KR101493311B1 - 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 광학 활성 키랄 아민의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제조방법에 의해 광학 활성 키랄 아민을 제조하는 경우에는 저가의 아미노 수용체를 사용함으로써 광학 활성 키랄 아민의 제조시 그 생산 단가를 현저하게 낮추는 효과가 있으며, 이러한 저가의 아미노 수용체를 사용하도라도 제조 효율이 우수한 광학 활성 키랄 아민의 제공이 가능하다.
또한 단일 거울상 이성질체의 제공이 가능하며, 추가적으로는 상기 제조방법을 통하여 자연적으로는 존재하지 않는 L-호모알라닌의 생산 및 제공이 가능하다.

Description

광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법{Preparation method of optically active amines and homoalanine}

본 발명은 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 저가의 기질을 사용하여 광학 활성 키랄 아민을 생산하며, 또한 자연적으로는 존재하지 않는 아미노산인 호모알라닌을 수득할 수 있는 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법에 관한 것이다.

키랄(Chiral)이란 왼손과 오른손이 서로 겹칠 수 없는 거울상의 관계에 있음에 비유된 그리스어로 ‘손’을 의미한다. 이러한 의미로 의약품 중에서 어떤 두 분자가 서로 겹칠 수 없는 3차원적 구조에 기인하여 거울상 이성질체의 관계에 있을 때 ‘키랄의약품’으로 분류한다. 현재 순수한 키랄 화합물의 생산에 대한 관심이 높아지고 있으며, 이중 키랄 아민은 제약, 농약 및 화학 산업에서 중요한 역할을 한다. 특히 키랄 아민은 여러 알츠하이머 병의 치료제인 (S)-리바스티그민, 항고혈압제인 딜레바볼, 항당뇨병제인 시타글립틴, 항부정맥제이자 항근경직제인 멕실레틴과 같은 다수의 의약품 제조에 반드시 필요하다.

키랄 아민의 이러한 약제학적 유용성 때문에, 선택적 결정화나 비대칭적 촉매수소화와 같은 화학공정에 대한 친환경적인 대안으로서 동역학적 분할, 비대칭 합성(asymmetric synthesis), 탈라세미화(deracemization) 등과 같은 생체촉매를 이용한 광학 활성 키랄 아민의 제조에 대한 연구가 활발히 진행되었다. 특히 과거에는 동역학적 분할에 의한 방법보다 최대 수율이 2배 이상인 비대칭합성의 방법이 선호되었다. 이러한 오메가트랜스아미네이즈는 높은 전환율, 우수한 거울상 선택성과 높은 안정성을 가지며, 외부 보조인자를 요하지 않아 키랄 아민의 생산에 효과적인 효소로 각광 받고 있다. 특히 오메가트랜스아미네이즈와 함께 아미노 수용체로서 α-케토산을 기질로 제공하고 라세믹 아민을 키네틱 레졸루션 반응 시켜 광학 활성 아민을 수득하는 방법이 부각되고 있는 실정이다. 이때 아미노 수용체로서 α-케토산을 사용하는 이유는 기존의 저가의 아미노 수용체인 프로판알 및 부탄알은 거울상체의 잉여율이 낮고, 효소를 심하게 비활성화 시키는 문제가 있으며, 화학독성을 가지는 문제점이 있음에 반해 α-케토산은 이러한 문제들의 해결이 가능하기 때문이다. 다만, α-케토산이 이러한 문제들을 해결할 수 있다고 하여도, 그 단가가 지나치게 높기 때문에 이를 통한 최종 광학 활성 아미노산의 생산 단가도 그만큼 높아질 수 밖에 없다는 문제점이 있다.

한편 광학 활성 아민은 의약품 등으로 그 활용도가 다양하지만, 각각의 단일 거울상 이성질체는 물리적 또는 생리학적 특성이 다른 경우가 다수 존재하며, 이를 구분하여 생산할 필요가 있음에도 그 생산 방법이 많이 부족한 문제점이 있었다.

또한 호모알라닌의 경우 자연적으로는 존재하지 않기 때문에 인공적으로 합성해야 하는 아미노산으로서 대량 생산의 어려움 및 생산 비용이 고가라는 문제점이 있다.

본 발명과 관련이 있는 선행문헌은 하기와 같다.

대한민국 등록특허 제10-0929473호

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 광학 활성 아민의 생산 비용을 절감하는 광학 활성 아민의 제조방법을 제공하며, 또한 상기 광학 활성 아민을 단일 거울상 이성질체로서 선택적으로 제공하는 것이고, 또한 추가적으로 이러한 제조방법을 통하여 자연적으로는 존재하지 않는 아미노산인 L형 또는 D형 호모알라닌을 선택적으로 제공하는 것이다.

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법은

1) 기질인 라세믹 아민 및 L-쓰레오닌을 효소인 쓰레오닌 디아미네이즈 및

(S) 또는 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈에 제공하는 단계와,

2) 상기 쓰레오닌 디아미네이즈는 L-쓰레오닌을 디아미네이션하여 아미노 수용체인 2-옥소부티레이트를 생산하는 단계와,

3) 상기 (S) 또는 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈가 상기 라세믹 아민 중 (S) 배열 또는 (R) 배열 광학 활성 아민을 기질로 사용하면서 상기 2)단계에서 생산된 2-옥소부티레이트와 트랜스아미네이션을 위한 키네틱 레졸루션(kinetic resolution)을 수행하는 단계 및,

4) 상기 3)단계의 반응에 의해 (R) 배열 또는 (S) 배열 광학 활성 아민 및 L형 또는 D형 호모알라닌을 생산하는 단계를 포함한다.

