ITMI940725A1 - Mutanti stabili della d-n- -carbamilasi - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda mutanti della D-N-α-carbamilasi che esibiscono una stabilità enzimatica migliorata rispetto a quella dell'enzima wild type, mezzi e metodi per la loro preparazione e loro impiego per la preparazione di D-α-amminoacidi.
In generale le limitazioni all'uso industriale degli enzimi sono dovute non solo ai loro elevati costi di produzione e purificazione, ma anche alla loro instabilità che, come è noto, può essere attribuita ad una serie di fattori quali ad esempio denaturazione termica, fenomeni ossidativi e aggregazioni causate da legami di tipo idrofobico e/o covalente.
Individuare le cause di instabilità di un enzima è quindi di fondamentale importanza al fine di trovare soluzioni per migliorare e rendere più competitivo un processo enzimatico. D'altra parte risulta spesso difficile poter individuare con esattezza (i) le cause di tale instabilità e (ii) i rimedi possibili affinché l'instabilità stessa venga eliminata o ridotta senza alterare l'attività dell'enzima.
La D-N-α-carbamilasi è un enzima in grado di convertire mediante idrolisi stereoselettiva D-N-carbamil-α-amminoacidi nei corrispondenti D-α-amminoacidi . Tali composti otticamente attivi sono importanti intermedi nella sintesi di sostanze farmacologicamente attive (ad esempio, la D-fenilglicina e la D-para-idrossifenilglicina sono utilizzate nella sintesi di penicilline e cefalosporine ), pesticidi (la D-valina per la sintesi dell'insetticida fluvanilato) o dolcificanti (D-alanina).
Anche la D-N-α-carbamilasi è soggetta a fenomeni di instabilità che compromettono fortemente le rese e l'economicità dei processi industriali in cui viene utilizzata.
Costituisce lo scopo della presente invenzione il superamento degli inconvenienti della tecnica sopra riportati.
In particolare è stato ora trovato, secondo la presente invenzione, che la sostituzione di almeno una delle cisteine 243, 250 e 279 della D-N-α-carbamilasi wild type con un residuo amminoacidico differente consente di stabilizzare detto enzima e di migliorare le rese di produzione di D-α-amminoacidi.
In accordo con ciò in un suo primo aspetto la presente invenzione riguarda mutanti della D-N-α carbamilasi con una migliorata stabilità enzimatica caratterizzati dal fatto che almeno uno dei residui amminoacidici cisteina in posizione 243, 250 e 279 è sostituito con un residuo amrainoacidico differente scelto nel gruppo degli amminoacidi naturali.
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione una sequenza nucleotidica che codifica almeno un mutante della D-N-α-carbamilasi con una stabilità migliorata.
Costituisce anche uno scopo della presente invenzione un vettore replicabile ad espressione comprendente detta sequenza.
Costituisce un ulteriore scopo della presente invenzione un microorganismo trasformato con detto vettore.
Costituisce inoltre uno scopo della presente invenzione un procedimento per la preparazione di almeno un mutante della D-N-α-carbamilasi con una stabilità migliorata che comprende il coltivare in opportune condizioni un microorganismo trasformato ed il separare il mutante così ottenuto.
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione l'impiego di detti microorganismi trasformati o di un mutante della D-N-a-carbamilasi ottenuto da detto microorganismo in un procedimento per la produzione di D-a-amminoacidi .
Ulteriori scopi della presente invenzione appariranno evidenti dalla lettura del testo e dagli esempi che seguono.
In particolare, mutanti della D-N-carbamilasi secondo la presente invenzione sono caratterizzati dal fatto che almeno uno dei residui cisteina (Cys) in posizione 243, 250 o 279 della sequenza amminoacidica dell'enzima wild type è sostituito con un residuo differente scelto tra L-alanina, L-serina, L-lisina, L-arginina, L-acido aspartico, L-acido glutammico, L-asparagina, L-glutamina, L-istidina, L-glicina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-tirosina, L-treonina, L-triptofano, L-fenilalanina, L-metionina o L-prolina.
Mutanti della D-N-α-carbamilasi in accordo con la presente invenzione vengono preparati mediante un procedimento che comprende:
a) l'introdurre una o più mutazioni in siti specifici del gene codificante la D-N-α carbamilasi ;
b) il clonare il gene mutagenizzato ottenuto nello stadio a) in un vettore di clonaggio; c) il trasformare un ceppo ospite con il vettore ricombinante ottenuto nello stadio b);
d) il coltivare in ambiente di coltura adatto il ceppo ospite trasformato come nello stadio c); ed infine
e) il separare e purificare il mutante della D-Ν-α-Garbami lasi così ottenuto.
