupergitRC, il SepharosioR attivato con BrCN e simili .
Secondo una forma di attuazione della presente invenzione i mutanti fusi ad una coda di poliistidina possono essere purificati e contemporaneamente immobilizzati mediante la tecnica IMAC.
Numerosi D-N-a-carbamil amminoacidi ed idantoine sostituite in posizione 5 possono essere utilizzati nel procedimento della presente invenzione. Possibili sostituenti in posizione 5 sono scelti tra un gruppo alchilico lineare o ramificato con un numero di atomi di carbonio compreso tra 1 e 6, che possono essere mono o polisostituiti con gruppi idrossilici, carbossilici, sulfidrilici o amminici oppure un gruppo fenilico o benzilico che, a loro volta, possono contenere uno o più sostituenti in posizione orto, meta e para.
Esempi di idantoine 5-sostituite sono: D,L-5-fenilidantoina;D,L-5-para-idrossifenilidantoi na; D,L-5-metilidantoina; D,L-5-isopropilidantoina, D,L-5-tienilidantoina;D,L-5-para-metossif enilidantoina; D,L-5-p-clorofenil-idantoina;D,L-5-benzilidantoina.
La reazione di conversione del substrato di partenza (idantoine 5-sostituite o D-N-a-carbamil amminoacidi) nei corrispondenti D-a-amminoacidi è preferibilmente condotta in atmosfera di azoto in una apparecchiatura ermeticamente chiusa, ad una temperatura compresa tra 25 e 70°C.
Il pH del mezzo di reazione è mantenuto entro valori compresi tra 6 e 10 e di preferenza tra 7 e 8,5. Questa regolazione del pH potrà essere effettuata, ad esempio, mediante aggiunta di una soluzione acquosa basica quale una soluzione acquosa di ammoniaca, di idrossido di potassio, di idrossido di sodio, carbonato di sodio oppure di potassio.
La concentrazione iniziale del substrato è generalmente compresa tra il 2% e il 30% in peso.
La quantità di biomassa o di enzima che viene addizionata alla miscela di reazione dipenderà dalla particolare affinità del substrato verso gli enzimi. In generale, può essere utilizzato un rapporto in peso biomassa/substrato compreso tra 1/1 e 1/50.
I D-a-amminoacidi preparati mediante il processo della presente invenzione possono essere recuperati dall'ambiente di reazione mediante metodiche classiche come cromatografia a scambio ionico o precipitazione dell'amminoacido al suo punto isoelettrico.
Sebbene l'invenzione venga descritta relativamente alla produzione di mutanti della D-N-a-carbamilasi di A.radiobacter è evidente che può essere applicata alla modifica di enzimi omologhi ottenuti da altri microorganismi.
In accordo con la presente invenzione i plasmidi pSM754, pSM755, pSM756 e pSM769 sono stati depositati presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures , SK Baarn (Olanda) rispettivamente come E.coli SMC341, SMC342, SMC343 e SMC355 dove hanno ricevuto rispettivamente i numeri di deposito CBS 665.95, CBS666.95, CBS 667.95 e CBS 758.95.
Gli esempi sperimentali che seguono hanno lo scopo di illustrare meglio la presente invenzione senza volerla limitare.
Esempio 1
Inserimento della coda polvHis nel gene della D-N-a-carbamilasi .
La sequenza nucleotidica che codifica la coda polyHis è stata introdotta nel gene D-N-a-carbamilasi mediante amplificazione di una regione di circa 420 coppie di basi (bp) contenente l'estremità 3' del gene D-N-a-carbamilasi.
A tale scopo è stata utilizzata la tecnica della Polymerase Chain Reaction (PCR) impiegando come primers la seguente coppia di oligonucleotidi: a) 5'AAC GAT CGC CGC TGG CCT 3' (FORWARD)
HindiII Ball b) 5'CC CAA GCT TTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GCC ACC His His His His His His Gly Gly AAA TTC CGC GAT 3' (REVERSE)
L'oligonucleotide b) introduceva il sito di restrizione Ball utile ai fini della selezione dei trasformanti. Gli oligonucleotidi vengono sintetizzati mediante metodiche note utilizzando il sintetizzatore DNA SynthesizerR Oligo 1000 (Beckman).
L'amplificazione è stata condotta in una apparecchiatura DNA Thermal CyclerR 480 (Perkin - Elmer Cetus) utilizzando una miscela di reazione (100 μΐ) contenente :
- 1 ng del plasmide pSM637;
- 2,5 unità di Taq polimerasi (Boehringer);
- 10 mM Tris-HCl pH 8,3;
- 1,5 nK MgCl2;
- 50 mM KC1,
- 0,01% (peso/volume) gelatina
- 1 μΜ di ciascun primers;
- 200 μΜ di ciascuno dei dNTPs (dGTP, dATP, dTTP e dCTP) .