또한 상기 1)단계에서 (S) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 상기 3)단계에서 (S) 배열 광학 활성 아민을 기질로 사용하여 반응한 후,

상기 4)단계에서 (R) 배열 광학 활성 아민 및 L형 호모알라닌을 선택적으로 생산하는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 1)단계에서 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 상기 3)단계에서 (R) 배열 광학 활성 아민을 기질로 사용하여 반응한 후,

상기 4)단계에서 (S) 배열 광학 활성 아민 및 D형 호모알라닌을 선택적으로 생산하는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 (S) 선택적 오메가트랜스아미네이즈는 오크로박트럼 엔트로피( Ochrobactrum anthropi ) 에서 유래한 것으로서, 서열번호 1의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 효소인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈는 아스퍼질러스 터레우스( Aspergillus terreus)에서 유래한 것으로서, 서열번호 2의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 효소인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 쓰레오닌 디아미네이즈는 E. coli ( Escherichia coli )에서 유래한 것으로서, 서열번호 3의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 효소인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 라세믹 아민은 α-메틸벤질아민, 4-플루오로-α-메틸벤질아민, α-에틸벤질아민, 1-메틸-3-페닐프로필아민, 1-아미노인단, sec-부틸아민, 사이크로포로필에틸아민, 2-아미노펜테인, 2-아미노옥테인, 1-메톡시-2-프로필아민 및 알라니놀로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 의약품은 본 발명에 따라 제조된 광학 활성 아민 및 호모알라닌을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 의약품은 본 발명에 따라 제조된 호모알라닌을 중간체로 포함한다.

본 발명에 따른 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법은 고가의 아미노 수용체인 α-케토산을 사용하지 않고서도 광학적 순도가 높은 광학 활성 아민의 제조가 가능하다. 또한 본 발명에 따른 제조방법을 사용하면 상기 광학 활성 아민을 각각의 단일 거울상 이성질체로서 선택적으로 제공하는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 따른 제조방법을 이용하게 되면 자연적으로는 존재하지 않는 L형 또는 D형 호모알라닌의 선택적 제공이 가능하다.

그러므로 본 발명에 따른 제조방법을 이용하게 되면, 광학 활성 아민의 생산 단가의 절감 및 단일 거울상 이성질체로서 광학 활성 아민의 제공을 가능하게 한다. 또한 이와 동시에 인공적인 방법으로 제조하여야만 하는 호모알라닌의 생산 방법을 다각화하면서 L형 또는 D형 호모알라닌의 선택적 수득을 가능하게 한다.

이러한 본 발명을 통해 의약 관련 산업의 획기적 발전이 기대된다.

도 1은 오메가트랜스아미네이즈에 대하여 아미노 수용체로써 파이루베이트와 프로판알의 활성을 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 사용한 경우 (S) 배열 또는 (R) 배열α-메틸벤질아민의 농도를 반응시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이에 본 발명자들은 생산 단가를 절감하고, 광학 활성 아민을 단일 거울상 이성질체로서 선택적으로 제공하는 것이 가능하며, L형 또는 D형 호모알라닌의 선택적 제공이 가능한 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

구체적으로 본 발명에 따른 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법은

1) 기질인 라세믹 아민 및 L-쓰레오닌을 효소인 쓰레오닌 디아미네이즈 및

(S) 또는 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈에 제공하는 단계와,

2) 상기 쓰레오닌 디아미네이즈는 L-쓰레오닌을 디아미네이션하여 아미노 수용체인 2-옥소부티레이트를 생산하는 단계와,

3) 상기 (S) 또는 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈가 상기 라세믹 아민 중 (S) 배열 또는 (R) 배열 광학 활성 아민을 기질로 사용하면서 상기 2)단계에서 생산된 2-옥소부티레이트와 트랜스아미네이션을 위한 키네틱 레졸루션(kinetic resolution)을 수행하는 단계, 및

4) 상기 3)단계의 반응에 의해 (R) 배열 또는 (S) 배열 광학 활성 아민 및 L형 또는 D형 호모알라닌을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법은 하기 반응식 1로 나타낼 수 있다.

[반응식 1]

상기 반응식 1과 같이 본 발명은 1)단계에서 라세믹 아민과 L-쓰레오닌을 기질로서 제공하고, 여기에 효소인 쓰레오닌 디아미네이즈와 (S) 또는 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 제공할 수 있다. 이중 상기 쓰레오닌 디아미네이즈는 상기 L-쓰레오닌을 디아미네이션 할 수 있으며, 이를 통해 아미노 수용체인 2-옥소부티레이트를 생산할 수 있다. 이러한 상기 2-옥소부티레이트는 아미노 수용체로 작용할 수 있으며, 이를 통해 아미노 수용체인 고가의 α-케토산으로 사용될 수 있다. 또한 상기 2-옥소부티레이트는 또 다른 아미노 수용체인 프로판알보다 현저히 향상된 효과를 가지는 아미노 수용체로 작용할 수 있다.

상기 1)단계에서 (S) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 상기 3)단계에서 (S) 배열 광학 활성 아민을 기질로 사용하여 반응한 후, 상기 4)단계에서 (R) 배열 광학 활성 아민 및 L-형 호모알라닌을 선택적으로 생산할 수 있다. 이는 상기 쓰레오닌 디아미네이즈와 상기 (S) 선택적 오메가트랜스아미네이즈가 커플드 엔자임(coupled enzyme) 반응을 통한 키네틱 레졸루션(kinetic resolution)을 수행함으로써 생산되는 것일 수 있다.

또한 상기 1)단계에서 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 상기 3)단계에서 (R) 배열 광학 활성 아민을 기질로 사용하여 반응한 후, 상기 4)단계에서 (S) 배열 광학 활성 아민 및 D-형 호모알라닌을 선택적으로 생산할 수 있다. 이는 상기 쓰레오닌 디아미네이즈와 상기 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈가 커플드 엔자임(coupled enzyme) 반응을 통한 키네틱 레졸루션(kinetic resolution)을 수행함으로써 생산되는 것일 수 있다.

