KR101497333B1 - 탈라세믹화를 이용한 광학 활성 아미노산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탈라세믹화를 이용한 비대칭 광학 활성 아미노산의 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로는 본 발명에 따른 광학 활성 아미노산의 제조방법은 탈라세믹화를 이용한 광학 활성 아미노산의 제조방법이며, 특히 효소적 탈라세믹화를 이용하여 광학적으로 순수한 L-형 아미노산의 생산 방법에 관한 발명이다. 본 발명에 따른 아미노산의 제조방법에 의해 L-형 아미노산을 생산하게 되면, 오메가트랜스아미나제를 이용한 광학 활성 아미노산의 제조방법에 사용되던 고가의 α-케토산을 기질로 제공하지 않아도 되므로, 최종 수득되는 L-형 아미노산의 생산 단가를 크게 절감시키는 효과가 있다. 또한 상기 최종 수득되는 L-형 아미노산의 생산 단가를 절감하면서도, 높은 순도의 L-형 아미노산의 제공이 가능하다. 또한 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈에 의해 D-형 아미노산도 부수적으로 생산된다.

Description

탈라세믹화를 이용한 광학 활성 아미노산의 제조방법{Preparation method of optically active amino acids using deracemization}

본 발명은 탈라세믹화를 이용한 비대칭 광학 활성 아미노산의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 생체 촉매를 통한 탈라세믹화를 이용한 광학 활성 아미노산의 제조방법에 관한 것이다.

광학 활성 아미노산은 의약, 식품, 농업 및 화학 산업 등 다양한 분야에 사용되는 중요한 화합물이다. 천연 아미노산의 경우에는 발효 공정 등을 통해 간단히 생산해 낼 수 있지만, 비천연 아미노산의 경우에는 생체 촉매 또는 화학촉매를 이용하여 생산해 낼 수 밖에 없다. 비천연 아미노산을 화학촉매로 생산하는 경우에 사용되는 촉매는 그 비용이 매우 고가여서 비천연 아미노산의 생산 단가를 높이는 요인이 되는 문제점이 있다. 따라서 생체 촉매를 이용하여 비천연아미노산을 생산하는 방법이 주로 사용된다.

특히 높은 전환률, 우수한 거울상 선택성과 높은 안정성을 가지며 외부 보조인자를 요하지 않는 오메가 트랜스아미나제는 광학적으로 순수한 아미노산의 수득을 가능하게 하는 생체 촉매로서 각광 받고 있다.

하지만 이러한 오메가 트랜스아미나제를 생체 촉매로 이용하는 경우에는 필수적으로 α-케토산을 사용하여야 하며, 이때 사용되는 α-케토산이 고가여서 최종 수득되는 광학 활성 아미노산의 생산 단가를 상승시킨다는 문제점이 있었다. 본 발명과 관련이 있는 선행문헌은 하기와 같다.

대한민국 등록특허 제10-0870227호

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 광학 활성 아미노산의 생산 단가를 절감하기 위해 아미노산의 라세믹 혼합물을 순수한 광학 활성 아미노산으로 전환하는 제조방법을 제공하는 것이며, 더욱 구체적으로는 생산 단가를 크게 감소시키면서 광학적 순도가 높은 아미노산의 제조방법을 제공하는 것이다.

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 L-형 아미노산의 제조방법은

1) 기질인 라세믹 아미노산, 아미노수용체 및 아미노공여체를

효소인 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈 및 (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈에 제공하는 단계;

2) 상기 1)단계에서 제공된 기질 중

라세믹 아미노산 및 아미노수용체가 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈와 반응하여 D-형 아미노산 및 α-케토산을 생산하는 단계; 및

3) 상기 α-케토산이 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 반응하여 L-형 아미노산을 생산하는 단계;

를 포함한다.

또한 상기 2)단계에서 상기 α-케토산의 생산은 상기 라세믹 아미노산 중 D-형 아미노산으로부터 아미노수용체에 전달 된 아마노기에 의해 생산된 것을 특징으로 한다.

또한 상기 라세믹 아미노산은 라세믹 알라닌, 라세믹 호모알라닌, 라세믹 세린, 라세믹 노르발린, 라세믹 노르류신 및 라세믹 류신으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 아미노수용체는 α-케토글루타레이트, 아세토아세테이트, 페닐파이루베이트, 페닐글라이옥실에이트, α-케토아이소카프로에이트, α-케토아이소발러레이트로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 아미노공여체는 아이소프로필아민, 부틸아민, 메틸벤질아민, 에틸벤질아민, 아미노인단, 아미노테트라린, 벤질아민 및 이들의 유도체로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 제조방법에 의해 제조되는 L-형 아미노산은 L-형 알라닌, L-형 호모알라닌, L-형 세린, L-형 노르발린, L-형 노르류신 및 L-형 류신으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 오크로박트럼앤트로피(Ochrobactrumanthropi)에서 유래된 것으로서, 서열번호 1의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 효소인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 파라고쿠스덴이트리피컨스(Paracoccusdenitrificans)로부터 유래된 것으로서, 서열번호 2의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 효소인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈는 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus)로부터 유래된 것으로서, 서열번호 3의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 효소인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 L-형 아미노산의 제조방법에 의해 생산된 L-형 아미노산의 순도(ee)는 99% 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 리간드는 상기 제조방법에 의해 제조된 상기 L-형 아미노산을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 의약품은 상기 제조방법에 의해 제조된 상기 L-형 아미노산을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 생리활성물질은 상기 제조방법에 의해 제조된 상기 L-형 아미노산을 포함한다.

