JP2771825B2 - D‐アラニンの製造方法 - Google Patents
D‐アラニンの製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、ペプチド性人工甘味料の中間体などとして
産業上有用なD−アラニンの製造方法に関する。
産業上有用なD−アラニンの製造方法に関する。
[従来技術] 通常の化学合成法によって、D−アラニンを高い光学
純度で収率よく工業的に製造することは困難である。
純度で収率よく工業的に製造することは困難である。
従来、D−アラニン製造方法としては、発酵法(特公
昭42−20683,特公昭52−5590,特公昭51ー21076,特公昭5
1−22881等)、酵素法(ヒダントイン法;発酵工学61.,
(3)139−151(1983)など、アシラーゼ法;(特公昭
60−31477)など、アミダーゼ法;特開昭61−274690,日
本農芸化学会誌62.,(3)588(1988)など)等が知ら
れている。
昭42−20683,特公昭52−5590,特公昭51ー21076,特公昭5
1−22881等)、酵素法(ヒダントイン法;発酵工学61.,
(3)139−151(1983)など、アシラーゼ法;(特公昭
60−31477)など、アミダーゼ法;特開昭61−274690,日
本農芸化学会誌62.,(3)588(1988)など)等が知ら
れている。
その他D−トランスアミナーゼを用いたD−アミノ酸
製造方法として、特開昭62−205790記載の方法が知られ
ている。
製造方法として、特開昭62−205790記載の方法が知られ
ている。
また、アスパラギン酸をアミノ基供与体とするトラン
スアミナーゼ反応を用いたアミノ酸製造方法において、
副生するオキサロ酢酸を脱炭酸して反応効率を高める方
法としては、昭和61年度日本農芸化学会大会講演要旨集
p.220,特開昭61−21091,特開昭60−91993等記載の方法
が知られている。
スアミナーゼ反応を用いたアミノ酸製造方法において、
副生するオキサロ酢酸を脱炭酸して反応効率を高める方
法としては、昭和61年度日本農芸化学会大会講演要旨集
p.220,特開昭61−21091,特開昭60−91993等記載の方法
が知られている。
[発明が解決しようとする課題] しかしこれらの発明のうち、発酵法においては転換効
率が低い上、生成するアラニンのラセミ化が起りやす
い、という問題点を有していた。
率が低い上、生成するアラニンのラセミ化が起りやす
い、という問題点を有していた。
また酵素法のうち、ヒダントイナーゼ、D−アシラー
ゼ、アミダーゼを用いる方法においては、原料が高価で
ある、基質分子の溶解度が低い、工業生産に耐え得る酵
素の入手が困難である等の問題点を有していた。
ゼ、アミダーゼを用いる方法においては、原料が高価で
ある、基質分子の溶解度が低い、工業生産に耐え得る酵
素の入手が困難である等の問題点を有していた。
一方、D−トランスアミナーゼを用いてD−アミノ酸
を製造する方法(前掲;特開昭62−205790)は、複数酵
素の共役により構成される二種類の反応系が例示されて
いるが、そのうちアラニンラセマーゼを系内に含む場合
には、そのままの形ではD−アラニンの生産には適さな
い。また、例示されているもう一つの系はアラニンラセ
マーゼを含まないが、製造目的であるD−アミノ酸と等
しいモル数だけ対応するα−ケト酸(D−アラニンの場
合は、ピルビン酸)を添加する必要があり、D−アラニ
ン生産という観点からは、必ずしも経済的な方法ではな
い。
を製造する方法(前掲;特開昭62−205790)は、複数酵
素の共役により構成される二種類の反応系が例示されて
いるが、そのうちアラニンラセマーゼを系内に含む場合
には、そのままの形ではD−アラニンの生産には適さな
い。また、例示されているもう一つの系はアラニンラセ
マーゼを含まないが、製造目的であるD−アミノ酸と等
しいモル数だけ対応するα−ケト酸(D−アラニンの場
合は、ピルビン酸)を添加する必要があり、D−アラニ
ン生産という観点からは、必ずしも経済的な方法ではな
い。
一方、アスパラギン酸をアミノ基供与体とするトラン