그러므로 상기 (S) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 최종적으로 단일 거울상 이성질체로서 (R) 배열 광학 활성 아민 및 L-형 호모알라닌을 선택적으로 생산할 수 있으며, 또한 상기 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 최종적으로 단일 거울상 이성질체로서 (S) 배열 광학 활성 아민 및 D-형 호모알라닌을 선택적으로 생산할 수 있다.

특별한 제한이 있는 것은 아니지만 상기 (S) 선택적 오메가트랜스아미네이즈는 바람직하게는 오크로박트럼엔트로피( Ochrobactrumanthropi ) 에서 유래한 것으로서, 서열번호 1의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 효소일 수 있다. 또한 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 상기 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈는 바람직하게는 아스퍼질러스터레우스(Aspergillusterreus)에서 유래한 것으로서, 서열번호 2의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 효소일 수 있다. 이를 통해 상기 쓰레오닌 디아미네이즈와 (S) 또는 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈와의 활성을 향상시킬 수 있어 바람직하다.

또한 상기 쓰레오닌 디아미네이즈는 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 E. coli ( Escherichia coli )에서 유래한 것으로서, 서열번호 3의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 효소일 수 있다.

상기 라세믹 아민은 바람직하게는 α-메틸벤질아민, 4-플루오로-α-메틸벤질아민, α-에틸벤질아민, 1-메틸-3-페닐프로필아민, 1-아미노인단, sec-부틸아민, 사이크로포로필에틸아민, 2-아미노펜테인, 2-아미노옥테인, 1-메톡시-2-프로필아민 및 알라니놀로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 것일 수 있다.

이중 본 발명의 바람직한 일실시예로서 상기 α-메틸벤질아민(1a)과 L-쓰레오닌(2)을 기질로 제공하여 이루어지는 반응을 하기 반응식 2로 나타냈다.

[반응식 2]

상기 반응식 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 쓰레오닌 디아미네이즈(TD)가 L-쓰레오닌(2)을 디아미네이션하여 2-옥소부티레이트(3)를 생산하면 (S) 선택적 오메가트랜스아미네이즈가 라세믹 α-메틸벤질아민 중 (S) 배열 α-메틸벤질아민만을 선택적으로 기질로 사용하여 디아미네이션 한 후, 다시 2-옥소부티레이트를 아미네이션하는 트랜스아미네이션 반응을 할 수 있다. 이러한 반응을 통해 결과적으로는 아세토페논(5)과 L형 호모알라닌(4)을 생산하게 된다. 이는 결국 최종 생성물로서 (R) 배열 α-메틸벤질아민((R)-1a), L형 호모알라닌 및 아세토페논을 수득할 수 있음을 의미한다.

또한 상기 반응식 2의 일부 변형으로서, (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 사용하는 반대의 경우에는 쓰레오닌 디아미네이즈(TD)가 L-쓰레오닌을 디아미네이션하여 2-옥소부티레이트를 생산하면 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈가 라세믹 α-메틸벤질아민 중 (R) 배열 α-메틸벤질아민만을 선택적으로 기질로 사용하여 디아미네이션 한 후, 다시 2-옥소부티레이트를 아미네이션하는 트랜스아미네이션 반응을 할 수 있다. 이러한 반응을 통해 결과적으로는 아세토페논과 D형 호모알라닌을 생산하게 된다. 이는 결국 최종 생성물로서 (S) 배열 α-메틸벤질아민, D형 호모알라닌 및 아세토페논을 수득할 수 있음을 의미한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 의약품은 본 발명에 따른 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법으로 제조된 광학 활성 아민 및 호모알라닌을 포함할 수 있다.

상기 의약품은 당업계에 적용되는 공지의 제조방법에 의해 제조되는 모든 의약품을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 의약품은 본 발명에 따른 상기 제조방법에 의해 제조된 호모알라닌을 중간체로 사용하는 의약품을 포함할 수 있다.

상기 의약품은 당업계에 적용되는 공지의 제조방법에 의해 제조되는 모든 의약품을 포함할 수 있으며, 바람직한 일실시예로서 항결핵약제 및 항간질약제를 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1; 오크로박트럼앤트로피( Ochrobactrumanthropi )로부터 (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈를 암호화하는 DNA 및 벡터 DNA 로 이루어진 재조합 DNA 의 제조

오크로박트럼앤트로피(Ochrobactrumanthropi)을 LB-브로쓰(펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, pH 7)중에서 37 ℃ 12 시간 배양한 후 싱글 콜로니로부터 오메가트랜스아미네이즈를 발현하는 유전자를 합성하였으며, 이를 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nde1, Xho1 제한효소와 라이게이즈를 이용하여 삽입하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.

실시예 2; 아스퍼질러스터레우스( Aspergillusterreus )로부터 (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈를 암호화하는 DNA 및 벡터 DNA 로 이루어진 재조합 DNA 의 제조

아스퍼질러스터레우스(Aspergillusterreus) 유래의 (R)-선택적 오메가트랜스아미네이즈 유전자 서열(NCBI gene ID: 115385557)을 pGEM-T vector에 합성하여 플라스미드로부터 오메가트랜스아미네이즈를 발현하는 유전자를 합성하였으며, 이를 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nco1, Xho1 제한효소를 이용하여 클로닝하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 2와 같다.

실시예 3; Escherichia coli 로부터 쓰레오닌 디아미네이즈를 암호화하는 DNA 및 벡터 DNA 로 이루어진 재조합 DNA 의 제조

Escherichia coli을 LB-브로쓰(펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, pH 7)중에서 37 ℃ 12 시간 배양한 후 싱글콜로니로부터쓰레오닌디아미네이즈를 발현하는 유전자를 합성하였으며, 이를 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nde1, Xho1 제한효소와 라이게이즈를 이용하여 삽입하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같다.