본 발명에 따른 광학 활성 아미노산의 제조방법은 탈라세믹화를 이용한 광학 활성 아미노산의 제조방법이며, 특히 탈라세믹화와 효소적 방법을 이용하여 광학적으로 순수한 L-형 아미노산의 비대칭 합성 방법에 관한 발명이다.

본 발명에 따른 아미노산의 제조방법에 의해 L-형 아미노산을 생산하게 되면, 오메가 트랜스아미나제를 이용한 광학 활성 아미노산의 제조방법에 사용되던 고가의 α-케토산을 기질로 제공하지 않아도 되므로, 최종 수득되는 L-형 아미노산의 생산 단가를 크게 절감시키는 효과가 있다.

또한 상기 최종 수득되는 L-형 아미노산의 생산 단가를 절감하면서도, 높은 순도의 L-형 아미노산의 제공이 가능하다.

도 1은 L-형 아미노산에 의한 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈의 활성 저해 여부를 보여주는 그래프이다.
도 2는 아이소프로필아민을 본 발명의 아미노 공여체로 사용하는 경우 α-케토산으로부터 L-형 아미노산으로의 전환율을 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 일실시예에 의할 경우 라세믹 호모알라닌의 L-형 호모알라닌으로의 전환을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 일실시예에 의할 경우 기질로 제공되는 α-케토글루타레이트 및 아이소프로필아민의 변화량과 L-형 아미노산 이외에 또 다른 최종 생성물인 D-형 글루타메이트의 생산량을 보여주는 그래프이다.

이에 본 발명자들은 생산 단가를 절감시키는 광학 활성 아미노산의 제조방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 탈라세믹화를 이용한 비대칭 광학 활성 아미노산의 제조방법을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

일반적으로 광학적으로 순수한 아미노산을 생산하는 방법은 동역학적 분할, 비대칭합성(asymmetric synthesis), 탈라세믹화(deracemization) 등의 방법을 통해 생산될 수 있다. 이중 상기 탈라세믹화를 통해 광학적으로 순수한 L-형 아미노산의 생산은 기질로 제공된 라세믹 아미노산의 D-형 아미노산이 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈에 의해 α-케토산으로 전환되며 이 α-케토산은 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈의 반응에 의해 L-형 아미노산으로 전환된다. 이를 통해 최종적으로 라세믹 아미노산이 순수한 L-형 아미노산으로 생산될 수 있다. 본 발명은 이러한 L-형 아미노산의 생산에 사용되는 고가의 α-케토산을 기질로 제공하지 않고 중간체로 생성되게 하여 L-형 아미노산의 생산 단가를 낮추면서도 광학적으로 순수한 L-형 아미노산을 생산하는 방법에 관한 발명이다.

구체적으로 본 발명에 따른 L-형 아미노산의 제조방법은

1) 기질인 라세믹 아미노산, 아미노수용체 및 아미노 공여체를

효소인 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈 및 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 제공하는 단계와,

2) 상기 1)단계에서 제공된 기질 중

라세믹 아미노산 및 아미노수용체가 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈와 반응하여 D-형 아미노산(예: α-케토글루타레이트가 아미노수용체로 사용될 경우에는 D-형 그루타메이트일 수 있다.) 및 α-케토산을 생산하는 단계, 및

3) 상기 α-케토산이 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 반응하여 L-형 아미노산을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 L-형 아미노산의 생산방법은 하기 반응식 1로 나타낼 수 있다.

[반응식 1]

(상기 R1은 각각 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 하이드록시메틸 및 2-메틸프로필로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 2-메틸프로필, 카르복실메틸, 2-카르복실에틸일 수 있다. R3 와 R4는 각각 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 2-메틸프로필, 페닐, 벤질로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다)

상기 화학식 1로 표시되는 반응식과 같이 본 발명은 기질로 제공된 라세믹 아미노산이 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈에 의하여 D-형 아미노산의 아미노기가 아미노수용체(예: α-케토글루타레이트)에 전달되며 그 결과 D-형 아미노산으로부터 중간체인 α-케토산을 생산할 수 있다. 이렇게 중간체로 생산된 α-케토산이 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 반응하여 L-형 아미노산을 생산함으로써, 본 발명에서 최종 수득하려는 목적물인 L-형 아미노산의 최종적인 수득이 가능하다.

즉, 상기 반응식 1에 의하면 α-케토산이 기질로 제공되지 않고 중간체로 생산되게 하는데, 이는 상기 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈에 의해 라세믹 아미노산중의 D-형 아미노산과 아미노수용체가 아미노기 전달반응을 하고, 이를 통해 α-케토산이 중간체로서 생성될 수 있다.

그러므로 상기 2)단계에서 상기 α-케토산의 생산은 상기 라세믹 아미노산 중 D-형 아미노산으로부터 아미노수용체에 아미노기를 전달함으로서 생산된 것이다.

또한 상기 α-케토산이 중간체로 생성되는 과정에서 라세믹 아미노산 중의 D-형 아미노산이 모두 소진되며, 결과적으로는 이를 통해 상기 라세믹 아미노산은 L-형 아미노산으로 탈라세믹화되는 것일 수 있다.

결국 본 발명에 따른 상기 반응에서 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈 효소는 상기 라세믹 아미노산 중 D-아미노산의 아미노기 전달반응을 수행하는 효소 촉매일 수 있으며, 또한 (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈는 중간체로 생산된 α-케토산과 반응하여 L-형 아미노산으로의 전환을 가능하게 하는 효소 촉매일 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 반응식에 의해 최종 생성되는 생성물은 아미노수용체(예: α-케토글루타레이트)가 D-형 아미노산과 반응하여 α-케토산이 생성될 때 생산되는 D-글루타메이트가 상기 반응에 참여하지 않고 최종 수득되는 생성물일 수 있으며, 또한 L-형 아미노산이 최종 생성물이 될 수 있다. 이를 통해 본 발명이 목적하는 L-형 아미노산을 최종 생산할 수 있다.

