ES2228699T3 - Nuevo mutante de la n-acetigltamato sintasa y procedimiento para la produccion de-arginina. - Google Patents
Nuevo mutante de la n-acetigltamato sintasa y procedimiento para la produccion de-arginina.Info
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Abstract
N-acetilglutamato sintasa mutante en la que la secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 15 a 19 en una acetilglutamato sintasa de Escherichia coli es sustituida por cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID nos: 1 a 4 y la inhibición por retroalimentación por la L-arginina resulta desensibilizada.
Description
Nuevo mutante de la
N-acetilglutamato sintasa y procedimiento para la
producción de L-arginina.
La presente invención se refiere al campo de la
industria microbiológica, al procedimiento para la producción de
L-arginina, y se refiere al uso de unos nuevos
mutantes enzimáticos, resistentes a la retroinhibición en la vía
biosintética de la arginina de cepas de E coli productoras de
arginina.
La biosíntesis de arginina a partir de glutamato
por las células de E. coli se lleva a cabo mediante una
serie de reacciones que se inician con la acetilación del glutamato
por la N-acetilglutamato sintasa (NAGS), codificada
por argA. Este proceso es regulado mediante la represión de
la transcripción del regulón arg y por retroinhibición de la
NAGS por la arginina [Cunin R., et al., Microbiol.
Rev., vol. 50, p. 314-352, 1986].
La L-arginina reprime la expresión de argA en
una proporción superior a 250 e inhibe la actividad de NAGS
(Ki = 0,02 mM) [Leisinger T., Haas D., J. Biol.Chem.,
vol. 250, p. 1690-1693, 1975]. Para
incrementar la biosíntesis de arginina por E coli, son
necesarias enzimas NAGS resistentes a la retroinhibición
(denominadas enzimas "fbr").
Las enzimas mutantes resistentes a la
retroinhibición pueden ser obtenidas por mutagénesis espontánea,
química o dirigida al sitio.
Algunos argA "fbr" mutantes han sido
aislados y estudiados. Las células de Serratia marcescens
que portan mutaciones de argA "fbr" son inestables y
dan lugar a argA mutantes con actividad reducida o con
alteración de su afinidad por el glutamato [Takagi T., et
al., J. Biochem. vol. 99, p. 357-364,
1986].
Los genes argA "fbr" de cinco cepas
de E. coli con NAGS "fbr" han sido clonados y se han
descubierto sustituciones de base únicas en los genes argA
en cada una de las cepas NAGS "fbr", habiéndose demostrado que
las sustituciones causan la sustitución de His-15
por Tyr, Tyr-19 por Cys, Ser-54 por
Asn, Arg-58 por His, Gly-287 por Ser
y Gln-432 por Arg (Rajanopal B.S., et al.,
Appl. Environ. Microbiol., 1998, vol.64, No. 5,
p. 1805-1811).
Como regla, el fenotipo "fbr" de la enzima
surge como resultado de la sustitución del residuo aminoácido por
otro en un sitio único o en pocos sitios de la secuencia proteica y
estas sustituciones dan lugar a la reducción de la actividad de la
enzima. Por ejemplo, la sustitución de la Met-256
natural por otros 19 residuos aminoácidos en el gen de la serina
acetiltransferasa (SAT) (gen cysE) de E. coli, da
lugar, en la mayoría de los casos, al fenotipo "fbr" pero las
SAT mutantes no restablecen el nivel de actividad de la SAT natural
[Nakamori S., et al., AEM, 64(5):
1607-1611, 1998].
Por lo tanto, la desventaja de las enzimas
mutantes obtenidas con estos procedimientos es la reducción de su
actividad en comparación con la de las enzimas de tipo salvaje.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar enzimas mutantes con una función clave en la
biosíntesis de arginina por E. coli, resistentes a la
regulación por retroalimentación y altamente selectivas.
En la presente invención, se propone un nuevo
procedimiento para la síntesis de un gran conjunto de genes
argA mutantes usando la completa aleatorización del
fragmento del gen argA. Las sustituciones simultáneas de
algunos residuos aminoácidos en un fragmento de la secuencia
proteica en el que se localiza la mutación "fbr" pueden dar
lugar a proteínas mutantes con un nivel de actividad próximo al
natural debido a la restauración más correcta de la estructura
tridimensional de la enzima. De esta forma se ha logrado la
realización de la presente invención descrita más adelante.
