JP2002253268A - 新規変異型ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素及びｌ−アルギニンの製造法 - Google Patents
新規変異型ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素及びｌ−アルギニンの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 フィードバック阻害に耐性な変異を有し、か
つ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸合成酵
素及び同酵素を保持するＬ−アルギニン生産菌を提供す
る。 【解決手段】 野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵
素の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が配列番号
１〜４のいずれかのアミノ酸配列で置換されたアミノ酸
配列を有し、かつ、Ｌ−アルギニンによるフィードバッ
ク阻害が解除された変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合
成酵素をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細
菌を培地で培養し、Ｌ−アルギニンを培地中に生成蓄積
させ、該培地よりＬ−アルギニンを採取することにより
Ｌ−アルギニンを製造する。
つ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸合成酵
素及び同酵素を保持するＬ−アルギニン生産菌を提供す
る。 【解決手段】 野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵
素の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が配列番号
１〜４のいずれかのアミノ酸配列で置換されたアミノ酸
配列を有し、かつ、Ｌ−アルギニンによるフィードバッ
ク阻害が解除された変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合
成酵素をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細
菌を培地で培養し、Ｌ−アルギニンを培地中に生成蓄積
させ、該培地よりＬ−アルギニンを採取することにより
Ｌ−アルギニンを製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物工業に関
し、Ｌ−アルギニンの製造法及びエシェリヒア・コリの
アルギニン生産菌のアルギニン生合成系における新規な
フィードバック阻害型変異酵素の使用に関する。
し、Ｌ−アルギニンの製造法及びエシェリヒア・コリの
アルギニン生産菌のアルギニン生合成系における新規な
フィードバック阻害型変異酵素の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】エシェリヒア・コリ細胞におけるグルタ
ミン酸からアルギニンへの生合成は、Ｎ−アセチルグル
タミン酸合成酵素（以下、「NAGS」ともいう）によるグ
ルタミン酸のアセチル化に始まる連続反応によって行わ
れる。このプロセスは、アルギニンによる、レギュロン
の転写抑制及びNAGSのフィードバック阻害を介して調節
されている（Cunin R., et al., Microbiol. Rev., 50,
314-352, 1986）。アルギニンは、argAの発現を２５０
倍以上抑制し、NAGS活性を阻害する（Ki=0.02 mM）（Le
isinger T., Haas D., J. Biol. Chem., 250, 1690-169
3, 1975）。エシェリヒア・コリにおいてアルギニン生
合成を増強するためには、フィードバック阻害に対して
耐性（fbr）なNAGS酵素が必要である。
ミン酸からアルギニンへの生合成は、Ｎ−アセチルグル
タミン酸合成酵素（以下、「NAGS」ともいう）によるグ
ルタミン酸のアセチル化に始まる連続反応によって行わ
れる。このプロセスは、アルギニンによる、レギュロン
の転写抑制及びNAGSのフィードバック阻害を介して調節
されている（Cunin R., et al., Microbiol. Rev., 50,
314-352, 1986）。アルギニンは、argAの発現を２５０
倍以上抑制し、NAGS活性を阻害する（Ki=0.02 mM）（Le
isinger T., Haas D., J. Biol. Chem., 250, 1690-169
3, 1975）。エシェリヒア・コリにおいてアルギニン生
合成を増強するためには、フィードバック阻害に対して
耐性（fbr）なNAGS酵素が必要である。
【０００３】フィードバック耐性変異酵素は、自然突然
変異により、又は化学的もしくは部位特異的変異により
取得され得る。いくつかのargAのfbr変異が単離され、
研究されている。セラチア・マルセッセンスは、染色体
上にargAのfbr変異を持つと細胞は不安定となり、活性
の減少又はグルタミン酸に対する親和性の変化を伴うar
gA変異が生じる（Takagi T, etal., J. Biochem., 99,
357-364, 1986）。
変異により、又は化学的もしくは部位特異的変異により
取得され得る。いくつかのargAのfbr変異が単離され、
研究されている。セラチア・マルセッセンスは、染色体
上にargAのfbr変異を持つと細胞は不安定となり、活性
の減少又はグルタミン酸に対する親和性の変化を伴うar
gA変異が生じる（Takagi T, etal., J. Biochem., 99,
357-364, 1986）。
【０００４】fbrのNAGSを持つ５株のエシェリヒア・コ
リ由来のfbr argA遺伝子がクローニングされ、各々のfb
r NAGS株においてargA遺伝子中に別々の一塩基置換が見
出され、１５位のHisからtyr、１９位のTyrからCys、５
４位のSerからAsn、５８位のArgからHis、２８７位のGl
yからSer、及び、４３２位のGlnからArgへの置換が明ら
かになっている（Rajagopal, B.S. et al., Appl. Envi
ron. Microbiol., 1998, v.64. No.5, p.1805-1811）。
リ由来のfbr argA遺伝子がクローニングされ、各々のfb
r NAGS株においてargA遺伝子中に別々の一塩基置換が見
出され、１５位のHisからtyr、１９位のTyrからCys、５
４位のSerからAsn、５８位のArgからHis、２８７位のGl
yからSer、及び、４３２位のGlnからArgへの置換が明ら
かになっている（Rajagopal, B.S. et al., Appl. Envi
ron. Microbiol., 1998, v.64. No.5, p.1805-1811）。
【０００５】酵素のfbr形質は、大抵の場合、１又は数
個の位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸による置換の結
果として生じる。これらの置換は、酵素活性の低下につ
ながる。例えば、エシェリヒア・コリのセリンアセチル
トランスフェラーゼ（SAT）（cysE遺伝子）における２
５６位の天然Metが他のアミノ酸残基によって置換され
ると、多くの場合fbr形質になるが、変異SATタンパク質
は天然SATの活性のレベルには維持されない（Nakamuri
S. et al., AEM, 64(5):1607-11, 1998）。このよう
に、これらの方法によって得られる変異酵素の不利な点
は、変異酵素は野生型酵素に比べて活性が低いことであ
る。
個の位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸による置換の結
果として生じる。これらの置換は、酵素活性の低下につ
ながる。例えば、エシェリヒア・コリのセリンアセチル
トランスフェラーゼ（SAT）（cysE遺伝子）における２
５６位の天然Metが他のアミノ酸残基によって置換され
ると、多くの場合fbr形質になるが、変異SATタンパク質
は天然SATの活性のレベルには維持されない（Nakamuri
S. et al., AEM, 64(5):1607-11, 1998）。このよう
に、これらの方法によって得られる変異酵素の不利な点
は、変異酵素は野生型酵素に比べて活性が低いことであ
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、エシェリヒ
ア・コリのアルギニン生合成において、重要な役割を果
たす酵素について、フィードバック阻害に耐性な変異を