L'introduzione di una mutazione in siti ben determinati del gene può essere effettuata utilizzando una delle tecniche note di mutagenesi in vitro . Fra le diverse tecniche che producono modificazioni mirate su una sequenza di DNA, le più diffuse sono quelle che impiegano oligonucleotidi sintetici a singola elica.
In particolare è stata impiegata una modifica del metodo descritto da Zoller, M.J. e Smith, M .,(1982), Nucl.Acid.Res. , 10, 6487-6500) che comprende:
1) l'inserire il gene della D-N-α-carbamilasi o parte di questo (sequenza bersaglio) in un fago tipo M13 od in un plasmide da esso derivato e prepararlo nella forma a singolo filamento utile come "stampo" (templato) per la sintesi di quello mutato ;
2) il sintetizzare un oligonucleotide complementare alla sequenza da mutagenizzare ad eccezione di una porzione interna che determina la mutazione;
3) il procedere all'accoppiamento ( "annealing") dell 'oligonucleotide sintetico allo "stampo". Esso farà da "primer" per la sintesi del secondo filamento modificato;
4) il ricostituire, mediante un passaggio di polimerizzazione e ligazione in vitro, la struttura circolare a doppia elica, di cui un filamento è quello parentale, mentre l'altro porta la mutazione desiderata;
5) l'eliminare il filamento parentale ed il ripristinare, mediante un passaggio di polimerizzazione e ligazione in vitro, la struttura circolare a doppia elica in cui entrambi i filamenti contemgono la mutazione desiderata;
6) l'impiegare la forma a doppia elica per trasformare cellule ospiti rese competenti ottenendo una popolazione di cloni mutanti e wild type;
7) il selezionare i cloni mutanti.
Per quanto riguarda il gene della D-N--α-carbarailasi da mutagenizzare, questo può essere isolato da microorganismi quali Pseudomonas, Hansenula, Agrobacterium, Aerobacter, Aeromonas, Bacillus, Moraxella, Brevibacterium, Flavobacterium, Serratia, Micrococcus, Arthrobacter o Paracoccus. Specifici esempi di tali microorganismi sono Bacillus macroides ATCC 12905, Aerobacter cloacae IAM 1221, Agrobacterium sp.IP 1-671, Agrobacterium radiobacter NRRLB 11291, Pseudomonas sp. FERM BP 1900.
Secondo una forma di attuazione della presente invenzione è stato mutagenizzato il gene della D-N-α-carbamilasi da Agrobacterium radiobacter NRRLB-11291.
Un frammmento di DNA contenente il gene che codifica la D-N-α-carbamilasi è stato isolato dal plasmide pSM651 (CBS 203.94) mediante digestione con gli enzimi di restrizione EcoRI e HindiII e, dopo purificazione mediante gel elettroforesi, è stato ligato, operando secondo tecniche note, al fago M13mp8 previamente digerito con gli stessi enzimi di restrizione.
La miscela di ligasi risultante è stata impiegata per trasformare cellule di Escherichia coli 71/18 (E.coli ) rese competenti come descritto da Dagert, M. e Ehrlich (1979), (Gene, _6: 23) ed i trasformanti sono stati selezionati su terreno di coltura adatto ottenendo numerose placche ricombinanti positive.
Dopo aver preparato il filamento a singola elica da una delle placche positive, questo è stato utilizzato come templato per introdurre la mutazione desiderata. In particolare per introdurre la sostituzione Cys— > Ala nelle posizioni 243, 250 e 279 sono stati impiegati i seguenti oligonucleotidi sintetici:
La sintesi degli oligonucleotidi può essere condotta secondo metodiche note utilizzando una delle apparecchiature disponibili in commercio, quale ad esempio il sintetizzatore DNA Synthesizer Oligo 1000 (Beckman).
Si è quindi proceduto all'accoppiamento della singola elica all'oligonucleotide sintetico che funge da "primer" per la sintesi del secondo filamento modificato.
Dopo aver effettuato la mutazione desiderata è stata ricostituita mediante un passaggio di polimerizzazione e ligazione in vitro, la struttura circolare a doppia elica della sequenza bersaglio, di cui un filamento è quello parentale, mentre l'altro porta la mutazione desiderata.
Il filamento parentale viene eliminato con esonucleasi e successivamente viene ripristinata la struttura circolare a doppio filamento tramite ripolimerizzazione e ligazione. In tale struttura entrambi i filamenti contengono la mutazione.
