JP2002253268A - 新規変異型n−アセチルグルタミン酸合成酵素及びl−アルギニンの製造法 - Google Patents

新規変異型n−アセチルグルタミン酸合成酵素及びl−アルギニンの製造法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 フィードバック阻害に耐性な変異を有し、か
つ、高い活性を有するN−アセチルグルタミン酸合成酵
素及び同酵素を保持するL−アルギニン生産菌を提供す
る。 【解決手段】 野生型N−アセチルグルタミン酸合成酵
素の15位〜19位に相当するアミノ酸配列が配列番号
1〜4のいずれかのアミノ酸配列で置換されたアミノ酸
配列を有し、かつ、L−アルギニンによるフィードバッ
ク阻害が解除された変異型N−アセチルグルタミン酸合
成酵素をコードするDNAを保持するエシェリヒア属細
菌を培地で培養し、L−アルギニンを培地中に生成蓄積
させ、該培地よりL−アルギニンを採取することにより
L−アルギニンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物工業に関
し、L−アルギニンの製造法及びエシェリヒア・コリの
アルギニン生産菌のアルギニン生合成系における新規な
フィードバック阻害型変異酵素の使用に関する。
【0002】
【従来の技術】エシェリヒア・コリ細胞におけるグルタ
ミン酸からアルギニンへの生合成は、N−アセチルグル
タミン酸合成酵素(以下、「NAGS」ともいう)によるグ
ルタミン酸のアセチル化に始まる連続反応によって行わ
れる。このプロセスは、アルギニンによる、レギュロン
の転写抑制及びNAGSのフィードバック阻害を介して調節
されている(Cunin R., et al., Microbiol. Rev., 50,
314-352, 1986)。アルギニンは、argAの発現を250
倍以上抑制し、NAGS活性を阻害する(Ki=0.02 mM)(Le
isinger T., Haas D., J. Biol. Chem., 250, 1690-169
3, 1975)。エシェリヒア・コリにおいてアルギニン生
合成を増強するためには、フィードバック阻害に対して
耐性(fbr)なNAGS酵素が必要である。
【0003】フィードバック耐性変異酵素は、自然突然
変異により、又は化学的もしくは部位特異的変異により
取得され得る。いくつかのargAのfbr変異が単離され、
研究されている。セラチア・マルセッセンスは、染色体
上にargAのfbr変異を持つと細胞は不安定となり、活性
の減少又はグルタミン酸に対する親和性の変化を伴うar
gA変異が生じる(Takagi T, etal., J. Biochem., 99,
357-364, 1986)。
【0004】fbrのNAGSを持つ5株のエシェリヒア・コ
リ由来のfbr argA遺伝子がクローニングされ、各々のfb
r NAGS株においてargA遺伝子中に別々の一塩基置換が見
出され、15位のHisからtyr、19位のTyrからCys、5
4位のSerからAsn、58位のArgからHis、287位のGl
yからSer、及び、432位のGlnからArgへの置換が明ら
かになっている(Rajagopal, B.S. et al., Appl. Envi
ron. Microbiol., 1998, v.64. No.5, p.1805-1811)。
【0005】酵素のfbr形質は、大抵の場合、1又は数
個の位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸による置換の結
果として生じる。これらの置換は、酵素活性の低下につ
ながる。例えば、エシェリヒア・コリのセリンアセチル
トランスフェラーゼ(SAT)(cysE遺伝子)における2
56位の天然Metが他のアミノ酸残基によって置換され
ると、多くの場合fbr形質になるが、変異SATタンパク質
は天然SATの活性のレベルには維持されない(Nakamuri
S. et al., AEM, 64(5):1607-11, 1998)。このよう
に、これらの方法によって得られる変異酵素の不利な点
は、変異酵素は野生型酵素に比べて活性が低いことであ
る。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、エシェリヒ
ア・コリのアルギニン生合成において、重要な役割を果
たす酵素について、フィードバック阻害に耐性な変異を
有し、かつ、高い活性を有する酵素を提供することを、
課題の一つとするものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明においては、argA
遺伝子断片の完全無作為化による、多数組の変異型argA
遺伝子の新規な合成法が提案される。タンパク質配列の
うちfbr変異を局在化し得る断片において、いくつかの
アミノ酸を同時置換することによって、酵素の三次元構
造がより正しく維持されることにより天然体に近い活性
のレベルを維持した変異型タンパク質を取得することが
できる。
【0008】かくして、以下に示す本発明がなされるに
至った。、 (1)野生型N−アセチルグルタミン酸合成酵素の15
位〜19位に相当するアミノ酸配列が配列番号1〜4の
いずれかのアミノ酸配列で置換されたアミノ酸配列を有
し、かつ、L−アルギニンによるフィードバック阻害が
解除された変異型N−アセチルグルタミン酸合成酵素。 (2)野生型N−アセチルグルタミン酸合成酵素がエシ
ェリヒア・コリのN−アセチルグルタミン酸合成酵素で