有し、かつ、高い活性を有する酵素を提供することを、
課題の一つとするものである。
ア・コリのアルギニン生合成において、重要な役割を果
たす酵素について、フィードバック阻害に耐性な変異を
有し、かつ、高い活性を有する酵素を提供することを、
課題の一つとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明においては、argA
遺伝子断片の完全無作為化による、多数組の変異型argA
遺伝子の新規な合成法が提案される。タンパク質配列の
うちfbr変異を局在化し得る断片において、いくつかの
アミノ酸を同時置換することによって、酵素の三次元構
造がより正しく維持されることにより天然体に近い活性
のレベルを維持した変異型タンパク質を取得することが
できる。
遺伝子断片の完全無作為化による、多数組の変異型argA
遺伝子の新規な合成法が提案される。タンパク質配列の
うちfbr変異を局在化し得る断片において、いくつかの
アミノ酸を同時置換することによって、酵素の三次元構
造がより正しく維持されることにより天然体に近い活性
のレベルを維持した変異型タンパク質を取得することが
できる。
【０００８】かくして、以下に示す本発明がなされるに
至った。、 （１）野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素の１５
位〜１９位に相当するアミノ酸配列が配列番号１〜４の
いずれかのアミノ酸配列で置換されたアミノ酸配列を有
し、かつ、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害が
解除された変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素。 （２）野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素がエシ
ェリヒア・コリのＮ−アセチルグルタミン酸合成酵素で
ある（１）の変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵
素。 （３）１５位〜１９位以外の１又は複数の位置におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は
付加を含み、かつ、Ｌ−アルギニンによるフィードバッ
ク阻害が解除された（１）又は（２）の変異型Ｎ−アセ
チルグルタミン酸合成酵素。 （４）（１）〜（３）のいずれかの変異型Ｎ−アセチル
グルタミン酸合成酵素をコードするＤＮＡ。 （５）（４）のＤＮＡで形質転換され、かつ、Ｌ−アル
ギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌。 （６）（５）のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、Ｌ
−アルギニンを培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−
アルギニンを採取することを特徴とするＬ−アルギニン
の製造法。
至った。、 （１）野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素の１５
位〜１９位に相当するアミノ酸配列が配列番号１〜４の
いずれかのアミノ酸配列で置換されたアミノ酸配列を有
し、かつ、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害が
解除された変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素。 （２）野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素がエシ
ェリヒア・コリのＮ−アセチルグルタミン酸合成酵素で
ある（１）の変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵
素。 （３）１５位〜１９位以外の１又は複数の位置におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は
付加を含み、かつ、Ｌ−アルギニンによるフィードバッ
ク阻害が解除された（１）又は（２）の変異型Ｎ−アセ
チルグルタミン酸合成酵素。 （４）（１）〜（３）のいずれかの変異型Ｎ−アセチル
グルタミン酸合成酵素をコードするＤＮＡ。 （５）（４）のＤＮＡで形質転換され、かつ、Ｌ−アル
ギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌。 （６）（５）のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、Ｌ
−アルギニンを培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−
アルギニンを採取することを特徴とするＬ−アルギニン
の製造法。
【０００９】本明細書において、上記のようなfbr変異
を有するNAGSを変異型NAGS、変異型NAGSをコードするＤ
ＮＡを変異型argA遺伝子ということがある。また、前記
変異を有しないNAGSを野生型NAGSということがある。
を有するNAGSを変異型NAGS、変異型NAGSをコードするＤ
ＮＡを変異型argA遺伝子ということがある。また、前記
変異を有しないNAGSを野生型NAGSということがある。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】＜１＞変異型NAGS及び変異型argA遺伝子 本発明の変異型NAGS及びそれをコードする変異型argA遺
伝子は、無作為化断片による突然変異誘発によって取得
された。argA遺伝子における多数の変異を得るため、タ
ンパク質配列の１５位から１９位のアミノ酸残基の領域
をコードするargA遺伝子の１５ヌクレオチドからなる断
片の完全無作為化を行った。完全無作為化された１５ヌ
クレオチドの断片は、415すなわち約1019の異なるDNA配
列を生じさせ、これらは５merのペプチドにおいて205の
異なるアミノ酸残基をコードすることができる。これら
の配列においてストップコドンがフレームに入らない確
率は、約0.955すなわち78％に相当する。したがって、
１５位から１９位のアミノ酸残基のペプチドをコードす
るargA遺伝子断片の完全無作為化は、NAGS構造における
このペプチドの多様性を有するおよそ250万の異なるタ
ンパク質配列を生じさせるはずである。
伝子は、無作為化断片による突然変異誘発によって取得
された。argA遺伝子における多数の変異を得るため、タ
ンパク質配列の１５位から１９位のアミノ酸残基の領域
をコードするargA遺伝子の１５ヌクレオチドからなる断
片の完全無作為化を行った。完全無作為化された１５ヌ
クレオチドの断片は、415すなわち約1019の異なるDNA配
列を生じさせ、これらは５merのペプチドにおいて205の
異なるアミノ酸残基をコードすることができる。これら
の配列においてストップコドンがフレームに入らない確
率は、約0.955すなわち78％に相当する。したがって、
１５位から１９位のアミノ酸残基のペプチドをコードす
るargA遺伝子断片の完全無作為化は、NAGS構造における
このペプチドの多様性を有するおよそ250万の異なるタ
ンパク質配列を生じさせるはずである。
【００１２】続いて、発現ベクターにクローニングされ
た変異型argA遺伝子を保持する組換え株に選択及びスク
リーニングを行うことによって、抑制解除された野生型
NAGSの活性レベルに至るまでの種々のレベルの生理活性
を有するfbr変異体を選択することに成功した。その
際、argD-、かつ、proB-又はproA-の菌株は、培地中に
過剰のＬ−アルギニンが存在するとNAGSが阻害されてＬ
−プロリンが合成できず生育できないが、fbrのNAGSを
保持している場合は最少培地で生育できるので、変異型
argA保持株を選択することができると考えた。しかし、
後記実施例に示すように、この方法では活性の高いfbr
NAGSを得ることが難しく、変異型argA遺伝子を野生株に
導入し、生育の遅い株を選択することによって、活性の
高いfbr NAGSが得られることを見い出した。
た変異型argA遺伝子を保持する組換え株に選択及びスク
リーニングを行うことによって、抑制解除された野生型
NAGSの活性レベルに至るまでの種々のレベルの生理活性
を有するfbr変異体を選択することに成功した。その
際、argD-、かつ、proB-又はproA-の菌株は、培地中に
過剰のＬ−アルギニンが存在するとNAGSが阻害されてＬ
−プロリンが合成できず生育できないが、fbrのNAGSを
保持している場合は最少培地で生育できるので、変異型
argA保持株を選択することができると考えた。しかし、
後記実施例に示すように、この方法では活性の高いfbr
