JPH0884584A - Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの安定な変異体 - Google Patents

Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの安定な変異体

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JPH0884584A
JPH0884584A JP7091195A JP9119595A JPH0884584A JP H0884584 A JPH0884584 A JP H0884584A JP 7091195 A JP7091195 A JP 7091195A JP 9119595 A JP9119595 A JP 9119595A JP H0884584 A JPH0884584 A JP H0884584A
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レナータ、グリファンティーニ
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、野生型酵素のアミノ酸配列の２４
３、２５０、および２７９位におけるシステインのうち
少くとも一つが天然アミノ酸から選択される異なる残基
で置換されてなるＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異
体、Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体のうち少くと
も一つをコードするヌクレオチド配列を含んだ組換えプ
ラスミド、そのプラスミドで形質転換された宿主微生
物、および上記微生物の培養物によるこれら変異体の製
造方法。 【効果】 Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体は野生
型酵素の場合より高い酵素安定性を有しており、製造収
率で改善を示すＤ‐α‐アミノ酸の製造にとり特に有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、野生型酵素の場合と比較して改善された酵素
安定性を有するＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体、
それらの製造手段および方法、およびＤ‐α‐アミノ酸
の製造についてのそれらの使用に関する。
【０００２】背景技術 酵素の工業的使用が限定されるのは、一般的にそれらの
高い製造および精製コストのためだけではなく、知られ
ているように、一連の因子、例えば熱変性、酸化現象と
疎水性および／または共有タイプの結合に起因する凝集
に基づくそれらの不安定性のためでもある。
【０００３】したがって、酵素の不安定性の原因を突き
止めることが、酵素方法を改善してそれをもっと有用な
ものにする解決策を見つける上で最も重要である。他
方、(i) この不安定性の原因と、(ii)酵素の活性を変え
ずに不安定性を解消または減少する上で可能な方策とを
正確に示すことはしばしば困難性を伴う。
【０００４】Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼは、Ｄ‐Ｎ‐
カルバミル‐α‐アミノ酸を立体特異性加水分解によ
り、対応Ｄ‐α‐アミノ酸に変換することができる酵素
である。これらの光学活性化合物は、薬理活性物質（例
えば、Ｄ‐フェニルグリシンおよびＤ‐パラヒドロキシ
フェニルグリシンは、ペニシリン類およびセファロスポ
リン類の合成に用いられる）、農薬（殺虫剤フルバニレ
ート合成用のＤ‐バリン）または甘味料（Ｄ‐アラニ
ン）の合成に重要な中間体である。
【０００５】Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼは、それが用
いられる工業的方法の収率およびコストをかなり悪化さ
せる不安定化現象もうけやすい。
【０００６】
【発明の概要】上記技術の欠点を克服することが本発明
の目的である。特に、本発明によると、野生型Ｄ‐Ｎ‐
α‐カルバミラーゼのシステイン２４３、２５０、およ
び２７９のうち少くとも一つの異なるアミノ酸残基によ
る置換により、この酵素を安定化させることができて、
Ｄ‐α‐アミノ酸の製造収率を改善することが見出され
た。これによれば、本発明の第一の態様は、２４３、２
５０、および２７９位におけるシステインアミノ酸残基
のうち少くとも一つが天然アミノ酸の群から選択される
異なるアミノ酸残基で置換されてなることを特徴とす
る、改善された酵素安定性を有したＤ‐Ｎ‐α‐カルバ
ミラーゼの変異体に関する。改善された安定性を有する
Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの少くとも１つの変異体を
コードするヌクレオチド配列が、本発明のもう１つの対
象である。本発明は上記配列を含んでなる複製性発現ベ
クターにも関する。本発明のもう１つの対象は、上記ベ
クターで形質転換された微生物に関する。適切な条件下
で形質転換微生物を培養し、こうして得られた変異体を
分離することからなる、改善された安定性を有するＤ‐
Ｎ‐α‐カルバミラーゼの少くとも一つの変異体の製造
方法が、本発明のもう１つの態様である。本発明は、Ｄ
‐α‐アミノ酸の製造方法における、上記形質転換微生
物または上記微生物から得られたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミ
ラーゼの変異体の用途にも関する。
【０００７】
【発明の具体的説明】本発明の他の目的は、下記記載お
よび例から明らかである。特に、本発明によるＤ‐Ｎ‐