La miscela di reazione sopra descritta è stata utilizzata per trasformare cellule competenti di E.coli TG1, ottenendo placche fagiche ricombinanti. Il gene della carbamilasi contenuto nel genoma di una placca ricombinante positiva ottenuta da ciascun esperimento di mutagenesi è stato sequenziato utilizzando il kit commerciale SequenaseR (USB) che si basa sulla metodologia descritta da Sanger et al. (PNAS (1977), 74: 5463) .
Per verificare le caratteristiche di attività e stabilità dei mutanti secondo la presente invenzione, cellule di E.coli trasformate con un plasmide contenente il gene mutagenizzato come sopra riportato sono state coltivate in un terreno adatto, a 37°C per 16 ore. Quindi gli estratti proteici ottenuti dai U sati cellulari sono stati analizzati mediante SDS-PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide contenente sodiododecilsolfato) ed analisi densitometrica. I risultati hanno mostrato che i mutanti erano espressi in quantità paragonabili tra loro e simili al livello di espressione dell'enzima wild type.
Il saggio di attività eseguito sugli estratti grezzi, come descritto da Weatherburn, M.W., (1967), (Anal. Chem., 39: 971), ha rivelato per tutti i mutanti una attività paragonabile a quella dell'enzima wild type.
Gli studi di stabilità condotti a temperatura ambiente (20-25°C) per differenti tempi hanno evidenziato per i mutanti saggiati una stabilità superiore a quella della D-N-ci-carbamilasi wild type (esempio 9 e figura 1).
Infatti, mentre dopo 888 ore l'enzima wild type mostrava aver perso completamente l'attività, per il doppio mutante Cys243Ala-Cys279Ala si osservava una attività residua del 63%, attività che dopo 1896 ore era del 32%.
Inoltre, uno studio condotto ponendo a contatto D-N-carbamil-paraidrossifenilglicina con le stesse quantità di enzima mutato Cys243Al~ a-Cys279Ala e di enzima wild type ha rivelato, a parità di tempo di reazione, che l’enzima mutato consente un miglioramento delle rese di produzione della D-paraidrossifenilglicina (esempio 10 e figura 2).
In accordo con la presente invenzione il gene mutagenizzato come sopra riportato può essere introdotto in un vettore di clonaggio posizionando correttamente detto gene sotto il controllo di sequenze che ne regolano l'espressione nel ceppo ospite .
Vettori adatti allo scopo possono essere scelti tra plasmidi, fagi e cosmidi disponibili in commercio o presso centri di raccolta autorizzati.
Secondo una forma di attuazione preferita della presente invenzione il gene mutagenizzato della carbamilasi può essere clonato in un plasmide contenente il gene che codifica l'enzima D-idantoinasi quale ad esempio pSM651 (CBS 203.94) .
In particolare questo plastnide, ottenuto inserendo nel vettore pSM671 (CBS 205.94) i geni idantoinasi e carbamilasi wild type (operone idantoinasi-carbamilasi ), è caratterizzato dal fatto di contenere un promotore sintetico capace di dirigere con elevata efficienza ed in assenza di induttori l'espressione dei geni posti sotto il suo controllo in E.coli e/o B.subtilis.
La sostituzione del gene codificante la D-N-α -carbamilasi wild type con lo stesso gene mutagenizzato porta alla costruzione di plasmidi ricombinanti in grado di esprimere un sistema enzimatico, costituito dall'enzima D-idantoinasi e da un mutante della D-N-α-carbamilasi .
I plasmidi ricombinanti , contenenti il gene D-N-α -carbamilasi mutagenizzato o l'operone idantoinasi -carbami lasi mutagenizzata , possono essere introdotti in un microorganismo ospite selezionato nel gruppo di B.subtilis e/o E .coli.
Detti microorganismi vengono quindi coltivati in condizioni aerobiche, in un mezzo acquoso contenente sorgenti assimilabili di carbonio e di azoto nonché diversi cationi, anioni ed, eventualmente, tracce di vitamine, quali biotina o tiamina, o di amminoacidi.
Sorgenti di carbonio assimilabili includono carboidrati come glucosio, amidi idrolizzati, melassa, saccarosio od altre sorgenti di carbonio convenzionali .
Esempi di sorgenti di azoto possono essere scelti, ad esempio, tra sali d'ammonio minerali, quali nitrato di ammonio, solfato di ammonio, cloruro di ammonio o carbonato di ammonio e urea o materiali contenenti azoto organico o inorganico come peptone, estratto di lievito o estratto di carne .