실시예 4; 형질 전환 균주로부터 효소의 과발현 및 정제

상기 실시예 1, 실시예 2 및 실시예3에서 수득된 플라스미드를 사용하여 E.coli BL21(DE3)를 형질 전환시켰다. 가나마이신을 함유하는 LB-보로쓰 300 mL에서 배양시킨 후, IPTG(최종 농도 1 mM)를 현탁도(OD) 0.5에서 첨가하였다. 이후 6 시간 이상 37 ℃에서 배양한 후 10000×g 4 ℃ 에서 20 분간 원심분리하여 세균세포를 얻어 15 mL 리서스펜션 버퍼(50 mMTris-HCl, 50 mM염화칼슘, 1 mM β-mercaptoethanol, 0.1 mM PMSF, 20 μM PLP, pH 7)로 현탁시켰다. 이를 빙냉시키면서 초음파 처리를 한 다음 17000×g 4 ℃에서 30분간 원심 분리하여 상층액을 조추출액으로 수득하였다. 이 조추출액을 친화성 크로마토그래피를 이용하여 원하는 오메가트랜스아미네이즈와 쓰레오닌 디아미네이즈를 정제하여 효소 용액을 얻었다.

실시예 5; 정제된 효소의 활성측정 및 농도결정

효소의 활성 및 농도 결정은 37 ℃ 에서 50 mM potassium phosphate 버퍼 pH 7 에서 수행되었다. 활성 측정을 위한 효소반응은 반응시작 10분 후 반응용액 100 μl에 아세도니트릴 600 μl를 넣어 멈추었다. 상기 실시예 4에서 정제된 1 unit의 쓰레오닌디아미네이즈 활성은 0.1 mM PLP, 50 mM L-쓰레오닌 에서 1분 동안 2-옥소부티레이트 1 μmole이 생기는 것을 의미한다. 상기 실시예 4에서 정제된 1 unit의 오메가트랜스아미네이즈 활성은 0.1 mM PLP, 10 mM 파이루베이트, 10 mM (S)-또는 (R)-α-메틸벤질아민 에서 1분 동안 1 μmole의 아세토페논이 생기는 것을 의미한다. 활성 측정을 위하여 쓰레오닌 디아미네이즈의 경우는 2-옥소부티레이트를 오메가트랜스아미네이즈의 경우는 아세토페논을 HPLC를 이용하여 측정한다.

실시예 6; 아민의 분석

생산물의 농도분석과 enantiomeric excess를 구하기 위하여 키랄아민과 아미노산은 GITC와 Marfey reagent를 이용하여 유도체화 한 후 HPLC를 이용하여 분석한다. 일반적인 GITC 유도체화 과정은 반응샘플(0.5 mM 이하의 아민 또는 아미노산)과 유도체화용액 (1.5 mM GITC, 1.5 mM 트라이에틸아민 in 아세토나이트릴) 과 1:1로 섞은 후 상온에서 35분 이상 반응한다. 이후 C18 컬럼과 HPLC를 이용하여 분석한다. 유속은 1 ml/min 이며 254 nm에서 UV 측정기를 이용하여 분석한다. 그 결과를 하기 [표 4]에 나타내었다. Marfey reagent 유도체화 과정은 10 μl의 샘플을 1 M 소디움바이카르보네이트 8 μl와 40 μl 1% Marfey reagent 를 섞은 후 40 ℃에서 1 시간 반응한 후 차게하여 8 μl의 1 M 염산을 섞어준다. 이 용액을 434 μl 의 40% 아세토나이트릴 용액과 섞은 후 C18 컬럼과 HPLC를 이용하여 분석한다. 유속은 1 ml/min 이며 온도는 40 ℃ 그리고 320 nm에서 UV 측정기를 이용하여 분석한다. 그 결과를 하기 [표 4]에 나타내었다. Enantiomeric excess는 위에서 측정된 (S)-enantiomer의 농도(CS) 와 (R)-enantiomer의 농도(CR)를 이용하여 계산된다. 그 계산식은 아래에 나타내었다.

[계산식]

또한 하기 표 4에서 α-메틸벤질아민는 1a로, 4-플루오로-α-메틸벤질아민은 1b로, α-에틸벤질아민은 1c로, 1-메틸-3-페닐프로필아민은 1d로, 1-아미노인단은 1e로, sec-부틸아민은 1f로, 사이크로포로필에틸아민은 1g로, 2-아미노펜테인은 1h로, 2-아미노옥테인은 1i로, 1-메톡시-2-프로필아민은 1j로, 알라니놀은 1k로 각각 나타내었다.

실시예 7; 정제한 오메가트랜스아미네이즈를 이용한 광학 활성 키랄 아민의 키네틱레졸루션( kinetic resolution ) 반응 시 파이루베이트와 프로판알의 아미노 수용체로써 활성 비교

상기 실시예 4에서 정제된 (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈를 이용하여 라세믹(racemic) α-메틸벤질아민과 파이루베이트 또는 프로판알을 기질로 사용하여 반응을 수행하였다. 100 mMα-메틸벤질아민, 80 mM파이루베이트 또는 프로판알, 0.1 mM PLP, 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7.5, 37 ℃ 조건에서 O.anthropi 유래의 (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈 5 U/ml을 첨가하여 시간에 따라 α-메틸벤질아민의 양을 (S)-α-메틸벤질아민과 (R)-α-메틸벤질아민으로 나눠서 각각 측정하였으며, 이의 enantiomeric excess를 구하였다. 그 결과 파이루베이트의 경우 3시간의 반응 만에 99% 이상의 enatiomeric excess로 (R)-α-메틸벤질아민을 얻을 수 있었으나 프로판알의 경우 24시간의 반응에도 57% 의 enantiomeric excess로 (R)-α-methylbenzylamine를 얻을 수 있었다. 이의 결과를 하기 도 1에 나타내었다.