Dopo l'aggiunta di una perla di paraffina (Ampliwax1” PCR Gem 100R-Perkin-Elmer Cetus) e denaturazione 4 minuti a 94’C, si è fatto partire il programma che comprende :
- 1 minuto a 94°C;
- 1 minuto a 42°C;
- 1 minuto a 72°C (estensione)
per tre cicli;
1 minuto a 94°C (denaturazione);
1 minuto a 55’C (annealing);
1 minuto a 72°C per 30 cicli (estensione);
8 minuti a 72°C (estensione finale)
per 30 cicli.
Il prodotto di amplificazione così ottenuto è stato precipitato con 3 M Na-acetato pH 5,2 (1/10 volume) ed Etanolo (2 volumi), risospeso in 40 μΐ di acqua e digerito con gli enzimi di restrizione Nael e HindlII (Boehringer). La miscela risultante è stata caricata su gel di acrilammide 10% e corsa a 100 volts per 2 ore. Quindi la banda di 240 bp, comprendente il frammento di DNA contenente l'estremità 3' terminale del gene della D-N-a-carbamilasi fusa alla sequenza polyHis, è stata ritagliata dal gel ed il DNA eluito in 300 μΐ di acqua per 16 ore a 37°C. Dopo precipitazione il DNA è stato risospeso in 15 μΐ di TE (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM EDTA).
Il plasmide pSM637 (40 μ9) è stato digerito con gli enzimi di restrizione Nael e HindlII e risospeso in 200 μΐ di tampone di corsa per i gradienti di saccarosio (30 mM Tris-HCl pH8, 10 mM EDTA ed 1M NaCl) al fine di allontanare il frammento di DNA contenente la regione 3' terminale del gene della carbamilasi. I gradienti sono stati preparati, utilizzando soluzioni al 5% ed al 20% di saccarosio nel tampone di corsa, mediante un formatore di gradienti (Buchler Auto Densi - Flow IIC). Il volume totale del gradiente era di 16 mi. Il campione è stato applicato alla superficie dei gradienti e corso per 20 ore nel rotore SW28R a 25.000 rpm, ad una temperatura di 20°C, in una ultracentrifuga L8 - M (Beckman). Successivamente il gradiente è stato frazionato prelevando dalla superficie 40 frazioni da 400 μΐ ciascuna. Un decimo del volume di ogni frazione è stato caricato su gel di agarosio e, separatamente, sono state raccolte le frazioni contenenti il solo vettore proveniente dal pSM637. Queste frazioni sono state poi diluite 1:1 con H20 e precipitate da EtOH (2-3 volumi).
Dopo aver risospeso i frammenti in H20, è stata effettuata una reazione di ligasi utilizzando il vettore pSM637 (50 ng) ed il frammento Nael-HindlII di 220 bp (5 ng) ottenuto come riportato nell'esempio 1. La reazione è stata condotta in 10 μΐ di miscela di reazione contenente 66 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM ATP, 10 mM MgCl2, 10 mM Ditiotreitolo (DTT), in presenza di 1 U di T4 DNA ligasi, a 16°C per 16 ore .
Una aliquota (2 μΐ) di tale miscela è stata impiegata per trasformare cellule di E.coli 71/18 (BRL) rese competenti con 50 mM CaC12 (Dagert, M. e Ehrlich (1979), Gene, 6:23). I trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno LB agar (0,8% Bacto triptone, 0,5% Estratto di lievito, 0,5% NaCl, agar 18 g/1) contenenti 20 Mg/ml di d oramienicolo.
Il DNA plasmidico estratto da uno dei cloni positivi CmR (cloramfenicolo resistenti), è stato sequenziato utilizzando il Kit SequenaseR version 2.0 (United States Biochemical) per verificare la presenza della coda polyHis al 3' del gene della carbamilasi. Il plasmide così ottenuto è stato denominato pSM716. Il ceppo di E.coli contenente tale plasmide è stato denominato SMC329 Esempio 2
Costruzione e screening di una banca di mutanti del gene della D-N-a-carbamilasi.
La mutagenesi è stata effettuata mediante PCR in condizioni in cui si produce un incremento della frequenza di errore durante la polimerizzazione (Leung D.W. et al., 1989, Technique, 1, 11-15).
Per l'amplificazione è stata utilizzata la seguente coppia di oligonucleotidi:
a )5'CTC GGC TTC CCG GTC TAT GAC GTC GAC3' (forward) b)5 'GGC TTA CTT GTC TGC TTT C 3' (reverse).