La presente invención proporciona:
(1) Un mutante de
N-acetilglutamato sintasa en el que la secuencia de
aminoácidos correspondientes a las posiciones de 15 a 19 en una
N-acetilglutamato sintasa de Escherichia coli
de tipo salvaje es sustituida por cualquiera de las secuencias de
aminoácidos de SEC ID n^{os}: 1 a 4, resultando desensibilizada la
retroinhibición por L-arginina;
(2) La N-acetilglutamato sintasa
mutante según (1) que incluye la deleción, sustitución, inserción o
adición de uno o varios aminoácidos en una o múltiples posiciones
distintas de las posiciones 15 a 19, con lo que resulta
desensibilizada la retroinhibición por
L-arginina;
(3) Un ADN codificador de la
N-acetilglutamato sintasa mutada según se define en
(1) ó (2);
(4) Una bacteria perteneciente al género
Escherichia coli transformada con el ADN según se define en
(3) y con actividad para producir L-arginina, y
(5) Un procedimiento para producir
L-arginina que comprende las etapas de cultivo de
la bacteria, según se define en (4) en un medio para producir y
acumular L-arginina en el medio y recolectar la
L-arginina del mismo.
La NAGS con una mutación "fbr" como la
descrita más arriba puede ser designada "NAGS mutante", un ADN
codificador de la NAGS mutante puede ser designado "gen
argA mutante" y la NAGS sin mutación puede ser denominada
"NAGS de tipo salvaje".
A continuación se describirá con mayor detalle la
presente invención.
Las NAGS y los genes argA mutantes que las
codifican se obtuvieron por mutagénesis aleatorizada dirigida a
fragmentos. Para obtener las numerosas mutaciones del gen
argA se llevó a cabo la aleatorización completa del
fragmento de 15 nucleótidos del gen argA, que codifica la
región de las posiciones 15 a 19 de los residuos aminoácidos en la
secuencia proteica. El fragmento de 15 nucleótidos totalmente
aleatorizado da lugar a 4^{15} o casi 10^{9} secuencias
diferentes de ADN, que pueden codificar 20^{5} diferentes
residuos aminoácidos en péptido 5-mero. La
probabilidad de no introducir en el marco los codones de parada en
estas secuencias es aproximadamente 0,95^{5} ó 78%. Por lo tanto,
la total aleatorización del fragmento del gen argA codifica
el péptido de los residuos aminoácidos de las posiciones 15 a la 19
debe proporcionar aproximadamente 2,5 millones de secuencias
proteicas diferentes con diversidad de este fragmento peptídico en
la estructura de la NAGS. La ulterior selección y detección
selectiva de los clones recombinantes que portan los genes
argA mutantes clonados en vectores de expresión permite
elegir las variantes "fbr" de NAGS mutantes con diferente grado
de actividad biológica hasta el nivel de actividad de la NAGS no
reprimida de tipo salvaje (wt). En la selección, los inventores
consideraron que la cepa que portara el gen argA mutante
podría obtenerse usando las cepas argD^{-} y proB^{-} o
proA^{-} porque dicha cepa no puede producir
L-prolina debido a la inhibición de la NAGS y, por
lo tanto, no puede crecer si existe una excesiva cantidad de
L-arginina en el medio de cultivo, pero la cepa que
alberga NAGS "fbr" puede crecer en un medio mínimo porque el
semialdehído glutámico, un precursor de la
L-prolina, puede ser aportado por la acetilornitina
desacetilasa (el producto de argE) a partir
N-acetilglutamato semialdehído, un precursor de la
L-arginina (Eckhardt T., Leisinger T., Mol. Gen.
Genet., vol. 138, p. 225-232, 1975). Sin
embargo, los inventores descubrieron que es difícil obtener NAGS
"fbr" con una alta actividad mediante el procedimiento
anterior, como se describe en el siguiente ejemplo, y que se puede
obtener NAGS "fbr" con una gran actividad introduciendo el
argA mutante en una cepa de tipo salvaje y seleccionando la
cepa que presenta retraso del crecimiento celular.
Las secuencias de aminoácidos de las NAGS
mutantes adecuadas para el fenotipo "fbr" de NAGS han sido
definidas en la presente invención. Así, la NAGS mutante puede
obtenerse basándose en las secuencias e introduciendo mutaciones en
un argA salvaje, usando procedimientos ordinarios. Como tipo
salvaje de gen argA se puede mencionar el gen argA de
E. coli (GenBank No. Y00492).
La secuencia de aminoácidos de las posiciones 15
a 19 de la NAGS mutante de la presente invención es cualquiera de
las secuencias SEC ID N^{os}: 1 a 4. En la SEC ID N^{os}: 5 y 6
se ilustran las secuencias de aminoácidos correspondientes a
mutantes conocidos de NAGS, en los que la tyr en una posición 19 es
sustituida por cys, y el tipo salvaje de NAGS de E. coli.