スアミナーゼ反応において、副生するオキサロ酢酸を脱
炭酸することにより反応効率を向上させる方法として従
来知られていたもの(前掲;昭和61年度日本農芸化学会
大会講演要旨集p.220,特開昭61−21091,特開昭60−9199
3等)は、アラニンが製造の対象とされていないことも
あって、オキサロ酢酸を脱炭酸することの意義は、専ら
副生成物の系外への除去による反応促進という点にのみ
求められるものであった。したがって、オキサロ酢酸の
脱炭酸産物であるピルビン酸は、必ずしも有効には利用
されなかった。
スアミナーゼ反応において、副生するオキサロ酢酸を脱
炭酸することにより反応効率を向上させる方法として従
来知られていたもの(前掲;昭和61年度日本農芸化学会
大会講演要旨集p.220,特開昭61−21091,特開昭60−9199
3等)は、アラニンが製造の対象とされていないことも
あって、オキサロ酢酸を脱炭酸することの意義は、専ら
副生成物の系外への除去による反応促進という点にのみ
求められるものであった。したがって、オキサロ酢酸の
脱炭酸産物であるピルビン酸は、必ずしも有効には利用
されなかった。
[課題を解決するための手段] そこで本発明者らは、D−アラニンを低コストで製造
する方法に関し鋭意検討の結果、低廉な原料であるL−
アスパラギン酸およびピルビン酸を原料として、アスパ
ラギン酸ラセマーゼ、D−トランスアミナーゼ、および
オキサロ酢酸の脱炭酸反応を組合わせて使用することに
より、極めて効率的にD−アラニンのみを製造する方法
を新規に見出し、本発明を完成するに至った。
する方法に関し鋭意検討の結果、低廉な原料であるL−
アスパラギン酸およびピルビン酸を原料として、アスパ
ラギン酸ラセマーゼ、D−トランスアミナーゼ、および
オキサロ酢酸の脱炭酸反応を組合わせて使用することに
より、極めて効率的にD−アラニンのみを製造する方法
を新規に見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、低廉な原料であるL−アスパラギ
ン酸を出発基質とし、これにアスパラギン酸ラセマーゼ
を作用させ、生成するD−アスパラギン酸をアミノ基供
与体、ピルビン酸をアミノ基受容体とするD−トランス
アミナーゼ反応によってD−アラニンを生成せしめ、同
時に副生するオキサロ酢酸をオキサロ酢酸脱炭酸酵素の
存在下に脱炭酸することによって反応系から駆追すると
ともに、生成したピルビン酸が原料基質の一部として同
時に供給されることによって、本来平衡反応であるD−
トランスアミナーゼ反応をD−アラニン生成方向に進行
させ、その結果効率よくD−アラニンを蓄積させること
を特徴とするD−アラニンの製造方法に関するものであ
る。
ン酸を出発基質とし、これにアスパラギン酸ラセマーゼ
を作用させ、生成するD−アスパラギン酸をアミノ基供
与体、ピルビン酸をアミノ基受容体とするD−トランス
アミナーゼ反応によってD−アラニンを生成せしめ、同
時に副生するオキサロ酢酸をオキサロ酢酸脱炭酸酵素の
存在下に脱炭酸することによって反応系から駆追すると
ともに、生成したピルビン酸が原料基質の一部として同
時に供給されることによって、本来平衡反応であるD−
トランスアミナーゼ反応をD−アラニン生成方向に進行
させ、その結果効率よくD−アラニンを蓄積させること
を特徴とするD−アラニンの製造方法に関するものであ
る。
以下に、本発明の酵素反応系及び使用酵素について説
明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明の酵素反応系は下記(I)式で表されるもので
ある。
ある。
初発原料のD−アスパラギン酸を製造するには例え
ば、L−アスパラギン酸を用いるが、L−アスパラギン
酸のかわりにラセミ体のアスパラギン酸を用いてもよ
い。もしくは、さらに低廉な原料であるフマール酸を用
いてもよい。
ば、L−アスパラギン酸を用いるが、L−アスパラギン
酸のかわりにラセミ体のアスパラギン酸を用いてもよ
い。もしくは、さらに低廉な原料であるフマール酸を用
いてもよい。