L'amplificazione è stata condotta in una apparecchiatura DNA Thermal CyclerR 480 (Perkin - Elmer Cetus) utilizzando una miscela di reazione (100 μΐ) contenente :
- 1 ng del plasmide pSM716;
- 84 picomoli (pmoli) di ciascun oligonucleotide; - 16,6 mM (NH4)2S04;
-67 mM Tris-HCl pH 8.8;
- 6,1 mM MgCl2;
- 6,7 mM EDTA pH 8;
- 0,17 mg/ml BSA;
- 10 mM di β-mercaptoetanolo preparato al momento; - 10 % DMSO (v/v);
- 0,5 mM MnC12;
- 0,2 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dTTP e 1 mM dCTP.
La miscela è stata sottoposta a denaturazione a 94 ”C per 7 minuti e ad annealing dei primers a 50 °C per 1 minuto. Dopo aver aggiunto l'enzima Taq DNA polimerasi (Boehringer, 5 U/μΙ) ed una perla di paraffina, si è fatto partire il programma ciclico che comprende :
1 minuto a 94’C (denaturazione)
1 minuto a 50°C (annealing)
4 minuti a 70’C (estensione)
per 25 cicli complessivi.
Il prodotto dell'amplificazione di circa 500 bp, è stato precipitato con 7,5 M NH4Acetato (0,6 volumi) ed etanolo (2 volumi) e risospeso in 40 μΐ di H20. Dopo digestione con gli enzimi di restrizione Sali e HindlII il frammento mutagenizzato è stato purificato su gel di agarosio low - melting allo 0,8% (Nusieve, FMC BioProducts). La banda di interesse è stata ritagliata, posta a 68°C per 15 minuti e trattata con GELaseR (Epicentre Technologies) (1 U ogni 300 mg di gel pesato) per 1,5 ore a 45°C.
Parallelamente, il plasmide pSM637 (30 μg) è stato digerito con gli enzimi di restrizione Sali e HindlII, precipitato con Na-acetato ed etanolo, risospeso in 200 μΐ di tampone di corsa (30 mM Tris-HC1 pH 8, 10 mM EDTA, 1 M NaCl) e purificato mediante gradiente di saccarosio operando come descritto nell'esempio 1. Le frazioni contenenti il plasmide sono state riunite, diluite 1:1 con acqua, precipitate con etanolo (2-3 volumi) e risospese in tampone TE.
Quindi 500 ng del plasmide pSM637 purificato sono stati ligati con il frammento mutagenizzato in 80 μΐ di miscela di ligasi a 16°C per 14 ore.
Una aliquota (1 μΐ) della miscela di ligasi è stata utilizzata per trasformare cellule di E.coli 71/18 (BRL) rese competenti per elettroporazione (Dower W.J., Miller J.F. and Ragsdale C.W., N.A.R. (1988), 16, 6127). Quindi le cellule sono state piastrate su terreno LB (10 g/1 Bacto - TryptoneR (DIFCO), 5 g/1 Yeast Extract, 5 g/1 NaCl, 300 μΐ NaOH 10 N, 20 μg/ml cloramfenicolo) e coltivate a 37*C per circa 16 ore.
Da ciascuna piastra di trasformazione sono state fatte repliche su membrana di nitrocellulosa (MFS, Sartorius). Tali repliche sono state sottoposte a tre cicli di congelamento-scongelamento per U sare le colonie e successivamente poste a 48,5°C per 16 ore.
Dopo tale trattamento di inattivazione le membrane sono state trasferite su piastre contenenti 20 mM CDPG (carbammile della D-fenil-glicina) in 20 mM di tampone sodio-fosfato pH 7, 1% agarosio (Bio-Rad), 0,0032 % di rosso fenolo ed incubate a 37-40°C. Dopo poche ore le colonie contenenti attività carbamilasica termostabile rivelavano una colorazione rosso-violetto, mentre le colonie wild-type non mostravano più attività. Il controllo positivo del saggio consisteva nel ripetere la stessa procedura omettendo l'incubazione a 48,5’C; in queste condizioni le colonie wild-type esibivano una colorazione rosso-violetta dopo pochi minuti.
Mediante tale screening sono stati isolati tre cloni termostabili SMC341, SMC342 e SMC343. Il DNA plasmidico estratto dai cloni è stato sequenziato mediante Sequenase e, per ciascun clone, sono state individuate le mutazioni riportate in tabella 1:
Tabella 1
Clone Plasmide Mutazione SMC341 pSM754 Metl84Leu e Phe304lle SMC342 PSM755 Thr2 12Ala SMC343 PSM756 Thr262Ala Esempio 3
Costruzione di mutanti singoli e multipli.
Le mutazioni risultate termostabilizzanti sono state introdotte nel gene della carbamilasi wild type privo della coda poly-His come mutazioni singole e multiple.