본 발명에 의하면 상기 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈/(S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 의해 탈라세믹화한 L-형 아미노산뿐만 아니라, D-형 아미노산 트랜스아미네이즈에 의해 아미노수용체로부터 광학 변환된 D-형 아미노산(이것은 탈라세믹화한 L-형 아미노산과 다른 종류의 아미노산임)을 생산할 수 있어 최종 수득물은 상기 L-형 아미노산 및 이와는 다른 종류의 D-형 아미노산 두 가지가 될 수 있다.

상기 1)단계에서 기질로 제공되는 물질 중 라세믹 아미노산은 본 발명에 제공되는 기질인 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈와 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 대해 활성을 지니는 아미노산이라면 특별한 제한 없이 기질로 제공될 수 있으며, 바람직하게는 상기 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈와 오메가 트랜스아미네이즈에 대해 활성을 지니는 라세믹 아미노산으로서 알라닌, 세린, 호모알라닌, 노르발린, 노르류신 및 류신 등으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 일 수 있다.

상기 1)단계에서 기질로 제공되는 아미노수용체 중 α-케토글루타레이트는 본 발명에 따른 상기 반응에서 아미노수용체로서 작용할 수 있으며, 이 과정에서 상기 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈에 대해서는 활성을 지니고 있으면서도 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 대해서는 활성을 보이지 않아야 하는데, 상기 α-케토글루타레이트는 이에 대한 활성이 존재하지 않아 본 발명에 따른 상기 반응의 바람직한 기질로 제공될 수 있다. 또한 α-케토글루타레이트 이외에도 상기한 성질을 만족시키는 아세토아세테이트, 페닐파이루베이트, 페닐글라이옥실에이트, α-케토아이소카프로에이트, α-케토아이소발러레이트로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상이 사용될 수 있다.

상기 1)단계에서 기질로 제공되는 물질 중 아미노공여체는 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈에 대하여는 활성이 존재하지 않으면서 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 대해 활성이 존재하면서 아미노기를 제공하는 것이어야 하며, 바람직하게는 아이소프로필아민, 부틸아민, 메틸벤질아민, 에틸벤질아민, 아미노인단, 아미노테트라린, 벤질아민 및 이들의 유도체로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따라 최종 생산되는 L-형 아미노산은 바람직하게는 L-형 알라닌, L-형 호모알라닌, L-형 세린, L-형 노르발린, L-형 노르류신 및 L-형 류신 등으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 L-형 아미노산일 수 있다.

상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 α-케토산과 반응하여 L-형 아미노산을 생산하는 것이라면 특별한 제한 없이 사용될 수 있는 것이지만, 본 발명에서는 오크로박트럼앤트로피(Ochrobactrumanthropi)에서 유래된 것으로서, 서열번호 1의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 효소를 이용하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명에 따른 상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 파라고쿠스덴이트리피컨스(Paracoccusdenitrificans)로부터 유래된 것으로서, 서열번호 2의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 효소를 이용하는 것이 바람직하다.

상기 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈는 라세믹 아미노산에서 D-형 아미노산만을 α-케토산으로 전환하는 것이라면 특별한 제한 없이 사용될 수 있는 것이지만, 본 발명에서는 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus)로부터 유래된 것으로서, 서열번호 3의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 효소를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 생산된 L-형 아미노산의 순도(ee)는 99%이상일 수 있다.

그러므로 본 발명에 따른 L-형 아미노산의 생산방법은 고가의 α-케토산을 기질로 제공하지 않고 중간체로 이를 생성되게 하여, L-형 아미노산의 전체 생산 단가를 낮출 수 있음과 동시에 광학적으로 순도가 높은 L-형 아미노산의 생산을 가능하게 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 리간드, 의약품 및 생리활성물질은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 생산된 순도 99%이상의 L-형 아미노산을 포함하는 리간드, 의약품 및 생리활성물질로서 당업계에 적용되는 공지의 리간드, 의약품 및 생리활성물질이 모두 포함될 수 있다. 또한 상기 리간드, 의약품 및 생리활성물질은 당업계에 적용되는 모든 공지의 방법으로 제조되는 리간드, 의약품 및 생리활성물질이 모두 포함될 수 있다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 오크로박트럼앤트로피( Ochrobactrumanthropi )로부터 (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈를 암호화하는 재조합 DNA 의 제조

Ochrobactrumanthropi을 LB-브로쓰(펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, pH 7) 중에서 37 ℃ 12 시간 배양한 후 싱글 콜로니로부터 오메가트랜스아미네이즈를 발현하는 유전자를 합성하였으며, 이를 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nde1, Xho1 제한효소와 라이게이즈를 이용하여 삽입하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.

실시예 2: 파라고쿠스덴이트리피컨스( Paracoccusdenitrificans )로부터 (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈를 암호화하는 재조합 DNA 의 제조

Paracoccusdenitrificans을 LB-브로쓰(펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, pH 7) 중에서 37 ℃ 12 시간 배양한 후 싱글 콜로니로부터 오메가 트랜스아미네이즈를 발현하는 유전자를 합성하였으며, 이를 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nde1, Xho1 제한효소와 라이게이즈를 이용하여 삽입하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 2와 같다.