실시예 8; 정제한 오메가트랜스아미네이즈의 아민에 대한 기질 특이성 조사

상기 실시예 4에서 정제된 O.anthropi 유래의 (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈의 아민에 대한 기질특이성을 조사하였다. α-메틸벤질아민(1a), 4-플루오로-α-메틸벤질아민(1b), α-에틸벤질아민(1c), 1-메틸-3-페닐프로필아민(1d), 1-아미노인단(1e), sec-부틸아민(1f), 사이크로포로필에틸아민(1g), 2-아미노펜테인(1h), 2-아미노옥테인(1i), 1-메톡시-2-프로필아민(1j)과 알라니놀(1k) 11가지 아민들에 대하여 기질특이성을 조사하였다. 10 mM 의 racemic 아민, 10 mM파이루베이트 0.1 mM PLP, 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7.5, 37 ℃ 조건에서 O.anthropi 유래의 (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈 0.125 U/ml을 첨가하여 10분간 반응하여 L-알라닌의 생성양을 GITC 유도체화를 통하여 측정하였다. 모든 활성은 5% 이하 전환율의 초기반응속도 구간에서 측정되었다. α-메틸벤질아민의 초기반응속도는 0.033 mM/min으로 측정되었다. α-메틸벤질아민에 대한 활성을 100%로 하였을 때 아릴알킬아민인 4-플루오로-α-메틸벤질아민(1b)의 경우는 91%, α-에틸벤질아민(1c)는 18%, 1-메틸-3-페닐프로필아민(1d)은 70%, 1-아미노인단(1e)은 64%((S)-1-아미노인단은 (S)-α-메틸벤질아민의 153%)의 활성을 지녔으며, 알킬아민의 경우 sec-부틸아민(1f)는 54%, 사이크로포로필에틸아민(1g)는 63%, 2-아미노펜테인(1h)은 29%, 2-아미노옥테인(1i)은 146%, 1-메톡시-2-프로필아민(1j)은 60%, 알라니놀(1k)은 63%의 활성을 지녔다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

실시예 9; 쓰레오닌 디아미네이즈와 오메가트랜스아미네이즈가 커플드 엔자임( coupled enzyme ) 반응 하여 키네틱 레졸루션(kinetic resolution)을 수행하는 경우 농도 변화에 따른 광학 활성 키랄 아민의 수득률

상기 실시예 4에서 정제된 쓰레오닌 디아미네이즈와 오메가트랜스아미네이즈를 이용하여 각 효소의 농도를 하기 [표 6]과 같이 다양하게 하여 coupled enzyme 반응을 수행하였다. 100 mM racemic α-메틸벤질아민, 60 mML-쓰레오닌, 0.1 mM PLP, 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7.5, 37 ℃ 조건에서 2.5시간 반응하였다. 쓰레오닌 디아미네이즈의 농도를 9U/ml로 고정하고 오메가트랜스아미네이즈의 농도를 1.25U/ml, 2.50U/ml, 3.75U/ml로 늘려 주었을 때 enantiomeric excess가 28%, 65%, 90%로 증가하는 것을 확인하였지만 오메가트랜스아미네이즈의 농도를 1.25U/ml로 고정하고 쓰레오닌디아미네이즈의 농도를 9U/ml, 18U/ml, 27U/ml로 증가시켰을 경우에는 enantiomeric excess가 28%, 24%, 26%로 향상되는 것을 확인하지 못하였다. 따라서 이 coupled enzyme 반응의 rate determining step은 오메가트랜스아미네이즈의 반응이므로 오메가트랜스아미네이즈의 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

실시예 10; L형 쓰레오닌과 라세믹 아민을 기질로 하면서, (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈와 쓰레오닌 디아미네이즈의 커플드 엔자임 반응을 이용한 (R) 배열 광학 활성 아민의 수득과 L형 호모알라닌의 생산

실시예 9에서 가장 좋은 결과를 얻은 효소 비율을 참고하고 실시예 4에서 정제된 오메가트랜스아미네이즈와 쓰레오닌 디아미네이즈를 이용하여 커플드 엔자임 반응을 이용한 아민의 키네틱 레졸루션과 L-호모알라닌의 생산 실험을 수행하였다. 11가지 아민(α-메틸벤질아민(1a), 4-플루오로-α-메틸벤질아민(1b), α-에틸벤질아민(1c), 1-메틸-3-페닐프로필아민(1d), 1-아미노인단(1e), sec-부틸아민(1f), 사이크로포로필에틸아민(1g), 2-아미노펜테인(1h), 2-아미노옥테인(1i), 1-메톡시-2-프로필아민(1j)과 알라니놀(1k))에 대하여 키네틱 레졸루션을 수행하였다. 100 mM 아민(1a-1k), 60 mML-쓰레오닌, 0.1 mM PLP, 50 mM phosphate 버퍼 pH 7.5에 3.75 U/ml (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈와 9 U/ml 쓰레오닌 디아미네이즈를 첨가하여 각 아민의 농도와 enantiomeric excess를 측정하였다. α-에틸벤질아민(1c), 2-아미노옥테인(1i), 알라니놀(1k)을 제외한 모든 아민에 대해서 10시간 이내의 반응시간만에 99% 이상의 enantiomeric excess를 얻을 수 있었다. α-에틸벤질아민(1c), 2-아미노옥테인(1i), 알라니놀(1k)의 키네틱 레졸루션을 위해서 이 커플드 엔자임 반응의 rate determining step인 오메가트랜스아미네이즈의 농도를 10U/ml로 증가 함으로서 α-에틸벤질아민(1c), 2-아미노옥테인(1i)에 대하여 30시간 이내에 99% 이상의 enantiomeric excess를 얻을 수 있었고 알라니놀(1k)에 대해서는 66%의 enantiomeric excess를 얻을 수 있었다. 모든 반응에서 L-호모알라닌이 99% enantiomeric excess로 생성 되는 것을 확인 하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

실시예 11; L형 쓰레오닌과 라세믹 아민을 기질로 하면서, (R)-선택적 오메가트랜스아미네이즈와 쓰레오닌 디아미네이즈의 커플드 엔자임 반응을 이용한 (S) 배열 광학 활성 아민의 수득과 D형 호모알라닌의 생산