I seguenti cationi ed anioni sono ugualmente adatti per gli scopi della presente invenzione: potassio, sodio, magnesio, ferro, calcio, fosfati acidi, solfati, cloruri, manganese, e nitrati.
La fermentazione è condotta, sotto agitazione, ad una temperatura compresa tra 25°e 40°C, preferibilmente tra 30° e 37°C e ad un pH compreso tra 6 e 7,5, preferibilmente tra 6,5 e 7,0.
Le cellule (biomassa) recuperate dal mezzo di coltura mediante tecniche convenzionali come centrifugazione o filtrazione vengono impiegate nella produzione di D-α-amminoacidi mediante conversione di D-N-carbamil amminoacidi o, nel caso in cui le cellule esprimono gli enzimi idantoinasi e carbamilasi mutata, di miscele raceme di idantoine 5-sostituite.
Alternativamente, nella produzione di D-a-amminoacidi si può utilizzare l'estratto cellulare ottenuto dalla disintegrazione delle cellule mediante sonicazione o French-Press, sia gli enzimi purificati o parzialmente purificati utilizzando tecniche convenzionali, sia gli enzimi immobilizzati su supporti insolubili.
Numerosi D-N carbamil amminoacidi e idantoine sostituite: in posizione 5 possono essere utilizzati nel procedimento della presente invenzione. Possibili sostituenti in posizione 5 sono scelti tra un gruppo alchilico lineare o ramificato con un numero di atomi di carbonio compreso tra 1 e 6, che possono essere mono o polisostituiti con gruppi idrossilici, carbossilici, sulfidrilici o amminici oppure un gruppo fenilico o benzilico che, a loro volta, possono contenere uno o più sostituenti in posizione orto, meta e para.
Esempi di idantoine 5-sostituite sono: D,L-5-fenilidantoina , D,L-5-para-idrossifenil idantoina, D,L-5-metilidantoina, D,L-5-isopropilidantoina, D, L-5-tienilidantoina, D ,L-5-para-metossifenilidantoina,
D,L-5-para-clorofenil-idantoina, D,L-5-benzilidantoina.
La reazione di conversione del substrato di partenza (idantoine 5-sostituite o D-N-carbamil amminoacidi) nei corripondenti D- a-amminoacidi è preferibilmente condotta in atmosfera di azoto in una apparecchiatura ermeticamente chiusa, ad una temperatura compresa tra 20 e 60°C, preferibilmente tra 30 e 45°.
Il pH del mezzo di reazione è mantenuto entro valori compresi tra 6 e 10 e di preferenza tra 7 e 8,5. Questa regolazione del pH potrà essere effettuata, ad esempio, mediante aggiunta di una soluzione acquosa basica quale una soluzione acquosa di ammoniaca, di idrossido di potassio, di idrossido di sodio, carbonato di sodio oppure di potassio .
La concentrazione iniziale del substrato è generalmente compresa tra il 2% e il 30% in peso.
La quantità di biomassa o di enzima che viene addizionata alla miscela di reazione dipenderà dalla particolare affinità del substrato verso gli enzimi. In generale, può essere utilizzato un rapporto in peso biomassa/substrato compreso tra 1/1 e 1/50.
I D-α -amminoacidi preparati mediante il processo della presente invenzione possono essere recuperati dall'ambiente di reazione mediante metodiche classiche come cromatografia a scambio ionico o precipitazione dell 'amminoacido al suo punto isoelettrico.
Sebbene l'invenzione venga descritta relativamente alla produzione di mutanti della D-N-α-carbamilasi di A.radiobacter è evidente che essa può essere applicata alla modifica di enzimi omologhi ottenuti da altri microorganismi.
In accordo con la presente invenzione il plasmide pSM645 è stato depositato presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures , SK Baarn (Olanda) come E.coli SMC 306 dove ha ricevuto il numero di deposito CBS 204.94.
Gli esempi sperimentali che seguono hanno lo scopo di illustrare meglio la presente invenzione senza volerla limitare.
Esempio 1
Clonaggio del frammento EcoRI-HindiII del gene codificante la D-N-carbamilasi nella forma replicativa del fago M13mp8.
Il plasmide pSM651 CBS 203.94 (1 pg) è stato digerito con 1 unità degli enzimi di restrizione EcoRI e HindiII (Boehringer) a 37°C per 60 minuti.