フマール酸を用いる場合には、アスパルターゼによっ
て、L−アスパラギン酸を生成させることが必要である
が、該製造方法に関しては、Biotechnol.Bioeng.,15,69
(1973)などにおいて既に知られているものである。
て、L−アスパラギン酸を生成させることが必要である
が、該製造方法に関しては、Biotechnol.Bioeng.,15,69
(1973)などにおいて既に知られているものである。
L−アスパラギン酸は、アスパラギン酸ラセマーゼの
作用によりD−アスパラギン酸となるが、該酵素は例え
ば、J.Biol.Chem.,247,(16)5103(1972)等によって
知られている。
作用によりD−アスパラギン酸となるが、該酵素は例え
ば、J.Biol.Chem.,247,(16)5103(1972)等によって
知られている。
該反応によって生成したD−アスパラギン酸は共存す
るピルビン酸とともにD−トランスアミナーゼの基質と
なり、直ちにD−アニランおよびオキサロ酢酸が生成す
る。
るピルビン酸とともにD−トランスアミナーゼの基質と
なり、直ちにD−アニランおよびオキサロ酢酸が生成す
る。
D−トランスアミナーゼは、D体特異的でありピルビ
ン酸とD−アスパラギン酸からD−アラニンを生成し得
るものであればどのようなものでも使用可能であるが、
そのような酵素としては、例えば種々のバチルス属細菌
由来のもの(Method in Enzymol 17A,p167(70),J.Bio
l.Chem.,250,6983(1975),特開昭61−187787)が知ら
れている他、土壌細菌などから比較的容易に入手し調製
することが可能である。
ン酸とD−アスパラギン酸からD−アラニンを生成し得
るものであればどのようなものでも使用可能であるが、
そのような酵素としては、例えば種々のバチルス属細菌
由来のもの(Method in Enzymol 17A,p167(70),J.Bio
l.Chem.,250,6983(1975),特開昭61−187787)が知ら
れている他、土壌細菌などから比較的容易に入手し調製
することが可能である。
一方、D−トランスアミナーゼ反応は、本質的に可逆
反応であるため、見掛け上の反応速度を低下させること
なく効率的にD−アラニンを生産させるためには、反応
生成物の一部もしくは全部を該反応系外に連続的に除去
するか、もしくは原料化合物を供給することが必要であ
る。
反応であるため、見掛け上の反応速度を低下させること
なく効率的にD−アラニンを生産させるためには、反応
生成物の一部もしくは全部を該反応系外に連続的に除去
するか、もしくは原料化合物を供給することが必要であ
る。
この様な条件を実現させるためには、該反応系にオキ
サロ酢酸脱炭酸酵素を共存させることが有効である。す
なわち、該D−トランスアミナーゼ反応においては、目
的とするD−アラニンのほかにオキサロ酢酸が副生する
が、該系にオキサロ酢酸脱炭酸酵素を共存させると、オ
キサロ酢酸は直ちにピルビン酸となって、平衡反応系外
に一旦除去される。さらに、同じに生成したピルビン酸
は、そのままD−トランスアミナーゼ反応の一方の基質
として連続的に供給することができるため、ピルビン酸
を特別に分離することなく、反応平衡を目的とするD−
アラニン生成方向に偏らせることができるので極めて好
都合である。このことは、同時に、原料基質であるアス
パラギン酸をアミノ基供与体として利用するのみなら
ず、その炭素骨格をも無駄なく有効にD−アラニンに転
換できることを意味するため、オキサロ酢酸脱炭酸酵素
を添加することにより、D−アラニンの生産効率は相乗
的に高まる。
サロ酢酸脱炭酸酵素を共存させることが有効である。す
なわち、該D−トランスアミナーゼ反応においては、目
的とするD−アラニンのほかにオキサロ酢酸が副生する
が、該系にオキサロ酢酸脱炭酸酵素を共存させると、オ
キサロ酢酸は直ちにピルビン酸となって、平衡反応系外
に一旦除去される。さらに、同じに生成したピルビン酸
は、そのままD−トランスアミナーゼ反応の一方の基質
として連続的に供給することができるため、ピルビン酸