Il plasmide pSM637 (1 μg) è stato digerito con 1 unità degli enzimi di restrizione EcoRI e HindlII (Boehringer) a 37'C per 60 minuti. Dopo aver bloccato la reazione enzimatica a 65°C per 10 minuti, la miscela di reazione è stata caricata su gel di agarosio low melting allo 0.8% e corsa a 50 volts per 2 ore. Quindi la banda EcoRI-HindlII di 915 coppie di basi (bp), comprendente la sequenza codificante la D-N-a-carbamilasi, è stata purificata mediante GelaseR TM (Epicentre Technologies).
Il frammento di DNA corrispondente a questa banda (20 ng) è stato ligato al vettore M13mp8 (50 ng) previamente digerito con gli stessi enzimi di restrizione. La reazione di ligasi è stata condotta in 20 μΐ di miscela contenente 66 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM ATP, 10 mM MgC12, 10 mM Ditiotreitolo (DTT), in presenza di 1 U di T4 DNA ligasi, a 16°C per 16 ore.
Una aliquota (5 pi) della miscela di ligasi è stata impiegata per trasformare cellule di E.coli 71/18 (BRL) rese competenti con 50 mM CaCl2 (Dagert, M. e Ehrlich (1979), Gene, 6:23).
Successivamente i trasformanti sono stati selezionati su piastre di YT agar (8 g/1 Bacto tryptone (DIFCO), 5 g/1 NaCl) contenenti 40 μq/ml di X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-tio galactopiranoside) e 125 μg/ml di isopropil-beta-D-tiogalacto- piranoside (IPTG). Operando come sopra riportato si sono ottenute numerose placche ricombinanti positive (bianche) facilmente distinguibili da quelle non ricombinanti (blu).
Da una delle placche positive, che mostrava l'esatto inserimento, è stato preparato il DNA fagico a singola elica (SS) da utilizzare come templato nella fase di mutagenesi sito specifica.
Per introdurre le mutazioni desiderate sono stati sintetizzati i seguenti oligonucleotidi:
(1) 5' GCC CTT AAG TCC ££A CAC CCG CCA'CGT 3' inserisce la mutazione Metl84-->Leu;
(2) 5' GTG GTG GAA GGA CGC CAG ATG GTC GTG 3' inserisce la mutazione Thr212-->Ala;
(3) 5' TTC CAA CGT CGT GGC CAG GGC AAC GAT 3’ inserisce la mutazione Thr262-->Ala;
(4) 5'AAG CTT CAA ATT TCC GCG ATC AG 3'
inserisce la mutazione Phe304-->Ile;
Detti oligonucleotidi sono stati fosforilati all'estremità 5' in 30 μΐ di miscela di reazione contenente 100 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP e 2 U di T4 polinucleotide Kinase (Promega), mediante incubazione a 37"C per 30 minuti. Quindi gli oligonucleotidi fosforilati sono stati impiegati da soli ed in combinazione nelle reazioni di mutagenesi in vitro utilizzando il kit "SculptorR in vitro mutagenesis System" (Amersham).
Alcune delle placche ottenute sono state utilizzate per infettare colture di E.coli TG1 (Amersham) e, successivamente, da ciascuna coltura sono stati estratti i DNA fagici a singola elica (ssDNA) ed a doppia elica (RF, dsDNA).
I ssDNA sono stati sequenziati mediante il kit "Sequenase" 2.0" (United States Biochemical) basato sulla metodologia descritta da Sanger et al. (PNAS (1977) 74: 5463) per verificare la presenza della mutazione desiderata. I corrispondenti dsDNA sono stati utilizzati per subclonare i geni mutati nel plasmide pSM671 CBS 205.94.
Esempio 4
finhclnnaagio dei mutanti nel plasmide PSM671.
II plasmide pSM671 (1 μg) è stato digerito con gli enzimi di restrizione EcoRI e HindlII in un volume finale di 20 μΐ. Parallelamente i DNA fagici mutanti in forma replicativa sono stati digeriti separatamente con gli enzimi di restrizione EcoRI e HindlII in un volume finale di 20 μΐ. Quindi i geni mutati, ottenuti come frammenti di circa 920 bp, sono stati subclonati ligando un'aliquota delle miscele di digestione (5μ1) con circa 50 ng di pSM671 digerito. Le miscele di ligasi sono state utilizzate per trasformare cellule di E.coli 71/18 elettrocompetenti ed i trasformanti sono stati selezionati su piastre di LB contenenti 20 μg/ml Cloramfenicolo. Il DNA plasmidico estratto da cloni positivi è stato ricontrollato mediante sequenziamento. I plasmodi contenenti i geni mutati sono riportati in tabella 2.