Dopo aver bloccato la reazione enzimatica a 65°C per 10 minuti, la miscela di reazione è stata caricata su gel di agarosio low melting allo 0.8% e corsa a 50 volts per 2 ore. Quindi la banda EcoRI-HindIII di 915 coppie di basi (bp), comprendente la sequenza codificante la D-N-a-carbamilasi è stata purificata mediante Gelase TM (Epicentre Technologies).
Il frammento di DNA corrispondente a questa banda (0,02 yg) è stato ligato al vettore M13mp8 (50 ng) previamente digerito con gli stessi enzimi di restrizione. La reazione di ligasi è stata condotta in 20 μl di miscela contenente 66 mM Tri s-HCl pH 7,6, 1 mM ATP, 10 mM MgCl2, 10 mM Di tiotreitolo (DTT), in presenza di 1 U di T4 DNA ligasi, a 16°C per 16 ore.
Quindi una aliquota (5 μl) della miscela di ligasi è stata impiegata per trasformare cellule di E·coli 71/18 (BRL) rese competenti con 50 mM CaCl2 (Dagert, M. e Ehrlich (1979), Gene, .6:23).
Successivamente i trasformanti sono stati selezionati su piastre di YT agar (8 g/1 Bacto tryptone (DIFCO), 5 g/1 NaCl) contenenti 40 yg/ml di X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-tiogalactopiranoside) e 125 yg/ml di IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranoside) .
Operando come sopra riportato si sono ottenute numerose placche ricombinanti positive (bianche) facilmente distinguibili da quelle non ricombinanti (blu).
Allo scopo di verificare se l'inserimento del frammento EcoRI-HindIII è avvenuto correttamente, il DNA fagico a doppia elica (forma replicativa o RF) è stato isolato da alcune placche positive e digerito con gli enzimi EcoRI e HindiII (Boehringer).
Da una delle placche positive, che mostrava l'esatto inserimento, è stato preparato il DNA fagico a singola elica (SS) da utilizzare come templato nella fase di mutagenesi sito specifica. Esempio 2
Mutagenesi sito-specifica
Gli oligonucleotidi impiegati per introdurre le mutazioni desiderate sono stati sintetizzati mediante metodiche note utilizzando il sintetizzatore DNA Synthesizer Oligo 1000 (Beckman).
In particolare gli oligonucleotidi hanno le seguenti sequenze:
Le basi sottolineate sono quelle utilizzate per la sostituzione del codone della cisteina con quello dell'alanina.
Gli oligonucleotidi sono stati fosforilati all'estremità 5' in 30 μl di miscela di reazione contenente 100 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM MgC1 , 5 mM DTT, 1 mM ATP e 2 U di T4 polinucleotide Kinase (Promega), mediante incubazione a 37°C per 30'.
Gli oligonucleotidi fosforilati sono stati quindi utilizzati separatamente nelle tre reazioni di mutagenesi in vitro utilizzando il sistema "Oligonucleotide - directed in vitro mutagenesis version 2” (Amersham), basato sulla metodologia descritta da Zoller e Smith (1983, Methods in Enzymol., 100: 468-500), operando secondo le indicazioni del produttore.
Le miscele di reazione sono state quindi utilizzate per infettare cellule di E.coli TG1 (Amersham) come sopra riportato.
Il DNA fagico derivante da una placca bianca ottenuta da ciascun esperimento di mutagenesi è stato sequenziato mediante il kit "Sequenase 2.0" (United States Biochemical) basato sulla metodologia descritta da Sanger et al. (PNAS (1977) 74: 5463) Per verificare la presenza della mutazione desiderata.
Esempio 3
Subclonaqgio dei mutanti Cys-->Ala nel plasmide PSM671
1,0 μg di ciascuno dei DNA a doppia elica dei fagi ricombinanti contenenti la sostituzione della cisteina con l'alanina è stato digerito con gli enzimi di restrizione EcoRI e HindlII (2 U) e, successivamente ligato con il plasmide pSM671 CBS 205.94 (1 μg) precedentemente tagliato con gli stessi enzimi di restrizione. La reazione di ligasi è stata effettuata in 20 μl di tampone di ligasi contenente 2 U T4 DNA ligasi, 150 ng di DNA fagico e 50 ng di DNA plasmidico, a 16°C per 16 ore.
Quindi, 5 μl di ciascuna miscela sono stati impiegati per trasformare cellule competenti di E.coli 71/18 (BRL).
I trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno LB agar (0,8% Bacto triptone, 0,5% Estratto di lievito, 0,5% NaCl, agar 18 g/1) contenenti 20 μg/ml di cloramfenicolo.
Il DNA plasmidico isolato da uno dei cloni positivi Cm (cloramfenicolo resistenti) così ottenuti, è stato quindi analizzato mediante analisi di restrizione per verificare il corretto inserimento del gene.
I plasmidi così ottenuti sono stati denominati
Esempio 4
Espressione dei mutanti in E.coli.
I ceppi di E.coli portanti i plasmidi pSM641, pSM642 e pSM643, sono stati inoculati in beute da 50 mi contenenti ciascuna 10 mi di terreno LB addizionato con 20 μq/ml di cloramfenicolo ed incubati a 37°C per 16 ore, sotto agitazione (200 rpm). Come controllo è stato coltivato nelle stesse condizioni sopra riportate il ceppo di E.coli 71/18 contenente il plasmide pSM637 portante il gene wild type della carbamilasi.
Quindi le colture sono state centrifugate a 12000 rpm per 1 minuto (rotore SJ14, Beckman). Le cellule così ottenute sono state risospese in 300 μl di tampone 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM BMeOH, 20% glicerolo e U sate per sonicazione (Soniprepl50, MSE impulsi di 1 minuto, a voltaggio medio). 20 μl di ciascun U sato sono stati analizzati mediante SDS-PAGE e saggio di attività.
L'analisi elettroforetica ha mostrato che tutti gli enzimi vengono espressi in quantità paragonabili sia tra loro che rispetto al livello di espressione dell'enzima wild type.
Esempio 5
Costruzione di doppi mutanti Cys-->Ala.
Utilizzando la procedura di mutagenesi sito-specifica descritta nell'esempio 2, sono stati ottenuti mutanti contenenti le doppie mutazioni Cys243Ala-Cys250Ala e Cys243Ala-Cys279Ala. Unico accorgimento è stato quello di allestire due miscele di reazione in cui fossero addizionati contemporaneamente i due oligonucleotidi contenenti le mutazioni da introdurre (rispettivamente gli oligonucleotidi 1 e 2 per il mutante Cys243Ala-Cys250Ala e gli oligonucleotidi 1 e 3 per il mutante Cys243Ala-Cys279Ala). Dopo la reazione di mutagenesi in vitro, ciascuna miscela è stata utilizzata per trasformare cellule di E.coli TG1. Il DNA plasmidico isolato da una delle placche bianche ottenute da ciascuna trasformazione è stato sequenziato per verificare la corretta sostituzione delle cisteine. Quindi i fagi ricombinanti selezionati sono stati utilizzati per la preparazione del DNA a doppia elica. Esempio 6
Subclonaggio dei doppi mutanti nel plasmide PSM671.
Operando come riportato nell'esempio 3, i geni della carbamilasi contenenti le due mutazioni sono stati subclonati dal DNA fagico nel plasmide pSM671 CBS 205.94. L'analisi dei plasmidi risultanti ha mostrato la corretta inserzione del gene della carbamilasi. I plasmidi ottenuti sono stati denominati pSM644 (portante la mutazione doppia Cys243Ala-Cys250Ala) e pSM645 (portante la mutazione doppia Cys243Ala-Cys279Ala) .
Il clone di E.coli comprendente il plasmide pSM645 è stato indicato con la sigla SMC306.
Esempio 7
Espressione dei doppi mutanti in E.coli.
Cellule di E .coli contenenti i plasmidi pSM644 e pSM645 sono state coltivate nelle stesse condizioni riportate nell'esempio 4. L'analisi elettroforetica dei lisati cellulari mostrava che gli enzimi mutati erano espressi a livelli paragonabili con quelli dell'enzima wild type.
Esempio 8
Purificazione dei mutanti
Le biomasse provenienti dalle fermentazioni dei ceppi di E.coli contenenti rispettivamente i pLasmidi pSM641, pSM645 e pSM637 (controllo) sono state sospese in tampone Tris-HCl 25 mM, pH 7,0, glicerolo 20% (v/v) (Tampone A) e lisate mediante due passaggi alla French Press a 18.000 psi.
I supernatanti ottenuti dopo centrifugazione dei U sati (30.000 rpm, 4°C, 30 minuti) sono stati caricati su una colonna (2,6 x 20 cm) di Sepharose Q FF (Pharmacia) equilibrata con il tampone A. La colonna è stata successivamente lavata con il tampone A (3 volumi di colonna) e quindi eluita con un gradiente di NaCl da 0 a 0,4 M. Le frazioni contenenti l'attività enzimatica sono state raccolte e caricate su una colonna (2,6 x 20 cm) di Chelating Spharose Fast Flow (Pharmacia) attivata con nichel cloruro ed equilibrata con tampone A.