を特別に分離することなく、反応平衡を目的とするD−
アラニン生成方向に偏らせることができるので極めて好
都合である。このことは、同時に、原料基質であるアス
パラギン酸をアミノ基供与体として利用するのみなら
ず、その炭素骨格をも無駄なく有効にD−アラニンに転
換できることを意味するため、オキサロ酢酸脱炭酸酵素
を添加することにより、D−アラニンの生産効率は相乗
的に高まる。
オキサロ酢酸の脱炭酸は、必ずしも酵素的な方法での
み起こるものではなく、酵素のない状態においてもある
程度自然に進行する。しかし、上式(I)に示されたD
−アラニン生産系全体において、該脱炭酸は律速となる
反応過程であり、工業的に高い生産性を得るためには、
酵素によってできるだけ速やかに脱炭酸反応を進行させ
ることが必要である。
み起こるものではなく、酵素のない状態においてもある
程度自然に進行する。しかし、上式(I)に示されたD
−アラニン生産系全体において、該脱炭酸は律速となる
反応過程であり、工業的に高い生産性を得るためには、
酵素によってできるだけ速やかに脱炭酸反応を進行させ
ることが必要である。
オキサロ酢酸脱炭酸酵素は例えば、ミクロコッカス
ルテウス(Micrococcus luteus)、シュードモナス プ
チダ(Pseudomonas putida)、アゾトバクター ビネラ
ンディ(Azotobactor vinelandii)、アセトバクター
アセティ(Acetobactor aceti)、ストレプトコッカス
フェーカリス(Streptococcus faecalis)等から調製
することができる。
ルテウス(Micrococcus luteus)、シュードモナス プ
チダ(Pseudomonas putida)、アゾトバクター ビネラ
ンディ(Azotobactor vinelandii)、アセトバクター
アセティ(Acetobactor aceti)、ストレプトコッカス
フェーカリス(Streptococcus faecalis)等から調製
することができる。
本発明において使用する酵素は、精製標品を使用する
ことが必須ではないが、不要な妨害副反応の影響を回避
するために、少なくともD−トランスアミナーゼ及びオ
キサロ酢酸脱炭酸酵素の反応系から、L−トランスアミ
ナーゼ及びアラニンラセマーゼの両酵素活性を除去もし
くは許容される限度以下にまで低下させることは必須で
ある。その為の方法としては、通常知られている方法に
より酵素を精製することの他、耐熱性酵素遺伝子を大腸
菌などの常温宿主にクローン化し、目的酵素と不要酵素
との熱安定性の差異に基づいて加熱部分精製を行なう方
法や、種々pHに対する耐性の差異を利用して目的酵素を
簡便に部分精製する方法等を適宜使用することができ
る。
ことが必須ではないが、不要な妨害副反応の影響を回避
するために、少なくともD−トランスアミナーゼ及びオ
キサロ酢酸脱炭酸酵素の反応系から、L−トランスアミ
ナーゼ及びアラニンラセマーゼの両酵素活性を除去もし
くは許容される限度以下にまで低下させることは必須で
ある。その為の方法としては、通常知られている方法に
より酵素を精製することの他、耐熱性酵素遺伝子を大腸
菌などの常温宿主にクローン化し、目的酵素と不要酵素
との熱安定性の差異に基づいて加熱部分精製を行なう方
法や、種々pHに対する耐性の差異を利用して目的酵素を
簡便に部分精製する方法等を適宜使用することができ
る。
反応温度は、本発明において用いられる当該酵素が失
活しない温度範囲であればいずれの温度でもよいが、通
常10〜50℃好ましくは、20〜45℃の範囲で実施される。
また反応pHは、通常5〜9好ましくは6.5〜8.5の範囲で
実施される。
活しない温度範囲であればいずれの温度でもよいが、通
常10〜50℃好ましくは、20〜45℃の範囲で実施される。
また反応pHは、通常5〜9好ましくは6.5〜8.5の範囲で
実施される。
また本発明に使用する酵素類を、微生物から分離した
後そのまま可溶性の状態で用いるのみならず、種々な担
体に固定化した状態で実施する場合にも本発明の範疇に
属するものである。
後そのまま可溶性の状態で用いるのみならず、種々な担