실시예 4에서 정제된 (R)-선택적 오메가트랜스아미네이즈와 쓰레오닌 디아미네이즈를 이용하여 커플드 엔자임 반응을 이용한 아민의 키네틱 레졸루션과 D-호모알라닌의 생산 실험을 수행하였다. 30mMα-메틸벤질아민, 20 mM L-쓰레오닌, 0.1 mM PLP, 50 mM phosphate 버퍼 pH 7.5에 1.5 U/ml (R)-선택적 오메가트랜스아미네이즈와 4.5 U/ml 쓰레오닌 디아미네이즈를 첨가하여 각 (S) 배열 또는 (R) 배열α-메틸벤질아민의 농도를 반응시간에 따라 측정하였다. 99%이상의 enantiomeric excess를 5시간 반응만에 얻을 수 있었으며, 마찬가지로 D-호모알라닌을 99%이상의 enantiomeric excess로 얻을 수 있었다. 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

이상의 결과들을 통해 본 발명과 같이 라세믹 아민 및 L-쓰레오닌을 기질로 하면서, 쓰레오닌 디아미나제 및 (S) 또는 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 커플드 엔자임 반응시켜 키네틱 레졸루션 시키는 경우, 아미노 수용체로써 고가인 α-케토산을 사용하지 않고서도 2-옥소부티레이트를 중간체로 생산하여 광학 활성 아민의 생산을 가능하게 하여 생산 단가가 절감됨을 확인하였다. 또한 이때 (S) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 (R) 배열 광학 활성 아민의 제조가 가능하며, (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 (S) 배열 광학 활성 아민의 제조가 가능하여 각각의 단일 거울상 이성질체의 제조가 가능함을 확인하였다. 또한 본 발명에 따른 제조방법으로 광학 활성 아민을 제조하게 되면, 자연적으로는 존재하지 않는 호모 알라닌의 제조가 가능함과 동시에, (S) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 L형 호모알라닌의 생산이 가능하며, (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 D형 호모알라닌의 생산이 각각 가능함을 확인하였다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Preparation method of optically active amines and homoalanine <130> HPC3420 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1371 <212> DNA <213> Ochrobactrum anthropi <400> 1 atgactgctc agccaaactc tcttgaagct cgcgatatcc gttatcatct ccattcttat 60 accgatgctg tccgcctcga agcggaaggt ccgctcgtca tcgagcgtgg cgatggcatt 120 tacgtcgaag atgtatcggg caagcgctat atcgaagcga tgtcaggact gtggagtgtt 180 ggcgtgggct tttccgaacc gcgtctggcc gaagcagctg cacgacagat gaagaagctg 240 cctttctacc atacattctc ctaccgttcg catggtcctg tcattgatct ggcagaaaag 300 cttgtctcaa tggctcctgt tccgatgagc aaggcctact tcaccaattc aggttccgaa 360 gccaacgata cggtcgtcaa gttgatctgg tatcgctcca atgcgctggg tgaaccggag 420 cgcaagaaaa tcatctcacg caagcgcggc tatcacggtg tgacgattgc ctctgccagc 480 ctgaccggct tgcccaacaa tcaccgttct ttcgatctgc cgatcgatcg tatcctgcat 540 acgggctgcc cgcattttta tcgcgaagga caggctggcg agagtgagga acaattcgca 600 acgcggctgg cggatgagct ggaacagttg atcatcgcgg aaggtcctca caccatcgct 660 gctttcattg gcgagccggt gatgggggct ggcggcgtag tcgtgccgcc caaaacctat 720 tgggaaaaag tgcaggctgt tctcaagcgc tacgatattc tgctgatcgc cgacgaggtt 780 atttgcggct tcggacggac aggcaatctg ttcggcagcc agactttcga tatgaaaccg 840 gacattctgg tgatgtcgaa gcagctttcg tcatcctatc tgccgatttc ggccttcctc 900 atcaacgagc gtgtgtacgc gccaattgcc gaagaaagcc acaagatcgg cacgcttggc 960 acgggcttca cggcatctgg ccatccggtg gcggcagcgg tagcgctgga aaacctcgcc 1020 attattgaag agcgtgatct ggtcgccaat gcgcgcgacc gcggcaccta tatgcagaag 1080 cgcctgcgtg agttgcagga tcatcctctg gtcggcgaag tgcgtggcgt tggtctcata 1140 gccggtgtcg agcttgtcac cgacaagcag gccaagacgg gccttgaacc aaccggcgct 1200 ctgggcgcaa aggcaaacgc cgttcttcag gagcgcggcg tcatttcccg cgcaatgggc 1260 gatacgcttg ccttctgccc gccgctcatc atcaacgatc agcaggttga tacgatggtg 1320 tccgcgctcg aggcgacgct gaacgatgtt caggcaagcc tcaccaggta a 1371 <210> 2 <211> 978 <212> DNA <213> Aspergillus terreus <400> 2 atggcctcca tggacaaagt ctttgccggc tacgccgccc gccaagcgat cctcgaatca 60 accgagacca ccaacccctt tgcgaagggt atcgcctggg tagaaggcga gctggtgccc 120 ctggcagagg cacgcattcc actgctcgac cagggcttca tgcacagcga tctcacctac 180 gacgtgccct ccgtctggga cggccgcttc ttccggctag acgaccacat cacgcggctc 240 gaagccagct gcaccaagct ccggctgcga ctgccactcc cgcgcgacca ggtcaagcag 300 attctcgtcg agatggtggc caagagcggc atccgcgacg cctttgtcga gctgatcgtg 360 acgcgcgggc tgaagggcgt gcgggggaca cgccccgagg acatcgtcaa caatctgtac 420 atgtttgtgc agccgtacgt gtgggtgatg gagccggata tgcagcgtgt cggcggcagc 480 gcggtcgtcg cccgcaccgt gcgccgggtg cccccgggtg ccatcgaccc aaccgtcaag 540 aacctgcaat ggggcgatct cgtgcgcggc atgttcgagg ctgcggatcg cggtgcaact 600 tatccgttct tgacggacgg agatgcccat ctcaccgaag gctctgggtt caatattgtg 660 ctcgtcaagg acggcgtgct gtacacacca gaccgtggtg tgctgcaggg cgtgacacga 720 aagagtgtta tcaatgcggc ggaagccttc gggattgaag tccgcgttga gtttgtgccg 780 gttgagctgg cgtaccgttg tgatgagatc tttatgtgta ccaccgctgg cggcatcatg 840 cctatcacta cgctggatgg gatgcccgtg aatggaggac agatcggtcc tattacgaag 900 aagatttggg atggatattg ggctatgcat tatgatgcgg cttacagctt cgagattgat 960 tataacgaga ggaactga 978 <210> 3 <211> 1545 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atggctgact cgcaacccct gtccggtgct ccggaaggtg ccgaatattt aagagcagtg 60 ctgcgcgcgc cggtttacga ggcggcgcag gttacgccgc tacaaaaaat ggaaaaactg 120 tcgtcgcgtc ttgataacgt cattctggtg aagcgcgaag atcgccagcc agtgcacagc 180 tttaagctgc gcggcgcata cgccatgatg gcgggcctga cggaagaaca gaaagcgcac 240 ggcgtgatca ctgcttctgc gggtaaccac gcgcagggcg tcgcgttttc ttctgcgcgg 300 ttaggcgtga aggccctgat cgttatgcca accgccaccg ccgacatcaa agtcgacgcg 360 gtgcgcggct tcggcggcga agtgctgctc cacggcgcga actttgatga agcgaaagcc 420 aaagcgatcg aactgtcaca gcagcagggg ttcacctggg tgccgccgtt cgaccatccg 480 atggtgattg ccgggcaagg cacgctggcg ctggaactgc tccagcagga cgcccatctc 540 gaccgcgtat ttgtgccagt cggcggcggc ggtctggctg ctggcgtggc ggtgctgatc 600 aaacaactga tgccgcaaat caaagtgatc gccgtagaag cggaagactc cgcctgcctg 660 aaagcagcgc tgaatgcggg tcatccggtt gatctgccgc gcgtagggct atttgctgaa 720 ggcgtagcgg taaaacgcat cggtgacgaa accttccgtt tatgccagga gtatctcgac 780 gacatcatca ccgtcgatag cgatgcgatc tgtgcggcga tgaaggattt attcgaagat 840 gtgcgcgcgg tggcggaacc ctctggcgcg ctggcgctgg cgggaatgaa aaaatatatc 900 gccctgcaca acattcgcgg cgaacggctg gcgcatattc tttccggtgc caacgtgaac 960 ttccacggcc tgcgctacgt ctcagaacgc tgcgaactgg gcgaacagcg tgaagcgttg 1020 ttggcggtga ccattccgga agaaaaaggc agcttcctca aattctgcca actgcttggc 1080 gggcgttcgg tcaccgagtt caactaccgt tttgccgatg ccaaaaacgc ctgcatcttt 1140 gtcggtgtgc gcctgagccg cggcctcgaa gagcgcaaag aaattttgca gatgctcaac 1200 gacggcggct acagcgtggt tgatctctcc gacgacgaaa tggcgaagct acacgtgcgc 1260 tatatggtcg gcggacgtcc atcgcatccg ttgcaggaac gcctctacag cttcgaattc 1320 ccggaatcac cgggcgcgct gctgcgcttc ctcaacacgc tgggtacgta ctggaacatt 1380 tctttgttcc actatcgcag ccatggcacc gactacgggc gcgtactggc ggcgttcgaa 1440 cttggcgacc atgaaccgga tttcgaaacc cggctgaatg agctgggcta cgattgccac 