Dopo lavaggio della colonna con il tampone A, si eluisce con un gradiente di imidazolo da 0 a 0,2 M nello stesso tampone. Le frazioni contenenti l’attività enzimatica sono state raccolte e concentrate per ultrafiltrazione su membrana YM10 (Amicon) . Le soluzioni concentrate sono state poi caricate su una colonna di Superose 12 HR 10/30 (Pharmacia) equilibrata nel tampone A ed eluita con lo stesso tampone. Le frazioni contenenti l'attività enzimatica, analizzate su SDS-PAGE al 12,5 %, rivelavano la presenza di una proteina con un peso molecolare pari a circa 36.000 daltons, con una purezza superiore al 90%.
Le attività specifiche delle proteine purificate misurate utilizzando come substrato D-carbamilparaidrossifenilglicina 0,12 M in tampone NaPO4 0,2 M pH 7,0, sono risultate tra loro paragonabili e comprese tra 8 e 9 U/mg, valore simile a quello dell'enzima wild type.
Per unità si intende la quantità di enzima capace di trasformare 1 μmole di substrato in 1 minuto a 40°C.
Esempio 9
Analisi della stabilità enzimatica dei mutanti.
Le soluzioni enzimatiche ottenute come descritto nell'esempio 8, sono state filtrate in condizioni di sterilità su DynaGard da 0,2 μm (Microgon, Inc). Quindi aliquote (0,2 mi) di detti filtrati sono state introdotte in provette Eppendorf sterili e mantenute a temperatura ambiente (20-25°C). Ad intervalli di tempo è stata determinata l'attività enzimatica residua a 40°C dosando via HPLC la D-para-idrossifenilglicina formata utilizzando come substrato D-N-carbamil paraidrossifenilglicina in tampone sodio fosfato 0,2 M, pH 7,0.
In tabella 1 e figura 1 sono riportate in percentuale le attività residue (ordinata) della carbamilasi wild type (--o— ) e dei mutanti Cys243Ala (--+--) e Cys243Ala-Cys279Ala
rispetto al tempo espresso in ore (ascissa).
TABELLA 1
Esempio 10
Confronto produttività della carbamilasi wild type e del mutante Cvs243Ala-Cys279Ala.
In due apparecchiature termostatate a 40°C, contenenti D-N-carbamil paraidrossifenilglicina (25,2 mg/ml) in 100 mi di tampone Na-fosfato 0,2 M pH 7,0 sono state introdotte le stesse quantità (0,064 unità/ml) di carbamilasi wild type e di carbamilasi mutata Cys243Ala-Cys279Ala. Ad intervalli di tempo è stata determinata via HPLC la quantità di D-paraidrossifenilglicina prodotta- I risultati ottenuti sono riportati in figura 2, dove in ascissa si riporta il tempo in ore ed in ordinata la quantità dell 'amminoacido espressa come vMoli/ml; con -- -- carbamilasi wild type e (--+--) mutante della carbamilasi.
Claims (21)
- RIVENDICAZIONI 1. Mutanti stabili della D-N-α-carbamilasi caratterizzati dal fatto che, almeno uno dei residui amminoacidici Cisteina in posizione 243, 250 e 279 della sequenza amminoacidica della D-N-α-carbamilasi wild type è sostituito con un residuo diverso scelto nel gruppo degli amminoacidi naturali.
- 2. Un mutante della D-N-α-carbamilasi in accordo alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il residuo amminoacidico naturale è L-Alanina.
- 3. Un mutante della D-N-α-carbamilasi in accordo alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che entrambi i residui amminoacidici Cisteina in posizione 243 e 279 sono sotituiti con il residuo amminoacidico L-Alanina.
- 4. Sequenza nucleotidica che codifica un mutante della D-N-α-carbamilasi in accordo alla rivendicazione 1.
- 5. Sequenza nucleotidica in accordo alla rivendicazione 4, che codifica un mutante della D-N-α-carbamilasi in cui almeno uno delle Cisteine in posizione 243, 250 e 279 è sostituita con il residuo amminoacidico L-Alanina.
- 6. Sequenza nucleotidica in accordo alla rivendicazione 4, che codifica il mutante della D-N-α-carbamilasi in cui entrambe le Cisteine in posizione 243 e 279 sono sostituite con il residuo amminoacidico L-Alanina.