NAGSを得ることが難しく、変異型argA遺伝子を野生株に
導入し、生育の遅い株を選択することによって、活性の
高いfbr NAGSが得られることを見い出した。
【００１３】本発明により、fbr形質のNAGSとして適し
た変異型NAGSの配列が明らかとなったので、変異型NAGS
及びそれをコードする変異型argA遺伝子は、それらの配
列に基づいて、野生型argA遺伝子に通常の方法にしたが
って変異を導入することによって調製することができ
る。野生型argA遺伝子としては、エシェリヒア・コリの
argA遺伝子（GenBank Accession Y00492）が挙げられ
る。エシェリヒア・コリのargA遺伝子は、公知の塩基配
列に基づいて調製したプライマーを用いたＰＣＲによ
り、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡから増幅するこ
とによって取得することができる。
た変異型NAGSの配列が明らかとなったので、変異型NAGS
及びそれをコードする変異型argA遺伝子は、それらの配
列に基づいて、野生型argA遺伝子に通常の方法にしたが
って変異を導入することによって調製することができ
る。野生型argA遺伝子としては、エシェリヒア・コリの
argA遺伝子（GenBank Accession Y00492）が挙げられ
る。エシェリヒア・コリのargA遺伝子は、公知の塩基配
列に基づいて調製したプライマーを用いたＰＣＲによ
り、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡから増幅するこ
とによって取得することができる。
【００１４】本発明の変異型NAGSの１５位から１９位の
アミノ酸配列は、配列番号１〜４のいずれかである。
尚、エシェリヒア・コリの公知の変異型NAGS（１９位の
TyrのCysへの置換）及び野生型NAGSの相当するアミノ酸
配列を配列番号５、６に示す。また、各々のアミノ酸配
列をコードする塩基配列の例を配列番号７〜１２に示
す。これらの配列を表１に示す。
アミノ酸配列は、配列番号１〜４のいずれかである。
尚、エシェリヒア・コリの公知の変異型NAGS（１９位の
TyrのCysへの置換）及び野生型NAGSの相当するアミノ酸
配列を配列番号５、６に示す。また、各々のアミノ酸配
列をコードする塩基配列の例を配列番号７〜１２に示
す。これらの配列を表１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】また、本発明の変異型NAGSは、Ｌ−アルギ
ニンによるフィードバック阻害が解除され、NAGS活性、
すなわち、Ｌ−グルタミン酸をアセチル化してＮ−アセ
チルグルタミン酸を生成する反応を触媒する活性を有す
る限り、１５位〜１９位以外の１又は複数の位置におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は
付加を含んでいてもよい。
ニンによるフィードバック阻害が解除され、NAGS活性、
すなわち、Ｌ−グルタミン酸をアセチル化してＮ−アセ
チルグルタミン酸を生成する反応を触媒する活性を有す
る限り、１５位〜１９位以外の１又は複数の位置におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は
付加を含んでいてもよい。
【００１７】ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタ
ンパク質の立体構造における位置や種類によっても異な
る。それは、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ
酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、タンパク質
の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。従
って、NAGSを構成するアミノ酸配列全体に対し、３０〜
５０％以上、好ましくは５０〜７０％以上、より好まし
くは８０％以上の相同性を有し、fbr形質のNAGS活性を
有するものであってもよい。
ンパク質の立体構造における位置や種類によっても異な
る。それは、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ
酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、タンパク質
の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。従
って、NAGSを構成するアミノ酸配列全体に対し、３０〜
５０％以上、好ましくは５０〜７０％以上、より好まし
くは８０％以上の相同性を有し、fbr形質のNAGS活性を
有するものであってもよい。
【００１８】尚、本発明において、１５位〜１９位に相
当するアミノ酸配列とは、エシェリヒア・コリの野生型
NAGSのアミノ酸配列における１５位〜１９位のアミノ酸
配列に相当する配列をいう。上記のような活性に影響を
与えないアミノ酸の欠失、挿入又は付加によってアミノ
酸残基の位置が前後することがある。例えば、Ｎ末端部
に１つのアミノ酸残基が挿入されれば本来１５位のアミ
ノ酸残基は１６位となるが、そのような１５位のアミノ
酸残基に相当するアミノ酸残基を、本発明においては１
５位のアミノ酸残基と呼ぶこととする。
当するアミノ酸配列とは、エシェリヒア・コリの野生型
NAGSのアミノ酸配列における１５位〜１９位のアミノ酸
配列に相当する配列をいう。上記のような活性に影響を
与えないアミノ酸の欠失、挿入又は付加によってアミノ
酸残基の位置が前後することがある。例えば、Ｎ末端部
に１つのアミノ酸残基が挿入されれば本来１５位のアミ
ノ酸残基は１６位となるが、そのような１５位のアミノ
酸残基に相当するアミノ酸残基を、本発明においては１
５位のアミノ酸残基と呼ぶこととする。
【００１９】上記のような変異型NAGSと実質的に同一の
タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変
異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠
失、挿入又は付加を含むように塩基配列を改変すること
によって得られる。また、上記のような改変されたＤＮ
Ａは、従来知られている変異処理によっても取得され得
る。変異処理としては、変異型argA遺伝子を含むＤＮＡ
をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及
び変異型argA遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリ
ヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニト
ロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の
通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する
方法が挙げられる。
タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変
異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠
失、挿入又は付加を含むように塩基配列を改変すること
によって得られる。また、上記のような改変されたＤＮ
Ａは、従来知られている変異処理によっても取得され得
る。変異処理としては、変異型argA遺伝子を含むＤＮＡ
をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及
び変異型argA遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリ
ヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニト
ロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の
通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する
方法が挙げられる。
【００２０】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入又は付加等には、NAGSを保持する微生物の属、種、又
は菌株の個体差に基づく場合などの天然に生じる変異
（mutant又はvariant）も含まれる。
入又は付加等には、NAGSを保持する微生物の属、種、又
は菌株の個体差に基づく場合などの天然に生じる変異
（mutant又はvariant）も含まれる。
