JP2020535810A - 改変デカルボキシラーゼポリペプチドおよびβ−アラニンの調製におけるそれらの用途 - Google Patents
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Abstract
Description
1.概要
β−アラニンを製造するための現在の化学プロセスに存在する問題を解決するために、本発明は、高い生成物濃度、穏やかな反応条件、および環境に優しいことを特徴とする酵素変換を使用して、経済的かつ効率的な解決策を提供する。それは操作が簡単で、工業環境において容易にスケールアップされるため、良好な産業用途の展望を有する。
2.1 定義
別途明示的に定義されない限り、本開示で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。
本発明は、産業に関連する条件下でのL−アスパラギン酸のβ−アラニンへの変換を触媒するのに有用な改変デカルボキシラーゼのアミノ酸配列を提供する。本開示は、改変デカルボキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。野生型デカルボキシラーゼと比較して、本発明によって提供される改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、より良好な活性および安定性を有し、酵素に対するL−アスパラギン酸および/またはβ−アラニンの阻害を克服し、β−アラニンの調製のための本発明の改変ポリペプチドの使用は、より高い単位活性、より低いコストをもたらし、良好な産業用途の展望を有する。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載のデカルボキシラーゼ活性を有する改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、改変ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを生成するように遺伝子発現を制御する1つ以上の異種調節配列に連結することができる。改変デカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応する改変デカルボキシラーゼポリペプチドを発現させることができる。
改変デカルボキシラーゼは、デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを突然変異誘発および/または定方向進化に供することによって得ることができる。例示的な方向性進化技術は、「Biocatalysis for the Pharmaceutical Industry: Discovery,Development, and Manufacturing」(2009 John Wiley & Sons Asia(Pte)Ltd.ISBN:978−0−470−82314−9)に見ることができる。
別の態様において、本明細書に記載の改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、アミノ酸の脱炭酸を触媒してアミノ化合物を形成することができる。本開示はまた、本明細書に開示される改変デカルボキシラーゼポリペプチドを使用して、広範囲の化合物(I)またはその構造類似体を調製するプロセスも提供する。いくつかの実施形態において、改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、構造式(I)の化合物を調製するプロセスに使用することができ、
Corynebacterium glutamicumに由来する野生型デカルボキシラーゼのアミノ酸配列はNCBIから調達することができ、その後、対応する核酸が、当該技術分野における従来技術を使用して供給業者によって合成され、発現ベクターpACYC−Duet−1にクローニングされた。組換え発現プラスミドを、42℃および90秒間の熱ショックの条件下でE.coli BL21(DE3)コンピテント細胞に形質転換した。クロラムフェニコールを含むLB寒天プレートに形質転換溶液を播種し、次いで、37℃で一晩インキュベートした。組換え形質転換体を得た。
本発明の湿細胞調製ステップは以下の通りである:実施例1で得た組換えE.coli BL21(DE3)を、250mL三角フラスコ内のクロラムフェニコールを含む50mLのLB培地(ペプトン10g/L、酵母エキス粉末5g/L、塩素化ナトリウム10g/L、pH7.0±0.2、25℃)に接種し、次いで、30℃、250rpmで一晩振盪した。継代培養液のOD600が2に達したとき、振盪インキュベーターにおいて、250mLのTB培地(トリプトン12g/L、酵母エキス24g/L、リン酸水素二ナトリウム9.4g/L、リン酸水素二カリウム2.2g/L、pH7.2±0.2、30℃)を含む1000mLフラスコに培養物を30℃、250rpmで継代培養した、継代培養液のOD600が0.6〜0.8に達したとき、誘導剤としてIPTGを最終濃度1mMで加えた。30℃で20時間誘導した後、培養液を遠心分離した(8000rpm、10分):遠心分離後に上清を廃棄し、細胞ペレットを回収して湿細胞を得た。得られた湿細胞は、反応に直接使用することができるか、または使用のために−20℃の冷蔵庫に入れることができる。
HPLC分析方法:分析カラムはChilex−3126 30mm×4.6um、移動相は3mM CuSO4、流量は1.2mL/分、カラム温度は45℃、検出波長は230nm、分析時間は4分である。β−アラニンの滞留時間は1.45分、L−アスパラギン酸の滞留時間は2.5分である。