α‐カルバミラーゼの変異体は、野生型酵素のアミノ酸
配列の２４３、２５０、または２７９位におけるシステ
イン残基（Ｃｙｓ）のうち少くとも１つがＬ‐アラニ
ン、Ｌ‐セリン、Ｌ‐リジン、Ｌ‐アルギニン、Ｌ‐ア
スパラギン酸、Ｌ‐グルタミン酸、Ｌ‐アスパラギン、
Ｌ‐グルタミン、Ｌ‐ヒスチジン、Ｌ‐グリシン、Ｌ‐
ロイシン、Ｌ‐イソロイシン、Ｌ‐バリン、Ｌ‐チロシ
ン、Ｌ‐トレオニン、Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐フェニ
ルアラニン、Ｌ‐メチオニン、またはＬ‐プロリンから
選択される異なる残基で置換されていることを特徴とす
る。
【０００８】本発明のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変
異体は： ａ）Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼをコードする遺伝子の
特定部位に一以上の変異を導入し、 ｂ）工程ａ）で得られた変異誘発させた遺伝子をクロー
ニングベクターにクローニングし、 ｃ）工程ｂ）で得られた組換えベクターで宿主株を形質
転換し、 ｄ）工程ｃ）で形質転換された宿主株を適切な培地で培
養し、そして ｅ）こうして得られたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変
異体を分離および精製することからなる方法で製造され
る。
【０００９】遺伝子の既定部位における変異の導入は、
インビトロで公知変異誘発技術の１つを用いて実施でき
る。ＤＮＡ配列上にある特定の既定部位で修正を行う様
々な技術の中では、一本鎖の合成オリゴヌクレオチドを
用いる技術が最も広く用いられている。
【００１０】特に、Zoller,M.J.and Smith,M.,(1982),N
ucl.Acid.Res.,10,6487-6500に記載された方法の修正法
が用いられ、その方法では： １）Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼまたはこの一部（標的
配列）の遺伝子をＭ１３タイプバクテリオファージまた
はそれに由来するプラスミド中に導入して、変異遺伝子
の合成用の鋳型として有用な一本鎖でそれを作り、 ２）変異を決定する内部部分を除いて変異誘発される配
列に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、 ３）合成オリゴヌクレオチドを鋳型にアニーリングさせ
（これは第二修飾鎖の合成用のプライマーとして作用す
る）、 ４）インビトロで１回の重合および結合により二本鎖の
環状構造（１本のフィラメントは親であり、他方は望ま
しい変異を含んでいる）を再構成し、 ５）親フィラメントを除去し、インビトロで１回の重合
および結合により二本鎖の環状構造（双方のフィラメン
トが望ましい変異を含んでいる）を再構成し、 ６）変異および野生型クローンの集団を得ることにより
コンピテント(competento)化された宿主細胞を形質転換
するために二本鎖形を用い、 ７）変異クローンを選択する。
【００１１】変異誘発されるＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラー
ゼの遺伝子に関して、これは微生物、例えばPseudomona
s 、Hansenula 、Agrobacterium 、Aerobacter、Aeromo
nas、Bacillus、Moraxella 、Brevibacterium、Flavoba
cterium、Serratia、Micrococcus 、Arthrobactor、ま
たはParacoccusから単離することができる。これら微生
物の具体例としてはBacillus macroides ATCC 12905 、
Aerobacter cloacae IAM 1221 、Agrobacterium sp.IP
I-671 、Agrobacterium radiobacter NRRLB 11291 、Ps
eudomonas sp.FERM BP 1900 が挙げられる。
【００１２】本発明の好ましい態様によれば、Agrobact
erium radiobacter NRRLB 11291 に由来するＤ‐Ｎ‐α
‐カルバミラーゼ遺伝子が変異誘発された。Ｄ‐Ｎ‐α
‐カルバミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡの断片が制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII 切断によりプラスミドｐ
ＳＭ６５１（ＣＢＳ２０３．９４）から単離され、電気
泳動ゲルによる精製後、それが同制限酵素で切断された
後のバクテリオファージＭ１３ｍｐ８に公知技術を用い
て結合された。
【００１３】得られたリガーゼ混合物はDagert,M.and E
hrlich(1979),Gene,6:23に記載されたようにコンピテン
ト化されたEscherichia coli７１／１８（大腸菌）の細
胞を形質転換するために用いられ、形質転換株が多数の
陽性組換えプラークを得るために適した培地上で選択さ
れた。
【００１４】陽性プラークの１つから一本鎖を作った
後、これは望ましい変異を導入するための鋳型として用
いられた。特に、下記合成オリゴヌクレオチドがＣｙｓ
→Ａｌａ置換を２４３、２５０、および２７９位に導入
するために用いられた： （１）5'ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＡＴ ＧＧＣ ＣＣＣ Ｃ
ＴＣ ＣＴＣ Ｃ3' （２）5'ＣＧＣ ＣＡＣ ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＧＡ Ａ