【００２１】上記のような変異を有するＤＮＡを適当な
細胞で発現させ、発現産物のNAGS活性を調べることによ
り、変異型NAGSと実質的に同一のタンパク質をコードす
るＤＮＡが得られる。
細胞で発現させ、発現産物のNAGS活性を調べることによ
り、変異型NAGSと実質的に同一のタンパク質をコードす
るＤＮＡが得られる。
【００２２】また、変異型NAGSを保持する細胞を変異処
理し、同細胞から公知のargA遺伝子配列を有するＤＮＡ
又は同遺伝子配列から調製され得るプローブとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、NAGS活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離すること
によっても、変異型NAGSと実質的に同一のタンパク質を
コードするＤＮＡが得られる。
理し、同細胞から公知のargA遺伝子配列を有するＤＮＡ
又は同遺伝子配列から調製され得るプローブとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、NAGS活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離すること
によっても、変異型NAGSと実質的に同一のタンパク質を
コードするＤＮＡが得られる。
【００２３】ここでいう「ストリンジェントな条件」と
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異
的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件
を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せ
ば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同
性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相
同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あ
るいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条
件である６０℃、好ましくは６５℃で、１×ＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が
挙げられる。
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異
的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件
を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せ
ば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同
性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相
同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あ
るいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条
件である６０℃、好ましくは６５℃で、１×ＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が
挙げられる。
【００２４】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性が低下又は消失したものも含ま
れるが、それらについては、市販の発現ベクターにつな
ぎNAGS活性を調べることによって容易に取り除くことが
できる。
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性が低下又は消失したものも含ま
れるが、それらについては、市販の発現ベクターにつな
ぎNAGS活性を調べることによって容易に取り除くことが
できる。
【００２５】＜２＞本発明のエシェリヒア属細菌 本発明のエシェリヒア属細菌は、上記の変異型argA遺伝
子が導入されたエシェリヒア属細菌である。エシェリヒ
ア属細菌として具体的には、エシェリヒア・コリが挙げ
られる。変異型argA遺伝子は、同遺伝子を含むＤＮＡ断
片をエシェリヒア属細菌中で機能するベクターに連結し
て得られる組換えＤＮＡを用いてエシェリヒア属細菌を
形質転換することによって、導入することができる。ま
た、染色体ＤＮＡ上のargA遺伝子を変異型argAに置き換
えることによっても、変異型argA遺伝子を導入すること
ができる。
子が導入されたエシェリヒア属細菌である。エシェリヒ
ア属細菌として具体的には、エシェリヒア・コリが挙げ
られる。変異型argA遺伝子は、同遺伝子を含むＤＮＡ断
片をエシェリヒア属細菌中で機能するベクターに連結し
て得られる組換えＤＮＡを用いてエシェリヒア属細菌を
形質転換することによって、導入することができる。ま
た、染色体ＤＮＡ上のargA遺伝子を変異型argAに置き換
えることによっても、変異型argA遺伝子を導入すること
ができる。
【００２６】argA遺伝子の導入に用いるベクターとして
は、pBR322、pMW118、pUC19等のプラスミドベクター、
λ1059、λBF101、M13mp9等のファージベクター、Mu、T
n10、Tn5等のトランスポゾン等が挙げられる。
は、pBR322、pMW118、pUC19等のプラスミドベクター、
λ1059、λBF101、M13mp9等のファージベクター、Mu、T
n10、Tn5等のトランスポゾン等が挙げられる。
【００２７】エシェリヒア属細菌へのＤＮＡの導入は、
D.A.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326
(1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理し
てＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,
J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等により行うことができ
る。
D.A.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326
(1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理し
てＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,
J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等により行うことができ
る。
【００２８】Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒ
ア属細菌において、上記のようにして変異型argA遺伝子
を導入すると、Ｌ−アルギニンの生産量を増大させるこ
とができる。また、変異型argA遺伝子を保持するエシェ
リヒア属細菌に、Ｌ−アルギニン生産能を付与してもよ
い。
ア属細菌において、上記のようにして変異型argA遺伝子
を導入すると、Ｌ−アルギニンの生産量を増大させるこ
とができる。また、変異型argA遺伝子を保持するエシェ
リヒア属細菌に、Ｌ−アルギニン生産能を付与してもよ
い。
【００２９】Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒ
ア・コリとしては、エシェリヒア・コリ237株（VKPM B-
7925）が挙げられる。同株は、2000年４月10日にRussia
n National Collection of Industrial Microorganisms
（VKPM）にVKPM B-7925の番号で寄託され、2001年５月1
8日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。
ア・コリとしては、エシェリヒア・コリ237株（VKPM B-
7925）が挙げられる。同株は、2000年４月10日にRussia
n National Collection of Industrial Microorganisms
（VKPM）にVKPM B-7925の番号で寄託され、2001年５月1
8日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。
【００３０】＜３＞Ｌ−アルギニンの製造法 上記のようにして、変異型argA遺伝子が導入され、Ｌ−
アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌を好適な