ここでは、Quikchangeキット(供給業者:Agilent)を好ましく使用した。突然変異誘発プライマーの配列設計は、キットの指示に従って行った。次に、単一の残基位置を有する飽和変異体ライブラリーの構築を一例として説明する。PCRシステムは、10μlの5×バッファー、1μlの10mM dNTP、1μlのプラスミドDNAテンプレート(50ng/μl)、0.75μl(10uM)の上流および下流プライマー、0.5μlの高忠実度酵素、ならびに36μlのddH2Oからなり、PCRプライマーは変異位置にNNKコドンを有する。PCR増幅ステップ:(1)98℃で3分間の前変性、(2)98℃で10秒間の変性、(3)72℃で3分間のアニーリングおよび伸長、(2)〜(3)のステップを25回繰り返し、(5)72℃で10分間の伸長、(6)4℃に冷却し、2μlのDpnIをPCR産物に加え、37℃で一晩消化させることによりプラスミドテンプレートを除去した。消化されたPCR産物をE.coli BL21(DE3)コンピテント細胞に形質転換し、クロラムフェニコールを含むLB寒天プレートに播種して、標的残基位置の飽和変異体ライブラリーを得た。
変異体酵素ライブラリーのコロニーを寒天プレートから採取し、96ウェルの浅いプレートにクロラムフェニコールを含むLB培地に接種し(ウェル当たり200μlのLB培地)、180rpm、湿度80%、30℃で一晩振盪機に入れ、18〜20時間培養した。培養液のOD600が2〜3に達したとき、培養液20μlを96ウェルの浅いプレートから取り出し、96ウェルの深いウェルプレート中にクロラムフェニコールを含むTB培地に接種し(ウェルあたりTB培地400μl)、250rpmの振盪機に入れ、30℃および湿度80%でインキュベートした。培養液のOD600が0.6〜0.8に達したとき、誘導剤としてIPTGを最終濃度1mMで加え、250rpm、湿度80%、30℃で一晩(18〜20時間)、振盪機内で発現を行った。一晩の発現が終了してから、培養物を4000rpmで10分間遠心分離して、細胞ペレット(すなわち湿細胞)を得た。湿細胞を、使用のために−20℃の冷凍庫に入れた。
配列番号360のポリペプチドを発現する5gの湿細胞を水で再懸濁して、最終体積150mLとした。50gのL−アスパラギン酸を300mLの純水に加え、そのpHをアンモニアで6.0〜7.0に調整し、その最終体積を水で350mLに調整した。このL−アスパラギン酸の溶液に、上記で調製した150mLの細胞懸濁液を加えて反応を開始し、反応中に21%リン酸溶液を加えて、反応溶液のpHを6.0〜7.0に制御した。反応温度は、40℃〜50℃に制御した。24時間の反応後、L−アスパラギン酸のβ−アラニンへの変換率は≧95%であった。
200g/LのL−アスパラギン酸および200g/Lのβ−アラニンの混合溶液を調製し、その調製中にアンモニアおよび/または塩酸で溶液のpHを6に調整し、次いで、後に使用するために4℃の冷蔵庫に入れた。実施例5に示した手順と同様に、96ウェルプレート内の湿細胞を水に再懸濁し、80μlの細胞懸濁液を新しい深いウェルプレートに入れた。このプレートの各ウェルに、上記で調製したL−アスパラギン酸とβ−アラニンの混合溶液を100μl加えた。反応系の緩衝液はpH6の0.3M PBSであり、反応溶液の総体積は200μlであった。最後に、PBS緩衝液を反応物に加えて、pH6の0.3M PBSで200μl/ウェルの総反応体積とした。次いで、50℃の振盪機で、250rpmで16時間反応を行った後、LC/MSまたはHPLC分析を行って生成物の形成を検出した。
標的デカルボキシラーゼポリペプチドを担持する発現プラスミドを含むE.coli BL21(DE3)の単一微生物コロニーを、30μg/mLのクロラムフェニコールを含む50mLのLBブロス(5.0g/L酵母エキスLP0021、10g/LトリプトンLP0042、10g/L塩化ナトリウム)に接種した。30℃の振盪機で、250rpmで振盪しながら、細胞を一晩(少なくとも16時間)培養した。
10g/LのL−グルタミン酸溶液を調製し、その調製中にKOHでpHを6に調整した。配列番号164のポリペプチドを発現する200mgの湿細胞を反応フラスコに加え、上記で調製したL−グルタミン酸溶液2.5mLを反応フラスコに加え、純水を全体に加えて反応液の総体積を5.0mLとした。反応は、温度30℃、撹拌速度400rpmで進行した。20時間の反応後、95℃で10分間加熱して反応を停止した。次いで、反応物のアリコートを0.3%塩酸で検出濃度まで希釈した後、HPLC分析を行った。L−グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率は≧70%であった。HPLC分析法は以下の通りであった。カラム:Elite−NH2 150*4.6mm、移動相:[アセトニトリル:pH3.5=65:35の0.02Mリン酸二水素カリウム溶液]、カラム温度30℃、検出波長205nm、流量1.5mL/分。
Claims (21)
- 適切な反応条件下で、L−アスパラギン酸の脱炭酸を触媒し、配列番号2よりも良好な活性および/または安定性を有するβ−アラニンを生成することができる、配列番号2に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変デカルボキシラーゼポリペプチド。
- 前記適切な反応条件は、約5g/L〜約400g/LのL−アスパラギン酸、pH約4.0〜8.0、温度約10〜60℃を含む、請求項1に記載のデカルボキシラーゼポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列は、2、3、4、6、8、15、18、21、29、30、33、34、39、40、45、46、53、64、67、68、70、80、81、91、92、93、99、100、102、103、104、106、109、110、111、113、114、115、116、117、118、119、121、122、124、125、126、127、128、130、132、133、135、および136から選択される1つ以上のアミノ酸残基に配列番号2の配列とは異なるアミノ酸配列を含み、番号付けは配列番号2に言及し、前記ポリペプチドはデカルボキシラーゼ活性を有する、請求項1または2に記載のデカルボキシラーゼポリペプチド。