ＴＧ ＧＣＣ3' （３）5'ＧＣＡ ＧＴＴ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＧＣ Ｇ
ＧＴ ＣＧＡ ＧＡＴ3'
【００１５】オリゴヌクレオチドの合成は市販装置、例
えばオリゴ１０００ＤＮＡシンセサイザー(Beckman) を
用いて、公知方法で実施できる。
【００１６】次いで、第二修飾フィラメントの合成用の
プライマーとして作用する合成オリゴヌクレオチドへの
一本鎖のカップリングが行われる。
【００１７】望ましい変異を得た後、一方のフィラメン
トが親で、他方が望ましい変異を起こした標的配列の環
状二本鎖構造が、インビトロで１回の重合および結合に
より再構成された。
【００１８】親フィラメントはヘキソヌクレアーゼで除
去され、その後環状二本鎖構造が再重合および結合によ
り再構成される。この構造において、双方のフィラメン
トは変異を含んでいる。
【００１９】上記反応混合物は、大腸菌ＴＧ１のコンピ
テント細胞を形質転換して、組換えバクテリオファージ
プラークを得るために用いた。各変異誘発実験から得ら
れる陽性組換えプラークのゲノムに含まれたカルバミラ
ーゼ遺伝子は、Sanger et al.(PNAS(1977),74:5463) に
より記載された方法に基づき、市販キット SequenaseＲ
（ＵＳＢ）を用いて配列決定した。
【００２０】本発明の変異体の活性および安定性の特徴
を確かめるために、上記のように変異誘発された遺伝子
を含むプラスミドで形質転換された大腸菌細胞が、適切
な培地中３７℃で１６時間培養された。次いで細胞溶解
物から得られたタンパク質抽出物が、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ
（ドデシル硫酸ナトリウムを含有したポリアクリルアミ
ドゲル上の電気泳動）および光学密度計測分析により分
析された。結果は、変異体が互いに匹敵して、野生型酵
素の発現レベルに類似した量で発現されることを示し
た。
【００２１】Weatherburn,M.W.,(1967),(Anal.Chem.,3
9:971) に記載されたように生抽出物で行われた活性試
験では、すべての変異体について野生型酵素の場合に匹
敵する活性を示した。
【００２２】異なる時間に室温（２０〜２５℃）で行わ
れた安定性研究では、試験された変異体について野生型
Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの場合よりも高い安定性を
示した（例９および図１）。
【００２３】事実、８８８時間後に野生型酵素はその活
性を完全に喪失したが、二重変異体Ｃｙｓ２４３Ａｌａ
‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａの場合は６３％の残留活性が観察
され、１８９６時間後に３２％であった。
【００２４】加えて、Ｄ‐Ｎ‐カルバミル‐パラヒドロ
キシフェニルグリシンを同量の変異酵素Ｃｙｓ２４３Ａ
ｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａおよび野生型酵素と接触させ
ることにより行われた研究では、同反応時間で、変異酵
素がＤ‐パラヒドロキシフェニルグリシンの製造収率で
改善を示すことを示した（例１０および図２）。
【００２５】本発明によれば、上記のように変異誘発さ
れた遺伝子は、宿主株でその発現を調節する配列のコン
トロール下にその遺伝子を正確に配置することにより、
クローニングベクター中に導入できる。
【００２６】目的に適したベクターは、市場または公的
な貯蔵センターで入手しうるプラスミド、バクテリオフ
ァージ、およびコスミドから選択することができる。
【００２７】本発明の好ましい態様によれば、変異誘発
されたカルバミラーゼ遺伝子はＤ‐ヒダントイナーゼ酵
素をコードする遺伝子を含んだプラスミド例えばｐＳＭ
６５１（ＣＢＳ２０３．９４）中にクローニングされ
る。
【００２８】特に、ヒダントイナーゼおよび野生型カル
バミラーゼ遺伝子（ヒダントイナーゼ‐カルバミラーゼ
オペロン）をベクターｐＳＭ６７１（ＣＢＳ２０５．９
４）中に挿入することで得られた上記プラスミドは、そ
れが大腸菌および／または枯草菌中でコントロール下に
おかれた遺伝子の発現をかなり効率的にインダクターな
しで指示できる合成プロモーターを含んでいることで特
徴付けられる。
【００２９】同様の変異誘発された遺伝子による野生型
Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼをコードする遺伝子の置換
から、Ｄ‐ヒダントイナーゼ酵素およびＤ‐Ｎ‐α‐カ
ルバミラーゼの変異体からなる酵素系を発現できる組換
えプラスミドを組立てる。
【００３０】変異誘発されたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラー
ゼ遺伝子または変異誘発されたヒダントイナーゼ‐カル
バミラーゼオペロンを含む組換えプラスミドは枯草菌お
よび／または大腸菌の群から選択される宿主微生物中に
導入することができる。
【００３１】次いで、これらの微生物は炭素および窒素
の同化源と、異なるカチオン、アニオンおよび、場合に
より微量のビタミン、例えばビオチンまたはチアミン、
あるいはアミノ酸を含有した水性培地中、好気的条件下
で培養される。
【００３２】同化性炭素源には炭水化物、例えばグルコ
ース、加水分解アミド、糖蜜、スクロースまたは他の慣
用的な炭素源がある。
【００３３】窒素源の例は、例えば無機アンモニウム
塩、例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウムまたは炭酸アンモニウムと、尿素または有