培地で培養し、該培地中にＬ−アルギニンを生産蓄積せ
しめ、該培地からＬ−アルギニンを採取することによ
り、Ｌ−アルギニンを効率よく製造することができる。
アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌を好適な
培地で培養し、該培地中にＬ−アルギニンを生産蓄積せ
しめ、該培地からＬ−アルギニンを採取することによ
り、Ｌ−アルギニンを効率よく製造することができる。
【００３１】本発明の製造法におけるエシェリヒア属細
菌の培養および培養液からのＬ−アルギニンの採取、精
製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるＬ−アルギ
ニンの製造法と同様にして行えばよい。培養に使用する
培地としては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要
があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有
するものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭
素源としては、グルコースやシュークロースをはじめと
する各種炭水化物、各種有機酸があげられる。また使用
する微生物の資化性によってはエタノールやグリセロー
ル等のアルコールを用いることが出来る。窒素源として
は、アンモニアや、硫酸アンモニウム等の各種のアンモ
ニウム塩類や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプト
ン、大豆加水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を
用いることが出来る。無機物としては、燐酸一カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、
硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が用いられる。
菌の培養および培養液からのＬ−アルギニンの採取、精
製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるＬ−アルギ
ニンの製造法と同様にして行えばよい。培養に使用する
培地としては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要
があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有
するものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭
素源としては、グルコースやシュークロースをはじめと
する各種炭水化物、各種有機酸があげられる。また使用
する微生物の資化性によってはエタノールやグリセロー
ル等のアルコールを用いることが出来る。窒素源として
は、アンモニアや、硫酸アンモニウム等の各種のアンモ
ニウム塩類や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプト
ン、大豆加水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を
用いることが出来る。無機物としては、燐酸一カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、
硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３２】培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気
的条件下で行うことが好ましく、培養温度は２０〜４０
℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。培地のｐ
Ｈは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範囲が
好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウ
ム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整するこ
とができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中
にＬ−アルギニンが蓄積する。
的条件下で行うことが好ましく、培養温度は２０〜４０
℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。培地のｐ
Ｈは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範囲が
好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウ
ム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整するこ
とができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中
にＬ−アルギニンが蓄積する。
【００３３】培養終了後、培養液から菌体などの固形物
を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮
法、晶析法等によってＬ−アルギニンを採取、精製する
ことが出来る。
を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮
法、晶析法等によってＬ−アルギニンを採取、精製する
ことが出来る。
【００３４】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００３５】
【実施例１】＜１＞無作為化断片による突然変異誘発 野生型argA遺伝子を有するBamHI-SalI染色体ＤＮＡ断片
（2.02 kbp）をプラスミドpUC19にクローニングし、プ
ラスミドpUC19-ArgAを得た。PCR増幅に用いたPyrobest
TM DNA ポリメラーゼは、宝酒造株式会社（日本）から
入手し、同社が推奨する条件下で使用した。
（2.02 kbp）をプラスミドpUC19にクローニングし、プ
ラスミドpUC19-ArgAを得た。PCR増幅に用いたPyrobest
TM DNA ポリメラーゼは、宝酒造株式会社（日本）から
入手し、同社が推奨する条件下で使用した。
【００３６】変異argA遺伝子のプールを作製するため、
第１段階として、NAGSの２０位から末端までの配列をコ
ードするargA遺伝子の断片を増幅した（図１）。プラス
ミドpUC19-ArgAを鋳型として用い、センスプライマーP
1:5'-CGAGGGATTCCGNNNNNNNNNNNNNNATCAATACCCACCGGG-3'
（配列番号１３）は、argAの塩基配列に基づいて設計
し、標準M13リバースプライマーは、アンチセンスプラ
イマーP2として用いた。プライマーP1の固定された１６
ヌクレオチドの３’末端配列は、argA遺伝子のTyr-19コ
ドンから下流配列と相同であり、固定された１３ヌクレ
オチドの５’末端配列は、His-15コドンの上流配列と相
同である。argA配列に対するP1の３’末端部分の相同性
は、1.75kbpのＤＮＡ断片を２０回のPCRサイクルによっ
て合成するのに用いた。
第１段階として、NAGSの２０位から末端までの配列をコ
ードするargA遺伝子の断片を増幅した（図１）。プラス
ミドpUC19-ArgAを鋳型として用い、センスプライマーP
1:5'-CGAGGGATTCCGNNNNNNNNNNNNNNATCAATACCCACCGGG-3'
（配列番号１３）は、argAの塩基配列に基づいて設計
し、標準M13リバースプライマーは、アンチセンスプラ
イマーP2として用いた。プライマーP1の固定された１６
ヌクレオチドの３’末端配列は、argA遺伝子のTyr-19コ
ドンから下流配列と相同であり、固定された１３ヌクレ
オチドの５’末端配列は、His-15コドンの上流配列と相
同である。argA配列に対するP1の３’末端部分の相同性
は、1.75kbpのＤＮＡ断片を２０回のPCRサイクルによっ
て合成するのに用いた。
【００３７】100ngのpUC19-ArgAを鋳型として、２つの
プライマー（40pmol）のそれぞれを含むPCR溶液（50μm
l）に加えた。２０サイクルのPCR（９４℃で０．６分、
５５℃で０．５分、７２℃で２分）を、モデル2400 DNA
サーマルサイクラー（Perkin-Elmer Co., Foster City,
Calif.）を用いて行った。
プライマー（40pmol）のそれぞれを含むPCR溶液（50μm
l）に加えた。２０サイクルのPCR（９４℃で０．６分、