体に固定化した状態で実施する場合にも本発明の範疇に
属するものである。
以下に本発明の実施例について説明するが、なんらこ
れに限定されるものではない。
れに限定されるものではない。
[実施例] 以下の実施例で使用した諸酵素の調製方法を示す。
D−トランスアミナーゼは、バチルス スフェリカス
(Bacillus sphaericus)IFO3525を、3L坂口フラスコ
中、ニュートリエントブロス500mlを用いて好気培養
し、後期対数増殖期で集菌後生理食塩水で洗菌した。さ
らに該菌体を超音波破砕後、遠心により破砕残渣を除去
し、粗酵素抽出液とした。該抽出液を硫安分画後DEAEセ
ファデックスカラムクロマトグラフィー、セファクリル
S−300クロマトグラフィーにて処理したものを部分精
製標品とし、以下の実施例に供した。
(Bacillus sphaericus)IFO3525を、3L坂口フラスコ
中、ニュートリエントブロス500mlを用いて好気培養
し、後期対数増殖期で集菌後生理食塩水で洗菌した。さ
らに該菌体を超音波破砕後、遠心により破砕残渣を除去
し、粗酵素抽出液とした。該抽出液を硫安分画後DEAEセ
ファデックスカラムクロマトグラフィー、セファクリル
S−300クロマトグラフィーにて処理したものを部分精
製標品とし、以下の実施例に供した。
ただし、D−トランスアミナーゼにおいては、37℃下
100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)、0.025mMピリ
ドキサールリン酸、2.5mM D−アスパラギン酸、2.5mMピ
ルビン酸を含む溶液中に酵素溶液を添加した時、1分間
に1μモルのD−アラニンを生成する酵素量を1Uと定義
する。
100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)、0.025mMピリ
ドキサールリン酸、2.5mM D−アスパラギン酸、2.5mMピ
ルビン酸を含む溶液中に酵素溶液を添加した時、1分間
に1μモルのD−アラニンを生成する酵素量を1Uと定義
する。
アスパラギン酸ラセマーゼは、ストレプトコッカス
サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)IAM100
64を5Lコルベン中2Lの乳酸菌接種用培地(日水製薬製)
を用いて静置培養し、後期対数増殖期で集菌後生理食塩
水で洗菌した。更に該菌体を超音波破砕後遠心により破
砕残渣を除去し、粗酵素抽出液とした。該抽出液をトヨ
パールHW65F,セファクリルS−200,DEAE−セファロース
の各クロマトグラフィー処理にかけ、部分精製標品と
し、以下の実施例に供した。
サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)IAM100
64を5Lコルベン中2Lの乳酸菌接種用培地(日水製薬製)
を用いて静置培養し、後期対数増殖期で集菌後生理食塩
水で洗菌した。更に該菌体を超音波破砕後遠心により破
砕残渣を除去し、粗酵素抽出液とした。該抽出液をトヨ
パールHW65F,セファクリルS−200,DEAE−セファロース
の各クロマトグラフィー処理にかけ、部分精製標品と
し、以下の実施例に供した。
ただし、アスパラギン酸ラセマーゼにおいては、37℃
下100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)、0.025mMピ
リドキサールリン酸、2.5mM L−アスパラギン酸、を含
む溶液中に酵素を添加した時、1分間に1μモルのD−
アスパラギン酸を生成する酵素量を1Uと定義する。
下100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)、0.025mMピ
リドキサールリン酸、2.5mM L−アスパラギン酸、を含
む溶液中に酵素を添加した時、1分間に1μモルのD−
アスパラギン酸を生成する酵素量を1Uと定義する。
オキサロ酢酸脱炭酸酵素は、シュードモナス プチダ
(Pseudomonas putida)IAN1505を3L坂口フラスコ