機もしくは無機窒素含有物質、例えばペプトン、酵母ま
たは肉エキスから選択することができる。
【００３４】下記カチオンおよびアニオン、即ちカリウ
ム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、カルシウム、酸の
リン酸、硫酸、塩化物、マンガンおよび硝酸イオンが本
発明の目的にとり同等に適している。
【００３５】発酵は２５〜４０℃、好ましくは３０〜３
７℃の温度、６〜７．５、好ましくは６．５〜７．０の
ｐＨにおいて、攪拌下で行われる。
【００３６】慣用的技術、例えば遠心または濾過で培地
から回収された細胞（バイオマス）はＤ‐α‐アミノ酸
の製造に用いられ、または細胞がヒダントイナーゼおよ
び変異カルバミラーゼ酵素を発現するときには、５‐置
換ヒダントインのラセミ混合物の製造に用いられる。
【００３７】一方、Ｄ‐α‐アミノ酸の製造において
は、超音波処理またはFrench-Pressによる細胞の破壊か
ら得られた細胞抽出物、慣用的技術を用いて精製または
部分精製された双方の酵素、あるいは不溶性支持体に固
定された酵素が使用できる。
【００３８】多数のＤ‐Ｎ‐カルバミルアミノ酸および
５位で置換されたヒダントインが本発明の目的に使用で
きる。５位で可能な置換基は炭素原子数１〜６の直鎖ま
たは分岐鎖アルキル基から選択されるが、そのアルキル
基はヒドロキシル、カルボキシル、スルフヒドリルもし
くはアミノ基またはフェニルもしくはベンジル基で一ま
たは多置換でき、更に後者の置換基はオルト、メタおよ
びパラ位に１以上の置換基を含むことができる。
【００３９】５‐置換ヒダントインの例としては、Ｄ，
Ｌ‐５‐フェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ‐５‐パラヒド
ロキシフェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ‐５‐メトキシヒ
ダントイン、Ｄ，Ｌ‐５‐イソプロピルヒダントイン、
Ｄ，Ｌ‐５‐チエニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ‐５‐パラ
メトキシフェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ‐５‐パラクロ
ロフェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ‐５‐ベンジルヒダン
トインが挙げられる。
【００４０】対応Ｄ‐α‐アミノ酸における出発基質
（５‐置換ヒダントインまたはＤ‐Ｎ‐カルバミルアミ
ノ酸）の変換反応は、密封容器中、窒素雰囲気下におい
て、２０〜６０℃、好ましくは３０〜４５℃の温度で行
われることが好ましい。反応培地のｐＨは６〜１０、好
ましくは７〜８．５の値内に維持される。このｐＨ調節
は、例えば塩基性水溶液、例えばアンモニア、水酸化カ
リウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたはカリ
ウムの水溶液を加えることにより実施できる。
【００４１】基質の初期濃度は通常２〜３０重量％であ
る。
【００４２】反応混合液に加えられるバイオマスまたは
酵素の量は、酵素に対する基質の具体的親和性に依存し
ている。１／１〜１／５０のバイオマス／基質重量比が
通常使用できる。
【００４３】本発明の方法で製造されたＤ‐α‐アミノ
酸は、従来よりの方法、例えばイオン交換クロマトグラ
フィーまたはアミノ酸の等電点沈降を用いて反応環境か
ら回収することができる。
【００４４】本発明はA.radiobacter のＤ‐Ｎ‐α‐カ
ルバミラーゼの変異体の製造に関するが、他の微生物か
ら得られる相同的酵素の修正にも適用しうることは明ら
かである。
【００４５】本発明によれば、プラスミドｐＳＭ６４５
は大腸菌ＳＭＣ３０６としてCentraalbureau Voor Schi
mmelcultures,SK Baarn(Holland)に受託され、そこで寄
託番号ＣＢＳ２０４．９４が付された。
【００４６】
【実施例】下記実験例は本発明を更に説明するが、その
範囲を制限するものではない。 例１バクテリオファージＭ１３ｍｐ８の複製形におけるＤ‐
Ｎ‐カルバミラーゼをコードする遺伝子の断片ＥｃｏＲ
Ｉ‐ＨｉｎｄIII のクローニング： プラスミドｐＳＭ６
５１ ＣＢＳ２０３．９４（１μｇ）を３７℃で６０分
間かけて１単位の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄII
I (Boehringer)により切断した。
【００４７】酵素反応を６５℃で１０分間阻止した後、
反応混合物を低融点アガロースゲル上に０．８％で置
き、５０ボルトで２時間処理した。次いでＤ‐Ｎ‐α‐
カルバミラーゼをコードする配列を含んだ９１５塩基対
（ｂｐ）のＥｃｏＲＩ‐ＨｉｎｄIII バンドをGelaseTM
(Epicentre Technologics)により精製した。
【００４８】このバンドに相当するＤＮＡ断片（０．０
２μｇ）を、同制限酵素で切断した後のベクターＭ１３
ｍｐ８（５０ng）に結合させた。リガーゼ反応は６６mM
トリスＨＣｌ ｐＨ７．６、１mMＡＴＰ、１０mMＭｇＣ
ｌ２、１０mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）含有混合液
２０μｌ中Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１Ｕの存在下１６℃で
１６時間行った。
【００４９】次いでリガーゼ混合液の一部（５μｌ）を
用いて、５０mMＣａＣｌ２でコンピテント化された大腸
菌７１／１８（ＢＲＬ）の細胞を形質転換させた(Dager