５５℃で０．５分、７２℃で２分）を、モデル2400 DNA
サーマルサイクラー（Perkin-Elmer Co., Foster City,
Calif.）を用いて行った。
【００３８】第２段階では、８サイクル（９４℃で１
分、３７℃で１分、７２℃で０．５分）の増幅を行っ
た。ここでは、増幅断片の（−）鎖が、それを延長して
全遺伝子配列を得るために「プライマー」として機能す
る。
分、３７℃で１分、７２℃で０．５分）の増幅を行っ
た。ここでは、増幅断片の（−）鎖が、それを延長して
全遺伝子配列を得るために「プライマー」として機能す
る。
【００３９】第３段階では、反応混合物の１０μｌづつ
を、argA遺伝子の５’末端配列に相同なセンスプライマ
ーP3:5'-TGCCATGGTAAAGGAACGTAAAACC-3'（配列番号１
４）、およびアンチセンスプライマーP2を100pmol含む
新たな反応混合物（４０μｌ）に加え、さらに１０サイ
クル（９４℃で０．５分、５２℃で０．５分、７２℃で
２分）行った。
を、argA遺伝子の５’末端配列に相同なセンスプライマ
ーP3:5'-TGCCATGGTAAAGGAACGTAAAACC-3'（配列番号１
４）、およびアンチセンスプライマーP2を100pmol含む
新たな反応混合物（４０μｌ）に加え、さらに１０サイ
クル（９４℃で０．５分、５２℃で０．５分、７２℃で
２分）行った。
【００４０】完全長argA遺伝子の変異型のプールをコー
ドする1.78kbpのDNA断片を、アガロースゲル電気泳動に
より精製し、NcoI（argA遺伝子の開始ATGコドンを含む
部位）およびHindIIIで消化し、NcoIおよびHindIIIで消
化したpKK2333-2ベクター (Pharmacia, Sweden)と連結
した。
ドする1.78kbpのDNA断片を、アガロースゲル電気泳動に
より精製し、NcoI（argA遺伝子の開始ATGコドンを含む
部位）およびHindIIIで消化し、NcoIおよびHindIIIで消
化したpKK2333-2ベクター (Pharmacia, Sweden)と連結
した。
【００４１】連結したDNAの約150ngを、以下の各実験に
おいてE．coli受容細胞の形質転換に用い、約2000づつ
の組み換えクローンを得た。
おいてE．coli受容細胞の形質転換に用い、約2000づつ
の組み換えクローンを得た。
【００４２】＜２＞新規な変異型argAの単離およびNAGS
の触媒特性におけるアミノ酸置換の効果 プラスミドベクターpKK233-2（Pharmacia, Sweden）
を、変異型argA遺伝子のクローニングおよび発現に用い
た。E．coli受容菌株は、TG1 (supE hsdD5 thiD(lac- p
roAB) F'[traD36 proAB+ lacZDM15])（J. Sambrook et
al., MolecularCloning, 1989）である。組み換えプラ
スミドpKK-argA-random（変異型argA遺伝子を有する）
のセットを保持するTG1細胞の選択を、LB寒天プレート
上で行った。いくつかの変異クローンでは細胞生育の遅
延が観察され、この効果は活性なfbr NAGS変異酵素の生
産と相関があると思われた。いくつかのクローンからプ
ラスミドを精製し、変異型argA遺伝子の５’断片のDNA
配列を、ダイデオキシ・チェイン・ターミネーション法
によって決定した（表２）。
の触媒特性におけるアミノ酸置換の効果 プラスミドベクターpKK233-2（Pharmacia, Sweden）
を、変異型argA遺伝子のクローニングおよび発現に用い
た。E．coli受容菌株は、TG1 (supE hsdD5 thiD(lac- p
roAB) F'[traD36 proAB+ lacZDM15])（J. Sambrook et
al., MolecularCloning, 1989）である。組み換えプラ
スミドpKK-argA-random（変異型argA遺伝子を有する）
のセットを保持するTG1細胞の選択を、LB寒天プレート
上で行った。いくつかの変異クローンでは細胞生育の遅
延が観察され、この効果は活性なfbr NAGS変異酵素の生
産と相関があると思われた。いくつかのクローンからプ
ラスミドを精製し、変異型argA遺伝子の５’断片のDNA
配列を、ダイデオキシ・チェイン・ターミネーション法
によって決定した（表２）。
【００４３】NAGS活性を測定するため、アルギニン栄養
要求変異株であるE. coli B3083株(argA-, metB-) を、
上記プラスミドで形質転換した。超音波処理した組換え
細胞から得られた可溶性フラクションにおける酵素を、
硫酸アンモニウム沈殿により部分的に精製し、後述のよ
うにしてアッセイした。プラスミドpKK-argA-r11（3390
nmol/分×mg）、pKK-argA-r12（1220nmol/分×mg) およ
びpKK-argA-r13 （3120nmol/分×mg）を保持する菌株の
NAGS活性は、pKK-argA-r4 (300nmol/分×mg)を保持する
菌株のNAGS活性よりも極めて高かった。最後のプラスミ
ドは、Rajagopal, B.S.ら（Rajagopal, B.S. et al., A
ppl. Environ. Microbiol., 1998, v.64, No.5, p.1805
-1811）により、単一の置換を有するargA遺伝子の最も
活性のある変異型であると記載されたのと同一の置換
（Y19C）を有する変異型argA遺伝子を保持する。
要求変異株であるE. coli B3083株(argA-, metB-) を、
上記プラスミドで形質転換した。超音波処理した組換え
細胞から得られた可溶性フラクションにおける酵素を、
硫酸アンモニウム沈殿により部分的に精製し、後述のよ
うにしてアッセイした。プラスミドpKK-argA-r11（3390
nmol/分×mg）、pKK-argA-r12（1220nmol/分×mg) およ
びpKK-argA-r13 （3120nmol/分×mg）を保持する菌株の
NAGS活性は、pKK-argA-r4 (300nmol/分×mg)を保持する
菌株のNAGS活性よりも極めて高かった。最後のプラスミ
ドは、Rajagopal, B.S.ら（Rajagopal, B.S. et al., A
ppl. Environ. Microbiol., 1998, v.64, No.5, p.1805
-1811）により、単一の置換を有するargA遺伝子の最も
活性のある変異型であると記載されたのと同一の置換
（Y19C）を有する変異型argA遺伝子を保持する。
【００４４】また、プラスミドpKK-argA(wt)（野生型ar
gA）を保持する菌株におけるNAGSの活性も、pKK-argA-r
11、pKK-argA-r12及びpKK-argA-r13の場合よりも低かっ
た。変異酵素の活性レベルは、10mMアルギニンの存在下
でほぼ同じであったが、野生型酵素は、明らかにアルギ
ニンにより阻害された（1/10以下）。これらの結果は、
１５位から１９位のアミノ酸残基のペプチド断片は、Ｌ
−アルギニンによるNAGSのフィードバック阻害だけでな
く、変異NAGSの触媒能力のレベルを担っていることを示
唆している。
gA）を保持する菌株におけるNAGSの活性も、pKK-argA-r
11、pKK-argA-r12及びpKK-argA-r13の場合よりも低かっ
た。変異酵素の活性レベルは、10mMアルギニンの存在下
でほぼ同じであったが、野生型酵素は、明らかにアルギ
ニンにより阻害された（1/10以下）。これらの結果は、
１５位から１９位のアミノ酸残基のペプチド断片は、Ｌ
−アルギニンによるNAGSのフィードバック阻害だけでな
く、変異NAGSの触媒能力のレベルを担っていることを示
唆している。
【００４５】（酵素アッセイ）アセチルコエンザイムＡ
および使用した全ての化合物は、Sigma Chemical Co.,
St. Louis, Mo.から購入した。NAGS活性を測定するた
め、組換えプラスミドを有する細胞E. coli B3083 (arg
A-, metB-)を、M9培地（5ml）で後期指数増殖期まで培
養し、0.14M NaCl溶液で洗浄し、2mlの100mM KClを含む
40mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に再懸濁した。細
胞を超音波処理し、遠心分離した。NAGSを含むフラクシ
ョンを、５容量の飽和(NH4)2SO4で沈殿させ、沈殿物
を、100mM KClおよび30%(vol/vol)グリセロールを含む4
0mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）2mlに溶解した。NA
GS溶液を、O.1mlの反応混合物（100mM Tris-HCl (pH 8.