ある(1)の変異型N−アセチルグルタミン酸合成酵
素。 (3)15位〜19位以外の1又は複数の位置におい
て、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は
付加を含み、かつ、L−アルギニンによるフィードバッ
ク阻害が解除された(1)又は(2)の変異型N−アセ
チルグルタミン酸合成酵素。 (4)(1)〜(3)のいずれかの変異型N−アセチル
グルタミン酸合成酵素をコードするDNA。 (5)(4)のDNAで形質転換され、かつ、L−アル
ギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌。 (6)(5)のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、L
−アルギニンを培地中に生成蓄積させ、該培地よりL−
アルギニンを採取することを特徴とするL−アルギニン
の製造法。
【0009】本明細書において、上記のようなfbr変異
を有するNAGSを変異型NAGS、変異型NAGSをコードするD
NAを変異型argA遺伝子ということがある。また、前記
変異を有しないNAGSを野生型NAGSということがある。
【0010】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【0011】<1>変異型NAGS及び変異型argA遺伝子 本発明の変異型NAGS及びそれをコードする変異型argA遺
伝子は、無作為化断片による突然変異誘発によって取得
された。argA遺伝子における多数の変異を得るため、タ
ンパク質配列の15位から19位のアミノ酸残基の領域
をコードするargA遺伝子の15ヌクレオチドからなる断
片の完全無作為化を行った。完全無作為化された15ヌ
クレオチドの断片は、415すなわち約1019の異なるDNA配
列を生じさせ、これらは5merのペプチドにおいて205
異なるアミノ酸残基をコードすることができる。これら
の配列においてストップコドンがフレームに入らない確
率は、約0.955すなわち78%に相当する。したがって、
15位から19位のアミノ酸残基のペプチドをコードす
るargA遺伝子断片の完全無作為化は、NAGS構造における
このペプチドの多様性を有するおよそ250万の異なるタ
ンパク質配列を生じさせるはずである。
【0012】続いて、発現ベクターにクローニングされ
た変異型argA遺伝子を保持する組換え株に選択及びスク
リーニングを行うことによって、抑制解除された野生型
NAGSの活性レベルに至るまでの種々のレベルの生理活性
を有するfbr変異体を選択することに成功した。その
際、argD-、かつ、proB-又はproA-の菌株は、培地中に
過剰のL−アルギニンが存在するとNAGSが阻害されてL
−プロリンが合成できず生育できないが、fbrのNAGSを
保持している場合は最少培地で生育できるので、変異型
argA保持株を選択することができると考えた。しかし、
後記実施例に示すように、この方法では活性の高いfbr
NAGSを得ることが難しく、変異型argA遺伝子を野生株に
導入し、生育の遅い株を選択することによって、活性の
高いfbr NAGSが得られることを見い出した。
【0013】本発明により、fbr形質のNAGSとして適し
た変異型NAGSの配列が明らかとなったので、変異型NAGS
及びそれをコードする変異型argA遺伝子は、それらの配
列に基づいて、野生型argA遺伝子に通常の方法にしたが
って変異を導入することによって調製することができ
る。野生型argA遺伝子としては、エシェリヒア・コリの
argA遺伝子(GenBank Accession Y00492)が挙げられ
る。エシェリヒア・コリのargA遺伝子は、公知の塩基配
列に基づいて調製したプライマーを用いたPCRによ
り、エシェリヒア・コリの染色体DNAから増幅するこ
とによって取得することができる。
【0014】本発明の変異型NAGSの15位から19位の
アミノ酸配列は、配列番号1〜4のいずれかである。
尚、エシェリヒア・コリの公知の変異型NAGS(19位の
TyrのCysへの置換)及び野生型NAGSの相当するアミノ酸
配列を配列番号5、6に示す。また、各々のアミノ酸配
列をコードする塩基配列の例を配列番号7〜12に示
す。これらの配列を表1に示す。
【0015】
【表1】
【0016】また、本発明の変異型NAGSは、L−アルギ
ニンによるフィードバック阻害が解除され、NAGS活性、
すなわち、L−グルタミン酸をアセチル化してN−アセ
チルグルタミン酸を生成する反応を触媒する活性を有す
る限り、15位〜19位以外の1又は複数の位置におい
て、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は
付加を含んでいてもよい。
【0017】ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタ
ンパク質の立体構造における位置や種類によっても異な
る。それは、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ
酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、タンパク質
の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。従
って、NAGSを構成するアミノ酸配列全体に対し、30〜