t,M.and Ehrlich(1979),Gene,6:23)。
【００５０】次いで形質転換株を４０μg/mlのＸ‐Ｇａ
ｌ（５‐ブロモ‐４‐クロロ‐３‐インドリル‐Ｄ‐チ
オガラクトピラノシド）および１２５μg/mlのＩＰＴＧ
（イソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド）含
有のＹＴ寒天（８g/ｌバクトトリプトン(DIFCO) 、５g/
ｌＮａＣｌ）のプレート上で選択した。
【００５１】上記のように操作して、多数の陽性組換え
プラーク（白色）を得たが、これは非組換え体（青色）
と容易に区別することができた。
【００５２】ＥｃｏＲＩ‐ＨｉｎｄIII 断片の挿入が正
確に行われたかを確認するために、二本鎖バクテリオフ
ァージＤＮＡ（複製形またはＲＦ）をいくつかの陽性プ
ラークから単離し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII 酵素
(Boehringer)で切断した。
【００５３】部位特定変異誘発段階で鋳型として用いら
れる一本鎖バクテリオファージＤＮＡ（ＳＳ）を陽性プ
ラークの１つから作ったが、これは正確な挿入を示し
た。
【００５４】例２部位特定変異誘発 望ましい変異を導入するために用いられたオリゴヌクレ
オチドは、オリゴ１０００ＤＮＡシンセサイザー(Beckm
an) を用いて、公知方法により合成した。特に、そのオ
リゴヌクレオチドは下記配列を有している： （１）5'ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＡＴ ＧＧＣ ＣＣＣ Ｃ
ＴＣ ＣＴＣ Ｃ3' 変異Ｃｙｓ２４３→Ａｌａを挿入する； （２）5'ＣＧＣ ＣＡＣ ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＧＡ Ａ
ＴＧ ＧＣＣ 3' 変異Ｃｙｓ２５０→Ａｌａを挿入する； （３）5'ＧＣＡ ＧＴＴ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＧＣ Ｇ
ＧＴ ＣＧＡ ＧＡＴ3' 変異Ｃｙｓ２７９→Ａｌａを挿入する。
【００５５】下線の塩基はシステインのコドンをアラニ
ンのコドンで置換するために用いられる塩基である。
【００５６】オリゴヌクレオチドは、１００mMトリスＨ
Ｃｌ ｐＨ８、１０mMＭｇＣｌ２、５mMＤＴＴ、１mMＡ
ＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(Promega) ２
Ｕ含有の反応混合液３０μｌ中３７℃で３０分間のイン
キュベートにより、鎖の５´末端側でリン酸化させた。
【００５７】次いでリン酸化オリゴヌクレオチドは、製
造者の指示に従い操作するため、Zoller and Smith(198
3,Methods in Enzymol.,100:468-500)に記載された方法
に基づき、系“オリゴヌクレオチド‐特定部位インビト
ロ変異誘発バージョン２”(Amersham)を用いて、インビ
トロで３種の変異誘発反応に別々に用いた。
【００５８】次いで反応混合物は前記のように大腸菌Ｔ
Ｇ１(Amersham)の細胞を感染させるために用いた。
【００５９】各変異誘発実験から得られる白色プラーク
に由来するバクテリオファージＤＮＡは、望ましい変異
の存在を確認するために、Sanger et al.(PNAS(1977),7
4:5463) に記載された方法に基づき"Sequenase 2.0" キ
ット(United States Biochemical) で配列決定した。
【００６０】例３プラスミドｐＳＭ６７１における変異体Ｃｙｓ→Ａｌａ
のサブクローニング システインからアラニンへの置換を含んだ組換えバクテ
リオファージの二本鎖ＤＮＡの各々１．０μｇを制限酵
素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII(２Ｕ）で切断し、その
後同制限酵素で既に切断されたプラスミドｐＳＭ６７１
ＣＢＳ２０５．９４（１μｇ）と結合させた。リガー
ゼ反応はＴ４ ＤＮＡリガーゼ２Ｕ、バクテリオファー
ジＤＮＡ１５０ngおよびプラスミドＤＮＡ５０ngを含有
したリガーゼ緩衝液２０μｌ中１６℃で１６時間行っ
た。
【００６１】次いで各混合液５μｌを用いて、大腸菌７
１／１８（ＢＲＬ）のコンピテント細胞を形質転換させ
た。
【００６２】形質転換株は μg/mlのクロラムフェニ
コールを含有したＬＢ寒天培地（０．８％バクトトリプ
トン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、寒天１
８g/ｌ）のプレート上で選択した。
【００６３】こうして得られた陽性Ｃｍｒクローン（ク
ロラムフェニコール耐性）の１つから単離されたプラス
ミドＤＮＡを、遺伝子の正確な挿入を確認するために、
制限分析により分析した。
【００６４】こうして得られたプラスミドをｐＳＭ６４
１（変異Ｃｙｓ２４３→Ａｌａを有する）、ｐＳＭ６４
２（変異Ｃｙｓ２５０→Ａｌａを有する）、ｐＳＭ６４
３（変異Ｃｙｓ２７９→Ａｌａを有する）と呼んだ。
【００６５】例４大腸菌における変異体の発現 プラスミドｐＳＭ６４１、ｐＳＭ６４２、およびｐＳＭ
６４３を保有する大腸菌株を、２０μg/mlのクロラムフ
ェニコールが加えられたＬＢ培地１０mlを含有した各々
の５０mlフラスコ中に接種し、攪拌下（２００rpm)３７
℃で１６時間インキュベートした。コントロールとし
て、カルバミラーゼの野生型遺伝子を保有するプラスミ
ドｐＳＭ６３７を含んだ大腸菌７１／１８の株を上記と
同様の条件下で培養した。
【００６６】次いで培養液を１２０００rpm で１分間遠