1500 gacgaaacca ataacccggc gttcaggttc tttttggcgg gttaa 1545 <210> 4 <211> 456 <212> PRT <213> Ochrobactrum anthropi <400> 4 Met Thr Ala Gln Pro Asn Ser Leu Glu Ala Arg Asp Ile Arg Tyr His 1 5 10 15 Leu His Ser Tyr Thr Asp Ala Val Arg Leu Glu Ala Glu Gly Pro Leu 20 25 30 Val Ile Glu Arg Gly Asp Gly Ile Tyr Val Glu Asp Val Ser Gly Lys 35 40 45 Arg Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Leu Trp Ser Val Gly Val Gly Phe 50 55 60 Ser Glu Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Gln Met Lys Lys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Tyr His Thr Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 135 140 Ile Ser Arg Lys Arg Gly Tyr His Gly Val Thr Ile Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Leu Pro Asn Asn His Arg Ser Phe Asp Leu Pro Ile Asp 165 170 175 Arg Ile Leu His Thr Gly Cys Pro His Phe Tyr Arg Glu Gly Gln Ala 180 185 190 Gly Glu Ser Glu Glu Gln Phe Ala Thr Arg Leu Ala Asp Glu Leu Glu 195 200 205 Gln Leu Ile Ile Ala Glu Gly Pro His Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly 210 215 220 Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Val Val Pro Pro Lys Thr Tyr 225 230 235 240 Trp Glu Lys Val Gln Ala Val Leu Lys Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Ile 245 250 255 Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Leu Phe Gly 260 265 270 Ser Gln Thr Phe Asp Met Lys Pro Asp Ile Leu Val Met Ser Lys Gln 275 280 285 Leu Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Ile Ser Ala Phe Leu Ile Asn Glu Arg 290 295 300 Val Tyr Ala Pro Ile Ala Glu Glu Ser His Lys Ile Gly Thr Leu Gly 305 310 315 320 Thr Gly Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu 325 330 335 Glu Asn Leu Ala Ile Ile Glu Glu Arg Asp Leu Val Ala Asn Ala Arg 340 345 350 Asp Arg Gly Thr Tyr Met Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gln Asp His 355 360 365 Pro Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Ile Ala Gly Val Glu 370 375 380 Leu Val Thr Asp Lys Gln Ala Lys Thr Gly Leu Glu Pro Thr Gly Ala 385 390 395 400 Leu Gly Ala Lys Ala Asn Ala Val Leu Gln Glu Arg Gly Val Ile Ser 405 410 415 Arg Ala Met Gly Asp Thr Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Ile Ile Asn 420 425 430 Asp Gln Gln Val Asp Thr Met Val Ser Ala Leu Glu Ala Thr Leu Asn 435 440 445 Asp Val Gln Ala Ser Leu Thr Arg 450 455 <210> 5 <211> 325 <212> PRT <213> Aspergillus terreus <400> 5 Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala 1 5 10 15 Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala 20 25 30 Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu 35 40 45 Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser 50 55 60 Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp 85 90 95 Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg 100 105 110 Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg 115 120 125 Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln 130 135 140 Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser 145 150 155 160 Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp 165 170 175 Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe 180 185 190 Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp 195 200 205 Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp 210 215 220 Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg 225 230 235 240 Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val 245 250 255 Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met 260 265 270 Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met 275 280 285 Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp 290 295 300 Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp 305 310 315 320 Tyr Asn Glu Arg Asn 325 <210> 6 <211> 514 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr 1 5 10 15 Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr 20 25 30 Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile 35 40 45 Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg 50 55 60 Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His 65 70 75 80 Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe 85 90 95 Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala 100 105 110 Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val 115 120 125 Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu 130 135 140 Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro 145 150 155 160 Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln 165 170 175 Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu 180 185 190 Ala Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys 195 200 205 Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu 210 215 220 Asn Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu 225 230 235 240 Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln 245 250 255 Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala 260 265 270 Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Glu Pro Ser 275 280 285 Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr Ile Ala Leu His Asn 290 295 300 Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn 305 310 315 320 Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln 325 330 335 Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe 340 345 350 Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Thr Glu Phe Asn 355 360 365 Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg 370 375 380 Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn 385 390 395 400 Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys 405 410 415 Leu His Val Arg Tyr Met Val Gly Gly Arg Pro Ser His Pro Leu Gln 420 425 430 Glu Arg Leu Tyr Ser Phe Glu Phe Pro Glu Ser Pro Gly Ala Leu Leu 435 440 445 Arg Phe Leu Asn Thr Leu Gly Thr Tyr Trp Asn Ile Ser Leu Phe His 450 455 460 Tyr Arg Ser His Gly Thr Asp Tyr Gly Arg Val Leu Ala Ala Phe Glu 465 470 475 480 Leu Gly Asp His Glu Pro Asp Phe Glu Thr Arg Leu Asn Glu Leu Gly 485 490 495 Tyr Asp Cys His Asp Glu Thr Asn Asn Pro Ala Phe Arg Phe Phe Leu 500 505 510 Ala Gly