Tabella 2
Clone Plasmide Mutazione
SMC344 pSM758 Metl84Leu
SMC345 pSM759 Thr212Ala
SMC346 pSM760 Thr262Ala
SMC347 pSM761 Metl84Leu-Thr212Ala
SMC348 PSM762 Metl84Leu-Thr212Ala-Thr262Ala
SMC349 pSM763 Thr212Ala-Thr262Ala-Phe304Ile
SMC350 pSM764 Metl84Leu-Thr212Ala-Thr262Ala-Phe304Ile SMC351 pSM765 Thr262Ala-Phe304lle
SMC356 pSM770 Metl84Leu-Thr262Ala
SMC357 pSM771 Thr212Ala-Thr262Ala
Esempio 5
Espressione dei cloni mutanti
Singole colonie dei cloni mutanti sono state inoculate in beute da 50 mi contenenti ciascuna 5 mi di terreno LB addizionato con 20 μg/ml di cloramfenicolo ed incubate, sotto agitazione (200 rpm) , a 37°C per 16 ore (DO600 circa 4). Come controllo è stato coltivato nelle stesse condizioni sopra riportate il ceppo di E.coli contenente il plasmide pSM716 portante il gene wild type della carbamilasi fuso alla coda di istidina.
Quindi le colture sono state centrifugate a 12000 rpm per 1 minuto (rotore SJ14R, Beckman). Le cellule così recuperate sono state risospese in 300 μΐ di tampone di lisi 20 mM NaP04, 20% glicerolo e U sate per sonicazione (SoniprepE150, MSE impulsi di 1 minuto, a voltaggio medio). Un'aliquota (20 μΐ) di ciascun lisato è stata analizzata mediante SDS-PAGE 10%. L'analisi elettroforetica ha mostrato per tutti gli enzimi livelli di espressione paragonabili sia tra loro che rispetto all'enzima wild type.
Esempio 6
Studio sulla termostabilità deali enzimi mutati La termostabilità dei mutanti è stata studiata utilizzando la tecnica che prevede il riscaldamento di varie aliquote degli estratti cellulari solubili, ottenuti in tampone di lisi in assenza di glicerolo, a diverse temperature e successivo calcolo dell'attività residua su carbamile della D-fenilglicina (CoPG).
In pratica gli estratti cellulari sono stati opportunamente diluiti in 20 mM tampone fosfato pH 7 ed aliquote (100 μΐ) di questi, ciascuna contenente uguale attività enzimatica, sono state incubate a temperature comprese tra 50 e 80°C per 30 minuti. Il controllo positivo era tenuto in ghiaccio .
Successivamente 50 μΐ di ciascun estratto cellulare e del controllo positivo sono stati addizionati con 500 μΐ di una soluzione di carbamile della D-fenilglicina (CDPG) 0,12 M, in tampone fosfato 0,2 M, pH 7 per determinare l'attività enzimatica residua. Il valore di attività considerato come 100% era determinato su una aliquota non sottoposta al trattamento termico.
Dalle curve di inattivazione così ottenute è stato calcolato il valore di T50, definito come la temperatura alla quale il 50% dell'enzima risulta inattivato. I risultati sono riportati in figura 1 dove: * ■ ceppo wild type; mutante 184; mutante 212; —B— mutante 262; -X mutante 184-212; mutante 184-262; mutante 212-262; Sr mutante 184-212-262.
In tabella 3 sono riportati i valori di Tso, calcolati come media dei vari esperimenti effettuati per ogni campione, ed i valori di Δτ50; la variabilità per ciascun dato fornito è compresa tra 0,1 e 0,3°C.
Tabella 3
Mutanti carbamilasi T50 (’c) ΔΤ50 °C wild-type 61
Metl84Leu 62,6 1,6 Thr212Ala 65,8 4,8 Thr262Ala 70 9,0 Thr262Ala-Phe3041le 69 8,0 Metl84Leu-Thr212Ala 73,8 12,8 Metl84Leu-Thr262Ala 70,2 9,2 Thr212Ala-Thr262Ala 74 13 Metl84Leu-Thr212Ala-Thr262Ala 73,8 12,8 Thr212Ala-Thr262Ala-Phe304Ile 72,4 11,4 Metl84Leu-Thr212Ala-Thr262Ala-Phe304Ile 73,1 12,1 Tali risultati dimostrano chiaramente che la sostituzione di uno o più residui amminoacidici incrementa la stabilità termica della carbamilasi. Esempio 7 (confronto)
Alcuni dei mutanti preparati come descritto negli esempi che precedono sono stati comparati con i mutanti della tecnica nota (EP-610517) preparati mediante mutagenesi sito-specifica utilizzando i seguenti oligonucleotidi:
1) 5'GTC GGT GAA ATA CCA CCG CGG GAA 3'
che inserisce la mutazione His58-->Tyr
2) 5'CGT CAG ATG ATC ATG CTG GGG AAC TTC GGG ATT GTG 3'
che inserisce la mutazione Pro204-->Glu
3) 5' CAG CAT GCA TCC CTC CTC CAT GCC AGC CTT GCC GCC 3'
che inserisce la mutazione Val237-->Ala.