心した（ローターＳＪ１４、Beckman)。こうして得られ
た細胞を２０mMトリスＨＣｌ ｐＨ７．５、２０mMＭｅ
ＯＨ、２０％グリセロールの緩衝液３００μｌに再懸濁
し、超音波処理（Soniprep150,平均電圧でＭＳＥ１分間
インパルス）により溶解させた。各溶解物２０μｌをＳ
ＤＳ‐ＰＡＧＥ及び活性試験により分析した。
【００６７】電気泳動分析では、すべての酵素が互いに
および野生型酵素の発現レベルに匹敵する量で発現され
た。
【００６８】例５二重Ｃｙｓ→Ａｌａ変異体の組立て 例２で記載された部位特異性変異誘発方法を用いて、二
重変異Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２５０Ａｌａおよび
Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａを含んだ変異
体を得た。処置は、導入される変異を含んだ２つのオリ
ゴヌクレオチド（各々、変異体Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃ
ｙｓ２５０Ａｌａについてオリゴヌクレオチド１および
２、変異体Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａに
ついてオリゴヌクレオチド１および３）が同時に加えら
れた２種の反応混合液を調製することだけであった。イ
ンビトロ変異誘発反応後、各混合液は大腸菌ＴＧ１の細
胞を形質転換するために用いた。各形質転換から得られ
る白色プラークの１つから単離されたプラスミドＤＮＡ
は、システインの正確な置換を確認するために配列決定
した。次いで選択された組換えバクテリオファージを二
本鎖ＤＮＡの作成のために用いた。
【００６９】例６プラスミドｐＳＭ６７１における二重変異体のサブクロ
ーニング 例３で記載されたのと同様の操作を用いて、２つの変異
を含むカルバミラーゼ遺伝子をプラスミドｐＳＭ６７１
ＣＢＳ２０５．９４でバクテリオファージＤＮＡから
サブクローニングした。得られたプラスミドの分析で
は、カルバミラーゼ遺伝子の正確な挿入を示した。得ら
れたプラスミドはｐＳＭ６４４（二重変異Ｃｙｓ２４３
Ａｌａ‐Ｃｙｓ２５０Ａｌａを有する）およびｐＳＭ６
４５（二重変異Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌ
ａを有する）と呼んだ。プラスミドｐＳＭ６４５を含む
大腸菌のクローンは略称ＳＭＣ３０６で示した。
【００７０】例７大腸菌における二重変異体の発現 プラスミドｐＳＭ６４４およびｐＳＭ６４５を含んだ大
腸菌の細胞を例４に記載されたのと同条件下で培養し
た。細胞溶解物の電気泳動分析では、変異酵素が野生型
酵素の場合に匹敵するレベルで発現されることを示し
た。
【００７１】例８変異体の精製 プラスミドｐＳＭ６４１、ｐＳＭ６４５およびｐＳＭ６
３７（コントロール）を各々含んだ大腸菌の株の発酵か
ら得たバイオマスを２５mMトリスＨＣｌ ｐＨ７．０、
２０％(v/v) グリセロールの緩衝液（緩衝液Ａ）に懸濁
し、French-Pressで２回１８０００psi(約１２６０ kg/
cm2 ）で溶解させた。
【００７２】溶解物の遠心（３００００rpm 、４℃、３
０分間）後に得られた上澄を緩衝液Ａで平衡化された S
epharoseＲＱ ＦＦ(Pharmacia) カラム（２．６×２０
cm）上にのせた。次いでカラムを緩衝液Ａ（カラムの３
倍容量）で洗浄し、その後０〜０．４ＭのＮａＣｌ勾配
で溶出させた。酵素活性を有する分画を集め、塩化ニッ
ケルで活性化されて緩衝液Ａで平衡化されたFast Flow
Chelating SpharoseＲ(Pharmacia) カラム（２．６×２
０cm）上にのせた。
【００７３】緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、それを同
緩衝液中０〜０．２Ｍのイミダゾールの勾配で溶出させ
た。酵素活性を有する分画を集めて、ＹＭ１０膜(Amico
n)で限外濾過により濃縮した。次いで濃縮溶液を緩衝液
Ａで平衡化させたSuperoseＲ１２ＨＲ１０／３０(Pharm
acia) カラム上にのせ、同緩衝液で溶出させた。酵素活
性を有する分画をＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより１２．５％で
分析したところ、分子量約３６０００ドルトンで純度９
０％以上のタンパク質の存在を示した。
【００７４】０．２Ｍ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．０の緩衝
液中基質として０．１２Ｍ Ｄ‐カルバミルパラヒドロ
キシフェニルグリシンを用いて測定された精製タンパク
質の比活性は互いに匹敵し、野生型酵素の場合と類似す
る値８〜９U/mgであった。
【００７５】単位という用語は、４０℃で１分間かけて
１μモルの基質を形質転換できる酵素の量に関する。
【００７６】例９変異体の酵素安定性の分析 例８に記載されたように得られた酵素溶液を０．２μｍ
のDynaGard（Microgon,Inc.)で無菌条件下濾過した。次
いで濾液の一部（０．２ml）をEppendorf 無菌試験管に
入れ、室温（２０〜２５℃）で維持した。規則的な時間
間隔で、残留酵素活性はｐＨ７．０の０．２Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液中でＤ‐Ｎ‐カルバミルパラヒドロキシ
フェニルグリシンを基質として用いてＨＰＬＣで形成さ
れたＤ‐パラヒドロキシフェニルグリシンを計量するこ
とにより４０℃で調べた。
【００７７】表１および図１は、ｈｒ（横座標）で表示
された時間に対して、野生型カルバミラーゼ（−・