中、ニュートリエントブロス500mlを用いて好気培養
し、後期対数増殖期で集菌後生理食塩水で洗菌した。更
に該菌体を超音波破砕後、遠心により破砕残渣を除去
し、粗酵素抽出液とした。該抽出液をDEAEセファロー
ス、セファクリルS−300、ブチルセファロースカラム
の各クロマトグラフィー処理にかけ、部分精製標品と
し、以下の実験に供した。
(Pseudomonas putida)IAN1505を3L坂口フラスコ
中、ニュートリエントブロス500mlを用いて好気培養
し、後期対数増殖期で集菌後生理食塩水で洗菌した。更
に該菌体を超音波破砕後、遠心により破砕残渣を除去
し、粗酵素抽出液とした。該抽出液をDEAEセファロー
ス、セファクリルS−300、ブチルセファロースカラム
の各クロマトグラフィー処理にかけ、部分精製標品と
し、以下の実験に供した。
ただし、オキサロ酢酸脱炭酸酵素においては、37℃
下、100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)、2.5mMオ
キサロ酢酸、0.5mM塩化マグネシウムを含む溶液中で、
1分間に1μモルのピルビン酸を生成する酵素量を1Uと
定義する。
下、100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)、2.5mMオ
キサロ酢酸、0.5mM塩化マグネシウムを含む溶液中で、
1分間に1μモルのピルビン酸を生成する酵素量を1Uと
定義する。
尚、全ての部分精製標品はアラニンラセマーゼおよび
L−トランスアミナーゼの両酵素活性を有しないことを
確認した。
L−トランスアミナーゼの両酵素活性を有しないことを
確認した。
実施例1 反応液組成として、1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.
0)20μ1、5mMピリドキサールリン酸1μ1、50mM D−
アスパラギン酸10μ1、150mMピルビン酸10μ1、D−
トランスアミナーゼ溶液60μ1(4mU)、精製水110μ1
を含む溶液を37℃下反応させた。
0)20μ1、5mMピリドキサールリン酸1μ1、50mM D−
アスパラギン酸10μ1、150mMピルビン酸10μ1、D−
トランスアミナーゼ溶液60μ1(4mU)、精製水110μ1
を含む溶液を37℃下反応させた。
次いで反応時間3時間後の反応液より100μ1を分取
し、該分取液にオキサロ酢酸脱炭酸酵素の1mM塩化マグ
ネシウム溶液110μ1(40mU)を加え、分取した残りの
反応液100μ1には該酵素を含まない塩化マグネシウム
溶液110μ1を加え、ともに37℃下さらに1.5時間反応さ
せた。
し、該分取液にオキサロ酢酸脱炭酸酵素の1mM塩化マグ
ネシウム溶液110μ1(40mU)を加え、分取した残りの
反応液100μ1には該酵素を含まない塩化マグネシウム
溶液110μ1を加え、ともに37℃下さらに1.5時間反応さ
せた。
その結果、各々の場合においてD−アスパラギン酸の
減少およびD−アラニンの生成を認めたが、オキサロ酢
酸脱炭酸酵素無添加の場合のD−アラニン生成収率が79
%であったのに対し、添加した場合は91%であった。
減少およびD−アラニンの生成を認めたが、オキサロ酢
酸脱炭酸酵素無添加の場合のD−アラニン生成収率が79
%であったのに対し、添加した場合は91%であった。
その結果を表1に示す。
実施例2 実施例1における反応液組成のうち、精製水110μ1
のかわりに、オキサロ酢酸脱炭酸酵素の5mM塩化マグネ
シウム溶液110μ1(40mU)を含む反応溶液を、実施例
1と同様な条件下にインキュベートし4.5時間後に、サ
ンプリングおよび分析を行なった。
のかわりに、オキサロ酢酸脱炭酸酵素の5mM塩化マグネ
シウム溶液110μ1(40mU)を含む反応溶液を、実施例
1と同様な条件下にインキュベートし4.5時間後に、サ
ンプリングおよび分析を行なった。
その結果を表2に示す。
実施例3 反応液組成として、1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.