실시예 3: 바실러스 스패리쿠스 ( Bacillus sphaericus ) 유래의 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈를 암호화하는 재조합 DNA 의 제조

Bacillus sphaericus 유래의 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈 유전자 서열(NCBI gene ID: 849138)을 pGEM-T vector에 합성하여 플라스미드로부터 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈를 발현하는 유전자를 합성 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nco1, Xho1 제한효소를 이용하여 클로닝하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같다.

실시예 4: 형질 전환 균주로부터 효소 과발현 및 정제

상기 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3에 의해 수득된 플라스미드를 사용하여 E.coli BL21(DE3)를 형질 전환시켰다. 가나마이신을 함유하는 LB-보로쓰 300 mL에서 배양시킨 후, IPTG(최종 농도 1 mM)를 현탁도(OD) 0.5에서 첨가하였다.

이후 6 시간 이상 37 ℃에서 배양한 후 10000×g 4 ℃ 에서 20 분간 원심분리하여 세균세포를 얻어 15 mL 리서스펜션 버퍼(50 mMTris-HCl, 50 mM 염화칼슘, 1 mM β-mercaptoethanol, 0.1 mM PMSF, 20 μM PLP, pH 7)로 현탁시켰다. 이를 빙냉시키면서 초음파 처리를 한 다음 17000×g 4 ℃에서 30분간 원심 분리하여 상층액을 조추출액으로 수득하였다. 이 조추출액을 친화성 크로마토그래피를 이용하여 원하는 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈를 정제하여 효소 용액을 얻었다.

실시예 5: 정제된 효소의 활성측정 및 농도결정

효소의 활성 및 농도 결정은 37 ℃ 에서 50 mM potassium phosphate 버퍼 pH 7 에서 수행되었다. 활성 측정을 위한 효소반응은 반응시작 10분 후 반응용액 100 μl에 아세도니트릴 600 μl를 넣어 멈추었다. 상기 실시예 4에서 정제된 1 unit의 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈 활성은 20 mMD-알라닌과 2-옥소부티레이트 에서 1분 동안 파이루베이트 1 μmole이 생기는 것을 의미한다. 상기 실시예 4에서 정제된 1 unit의 오메가 트랜스아미네이즈 활성은 20 mM 파이루베이트, 20 mM (S)-α-메틸벤질아민 에서 1분동안 1 μmole의 아세토페논이 생기는 것을 의미한다. 활성 측정시 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈 경우는 파이루베이트를, 오메가 트랜스아미네이즈의 경우는 아세토페논을 HPLC를 이용하여 측정하였다.

실시예 6: 정제한 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈의 케토산에 대한 기질 특이성 및 케토산에 의해 전환된 광학 활성 아미노산

상기 실시예 4에서 정제된 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈를 사용하여 하기 [표 1]에 나타낸 각종 케토산과 D-형 알라닌 또는 D-형 호모알라닌을 기질로 하여 반응을 수행한다. 20 mM 케토산, 20 mM D-형 알라닌 또는 D-형 호모알라닌 및 50 mM 인산칼륨 (pH 7)에서 0.1 U/ml 의 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈에 의한 반응을 37 ℃에서 10 분간 반응시키고 생성된 케토산(파이루베이트 혹은 2-옥소부티레이트)의 생성량을 측정하였다. D-형 아미노산 트랜스아미네이즈는 2-옥소부티레이트, β-하이드록시파이루베이트, 머캅토파이루베이트, 플루오로파이루베이트, 3-메틸-2-옥소부티레이트, 2-옥소페타노에이트, 4-메틸-2옥소펜타노에이트, 2-케토헥사노에이트, α-케토글루타레이트, 페닐파이루베이트, 파이루베이트 등의 케토산에 대하여 활성이 존재함을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다.

실시예 7: 정제한 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈의 아미노산에 대한 기질특이성 및 케토산에 의해 전환된 광학 활성 아미노산

상기 실시예 4에서 정제된 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈를 사용하여 하기 표 5에 나타낸 각종 아미노산과 파이루베이트 또는 2-옥소부티레이트를 기질로 하여 반응을 수행한다. 20 mM 아미노산, 10 mM파이루베이트 또는 2-옥소부티레이트 및 50 mM 인산칼륨 (pH 7)에서 0.1 U/ml 의 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈에 의한 반응을 37 ℃에서 1 시간 반응시킨 후, 생산된 D-형 알라닌 또는 D-형 호모알라닌의 생산량을 측정하였다. D-형 아미노산 트랜스아미네이즈는 호모알라닌, 세린, 노르발린, 류신, 노르류신, 글루타메이트, 아스파레이트, 페닐알라닌, 알라닌 등의 아미노산에 대하여 활성이 존재함을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 6 및 표 7에 나타내었다.

실시예 8: 정제한 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈의 L-형 아미노산 농도에 따른 활성 저하 여부

상기 실시예 4에서 정제된 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈를 사용하여 라세믹 아미노산의 계속적인 디라세마이제이션을 위해서는 최종 생산되는 L-형 아미노산에 의한 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈 효소의 활성에 영향을 미치지 않아야 한다. 그 이유는 최종 생산되는 L-형 아미노산에 의해 그 활성이 저하된다면 계속적인 반응을 이끌어내기 어렵기 때문이다. 20 mMD-호모알라닌, 20 Mm 파이루베이트 및 50 mM 인산칼륨 (pH 7)에서 L-형 호모알라닌의 농도를 각각 0, 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20 mM로 하여 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈의 활성을 확인하기 위하여 37 ℃에서 10분간 반응시키고 2-옥소부티레이트의 생산량을 측정하였다. 이 결과 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈는 최종 생산되는 L-형 아미노산에 의하여 활성이 저하되지 않는 것을 확인하였다. 그 결과는 하기 도 1에 나타내었다.