50%以上、好ましくは50〜70%以上、より好まし
くは80%以上の相同性を有し、fbr形質のNAGS活性を
有するものであってもよい。
【0018】尚、本発明において、15位〜19位に相
当するアミノ酸配列とは、エシェリヒア・コリの野生型
NAGSのアミノ酸配列における15位〜19位のアミノ酸
配列に相当する配列をいう。上記のような活性に影響を
与えないアミノ酸の欠失、挿入又は付加によってアミノ
酸残基の位置が前後することがある。例えば、N末端部
に1つのアミノ酸残基が挿入されれば本来15位のアミ
ノ酸残基は16位となるが、そのような15位のアミノ
酸残基に相当するアミノ酸残基を、本発明においては1
5位のアミノ酸残基と呼ぶこととする。
【0019】上記のような変異型NAGSと実質的に同一の
タンパク質をコードするDNAは、例えば部位特異的変
異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠
失、挿入又は付加を含むように塩基配列を改変すること
によって得られる。また、上記のような改変されたDN
Aは、従来知られている変異処理によっても取得され得
る。変異処理としては、変異型argA遺伝子を含むDNA
をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及
び変異型argA遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリ
ヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニト
ロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)もしくは亜硝酸等の
通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する
方法が挙げられる。
【0020】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入又は付加等には、NAGSを保持する微生物の属、種、又
は菌株の個体差に基づく場合などの天然に生じる変異
(mutant又はvariant)も含まれる。
【0021】上記のような変異を有するDNAを適当な
細胞で発現させ、発現産物のNAGS活性を調べることによ
り、変異型NAGSと実質的に同一のタンパク質をコードす
るDNAが得られる。
【0022】また、変異型NAGSを保持する細胞を変異処
理し、同細胞から公知のargA遺伝子配列を有するDNA
又は同遺伝子配列から調製され得るプローブとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、NAGS活性
を有するタンパク質をコードするDNAを単離すること
によっても、変異型NAGSと実質的に同一のタンパク質を
コードするDNAが得られる。
【0023】ここでいう「ストリンジェントな条件」と
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異
的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件
を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せ
ば、相同性が高いDNA同士、例えば50%以上の相同
性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相
同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あ
るいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条
件である60℃、好ましくは65℃で、1×SSC,
0.1%SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1
%SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が
挙げられる。
【0024】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性が低下又は消失したものも含ま
れるが、それらについては、市販の発現ベクターにつな
ぎNAGS活性を調べることによって容易に取り除くことが
できる。
【0025】<2>本発明のエシェリヒア属細菌 本発明のエシェリヒア属細菌は、上記の変異型argA遺伝
子が導入されたエシェリヒア属細菌である。エシェリヒ
ア属細菌として具体的には、エシェリヒア・コリが挙げ
られる。変異型argA遺伝子は、同遺伝子を含むDNA断
片をエシェリヒア属細菌中で機能するベクターに連結し
て得られる組換えDNAを用いてエシェリヒア属細菌を
形質転換することによって、導入することができる。ま
た、染色体DNA上のargA遺伝子を変異型argAに置き換
えることによっても、変異型argA遺伝子を導入すること
ができる。
【0026】argA遺伝子の導入に用いるベクターとして
は、pBR322、pMW118、pUC19等のプラスミドベクター、
λ1059、λBF101、M13mp9等のファージベクター、Mu、T
n10、Tn5等のトランスポゾン等が挙げられる。
【0027】エシェリヒア属細菌へのDNAの導入は、
D.A.Morrisonの方法(Methods in Enzymology 68, 326