−）、変異体Ｃｙｓ２４３Ａｌａ（−＋−）およびＣｙ
ｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａ（−＊−）の残留
活性（縦座標）がパーセンテージで示されている。
【００７８】
【表１】
【００７９】例１０野生型カルバミラーゼおよび変異体Ｃｙｓ２４３Ａｌａ
‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａ間の生産力の比較 同量（０．０６４単位／ml）の野生型カルバミラーゼお
よび変異カルバミラーゼＣｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２
７９Ａｌａを、ｐＨ７．０の０．２Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液１００ml中にＤ‐Ｎ‐カルバミルパラヒドロキシ
フェニルグリシン（２５．２mg/ml)を含有した４０℃に
サーモスタット調節される２つの装置に導入した。規則
的な時間間隔で、生産されたＤ‐パラヒドロキシフェニ
ルグリシンの量をＨＰＬＣにより調べた。得られた結果
は図２で示される通りであった。そこでは横座標はｈｒ
の時間であり、縦座標はμモル／mlとして表示されたア
ミノ酸の量である。（−・−）は野生型カルバミラーゼ
を、（−＋−）はカルバミラーゼの変異体をそれぞれ表
す。
【００８０】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：プライマー 配列 GAGCAGCATG GCCCCCTCCT CC 22
【００８１】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：プライマー 配列 CGCCACGATG GCCGAATGGC C 21
【００８２】配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：プライマー 配列 GCAGTTCCCG GGCGCGGTCG AGAT 24
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による変異体の酸素安定性の分析結果を
示す図面である。ここで、野生型カルバミラーゼ（−・
−）、変異体Ｃｙｓ２４３Ａｌａ（−＋−）およびＣｙ
ｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａ（−＊−）の残留
活性（縦座標）がパーセンテージで示されている。
【図２】野生型カルバミラーゼおよび変異体Ｃｙｓ２４
３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａ間の生産力の比較を示す
図である。ここで、（−・−）は野生型カルバミラーゼ
を、（−＋−）はカルバミラーゼの変異体をそれぞれ表
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 グイド、グランディ イタリー国セグラーテ、ノナ、ストラー ダ、４

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】野生型Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼのアミ
    ノ酸配列の２４３、２５０、および２７９位におけるシ
    ステインアミノ酸残基のうち少くとも一つが天然アミノ
    酸の群から選択される異なる残基で置換されてなること
    を特徴とする、Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの安定な変
    異体。
  2. 【請求項２】天然アミノ酸残基がＬ‐アラニンである、
    請求項１に記載のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異
    体。
  3. 【請求項３】２４３および２７９位のシステインアミノ
    酸残基がアミノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換されてなる、
    請求項１に記載のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異
    体。
  4. 【請求項４】請求項１に記載のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラ
    ーゼの変異体をコードする、ヌクレオチド配列。
  5. 【請求項５】２４３、２５０、および２７９位における
    システインのうち少くとも一つがアミノ酸残基Ｌ‐アラ
    ニンで置換されたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体
    をコードする、請求項４に記載のヌクレオチド配列。
  6. 【請求項６】２４３および２７９位双方のシステインが
    アミノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換されたＤ‐Ｎ‐α‐カ
    ルバミラーゼの変異体をコードする、請求項４に記載の
    ヌクレオチド配列。
  7. 【請求項７】２４３、２５０、および２７９位における
    システインアミノ酸残基のうち少くとも一つが天然アミ
    ノ酸の群から選択される異なる残基で置換されたＤ‐Ｎ
    ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードするヌクレオチ
    ド配列を含んでなる、発現プラスミド。
  8. 【請求項８】ヌクレオチド配列が、２４３、２５０、お