La numerazione tiene conto della Metionina (Met) iniziale della carbamilasi.
Il subclonaggio è stato effettuato nel plasmide pSM671 operando come riportato nell'esempio 4. I cloni contenenti le mutazioni desiderate sono stati identificati ed analizzati in comparazione con i mutanti della presente invenzione risultati più termostabili .
Una uguale quantità di cellule del clone wild type e dei mutanti elencati in tabella 4 è stata risospesa in 500 μΐ di tampone contenente 20 mM NaP04 pH 7 e glicerolo 20% e sonicata. Gli estratti cellulari solubili ottenuti sono stati analizzati mediante saggio di attività ed analisi elettroforetica. I risultati sono riportati rispettivamente in tabella 4 ed in figura 2 dove:
linea 1 e 9 carbamilasi standard; linea 2 carbamilasi w.t.; linea 3 mutante 184-212; linea 4 mutante 184-262; linea 5 mutante 212-262;linea 6 mutante 184-212-262; linea 7 mutante 58-237 e linea 8 mutante 58-204-237.In tabella 4 sono riportati i dati
di attività espressi in U/ml e U/mg di proteine o solubili . co
LO
Tabella 4
_
MUTANTI ATTIVITÀ'
U/ml U/mg wild-type 1,25 0,64 Metl84Leu-Thr212Ala 1/71 0,83 Metl84Leu-Thr262Ala 2,00 1,01 Thr212Ala-Thr262Ala 1,58
Metl84Leu-Thr212Ala-Thr262Ala 1,62 0,89 His58Tyr-Val237Ala 0,63 0,36 His58Tyr-Pro204Glu-Val237Ala 0,82 0,45
Esempio 8
Costruzione di sistemi di espressione ad operone regolati da un unico promotore.
I geni dei mutanti risultati più termostabili sono stati associati in tandem con il gene del-11idantoinasi wild type per costituire sistemi di espressione ad operone regolati da un unico promotore .
Circa 1 μg dei plasmidi pSM761, pSM762, pSM763 e pSM764 sono stati digeriti con gli enzimi di restrizione HindlII e PstI, precipitati con Na-acetato ed etanolo ed i DNA risospesi in 20 μΐ di tampone TE.
Il plasmide pSM700 (6 pg) CBS 668.95, contenente 1'operone carbamilasi-idantoinasi, è stato digerito con gli enzimi di restrizione HindlII e PstI e caricato su gel di agarosio low-melting 0,8%. La banda di circa 1400 bp, corrispondente al gene idantoinasi preceduto dalla sua sequenza RBS, è stata ritagliata ed il DNA estratto mediante "freeze-squeeze" (Anal. Biochem., 132: 14, 1983).
In tale metodica la banda viene prima equilibrata per 5-10 minuti in un eccesso di tampone 0,3 M Na-acetato, 1 mM EDTA, pH 7,1, poi prelevata ed introdotta in una provetta eppendorf da 0,5 mi, bucata sul fondo contenente un batuffolo di lana di vetro siliconata. La provetta viene successivamente introdotta in una provetta eppendorf da 1,5 mi. Il tutto viene congelato per 20 minuti a -80°C e subito dopo centrifugato in microcentrifuga per 15 minuti a temperatura ambiente. Il DNA eluito nella provetta da 1,5 mi viene recuperato e precipitato con etanolo, previa aggiunta di 0,1% acido acetico e 10 mM MgCl2 ed infine risospeso in 20 μΐ di TE. Circa 30 ng dei plasmidi digeriti come sopra riportato sono stati ligati con 5 μΐ del frammento di circa 1400 bp in un volume finale di 10 μΐ. La miscela di ligasi è stata utilizzata per trasformare E .coli 71/18 competenti ed i trasformanti sono stati selezionati su piastre LB-cloramfenicolo. Il DNA plasmidico estratto dai cloni positivi conteneva un frammento di circa 2300 bp corrispondente all'operone costituito dal gene carbamilasi mutante e dal gene dell'idantoinasi wild type. In tabella 5 sono riportati i cloni ed i plasmidi contenenti 1'operone .