(1979))あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理し
てDNAの透過性を増す方法(Mandel,M. and Higa,A.,
J.Mol.Biol.,53,159(1970))等により行うことができ
る。
【0028】L−アルギニン生産能を有するエシェリヒ
ア属細菌において、上記のようにして変異型argA遺伝子
を導入すると、L−アルギニンの生産量を増大させるこ
とができる。また、変異型argA遺伝子を保持するエシェ
リヒア属細菌に、L−アルギニン生産能を付与してもよ
い。
【0029】L−アルギニン生産能を有するエシェリヒ
ア・コリとしては、エシェリヒア・コリ237株(VKPM B-
7925)が挙げられる。同株は、2000年4月10日にRussia
n National Collection of Industrial Microorganisms
(VKPM)にVKPM B-7925の番号で寄託され、2001年5月1
8日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。
【0030】<3>L−アルギニンの製造法 上記のようにして、変異型argA遺伝子が導入され、L−
アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌を好適な
培地で培養し、該培地中にL−アルギニンを生産蓄積せ
しめ、該培地からL−アルギニンを採取することによ
り、L−アルギニンを効率よく製造することができる。
【0031】本発明の製造法におけるエシェリヒア属細
菌の培養および培養液からのL−アルギニンの採取、精
製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるL−アルギ
ニンの製造法と同様にして行えばよい。培養に使用する
培地としては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要
があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有
するものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭
素源としては、グルコースやシュークロースをはじめと
する各種炭水化物、各種有機酸があげられる。また使用
する微生物の資化性によってはエタノールやグリセロー
ル等のアルコールを用いることが出来る。窒素源として
は、アンモニアや、硫酸アンモニウム等の各種のアンモ
ニウム塩類や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプト
ン、大豆加水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を
用いることが出来る。無機物としては、燐酸一カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、
硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が用いられる。
【0032】培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気
的条件下で行うことが好ましく、培養温度は20〜40
℃で、好ましくは30〜38℃の範囲で行う。培地のp
Hは通常5〜9の範囲であり、6.5〜7.2の範囲が
好ましい。培地のpHは、アンモニア、炭酸カルシウ
ム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整するこ
とができる。通常、1〜3日の培養によって、培養液中
にL−アルギニンが蓄積する。
【0033】培養終了後、培養液から菌体などの固形物
を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮
法、晶析法等によってL−アルギニンを採取、精製する
ことが出来る。
【0034】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
【0035】
【実施例1】<1>無作為化断片による突然変異誘発 野生型argA遺伝子を有するBamHI-SalI染色体DNA断片
(2.02 kbp)をプラスミドpUC19にクローニングし、プ
ラスミドpUC19-ArgAを得た。PCR増幅に用いたPyrobest
TM DNA ポリメラーゼは、宝酒造株式会社(日本)から
入手し、同社が推奨する条件下で使用した。
【0036】変異argA遺伝子のプールを作製するため、
第1段階として、NAGSの20位から末端までの配列をコ
ードするargA遺伝子の断片を増幅した(図1)。プラス
ミドpUC19-ArgAを鋳型として用い、センスプライマーP
1:5'-CGAGGGATTCCGNNNNNNNNNNNNNNATCAATACCCACCGGG-3'
(配列番号13)は、argAの塩基配列に基づいて設計
し、標準M13リバースプライマーは、アンチセンスプラ
イマーP2として用いた。プライマーP1の固定された16
ヌクレオチドの3’末端配列は、argA遺伝子のTyr-19コ
ドンから下流配列と相同であり、固定された13ヌクレ
オチドの5’末端配列は、His-15コドンの上流配列と相
同である。argA配列に対するP1の3’末端部分の相同性
は、1.75kbpのDNA断片を20回のPCRサイクルによっ
て合成するのに用いた。