실시예 9: 정제한 오메가 트랜스아미네이즈의 케토산에 대한 기질특이성 및 케토산에 의해 전환된 광학 활성 아미노산

상기 실시예 4에서 정제된 O.anthropi와 P.denitrificans 유래의 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈의 케토산에 대한 기질특이성을 조사하였다. 20 mM 케토산, 20 mM (S)-α-메틸벤질아민 및 50 mM 인산칼륨 (pH 7)에서 오메가 트랜스아미네이즈에 의한 반응을 37 ℃에서 10 분간 반응시키고 생성된 아세토페논의 생산량을 측정하였다. 오메가 트랜스아미네이즈는 글라이옥실레이트, 파이루베이트, 2-옥소부티레이트, β-하이드록시파이루베이트, 플루오로파이루베이트, 2-옥소펜타노에이트, 4-메틸-2옥소펜타노에이트(P.denitrifican), 2-케토헥사노에이트 등의 케토산에 대하여 활성이 존재함을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

상기 표 8에서 확인할 수 있는 바와 같이 α-케토글루타레이트는 오메가 트랜스아미네이즈에 대해서는 활성이 존재하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 상기 표 4 및 표 7에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 α-케토글루타레이트는 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈에 대해서는 활성이 존재하는 것을 확인할 수 있어 본 발명에서 아미노 수용체로 작용하는 바람직한 일실시예에 해당할 수 있음을 확인하였다.

실시예 10: 정제한 오메가 트랜스아미네이즈의 아민에 대한 기질특이성 및 파이루베이트로부터 전환된 L-형 알라닌

상기 실시예 4에서 정제된 O.anthropi와 P.denitrificans 유래의 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈의 아민에 대한 기질특이성을 조사하였다. 20 mM 아민, 20 mM(S)-아민(40mM라세믹 sec-부틸아민) 및 50 mM 인산칼륨 (pH 7)에서 오메가 트랜스아미네이즈에 의한 반응을 37 ℃에서 10 분간 반응시키고 생성된 L-형 알라닌의 생산량을 측정하였다. 오메가 트랜스아미네이즈는 (S)-α-메틸벤질아민, 아이소프로필, sec-부틸아민(O.anthropi) 등의 아민에 대하여 활성이 존재함을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

실험예

< 실험예 1: 정제한 오메가 트랜스아미네이즈가 반응하고 아미노공여체로써 아이소프로필아민을 사용한 경우 케토산으로부터 고농도의 L-형 아미노산의 생산 >

상기 실시예 10에서 오메가 트랜스아미네이즈의 아이소프로필아민에 대한 활성을 확인한 후 실시예 4에서 정제된 오메가 트랜스아미네이즈를 이용하게 되면 케토산으로부터 고농도의 L-형 아미노산이 생산됨을 확인하는 실험을 수행하였다. 100 mM 2-옥소부티레이트, 100 mM 아이소프로필아민 및 50 mM 인산칼륨 (pH 7)에서 1U/ml 오메가 트랜스아미네이즈에 의한 반응을 37 ℃에서 반응시키고 시간에 따라 생산된 L-형 호모알라닌의 생산량을 측정하였다. 아이소프로필아민을 아미노공여체로 사용하고 정제한 오메가 트랜스아미네이즈에 의해 케토산으로부터 고농도의 L-형 아미노산의 생산되며, 그 전환율은 80% 이상으로 진행되는 것을 확인하였다. 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

< 실험예 2: 정제한 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈와 오메가 트랜스아미네이즈의 커플링 반응에 의한 고농도 라세믹 아미노산의 L-형 아미노산으로의 전환 >