5), 35mM KCl, 20mMＬ−グルタミン酸、1.2 mMアセチル
コエンザイムＡ）に加え、反応混合物を37℃で10分間イ
ンキュベートした。
および使用した全ての化合物は、Sigma Chemical Co.,
St. Louis, Mo.から購入した。NAGS活性を測定するた
め、組換えプラスミドを有する細胞E. coli B3083 (arg
A-, metB-)を、M9培地（5ml）で後期指数増殖期まで培
養し、0.14M NaCl溶液で洗浄し、2mlの100mM KClを含む
40mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に再懸濁した。細
胞を超音波処理し、遠心分離した。NAGSを含むフラクシ
ョンを、５容量の飽和(NH4)2SO4で沈殿させ、沈殿物
を、100mM KClおよび30%(vol/vol)グリセロールを含む4
0mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）2mlに溶解した。NA
GS溶液を、O.1mlの反応混合物（100mM Tris-HCl (pH 8.
5), 35mM KCl, 20mMＬ−グルタミン酸、1.2 mMアセチル
コエンザイムＡ）に加え、反応混合物を37℃で10分間イ
ンキュベートした。
【００４６】0.3 mlのエタノールを加えることにより反
応を停止し、反応混合物を遠心分離した。0.95mlの0.24
mM DTNB（5,5-ジチオ-bis-2-ニトロベンゾエート）溶液
を上清に加え、混合物を15分間インキュベートした。NA
GS活性は、412nmの吸光度をモニターすることにより分
析した。
応を停止し、反応混合物を遠心分離した。0.95mlの0.24
mM DTNB（5,5-ジチオ-bis-2-ニトロベンゾエート）溶液
を上清に加え、混合物を15分間インキュベートした。NA
GS活性は、412nmの吸光度をモニターすることにより分
析した。
【００４７】＜３＞新規なargA変異のB16-4(pro- arg
D-)細胞における選択による単離 E. coli B16-4株におけるargA変異体（pKK-argA-rando
m）のセレクションを、上述した方法により行った。寒
天プレートからの組換えクローンを、Ｌ−アルギニンを
含むM9培地に懸濁し、定常期まで培養を行い、培養液の
一部を新しい培地に懸濁し、同様の培養の手順を４回繰
り返した。これらの後、培養液の一部を、5 mg/mlのＬ
−アルギニン、および100μgのアンピシリンを含むM9寒
天培地にプレーティングした。幾つかのクローンからプ
ラスミドを精製し、変異型argA遺伝子の５’断片につい
てシークエンスし、変異型NAGSの活性のレベルを、前記
と同様にしてアッセイした。変異体の60%は、酵素の変
異断片において配列-Gly-Trp-Pro-Cys-Val-（配列番号
４）を有しており、弱い(約10nmol/分×mg)が、fbr NAG
S活性を有していた。明らかに、この変異タンパク質
は、使用した選択条件でpro - argD-細胞が生育するのに
最適なレベルのNAGS活性を提供する。したがって、前記
の選択条件によって、得られる変異型NAGSの活性が定ま
ると考えられる。
D-)細胞における選択による単離 E. coli B16-4株におけるargA変異体（pKK-argA-rando
m）のセレクションを、上述した方法により行った。寒
天プレートからの組換えクローンを、Ｌ−アルギニンを
含むM9培地に懸濁し、定常期まで培養を行い、培養液の
一部を新しい培地に懸濁し、同様の培養の手順を４回繰
り返した。これらの後、培養液の一部を、5 mg/mlのＬ
−アルギニン、および100μgのアンピシリンを含むM9寒
天培地にプレーティングした。幾つかのクローンからプ
ラスミドを精製し、変異型argA遺伝子の５’断片につい
てシークエンスし、変異型NAGSの活性のレベルを、前記
と同様にしてアッセイした。変異体の60%は、酵素の変
異断片において配列-Gly-Trp-Pro-Cys-Val-（配列番号
４）を有しており、弱い(約10nmol/分×mg)が、fbr NAG
S活性を有していた。明らかに、この変異タンパク質
は、使用した選択条件でpro - argD-細胞が生育するのに
最適なレベルのNAGS活性を提供する。したがって、前記
の選択条件によって、得られる変異型NAGSの活性が定ま
ると考えられる。
【００４８】
【表２】
【００４９】＜４＞変異型argA遺伝子を用いたＬ−アル
ギニンの製造 組換えプラスミドpKKArgA-r4、pKKArgA-r11、pKKArgA-r
12、pKKArgA-r13およびpKKArgA-r32をBamHIおよびSalI
で消化し、trcプロモーター下に変異型argA遺伝子を含
む断片を、低コピープロモーターpMW119（ニッポンジー
ン社、東京）にサブクローン化した。得られたプラスミ
ドは、それぞれpMADS4、pMADS11、pMADS12、pMADS13お
よびpMADS32と命名された。これらのプラスミドは、Ｌ
−アルギニン生産株であるエシェリヒア・コリ237株（V
KPM B-7925）に導入された。形質転換株のＬ−アルギニ
ン（Arg）およびシトルリン（Cit）の生産を、表３に示
した。新規な変異型NAGSを保持する生産株のほとんど
は、受容株又は公知のTyr19Cys変異型NAGS（pMADS4）に
比べて、Ｌ−アルギニン及びシトルリンについて高い生
産性を示した。
ギニンの製造 組換えプラスミドpKKArgA-r4、pKKArgA-r11、pKKArgA-r
12、pKKArgA-r13およびpKKArgA-r32をBamHIおよびSalI
で消化し、trcプロモーター下に変異型argA遺伝子を含
む断片を、低コピープロモーターpMW119（ニッポンジー
ン社、東京）にサブクローン化した。得られたプラスミ
ドは、それぞれpMADS4、pMADS11、pMADS12、pMADS13お
よびpMADS32と命名された。これらのプラスミドは、Ｌ
−アルギニン生産株であるエシェリヒア・コリ237株（V
KPM B-7925）に導入された。形質転換株のＬ−アルギニ
ン（Arg）およびシトルリン（Cit）の生産を、表３に示
した。新規な変異型NAGSを保持する生産株のほとんど
は、受容株又は公知のTyr19Cys変異型NAGS（pMADS4）に
比べて、Ｌ−アルギニン及びシトルリンについて高い生
産性を示した。
【００５０】
【表３】
【００５１】（試験管内発行の培養条件）発酵培地は、
水道水１Ｌ中に、60 g/L グルコース、 25 g/L 硫酸ア
ンモニウム、2 g/L KH2PO4、1 g/L MgSO4、O.1 mg/L チ
アミン、5 g/L イースト イクストラクト（Difco）、25
g/L 沈降性炭酸カルシウムを含む（pH 7.2）。グルコ
ースと沈降性炭酸カルシウムは、別殺菌した。2 mlの培
地を試験管に入れ、被検微生物を１白金耳接種し、振盪
しながら32℃で３日間培養を行った。
水道水１Ｌ中に、60 g/L グルコース、 25 g/L 硫酸ア
ンモニウム、2 g/L KH2PO4、1 g/L MgSO4、O.1 mg/L チ
アミン、5 g/L イースト イクストラクト（Difco）、25
g/L 沈降性炭酸カルシウムを含む（pH 7.2）。グルコ
ースと沈降性炭酸カルシウムは、別殺菌した。2 mlの培
地を試験管に入れ、被検微生物を１白金耳接種し、振盪
しながら32℃で３日間培養を行った。
【００５２】
【発明の効果】本発明により、エシェリヒア属細菌のＬ
−アルギニン生産能を向上させることができる。
−アルギニン生産能を向上させることができる。