0)20μ1、5mMピリドキサールリン酸1μ1、50mM L−
アスパラギン酸10μ1、150mMピルビン酸10μ1、D−
トランスアミナーゼ溶液60μ1(4mU)、オキサロ酢酸
脱炭酸酵素の5mM塩化マグネシウム溶液20μ1(40mU)
およびアスパラギン酸ラセマーゼ溶液90μ1(1mU)を
含む溶液を37℃下6時間インキュベートした後、適当量
をサンプリングした。更に50%トリクロル酢酸をサンプ
リング容量に対し10%添加して反応を停止し、遠心によ
り除蛋白した後アミノ酸分析装置により、生成したD−
アラニンおよびアスパラギン酸(ラセミ体)を定量し
た。その結果を表2に示す。
0)20μ1、5mMピリドキサールリン酸1μ1、50mM L−
アスパラギン酸10μ1、150mMピルビン酸10μ1、D−
トランスアミナーゼ溶液60μ1(4mU)、オキサロ酢酸
脱炭酸酵素の5mM塩化マグネシウム溶液20μ1(40mU)
およびアスパラギン酸ラセマーゼ溶液90μ1(1mU)を
含む溶液を37℃下6時間インキュベートした後、適当量
をサンプリングした。更に50%トリクロル酢酸をサンプ
リング容量に対し10%添加して反応を停止し、遠心によ
り除蛋白した後アミノ酸分析装置により、生成したD−
アラニンおよびアスパラギン酸(ラセミ体)を定量し
た。その結果を表2に示す。
尚、以上の実施例における反応収率の測定は、サンプ
リング液に、50%トリクロル酢酸をサンプリング容量に
対し10%添加して反応を停止し、遠心により除蛋白した
後アミノ酸分析装置により、生成したアラニンおよび残
存するアスパラギン酸を定量することにより行なった。
リング液に、50%トリクロル酢酸をサンプリング容量に
対し10%添加して反応を停止し、遠心により除蛋白した
後アミノ酸分析装置により、生成したアラニンおよび残
存するアスパラギン酸を定量することにより行なった。
また、生成したアラニンの光学活性は、高速液体クロ
マトグラフィーキラルパックWE(ダイセル化学(株)
製)および、D−アミノ酸オキシダーゼにより確認し
た。その結果、生成アラニンは、D−体100%であっ
た。
マトグラフィーキラルパックWE(ダイセル化学(株)
製)および、D−アミノ酸オキシダーゼにより確認し
た。その結果、生成アラニンは、D−体100%であっ
た。
第1図は、D−アスパラギン酸、ピルビン酸、D−トラ
ンスアミナーゼ共存時のD−アラニン生成反応3時間目
において、オキサロ酢酸脱炭酸酵素を添加した場合と添
加しなかった場合の反応収率の差異を表す図である。 第2図は、反応開始当初よりD−アスパラギン酸、ピル
ビン酸、D−トランスアミナーゼ、オキサロ酢酸脱炭酸
酵素を共存させた場合の生成D−アラニン及び残存D−
アスパラギン酸の反応収率の経時変化を表す図である。 第3図は、L−アスパラギン酸、ピルビン酸、アスパラ
ギン酸ラセマーゼ、D−トランスアミナーゼ、オキサロ
酢酸脱炭酸酵素を共存させた場合の生成D−アラニンお
よび残存DL−アスパラギン酸の経時変化を示す図であ
る。
ンスアミナーゼ共存時のD−アラニン生成反応3時間目
において、オキサロ酢酸脱炭酸酵素を添加した場合と添
加しなかった場合の反応収率の差異を表す図である。 第2図は、反応開始当初よりD−アスパラギン酸、ピル
ビン酸、D−トランスアミナーゼ、オキサロ酢酸脱炭酸
酵素を共存させた場合の生成D−アラニン及び残存D−
アスパラギン酸の反応収率の経時変化を表す図である。 第3図は、L−アスパラギン酸、ピルビン酸、アスパラ
ギン酸ラセマーゼ、D−トランスアミナーゼ、オキサロ
酢酸脱炭酸酵素を共存させた場合の生成D−アラニンお
よび残存DL−アスパラギン酸の経時変化を示す図であ
る。
Claims (7)
- 【請求項1】D−アスパラギン酸をアミノ基供与体と
し、ピルピン酸をアミノ基受容体として、D−トランス
アミナーゼ存在下に両者を反応させてD−アラニンを製
造し、同時にあるいは次いで副生オキサロ酢酸をオキサ
ロ酢酸脱炭酸酵素の存在下に脱炭酸してピルビン酸を生
成させ、かかるピルビン酸を上記アミノ基受容体として
用いることを特徴とするD−アラニンの製造方法。 - 【請求項2】D−アスパラギン酸の製造をL−アスパラ
ギン酸のラセミ化によって行なう、請求項1記載の方
法。 - 【請求項3】L−アスパラギン酸のラセミ化をアスパラ
ギン酸ラセマーゼの存在下に行なう、請求項2記載の方
法。 - 【請求項4】D−アスパラギン酸を、ピルビン酸、オキ
サロ酢酸、D−トランスアミナーゼおよびオキサロ酢酸
脱炭酸酵素の存在する反応系中で反応させてD−アラニ
ンを製造することを特徴とするD−アラニンの製造方
法。 - 【請求項5】D−アスパラギン酸、ピルビン酸および/
またはオキサロ酢酸、D−トランスアミナーゼおよびオ
キサロ酢酸脱炭酸酵素を反応系に添加し、D−アスパラ
ギン酸とピルビン酸よりD−アラニンとオキサロ酢酸を