- 前記デカルボキシラーゼのアミノ酸配列は、以下のアミノ酸残基の1つ以上を含み、
X2はFもしくはSであり、
X3はYであり、
X4はSであり、
X6はMであり、
X8はGであり、
X15はTもしくはIであり、
X18はSもしくはVであり、
X21はHもしくはNであり、
X29はSもしくはTであり、
X30はGであり、
X33はIであり、
X34はL、Y、もしくはMであり、
X39はL、R、もしくはMであり、
X40はIもしくはVであり、
X45はQ、L、もしくはPであり、
X46はCもしくはVであり、
X53はDもしくはEであり、
X64はWであり、
X67はNもしくはFであり、
X68はA、K、RもしくはEであり、
X70はKであり、
X80はFであり、
X81はM、V、I、L、もしくはAであり、
X91はYであり、
X92はLもしくはVであり、
X93はVであり、
X99はN、T、DもしくはSであり、
X100はL、F、もしくはWであり、
X102はT、K、LもしくはQであり、
X103はAであり、
X104はY、S、もしくはNであり、
X106はLもしくはIであり、
X109はTであり、
X110はL、M、もしくはSであり、
X111はA、QもしくはRであり、
X113はGであり、
X114はS、P、N、WもしくはVであり、
X115はC、FもしくはWであり、
X116はN、RもしくはVであり、
X117はYもしくはFであり、
X118はRもしくはCであり、
X119はP、A、VもしくはLであり、
X121はG、S、T、CもしくはIであり、
X122はGもしくはSであり、
X124はD、G、HもしくはTであり、
X125はG、DもしくはIであり、
X126はSであり、
X127はE、R、D、I、S、YもしくはFであり、
X128はKもしくはLであり、
X130はIであり、
X132はYもしくはPであり、
X133はT、D、HもしくはVであり、
X135はN、HもしくはQであるか、または
X136はE、S、L、RもしくはFであり、
番号付けは配列番号2に言及する、請求項3記載のデカルボキシラーゼポリペプチド。 - 以下の(a)または(b)のポリペプチドである、改変ポリペプチド:
(a)配列番号:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、および390からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b)(i)(a)に列挙されるアミノ酸配列の1つに対する少なくとも80%の配列同一性、および(ii)(a)に列挙される前記1つのアミノ酸配列と比較して1つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、付加、または挿入、を有するアミノ酸配列を含む、デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド。 - 適切な反応条件下で、L−アスパラギン酸を脱炭酸し、配列番号2のものよりも高い活性および/または安定性でβ−アラニンを生成することができる、改変デカルボキシラーゼポリペプチド。
- 化学結合または物理吸着法によって固体材料に固定化されたポリペプチドであって、請求項1〜6のいずれか一項に記載のデカルボキシラーゼポリペプチドから選択される、ポリペプチド。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、および389である、請求項8に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項8または9に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- プラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスベクターを含む、請求項10に記載の発現ベクター。
- 請求項10〜11のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、好ましくはE.coliである、宿主細胞。
- 請求項12に記載の宿主細胞を培養し、培養物からデカルボキシラーゼポリペプチドを得るステップを含む、デカルボキシラーゼポリペプチドを調製する方法。
- 請求項12に記載の宿主細胞を培養することによって、または請求項13に記載の方法によって得られるデカルボキシラーゼ触媒であって、前記デカルボキシラーゼ触媒は、デカルボキシラーゼポリペプチドを含む細胞もしくは培養液、またはそれで処理された物品を含み、前記物品は、形質転換細胞の培養から得られる抽出物、前記抽出物からデカルボキシラーゼを単離もしくは精製することによって得られる単離生成物、または形質転換細胞、その抽出物、もしくは前記抽出物の単離生成物を固定化することによって得られる固定化生成物を指す、デカルボキシラーゼ触媒。
- 前記反応溶媒は、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはジメチルホルムアミド(DMF)を含む、請求項15〜17のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記反応条件は、10℃〜60℃の温度を含む、請求項15〜18のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記反応条件は、pH4.0〜pH8.0を含む、請求項15〜19のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記基質は、5g/L〜400g/Lの負荷で存在する、請求項15〜20のいずれか一項に記載のプロセス。
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