【0037】100ngのpUC19-ArgAを鋳型として、2つの
プライマー(40pmol)のそれぞれを含むPCR溶液(50μm
l)に加えた。20サイクルのPCR(94℃で0.6分、
55℃で0.5分、72℃で2分)を、モデル2400 DNA
サーマルサイクラー(Perkin-Elmer Co., Foster City,
Calif.)を用いて行った。
【0038】第2段階では、8サイクル(94℃で1
分、37℃で1分、72℃で0.5分)の増幅を行っ
た。ここでは、増幅断片の(−)鎖が、それを延長して
全遺伝子配列を得るために「プライマー」として機能す
る。
【0039】第3段階では、反応混合物の10μlづつ
を、argA遺伝子の5’末端配列に相同なセンスプライマ
ーP3:5'-TGCCATGGTAAAGGAACGTAAAACC-3'(配列番号1
4)、およびアンチセンスプライマーP2を100pmol含む
新たな反応混合物(40μl)に加え、さらに10サイ
クル(94℃で0.5分、52℃で0.5分、72℃で
2分)行った。
【0040】完全長argA遺伝子の変異型のプールをコー
ドする1.78kbpのDNA断片を、アガロースゲル電気泳動に
より精製し、NcoI(argA遺伝子の開始ATGコドンを含む
部位)およびHindIIIで消化し、NcoIおよびHindIIIで消
化したpKK2333-2ベクター (Pharmacia, Sweden)と連結
した。
【0041】連結したDNAの約150ngを、以下の各実験に
おいてE.coli受容細胞の形質転換に用い、約2000づつ
の組み換えクローンを得た。
【0042】<2>新規な変異型argAの単離およびNAGS
の触媒特性におけるアミノ酸置換の効果 プラスミドベクターpKK233-2(Pharmacia, Sweden)
を、変異型argA遺伝子のクローニングおよび発現に用い
た。E.coli受容菌株は、TG1 (supE hsdD5 thiD(lac- p
roAB) F'[traD36 proAB+ lacZDM15])(J. Sambrook et
al., MolecularCloning, 1989)である。組み換えプラ
スミドpKK-argA-random(変異型argA遺伝子を有する)
のセットを保持するTG1細胞の選択を、LB寒天プレート
上で行った。いくつかの変異クローンでは細胞生育の遅
延が観察され、この効果は活性なfbr NAGS変異酵素の生
産と相関があると思われた。いくつかのクローンからプ
ラスミドを精製し、変異型argA遺伝子の5’断片のDNA
配列を、ダイデオキシ・チェイン・ターミネーション法
によって決定した(表2)。
【0043】NAGS活性を測定するため、アルギニン栄養
要求変異株であるE. coli B3083株(argA-, metB-) を、
上記プラスミドで形質転換した。超音波処理した組換え
細胞から得られた可溶性フラクションにおける酵素を、
硫酸アンモニウム沈殿により部分的に精製し、後述のよ
うにしてアッセイした。プラスミドpKK-argA-r11(3390
nmol/分×mg)、pKK-argA-r12(1220nmol/分×mg) およ
びpKK-argA-r13 (3120nmol/分×mg)を保持する菌株の
NAGS活性は、pKK-argA-r4 (300nmol/分×mg)を保持する
菌株のNAGS活性よりも極めて高かった。最後のプラスミ
ドは、Rajagopal, B.S.ら(Rajagopal, B.S. et al., A
ppl. Environ. Microbiol., 1998, v.64, No.5, p.1805
-1811)により、単一の置換を有するargA遺伝子の最も
活性のある変異型であると記載されたのと同一の置換
(Y19C)を有する変異型argA遺伝子を保持する。
【0044】また、プラスミドpKK-argA(wt)(野生型ar
gA)を保持する菌株におけるNAGSの活性も、pKK-argA-r
11、pKK-argA-r12及びpKK-argA-r13の場合よりも低かっ
た。変異酵素の活性レベルは、10mMアルギニンの存在下
でほぼ同じであったが、野生型酵素は、明らかにアルギ
ニンにより阻害された(1/10以下)。これらの結果は、
15位から19位のアミノ酸残基のペプチド断片は、L
−アルギニンによるNAGSのフィードバック阻害だけでな
く、変異NAGSの触媒能力のレベルを担っていることを示
唆している。
【0045】(酵素アッセイ)アセチルコエンザイムA
および使用した全ての化合物は、Sigma Chemical Co.,
St. Louis, Mo.から購入した。NAGS活性を測定するた
め、組換えプラスミドを有する細胞E. coli B3083 (arg
A-, metB-)を、M9培地(5ml)で後期指数増殖期まで培
養し、0.14M NaCl溶液で洗浄し、2mlの100mM KClを含む
40mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)に再懸濁した。細
胞を超音波処理し、遠心分離した。NAGSを含むフラクシ
ョンを、5容量の飽和(NH4)2SO4で沈殿させ、沈殿物
を、100mM KClおよび30%(vol/vol)グリセロールを含む4
0mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)2mlに溶解した。NA
GS溶液を、O.1mlの反応混合物(100mM Tris-HCl (pH 8.