Claims (9)

1) 기질인 라세믹 아민 및 L-쓰레오닌을 효소인 쓰레오닌 디아미네이즈 및
(S) 또는 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈에 제공하는 단계;
2) 상기 쓰레오닌 디아미네이즈에 의하여 L-쓰레오닌을 디아미네이션하여 아미노 수용체인 2-옥소부티레이트를 생산하는 단계;
3) 상기 (S) 또는 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈에 의하여 상기 라세믹 아민 중 (S) 배열 또는 (R) 배열 광학 활성 아민을 기질로 사용하여 상기 2)단계에서 생산된 2-옥소부티레이트와 트랜스아미네이션을 통해 라세믹 아민을 키네틱 레졸루션(kinetic resolution)시키는 단계; 및
4) 상기 3)단계의 반응에 의해 (R) 배열 또는 (S) 배열 광학 활성 아민 및 L형 또는 D형 호모알라닌을 생산하는 단계를 포함하고,
상기 1)단계에서 (S) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 상기 3)단계에서 (S) 배열 광학 활성 아민을 기질로 사용하여, 상기 4)단계에서 (R) 배열 광학 활성 아민 및 L형 호모알라닌을 선택적으로 생산하는 것을 특징으로 하고,
상기 1)단계에서 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 상기 3)단계에서 (R) 배열 광학 활성 아민을 기질로 사용하여, 상기 4)단계에서 (S) 배열 광학 활성 아민 및 D형 호모알라닌을 선택적으로 생산하는 것을 특징으로 하는
쓰레오닌 디아미네이즈와 오메가트랜스아미네이즈의 커플링 반응에 의하여 L-쓰레오닌과 라세믹아민으로부터 광학활성아민과 호모알라닌을 동시에 생산하는 방법.

삭제

삭제

제 1항에 있어서,
상기 (S) 선택적 오메가트랜스아미네이즈는 오크로박트럼 엔트로피( Ochrobactrum anthropi ) 에서 유래한 것으로서, 서열번호 1의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 효소인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법.

제 1항에 있어서,
상기 (R) 선택적 오메가트랜스아미네이즈는 아스퍼질러스 터레우스( Aspergillus terreus)에서 유래한 것으로서, 서열번호 2의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 효소인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법.

제 1항에 있어서,
상기 쓰레오닌 디아미네이즈는 E. coli ( Escherichia coli)에서 유래한 것으로서, 서열번호 3의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되며, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 효소인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법.

제 1항에 있어서,
상기 라세믹 아민은 α-메틸벤질아민, 4-플루오로-α-메틸벤질아민, α-에틸벤질아민, 1-메틸-3-페닐프로필아민, 1-아미노인단, sec-부틸아민, 사이크로포로필에틸아민, 2-아미노펜테인, 2-아미노옥테인, 1-메톡시-2-프로필아민 및 알라니놀로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법.

삭제

삭제

Images