- 7. Un plasmide ad espressione comprendente una sequenza nucleotidica che codifica un mutante della D-N-α-carbamilasi in cui almeno uno dei residui amminoacidici Cisteina in posizione 243, 250 e 279 è sostituito con un residuo diverso scelto nel gruppo degli amminoacidi naturali.
- 8. Il plasmide ad espressione in accordo alla rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che la sequenza nucleotidica codifica un mutante della D-N-α-carbamilasi in cui almeno una delle Cisteine in posizione 243, 250 e 279 è sostituita con il residuo amminoacidico L-Alanina.
- 9. Il plasmide ad espressione in accordo alla rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che la sequenza nucleotidica codifica il mutante della D-N-α-carbamilasi in cui entrambe le Cisteine in posizione 243 e 279 sono sostituite con il residuo amminoacidico L-Alanina.
- 10. Il plasmide in accordo alle rivendicazioni da 7 a 9, caratterizzato dal fatto di contenere il gene che codifica l'enzima D-idantoinasi.
- 11. Il plasmide pSM645 in accordo alla rivendicazione 9, depositato presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures dove ha ricevuto il numero di deposito CBS 204.94.
- 12. Un microorganismo scelto nel gruppo di Bacillus subtilis ed Escherichia coli trasformato con un plasmide comprendente una sequenza nucleotidica che codifica un mutante della D-N-α-carbamilasi in cui almeno uno dei residui amminoacidici Cisteina in posizione 243, 250 e 279 è sostituito con un residuo diverso scelto nel gruppo degli amminoacidi naturali.
- 13. Il microorganismo in accordo alla rivendicazione 12, in cui il plasmide comprende la sequenza nucleotidica che codifica il mutante della D-N-α-carbamilasi in cui almeno una delle Cisteine in posizione 243, 250 e 279 è sostituita con il residuo amminoacidico L-Alanina.
- 14. Il microorganismo in accordo alla rivendicazione 12, in cui il plasmide comprende la sequenza nucleotidica che codifica il mutante della D-N-α-carbamilasi in cui entrambe le Cisteine in posizione 243 e 279 sono sostituite con il residuo amminoacidico L-Alanina.
- 15. Il microorganismo in accordo alla rivendicazione 12, in cui il plasmide comprende la sequenza nucleotidica che codifica la D-idantoinasi.
- 16. Il microorganismo in accordo alla rivendicazione 14, che è Escherichia coli SMC305 CBS 204.94.
- 17. Un procedimento per la preparazione di un mutante della D-N-α-carbamilasi in accordo alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di coltivare un microorganismo selezionato tra Escherichia coli e Bacillus subtllis trasformato con un plasmide come definito nella rivendicazione 7 e separare e purificare il mutante così ottenuto.
- 18. Il procedimento in accordo alla rivendicazione 17, caratterizzato dal fatto che il plasmide comprende la sequenza nucleotidica che codifica il mutante della D-Na-carbamilasi in cui almeno una delle Cisteine in posizione 243, 250 e 279 è sostituita con il residuo anuninoacidico L-Alanina.
- 19. Il procedimento in accordo alla rivendicazione 18, caratterizzato dal fatto che il plasmide comprende la sequenza nucleotidica che codifica il mutante della D-N-a-carbamilasi in cui entrambe le Cisteine in posizione 243 e 279 sono sostituite con il residuo amminoacidico L-Alanina.
- 20. Procedimento per la produzione di D-a-amminoacidi mediante conversione stereospecifica di D-N-carbamil amminoacidi o miscele raceme di idantoine 5-sostituite caratterizzato dal fatto che la reazione di conversione è condotta in presenza di un microorganismo capace di produrre un mutante della D-N-α-carbamilasi e/o un sistema enzimatico costituito da D-idantoinasi e da un mutante della D-N-a-carbamilasi.
- 21. Il procedimento in accordo alla rivendicazione 20, caratterizzato dal fatto che la reazione di conversione è condotta in presenza di un mutante della D-N-a-carbamilasi e/o di un sistema enzimatico costituito da D-idantoinasi e da un mutante della D-M-a-carbami lasi isolati da un microorganismo capace di produrre detto mutante e/o detto sistema enzimatico. Il procedimento in accordo alla rivendicazione 21, caratterizzato dal fatto che un mutante della D-N-α-carbamilasi e/o il sistema enzimatico comprendente detto mutante sono immobilizzati su un supporto solido insolubile .
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