5), 35mM KCl, 20mML−グルタミン酸、1.2 mMアセチル
コエンザイムA)に加え、反応混合物を37℃で10分間イ
ンキュベートした。
【0046】0.3 mlのエタノールを加えることにより反
応を停止し、反応混合物を遠心分離した。0.95mlの0.24
mM DTNB(5,5-ジチオ-bis-2-ニトロベンゾエート)溶液
を上清に加え、混合物を15分間インキュベートした。NA
GS活性は、412nmの吸光度をモニターすることにより分
析した。
【0047】<3>新規なargA変異のB16-4(pro- arg
D-)細胞における選択による単離 E. coli B16-4株におけるargA変異体(pKK-argA-rando
m)のセレクションを、上述した方法により行った。寒
天プレートからの組換えクローンを、L−アルギニンを
含むM9培地に懸濁し、定常期まで培養を行い、培養液の
一部を新しい培地に懸濁し、同様の培養の手順を4回繰
り返した。これらの後、培養液の一部を、5 mg/mlのL
−アルギニン、および100μgのアンピシリンを含むM9寒
天培地にプレーティングした。幾つかのクローンからプ
ラスミドを精製し、変異型argA遺伝子の5’断片につい
てシークエンスし、変異型NAGSの活性のレベルを、前記
と同様にしてアッセイした。変異体の60%は、酵素の変
異断片において配列-Gly-Trp-Pro-Cys-Val-(配列番号
4)を有しており、弱い(約10nmol/分×mg)が、fbr NAG
S活性を有していた。明らかに、この変異タンパク質
は、使用した選択条件でpro - argD-細胞が生育するのに
最適なレベルのNAGS活性を提供する。したがって、前記
の選択条件によって、得られる変異型NAGSの活性が定ま
ると考えられる。
【0048】
【表2】
【0049】<4>変異型argA遺伝子を用いたL−アル
ギニンの製造 組換えプラスミドpKKArgA-r4、pKKArgA-r11、pKKArgA-r
12、pKKArgA-r13およびpKKArgA-r32をBamHIおよびSalI
で消化し、trcプロモーター下に変異型argA遺伝子を含
む断片を、低コピープロモーターpMW119(ニッポンジー
ン社、東京)にサブクローン化した。得られたプラスミ
ドは、それぞれpMADS4、pMADS11、pMADS12、pMADS13お
よびpMADS32と命名された。これらのプラスミドは、L
−アルギニン生産株であるエシェリヒア・コリ237株(V
KPM B-7925)に導入された。形質転換株のL−アルギニ
ン(Arg)およびシトルリン(Cit)の生産を、表3に示
した。新規な変異型NAGSを保持する生産株のほとんど
は、受容株又は公知のTyr19Cys変異型NAGS(pMADS4)に
比べて、L−アルギニン及びシトルリンについて高い生
産性を示した。
【0050】
【表3】
【0051】(試験管内発行の培養条件)発酵培地は、
水道水1L中に、60 g/L グルコース、 25 g/L 硫酸ア
ンモニウム、2 g/L KH2PO4、1 g/L MgSO4、O.1 mg/L チ
アミン、5 g/L イースト イクストラクト(Difco)、25
g/L 沈降性炭酸カルシウムを含む(pH 7.2)。グルコ
ースと沈降性炭酸カルシウムは、別殺菌した。2 mlの培
地を試験管に入れ、被検微生物を1白金耳接種し、振盪
しながら32℃で3日間培養を行った。
【0052】
【発明の効果】本発明により、エシェリヒア属細菌のL
−アルギニン生産能を向上させることができる。
【0053】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> 新規変異型N−アセチルグルタミン酸合成酵素及びL−アルギニンの製造 法(New mutant N-acetylglutamate synthase and method for L-arginine prod uction) <130> P-7412F <140> <141> 2001-06-14 <150> RU 2000116481 <151> 2000-06-28 <150> RU 2001112869 <151> 2001-05-15 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.0
【0054】 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence encoded by random sequence <400> 1 Val Val Trp Arg Ala 1 5
【0055】 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence encoded by random sequence <400> 2 Leu Phe Gly Leu His 1 5
【0056】 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence encoded by random sequence <400> 3 Ser Ala Ala Ser Arg 1 5
【0057】 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence encoded by random sequence <400> 4 Gly Trp Pro Cys Val 1 5
【0058】 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence encoded by random sequence <400> 5 His Ser Val Pro Cys 1 5