실시예 4에서 정제된 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈와 오메가 트랜스아미네이즈를 이용하여 고농도 라세믹 아미노산으로부터 L-형 아미노산이 생산됨을 확인하는 실험을 진행하였다. 100 mM 라세믹 아미노산, 70 mM α-케토글루타레이트, 70 mM 아이소프로필아민, 0.1 mM PLP 및 50 mM인산칼률(pH 7)에서 4 U/ml D-아미노산 트랜스아미네이즈와 20U/ml 오메가 트랜스아미네이즈 커플링 반응을 37 ℃ 에서 진행하였다. 류신과 노르류신의 경우는 50 mM 라세믹 아미노산, 35 mM α-케토글루타레이트, 35 mM 아이소프로필아민의 기질을 사용하여 반응하였다. 알라닌 생산을 위한 디라세마이제이션 반응의 경우에는 반응 시간 별로 기질, 생성물을 측정하였으며 호모알라닌, 세린, 노르발린, 류신, 노르류신의 경우에는 D-형 아미노산과 L-형 아미노산을 분석하였다. 다양한 아미노산들에 대해서 100 mM 라세믹 아미노산(류신과 노르류신은 50 mM)으로부터 L-형 아미노산을 99 % 이상의 ee 값으로 디라세마이제이션을 통하여 얻을 수 있었다. 그 결과를 하기 도 3, 도 4 및 표 10에 나타내었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Preparation method of optically active amino acids using deracemization <130> HPC3423 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1371 <212> DNA <213> Ochrobactrumanthropi <400> 1 atgactgctc agccaaactc tcttgaagct cgcgatatcc gttatcatct ccattcttat 60 accgatgctg tccgcctcga agcggaaggt ccgctcgtca tcgagcgtgg cgatggcatt 120 tacgtcgaag atgtatcggg caagcgctat atcgaagcga tgtcaggact gtggagtgtt 180 ggcgtgggct tttccgaacc gcgtctggcc gaagcagctg cacgacagat gaagaagctg 240 cctttctacc atacattctc ctaccgttcg catggtcctg tcattgatct ggcagaaaag 300 cttgtctcaa tggctcctgt tccgatgagc aaggcctact tcaccaattc aggttccgaa 360 gccaacgata cggtcgtcaa gttgatctgg tatcgctcca atgcgctggg tgaaccggag 420 cgcaagaaaa tcatctcacg caagcgcggc tatcacggtg tgacgattgc ctctgccagc 480 ctgaccggct tgcccaacaa tcaccgttct ttcgatctgc cgatcgatcg tatcctgcat 540 acgggctgcc cgcattttta tcgcgaagga caggctggcg agagtgagga acaattcgca 600 acgcggctgg cggatgagct ggaacagttg atcatcgcgg aaggtcctca caccatcgct 660 gctttcattg gcgagccggt gatgggggct ggcggcgtag tcgtgccgcc caaaacctat 720 tgggaaaaag tgcaggctgt tctcaagcgc tacgatattc tgctgatcgc cgacgaggtt 780 atttgcggct tcggacggac aggcaatctg ttcggcagcc agactttcga tatgaaaccg 840 gacattctgg tgatgtcgaa gcagctttcg tcatcctatc tgccgatttc ggccttcctc 900 atcaacgagc gtgtgtacgc gccaattgcc gaagaaagcc acaagatcgg cacgcttggc 960 acgggcttca cggcatctgg ccatccggtg gcggcagcgg tagcgctgga aaacctcgcc 1020 attattgaag agcgtgatct ggtcgccaat gcgcgcgacc gcggcaccta tatgcagaag 1080 cgcctgcgtg agttgcagga tcatcctctg gtcggcgaag tgcgtggcgt tggtctcata 1140 gccggtgtcg agcttgtcac cgacaagcag gccaagacgg gccttgaacc aaccggcgct 1200 ctgggcgcaa aggcaaacgc cgttcttcag gagcgcggcg tcatttcccg cgcaatgggc 1260 gatacgcttg ccttctgccc gccgctcatc atcaacgatc agcaggttga tacgatggtg 1320 tccgcgctcg aggcgacgct gaacgatgtt caggcaagcc tcaccaggta a 1371 <210> 2 <211> 1362 <212> DNA <213> Paracoccusdenitrificans <400> 2 atgaaccaac cgcaaagctg ggaagcccgg gccgagacct attcgctcta cggtttcacc 60 gacatgccct cggtccatca gcggggcacg gtcgtcgtga cccatggcga ggggccctat 120 atcgtcgatg tccatggccg ccgctatctg gatgccaatt cgggcctgtg gaacatggtc 180 gcgggcttcg accacaaggg cctgatcgag gccgccaagg cgcaatacga ccgctttccc 240 ggctatcacg cctttttcgg ccgcatgtcc gaccagaccg tgatgctgtc ggaaaagctg 300 gtcgaggtct cgccattcga caacggccgg gtcttctata ccaattccgg ctccgaggcg 360 aacgacacca tggtcaagat gctgtggttc ctgcatgccg ccgagggcaa gccgcaaaag 420 cgcaagatcc tgacgcgctg gaacgcctat cacggcgtga ccgcggtttc ggcctcgatg 480 accggcaagc cctacaactc ggtcttcggc ctgccgctgc ccggcttcat ccacctgacc 540 tgcccgcatt actggcgcta tggcgaggaa ggcgagaccg aggcgcaatt cgtcgcccgc 600 ctggcacgcg agcttgagga taccatcacc cgcgagggcg ccgacaccat cgccggcttc 660 ttcgccgagc cggtgatggg cgcggggggg gtgatcccgc cggcgaaggg ttatttccag 720 gccatcctgc cgatcttgcg caagtatgac atcccgatga tctcggacga ggtgatctgc 780 ggcttcgggc gcaccggcaa cacctggggc tgcctgacct acgacttcat gcccgatgcg 840 atcatctcgt ccaagaacct gactgcgggc ttcttcccga tgggcgccgt catcctcggg 900 cccgacctcg ccaagcgggt cgaggccgcg gtcgaggcga tcgaggagtt cccgcacggc 960 ttcaccgcct cgggccatcc ggtcggctgc gccatcgcgc tgaaggccat cgacgtggtg 1020 atgaacgagg ggctggccga gaatgtccgc cgcctcgcac cccgcttcga ggcggggctg 1080 aagcgcatcg ccgaccgccc gaacatcggc gaataccgcg gcatcggctt catgtgggcg 1140 ctggaggcgg tcaaggacaa gccgaccaag acccccttcg acgccaatct ttcggtcagc 1200 gagcgcatcg ccaatacctg caccgatctg gggctgatct gccggccgct gggccagtcc 1260 atcgtgctgt gcccgccctt catcctgacc gaggcgcaga tggacgagat gttcgaaaag 1320 ctggaaaagg cgctcgacaa ggtctttgcc gaggtggcct ga 1362 <210> 3 <211> 852 <212> DNA <213> Bacillus sphaericus <400> 3 atggcatact cattatggaa tgaccaaatc gttgaagaag gatctattac aatttcacca 60 gaagaccgtg gttatcaatt tggtgatggt atttacgaag taatcaaagt atataacggg 120 catatgttta cagcacaaga gcacatcgat cgtttctatg ctagtgccga aaaaattcgc 180 cttgttattc cttatacaaa agatgtatta cacaaattat tgcatgattt aatcgaaaaa 240 aataatttaa atacaggtca tgtttacttc caaattacac gtggaacaac ttctcgtaac 300 cacattttcc cggatgcaag cgtaccagca gtgctaacag gtaatgttaa aactggtgaa 360 cgttcaattg aaaatttcga aaaaggcgta aaagcgacat tggttgaaga tgttcgttgg 420 ttacgttgtg atattaaatc tttaaattta cttggcgcgg tacttgcgaa acaagaagca 480 tctgaaaaag gttgttacga agccatttta caccgtggag atattatcac agaatgttct 540 tctgctaatg tctatggtat taaagatggt aaactttata cgcacccagc aaataactac 600 atcttaaatg gtattacacg ccaagttata ttaaaatgtg ccgctgaaat aaatttacca 660 gtgattgaag agccgatgac aaaaggcgat ttattaacaa tggatgaaat tattgtgtct 720 tctgtttcat ctgaagtgac accggttatc gatgtggatg gtcagcaaat tggtgcaggt 780 gttcctggtg aatggactcg taaattgcaa aaagcatttg aggcaaaatt accaatttca 840 attaatgcct aa 852 <210> 4 <211> 456 <212> PRT <213> Ochrobactrumanthropi <400> 4 Met Thr Ala Gln Pro Asn Ser Leu Glu Ala Arg Asp Ile Arg Tyr His 1 5 10 15 Leu His Ser Tyr Thr Asp Ala Val Arg Leu Glu Ala Glu Gly Pro Leu 20 25 30 Val Ile Glu Arg Gly Asp Gly Ile Tyr Val Glu Asp Val Ser Gly Lys 35 40 45 Arg Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Leu Trp Ser Val Gly Val Gly Phe 50 55 60 Ser Glu Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Gln