Tabella 5
Clone Plasmide operone carbamilasi mut.-idantoinasi w.t. SMC352 pSM766 Metl84Leu-Thr212Ala-Thr262Ala-Phe304Ile SMC353 pSM767 Metl84Leu-Thr212Ala-Thr262Ala
SMC354 pSM768 Thr212Ala-Thr262Ala-Phe3Q4Ile
SMC355 pSM769 Metl84Leu-Thr212Ala
Esempio 9
Espressione degli operoni
Singole colonie dei cloni SMC352, 353, 354 e 355 sono state inoculate in beute da 50 mi contenenti ciascuna 5 mi di terreno LB addizionato con 20 /jg/ml di d oramienicolo ed incubate a 37°C per 16 ore (DO600 circa 4), sotto agitazione (200 rpm).
Come controllo è stato coltivato nelle stesse condizioni sopra riportate il ceppo di E.coli SMC327 contenente il plasmide pSM700 portante il gene wild type della carbamilasi fuso al gene dell 'idantoinasi.
Quindi le colture sono state centrifugate a 12000 rpm per 1 minuto (rotore SJ14B, Beckman) e le cellule così ottenute sono state risospese in 300 μΐ di tampone di lisi 20 mM NaPO^, 20% glicerolo e lisate per sonicazione (Soniprepl50, MSE impulsi di 1 minuto, a voltaggio medio). 20 μΐ di ciascun lisato sono stati analizzati mediante SDS-PAGE 10%. L'analisi elettroforetica ha mostrato che tutti gli enzimi erano espressi in quantità paragonabili sia tra loro che rispetto al livello di espressione dell operone wild type.
B) Determinazione delle attività enzimatiche Beute contenenti 50 mi di terreno LB addizionato con cloramfenicolo (20 μg/ml) sono state inoculate con precolture dei cloni SMC327 e SMC355 ed incubate a temperatura ambiente fino ad una densità ottica DO600 di circa 4. Successivamente, uguali quantità di cellule sono state prelevate, risopese in tampone 0,2 M NaP04 pH 8,5 e sonicate. Le frazioni solubili sono state recuperate mediante centrifugazione e utilizzate per il dosaggio delle attività idantoinasica, che risulta dalla somma dalla quantità di carbamile e di amminoacido prodotto, e carbamilasica.
Il saggio di attività idantoinasica è stato effettuato a 40 "C aggiungendo 100 μΐ di estratto cellulare a 3,5 mi di tampone NaP04 0,2 M pH 8,0 contenente D,L-p-idrossifenil idantoina 20 mM. Ad intervalli di tempo aliquote (0,6 mi) della miscela di reazione sono state prelevate e trattate immediatamente con 0,2 mi di acido tricloroacetico al 15% in acqua. Le proteine precipitate sono state rimosse per centrifugazione e 0,5 mi di surnatante sono stati addizionati con 0,25 mi del reattivo di Ehrlich (10% 4-dimetilamminobenzaldeide in HC1 concentrato) per la determinazione colorimetrica a 438 nm del carbamile formatosi. Parallelamente, su una aliquota (50 μΐ) della miscela di reazione è stato determinato colorimetricamente a 625 nm il contenuto dell 'amminoacido utilizzando il reattivo di Berthelot secondo la procedura di Weatherburn, M.W. (Anal. Chem., voi. 39, 971, 1967).
Con unità enzimatica si definisce la quantità di enzima che idrolizza una micromole di idantoina in un minuto a IO40°C nelle condizioni di saggio sopra descritte.
L'attività carbamilasica è stata determinata a 40 °C in 0,5 mi di tampone NaP040,2 M pH 7,0 contenente D-carbamil-p-idrossifenil glieina 0,12 M. Il contenuto in amminoacido è stato determinato a differenti tempi di reazione prelevando 50 μΐ della miscela di reazione e operando come sopra descritto .
Con unità enzimatica si definisce la quantità di enzima che idrolizza una micromole di carbamile in un minuto a 40’C nelle condizioni di saggio sopra descritte. I risultati sono riportati nella tabella 6 che segue.
Tabella 6
Ceppo Proteine Carbamilasi Idantoinasi (mg/ml) (U/mg) (U/ml) (U/mg) (U/ml) SMC327 13,18 0,46 1,92
(pSM7Q0)
SMC355 22,63 17,46 0,77 2,25 0,1 (pSM769)
Dai risultati riportati in tabella si evidenzia che nel clone contenente la doppia mutazione nel gene della carbamilasi si induce oltre che un aumento della stabilità termica anche un miglioramento dell'attività carbamilasica ed idantoinasica.
Claims (16)
- RIVENDICAZIONI 1. Mutanti termostabili della D-N-a-carbamilasi caratterizzati dal fatto che, almeno uno dei residui amminoacidici Metl84, Thr212, Thr262 e Phe304 della sequenza amminoacidica della D-N-a-carbamilasi wild type è sostituito con un residuo diverso scelto nel gruppo degli amminoacidi naturali.