【0059】 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 His Ser Val Pro Tyr 1 5
【0060】 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 7 gtagtatggc gggca 15
【0061】 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 8 ttgttcggat tgcac 15
【0062】 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 9 tcggcggcgt ccaga 15
【0063】 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 10 gggtggccat gcgtg 15
【0064】 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 11 cattcggttc cctgt 15
【0065】 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 12 cattcggttc cctat 15
【0066】 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer containing random sequence <220> <221> misc_feature <222> (13)..(26) <223> n=a or g or c or t <400> 13 cgagggattc cgnnnnnnnn nnnnnnatca atacccaccg gg 42
【0067】 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 14 tgccatggta aaggaacgta aaacc 25
【図面の簡単な説明】
【図1】 変異型argA遺伝子のプールの構築のスキーム
を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12R 1:19) C12N 15/00 ZNAA (72)発明者 セルゲイ ヴァシリエヴィッチ スミルノ フ ロシア連邦、121552、モスクワ市、ヤルツ ェフスカヤ通り29番地、2号棟、94号室 (72)発明者 ユリヤ ゲオルギエヴナ ロストヴァ ロシア連邦、117454、モスクワ市、ヴェル ナツキ通り64A番地、40号室 (72)発明者 タチヤナ アブラモヴナ ヤンポリスカヤ ロシア連邦、123364、モスクワ市、ロドチ ナヤ通り31番地、5号棟、77号室 (72)発明者 タチヤナ ヴィクトロヴナ レオノヴァ ロシア連邦、123481、モスクワ市、スヴァ ボドゥィ通り81番地、5号棟、852号室 (72)発明者 ミハイル マルコヴィッチ グシャチネル ロシア連邦、113646、モスクワ市、セヴェ ルノエ チェルタノヴォ4番地、403号棟、 217号室 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA03 AA05 BA07 BA71 CA04 DA06 EA04 GA11 HA03 4B050 CC01 CC03 DD02 LL05 4B064 AE24 CA02 CA19 CC24 DA01 DA10 DA16 4B065 AA26X AA26Y AB01 BA01 CA17 CA27

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 野生型N−アセチルグルタミン酸合成酵
    素の15位〜19位に相当するアミノ酸配列が配列番号
    1〜4のいずれかのアミノ酸配列で置換されたアミノ酸
    配列を有し、かつ、L−アルギニンによるフィードバッ
    ク阻害が解除された変異型N−アセチルグルタミン酸合
    成酵素。
  2. 【請求項2】 野生型N−アセチルグルタミン酸合成酵
    素がエシェリヒア・コリのN−アセチルグルタミン酸合
    成酵素である請求項1記載の変異型N−アセチルグルタ
    ミン酸合成酵素。
  3. 【請求項3】 15位〜19位以外の1又は複数の位置
    において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿
    入又は付加を含み、かつ、L−アルギニンによるフィー
    ドバック阻害が解除された請求項1又は2に記載の変異
    型N−アセチルグルタミン酸合成酵素。
  4. 【請求項4】 請求項1〜3のいずれか一項に記載の変
    異型N−アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするD
    NA。
  5. 【請求項5】 請求項4記載のDNAで形質転換され、
    かつ、L−アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細
    菌。
  6. 【請求項6】 請求項5記載のエシェリヒア属細菌を培
    地で培養し、L−アルギニンを培地中に生成蓄積させ、
    該培地よりL−アルギニンを採取することを特徴とする
    L−アルギニンの製造法。
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