    よび２７９位におけるシステインのうち少くとも一つが
    アミノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換されたＤ‐Ｎ‐α‐カ
    ルバミラーゼの変異体をコードしている、請求項７に記
    載の発現プラスミド。
  9. 【請求項９】ヌクレオチド配列が、２４３および２７９
    位双方のシステインがアミノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換
    されたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードし
    ている、請求項８に記載の発現プラスミド。
  10. 【請求項１０】Ｄ‐ヒダントイナーゼ酵素をコードする
    遺伝子を含んでなる、請求項７〜９のいずれか一項に記
    載の発現プラスミド。
  11. 【請求項１１】Centraalbureau Voor Schimmelcultures
    に寄託され、寄託番号ＣＢＳ２０４．９４を受けてい
    る、請求項９に記載のプラスミドｐＳＭ６４５。
  12. 【請求項１２】２４３、２５０、および２７９位におけ
    るシステインアミノ酸残基のうち少くとも一つが天然ア
    ミノ酸の群から選択される異なる残基で置換されたＤ‐
    Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードするヌクレオ
    チド配列を含んでなるプラスミドで形質転換された枯草
    菌および大腸菌の群から選択される微生物。
  13. 【請求項１３】プラスミドが、２４３、２５０、および
    ２７９位におけるシステインのうち少くとも一つがアミ
    ノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換されたＤ‐Ｎ‐α‐カルバ
    ミラーゼの変異体をコードするヌクレオチド配列を含ん
    でなる、請求項１２に記載の微生物。
  14. 【請求項１４】プラスミドが、２４３および２７９位双
    方のシステインがアミノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換され
    たＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードするヌ
    クレオチド配列を含んでなるものである、請求項１２に
    記載の微生物。
  15. 【請求項１５】プラスミドがＤ‐ヒダントイナーゼをコ
    ードするヌクレオチド配列を含んでなるものである、請
    求項１２に記載の微生物。
  16. 【請求項１６】大腸菌ＳＭＣ３０５ ＣＢＳ２０４．９
    ４である、請求項１４に記載の微生物。
  17. 【請求項１７】請求項７に記載のプラスミドで形質転換
    された大腸菌および枯草菌から選択される微生物の培養
    と、こうして得られた変異体の分離および精製が行われ
    ることを特徴とする、請求項１に記載のＤ‐Ｎ‐α‐カ
    ルバミラーゼの変異体の製造方法。
  18. 【請求項１８】プラスミドが、２４３、２５０、および
    ２７９位におけるシステインのうち少くとも一つがアミ
    ノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換されたＤ‐Ｎ‐α‐カルバ
    ミラーゼの変異体をコードするヌクレオチド配列を含ん
    でなるものである、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】プラスミドが、２４３および２７９位双
    方のシステインがアミノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換され
    たＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードするヌ
    クレオチド配列を含んでなるものである、請求項１８に
    記載の方法。
  20. 【請求項２０】Ｄ‐Ｎ‐カルバミルアミノ酸または５‐
    置換ヒダントインのラセミ混合物の立体特異性変換によ
    るＤ‐α‐アミノ酸の製造方法であって、変換反応が、
    Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体および／またはＤ
    ‐ヒダントイナーゼおよびＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼ
    の変異体からなる酵素系を生産できる微生物の存在下で
    行われることを特徴とする、方法。
  21. 【請求項２１】変換反応がＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼ
    の変異体および／またはＤ‐ヒダントイナーゼおよびＤ
    ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体からなる酵素系を生
    産できる微生物から単位された上記変異体および／また
    は上記酵素系の存在下で行われる、請求項２０に記載の
    方法。
  22. 【請求項２２】Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体お
    よび／またはその変異体を含んだ酵素系が不溶性固体支
    持体上に固定されてなる、請求項２１に記載の方法。
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