Met Lys Lys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Tyr His Thr Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 135 140 Ile Ser Arg Lys Arg Gly Tyr His Gly Val Thr Ile Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Leu Pro Asn Asn His Arg Ser Phe Asp Leu Pro Ile Asp 165 170 175 Arg Ile Leu His Thr Gly Cys Pro His Phe Tyr Arg Glu Gly Gln Ala 180 185 190 Gly Glu Ser Glu Glu Gln Phe Ala Thr Arg Leu Ala Asp Glu Leu Glu 195 200 205 Gln Leu Ile Ile Ala Glu Gly Pro His Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly 210 215 220 Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Val Val Pro Pro Lys Thr Tyr 225 230 235 240 Trp Glu Lys Val Gln Ala Val Leu Lys Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Ile 245 250 255 Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Leu Phe Gly 260 265 270 Ser Gln Thr Phe Asp Met Lys Pro Asp Ile Leu Val Met Ser Lys Gln 275 280 285 Leu Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Ile Ser Ala Phe Leu Ile Asn Glu Arg 290 295 300 Val Tyr Ala Pro Ile Ala Glu Glu Ser His Lys Ile Gly Thr Leu Gly 305 310 315 320 Thr Gly Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu 325 330 335 Glu Asn Leu Ala Ile Ile Glu Glu Arg Asp Leu Val Ala Asn Ala Arg 340 345 350 Asp Arg Gly Thr Tyr Met Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gln Asp His 355 360 365 Pro Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Ile Ala Gly Val Glu 370 375 380 Leu Val Thr Asp Lys Gln Ala Lys Thr Gly Leu Glu Pro Thr Gly Ala 385 390 395 400 Leu Gly Ala Lys Ala Asn Ala Val Leu Gln Glu Arg Gly Val Ile Ser 405 410 415 Arg Ala Met Gly Asp Thr Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Ile Ile Asn 420 425 430 Asp Gln Gln Val Asp Thr Met Val Ser Ala Leu Glu Ala Thr Leu Asn 435 440 445 Asp Val Gln Ala Ser Leu Thr Arg 450 455 <210> 5 <211> 453 <212> PRT <213> Paracoccusdenitrificans <400> 5 Met Asn Gln Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Val His Gln Arg Gly Thr Val Val 20 25 30 Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val His Gly Arg Arg 35 40 45 Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly Phe Asp 50 55 60 His Lys Gly Leu Ile Glu Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Asp Arg Phe Pro 65 70 75 80 Gly Tyr His Ala Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu 85 90 95 Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Asp Asn Gly Arg Val Phe 100 105 110 Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys Met Leu 115 120 125 Trp Phe Leu His Ala Ala Glu Gly Lys Pro Gln Lys Arg Lys Ile Leu 130 135 140 Thr Arg Trp Asn Ala Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Met 145 150 155 160 Thr Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe 165 170 175 Ile His Leu Thr Cys Pro His Tyr Trp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Glu 180 185 190 Thr Glu Ala Gln Phe Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu Asp Thr 195 200 205 Ile Thr Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala Glu Pro 210 215 220 Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ala Lys Gly Tyr Phe Gln 225 230 235 240 Ala Ile Leu Pro Ile Leu Arg Lys Tyr Asp Ile Pro Met Ile Ser Asp 245 250 255 Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly Cys Leu 260 265 270 Thr Tyr Asp Phe Met Pro Asp Ala Ile Ile Ser Ser Lys Asn Leu Thr 275 280 285 Ala Gly Phe Phe Pro Met Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Asp Leu Ala 290 295 300 Lys Arg Val Glu Ala Ala Val Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro His Gly 305 310 315 320 Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu Lys Ala 325 330 335 Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Leu 340 345 350 Ala Pro Arg Phe Glu Ala Gly Leu Lys Arg Ile Ala Asp Arg Pro Asn 355 360 365 Ile Gly Glu Tyr Arg Gly Ile Gly Phe Met Trp Ala Leu Glu Ala Val 370 375 380 Lys Asp Lys Pro Thr Lys Thr Pro Phe Asp Ala Asn Leu Ser Val Ser 385 390 395 400 Glu Arg Ile Ala Asn Thr Cys Thr Asp Leu Gly Leu Ile Cys Arg Pro 405 410 415 Leu Gly Gln Ser Ile Val Leu Cys Pro Pro Phe Ile Leu Thr Glu Ala 420 425 430 Gln Met Asp Glu Met Phe Glu Lys Leu Glu Lys Ala Leu Asp Lys Val 435 440 445 Phe Ala Glu Val Ala 450 <210> 6 <211> 283 <212> PRT <213> Bacillus sphaericus <400> 6 Met Ala Tyr Ser Leu Trp Asn Asp Gln Ile Val Glu Glu Gly Ser Ile 1 5 10 15 Thr Ile Ser Pro Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Ile Tyr 20 25 30 Glu Val Ile Lys Val Tyr Asn Gly His Met Phe Thr Ala Gln Glu His 35 40 45 Ile Asp Arg Phe Tyr Ala Ser Ala Glu Lys Ile Arg Leu Val Ile Pro 50 55 60 Tyr Thr Lys Asp Val Leu His Lys Leu Leu His Asp Leu Ile Glu Lys 65 70 75 80 Asn Asn Leu Asn Thr Gly His Val Tyr Phe Gln Ile Thr Arg Gly Thr 85 90 95 Thr Ser Arg Asn His Ile Phe Pro Asp Ala Ser Val Pro Ala Val Leu 100 105 110 Thr Gly Asn Val Lys Thr Gly Glu Arg Ser Ile Glu Asn Phe Glu Lys 115 120 125 Gly Val Lys Ala Thr Leu Val Glu Asp Val Arg Trp Leu Arg Cys Asp 130 135 140 Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala 145 150 155 160 Ser Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Asp Ile Ile 165 170 175 Thr Glu Cys Ser Ser Ala Asn Val Tyr Gly Ile Lys Asp Gly Lys Leu 180 185 190 Tyr Thr His Pro Ala Asn Asn Tyr Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Gln 195 200 205 Val Ile Leu Lys Cys Ala Ala Glu Ile Asn Leu Pro Val Ile Glu Glu 210 215 220 Pro Met Thr Lys Gly Asp Leu Leu Thr Met Asp Glu Ile Ile Val Ser 225 230 235 240 Ser Val Ser Ser Glu Val Thr Pro Val Ile Asp Val Asp Gly Gln Gln 245 250 255 Ile Gly Ala Gly Val Pro Gly Glu Trp Thr Arg Lys Leu Gln Lys Ala 260 265 270 Phe Glu Ala Lys Leu Pro Ile Ser Ile Asn Ala 275 280