生成させるD−トランスアミナーゼ反応およびオキサロ
酢酸よりピルビン酸を生成させる脱炭酸反応を行なうこ
とを特徴とするD−アラニンの製造方法。 - 【請求項6】L−アスパラギン酸を、D−アスパラギン
酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸、アスパラギン酸ラセマ
ーゼ、D−トランスアミナーゼおよびオキサロ酢酸脱炭
酸酵素の存在する反応系中で反応させてD−アラニンを
製造することを特徴とするD−アラニンの製造方法。 - 【請求項7】L−アスパラギン酸、ピルビン酸および/
またはオキサロ酢酸、アスパラギン酸ラセマーゼ、D−
トランスアミナーゼ、およびオキサロ酢酸脱炭酸酵素を
反応系に添加し、L−アスパラギン酸をD−アスパラギ
ン酸に変換させるラセミ化反応、D−アスパラギン酸と
ピルビン酸よりD−アラニンとオキサロ酢酸を生成させ
るD−トランスアミナーゼ反応、およびオキサロ酢酸よ
りピルビン酸を生成させる脱炭酸反応を行なうことを特
徴とするD−アラニンの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63323665A JP2771825B2 (ja) | 1988-12-23 | 1988-12-23 | D‐アラニンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63323665A JP2771825B2 (ja) | 1988-12-23 | 1988-12-23 | D‐アラニンの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02171193A JPH02171193A (ja) | 1990-07-02 |
JP2771825B2 true JP2771825B2 (ja) | 1998-07-02 |
Family
ID=18157243
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63323665A Expired - Fee Related JP2771825B2 (ja) | 1988-12-23 | 1988-12-23 | D‐アラニンの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2771825B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101493311B1 (ko) | 2012-12-13 | 2015-02-16 | 연세대학교 산학협력단 | 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법 |
KR101806873B1 (ko) * | 2016-05-24 | 2017-12-12 | 주식회사 엠에이치투 바이오케미칼 | 융합 효소를 이용한 d-알라닌의 제조방법 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01285192A (ja) * | 1988-05-12 | 1989-11-16 | Daicel Chem Ind Ltd | D−アラニンの製造方法 |
-
1988
- 1988-12-23 JP JP63323665A patent/JP2771825B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPH01285192A (ja) * | 1988-05-12 | 1989-11-16 | Daicel Chem Ind Ltd | D−アラニンの製造方法 |
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---|---|---|---|---|
KR101493311B1 (ko) | 2012-12-13 | 2015-02-16 | 연세대학교 산학협력단 | 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법 |
KR101806873B1 (ko) * | 2016-05-24 | 2017-12-12 | 주식회사 엠에이치투 바이오케미칼 | 융합 효소를 이용한 d-알라닌의 제조방법 |
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Publication number | Publication date |
---|---|
JPH02171193A (ja) | 1990-07-02 |
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