【００５３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> 新規変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素及びＬ−アルギニンの製造 法（New mutant N-acetylglutamate synthase and method for L-arginine prod uction） <130> P-7412F <140> <141> 2001-06-14 <150> RU 2000116481 <151> 2000-06-28 <150> RU 2001112869 <151> 2001-05-15 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００５４】 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence encoded by random sequence <400> 1 Val Val Trp Arg Ala 1 5
【００５５】 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence encoded by random sequence <400> 2 Leu Phe Gly Leu His 1 5
【００５６】 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence encoded by random sequence <400> 3 Ser Ala Ala Ser Arg 1 5
【００５７】 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence encoded by random sequence <400> 4 Gly Trp Pro Cys Val 1 5
【００５８】 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence encoded by random sequence <400> 5 His Ser Val Pro Cys 1 5
【００５９】 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 His Ser Val Pro Tyr 1 5
【００６０】 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 7 gtagtatggc gggca 15
【００６１】 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 8 ttgttcggat tgcac 15
【００６２】 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 9 tcggcggcgt ccaga 15
【００６３】 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 10 gggtggccat gcgtg 15
【００６４】 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 11 cattcggttc cctgt 15
【００６５】 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 12 cattcggttc cctat 15
【００６６】 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer containing random sequence <220> <221> misc_feature <222> (13)..(26) <223> n=a or g or c or t <400> 13 cgagggattc cgnnnnnnnn nnnnnnatca atacccaccg gg 42
【００６７】 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 14 tgccatggta aaggaacgta aaacc 25
【図１】 変異型argA遺伝子のプールの構築のスキーム
を示す図。
を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 セルゲイ ヴァシリエヴィッチ スミルノ フ ロシア連邦、121552、モスクワ市、ヤルツ ェフスカヤ通り29番地、２号棟、94号室 (72)発明者 ユリヤ ゲオルギエヴナ ロストヴァ ロシア連邦、117454、モスクワ市、ヴェル ナツキ通り64Ａ番地、40号室 (72)発明者 タチヤナ アブラモヴナ ヤンポリスカヤ ロシア連邦、123364、モスクワ市、ロドチ ナヤ通り31番地、５号棟、77号室 (72)発明者 タチヤナ ヴィクトロヴナ レオノヴァ ロシア連邦、123481、モスクワ市、スヴァ ボドゥィ通り81番地、５号棟、852号室 (72)発明者 ミハイル マルコヴィッチ グシャチネル ロシア連邦、113646、モスクワ市、セヴェ ルノエ チェルタノヴォ４番地、403号棟、 217号室 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 BA07 BA71 CA04 DA06 EA04 GA11 HA03 4B050 CC01 CC03 DD02 LL05 4B064 AE24 CA02 CA19 CC24 DA01 DA10 DA16 4B065 AA26X AA26Y AB01 BA01 CA17 CA27
Claims (6)
- 【請求項１】 野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵
素の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が配列番号
１〜４のいずれかのアミノ酸配列で置換されたアミノ酸
配列を有し、かつ、Ｌ−アルギニンによるフィードバッ
ク阻害が解除された変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合
成酵素。 - 【請求項２】 野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵
素がエシェリヒア・コリのＮ−アセチルグルタミン酸合
成酵素である請求項１記載の変異型Ｎ−アセチルグルタ
ミン酸合成酵素。 - 【請求項３】 １５位〜１９位以外の１又は複数の位置
において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿
入又は付加を含み、かつ、Ｌ−アルギニンによるフィー
ドバック阻害が解除された請求項１又は２に記載の変異
型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項に記載の変
異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするＤ
ＮＡ。 - 【請求項５】 請求項４記載のＤＮＡで形質転換され、
かつ、Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細
菌。 - 【請求項６】 請求項５記載のエシェリヒア属細菌を培
地で培養し、Ｌ−アルギニンを培地中に生成蓄積させ、
該培地よりＬ−アルギニンを採取することを特徴とする
Ｌ−アルギニンの製造法。
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| RU2001112869/13A RU2215783C2 (ru) | 2001-05-15 | 2001-05-15 | МУТАНТНАЯ N-АЦЕТИЛГЛУТАМАТ СИНТАЗА (ВАРИАНТЫ), ФРАГМЕНТ ДНК, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ АРГИНИНА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА |
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