Claims (13)

1. 라세믹 아미노산의 탈라세믹화에 의한 L-형 아미노산의 제조 방법으로서,
   기질인 라세믹 아미노산, 아미노수용체 및 아미노공여체를 효소인 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈 및 (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈에 제공하는 단계를 포함하고,
   상기 라세믹 아미노산 및 상기 아미노수용체가 상기 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈와 반응하여 D-형 아미노산 및 α-케토산을 생산하는 반응; 및
   상기 α-케토산이 상기 아미노공여체와 상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 반응하여 L-형 아미노산을 생산하는 반응이 동시에 일어나는 것을 특징으로 하는 L-형 아미노산의 제조 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 α-케토산은 상기 라세믹 아미노산 중 D-형 아미노산으로부터 아미노수용체에 전달된 아미노기에 의해 생산된 것을 특징으로 하는 L-형 아미노산의 제조방법.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 라세믹 아미노산은 라세믹 알라닌, 라세믹 호모알라닌, 라세믹 세린, 라세믹 노르발린, 라세믹 노르류신 및 라세믹 류신으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 L-형 아미노산의 제조방법.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 아미노수용체는 α-케토글루타레이트, 아세토아세테이트, 페닐파이루베이트, 페닐글라이옥실에이트, α-케토아이소카프로에이트, α-케토아이소발러레이트로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 L-형 아미노산의 제조방법.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 아미노공여체는 아이소프로필아민, 부틸아민, 메틸벤질아민, 에틸벤질아민, 아미노인단, 아미노테트라린, 벤질아민 및 이들의 유도체로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 L-형 아미노산의 제조방법.
   
6. 제 1항에 있어서,
   상기 제조방법에 의해 제조되는 L-형 아미노산은 L-형 알라닌, L-형 호모알라닌, L-형 세린, L-형 노르발린, L-형 노르류신 및 L-형 류신으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 L-형 아미노산의 제조방법.
   
7. 제 1항에 있어서,
   상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 오크로박트럼앤트로피(Ochrobactrumanthropi)에서 유래된 것으로서, 서열번호 1의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 효소인 것을 특징으로 하는 L-형 아미노산의 제조방법.
   
8. 제 1항에 있어서,
   상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 파라고쿠스덴이트리피컨스(Paracoccusdenitrificans)로부터 유래된 것으로서, 서열번호 2의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 효소인 것을 특징으로 하는 L-형 아미노산의 제조방법.
   
9. 제 1항에 있어서,
   상기 D-형 아미노산 트랜스아미네이즈는 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus)로부터 유래된 것으로서, 서열번호 3의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 효소인 것을 특징으로 하는 L-형 아미노산의 제조방법.
   
10. 제 1항에 있어서,
    상기 L-형 아미노산의 제조방법에 의해 생산된 L-형 아미노산의 순도(ee)는 99% 이상인 것을 특징으로 하는 L-형 아미노산의 제조방법.
    
    
    
    
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