- 2. Un mutante termostabile della D-N-a-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il residuo amminoacidico Metl84 è sostituito con L-Leucina.
- 3. Un mutante della D-N-a-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il residuo amminoacidico Phe304 è sostituito con L-Isoleucina.
- 4. Un mutante della D-N-a-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il residuo amminoacidico Thr212 è sostituito con L-Alanina.
- 5. Un mutante della D-N-a-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il residuo amminoacidico Thr262 è sostituito con L-alanina.
- 6. Un mutante della D-N-a-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che i residui amminoacidici Metl84 e Phe304 sono sostituiti contemporaneamente con un residuo amminoacidico.
- 7. Un mutante della D-N-a-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che i residui amminoacidici Metl84 e Thr212 sono sostituiti contemporaneamente con un residuo amminoacidico.
- 8. Sequenza nucleotidica che codifica un mutante della D-N-a-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 1.
- 9. Sequenza nucleotidica che codifica un mutante della D-N-a-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 2.
- 10. Sequenza nucleotidica che codifica un mutante della D-N-a-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 3.
- 11. Sequenza nucleotidica che codifica un mutante della D-N-a-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 4.
- 12. Sequenza nucleotidica che codifica un mutante della D-N-a-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 5.
- 13. Sequenza nucleotidica che codifica un mutante della D-N-oc-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 6.
- 14. Sequenza nucleotidica che codifica un mutante della D-N-a-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 7.
- 15. Un vettore ad espressione comprendente una sequenza nucleotidica in accordo con le rivendicazioni da 8 a 14.
- 16. Il vettore ad espressione in accordo con la rivendicazione 15 scelto tra pSM754, pSM755, pSM756, pSM761, PSM762/PSM763, PSM764, PSM765, PSM770 e PSM771 17. Il vettore ad espressione pSM754 depositato presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures dove ha ricevuto il numero di deposito CBS665.95. 18. Il vettore ad espressione pSM755 depositato presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures dove ha ricevuto il numero di deposito CBS666.95. 19. Il vettore ad espressione pSM756 depositato presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures dove ha ricevuto il numero di deposito CBS667.95. 20. Il vettore ad espressione pSM769 CBS758.95. 21. Un microorganismo scelto tra Bacillns snbt-.-iTip ed Escherichia coli trasformato con un vettore ad espressione in accordo con le rivendicazioni da 15 a 20. 22. Il microorganismo in accordo alla rivendicazione 21, che è Escherichia coli SMC341 (pSM754) CBS 665.95. 23. Il microorganismo in accordo alla rivendicazione 21, che è Escherichia coli SMC342 (pSM755) CBS 666.95. 24. Il microorganismo in accordo alla rivendicazione 21, che è Escherichia coli SMC343 (pSM756) CBS 667.95. 25. Il microorganismo in accordo alla rivendicazione 21, che è Escherichia coli SMC355 (pSM769) CBS 758.95. 26. Un procedimento per la preparazione di un mutante della D-N-a-carbamilasi in accordo con la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di coltivare in un ambiente di coltura adatto un microorganismo selezionato tra Escherichia coli e Bacillus subtilis trasformato con un vettore ad espressione come definito nelle rivendicazioni da 15 a 20 e separare e purificare il mutante così ottenuto. 28. Procedimento per la produzione di D-a-amminoacidi mediante conversione stereospecifica di D-N-ot-carbamil amminoacidi o miscele raceme di idantoine 5-sostituite caratterizzato dal fatto che la reazione di conversione è condotta in presenza di un microorganismo capace di produrre un mutante termostabile della D-N-a-carbamilasi od un sistema enzimatico costituito da D-idantoinasi e da un mutante della D-N-oc-carbamilasi, dove detto mutante della D-N-cc-carbamilasi ha almeno uno dei residui amminoacidici Metl84/ Thr212, Thr262 e Phe304 della sequenza amminoacidica della D-N-ot-carbamilasi wild type sostituito con un residuo diverso scelto nel gruppo degli amminoacidi naturali. 29. Il procedimento in accordo con la rivendicazione 28, caratterizzato dal fatto che la reazione di conversione è condotta in presenza di un mutante della D-N-ot-carbamilasi o di un sistema enzimatico costituito da D-idantoinasi e da un mutante della D-N-a-carbamilasi isolati da un microorganismo capace di produrre detto mutante o detto sistema enzimatico. 30. Il procedimento in accordo alla rivendicazione 28, caratterizzato dal fatto che un mutante termostabile della D-N-ot-carbamilasi o il sistema enzimatico comprendente detto mutante sono immobilizzati su un supporto solido insolubile .
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