Ejemplos de secuencias nucleotídicas que codifican estas secuencias
de aminoácidos se ilustran en las SEC ID N^{os}: 7 a 12. La Tabla
1 muestra estas secuencias.
La NAGS mutante, puede incluir la deleción,
sustitución o adición de uno o varios aminoácidos en una o
múltiples posiciones distintas de las posiciones 15 a 19, siempre
que la actividad NAGS, es decir la actividad para catalizar la
reacción de acetilación del ácido L-glutámico que da
lugar a N-acetilglutamato, no resulte
deteriorada.
El número de los "varios" aminoácidos
difiere dependiendo de la posición y del tipo de residuos
aminoácidos en la estructura tridimensional de la proteína. Esto se
debe a la siguiente razón. Es decir, algunos aminoácidos tienen una
alta homología con otros y la diferencia en tal aminoácido no
afecta de forma importante a la estructura tridimensional de la
proteína. Por lo tanto, la NAGS mutante de la presente invención
puede ser una con una homología no inferior al
30-50%, preferentemente del 50-70%,
con respecto a todos los residuos aminoácidos de la NAGS
constitutiva y con actividad NAGS "fbr".
En la presente invención, la "secuencia de
aminoácidos correspondiente a la secuencia de las posiciones 15 a
19" significa una secuencia de aminoácidos correspondiente a la
secuencia de las posiciones 15 a 19 de la NAGS de tipo salvaje de
E. coli. La posición de un residuo aminoácido puede cambiar.
Por ejemplo, si un residuo aminoácido es insertado en la porción
N-terminal, el residuo aminoácido localizado
inherentemente en la posición 15 se transforma en la posición 16.
En tal caso, el residuo aminoácido correspondiente a la posición
original 15 es designado residuo aminoácido en posición 15 en la
presente invención.
El ADN que codifica la proteína sustancialmente
igual a la NAGS mutante según se describe más arriba puede ser
obtenido, por ejemplo, modificando la secuencia nucleotídica, por
ejemplo, mediante un procedimiento de mutagénesis dirigida al
sitio, de tal forma que uno o más residuos aminoácidos del sitio
específico sufren deleción, sustitución, inserción o adición. El ADN
modificado como se indica más arriba puede ser obtenido por el
tratamiento convencionalmente conocido como tratamiento mutagénico.
El tratamiento mutagénico incluye un procedimiento para el
tratamiento in vitro de un ADN que contiene el gen
argA, por ejemplo, con hidroxilamina, y un procedimiento
para el tratamiento de un microorganismo, por ejemplo, una bacteria
perteneciente al género Escherichia que porta el gen
argA mutante, con irradiación ultravioleta o con un agente
mutágeno como la
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG) y ácido nitroso, habitualmente utilizados como tratamiento
mutágeno.
La sustitución, deleción, inserción o adición de
nucleótidos descritas previamente también incluyen las mutaciones
que ocurren de forma natural (mutantes o variantes), por ejemplo,
en la base de las diferencias individuales o de especies o géneros
de bacterias que portan NAGS.
El ADN que codifica sustancialmente la misma
proteína que el gen mutante argA, se obtiene expresando el
ADN con la mutación descrita previamente en una célula apropiada e
investigando la actividad NAGS del producto expresado.
Además, el ADN que codifica una proteína
sustancialmente igual a la NAGS mutante puede obtenerse aislando un
ADN hibridado con ADN que posee la secuencia del gen argA o
con una sonda obtenida del mismo en condiciones estrictas y que
codifica una proteína con actividad NAGS, de una célula que alberga
la NAGS mutante sometida a tratamiento mutagénico.
Dicho término "condiciones estrictas" alude
a unas circunstancias en las que se forma el denominado híbrido
específico y no se forma híbrido no específico. Es difícil expresar
claramente esta condición usando un valor numérico. Sin embargo,
las condiciones estrictas incluyen, por ejemplo, unas condiciones
en las que los ADN con una alta homología, por ejemplo, ADN con una
homología no inferior al 50% entre sí, resultan hibridados y los ADN
con una homología inferior a la anterior no resultan hibridados.
Alternativamente, las condiciones estrictas son ejemplificadas por
unas condiciones en las que los ADN se hibridan entre sí con una
concentración salina correspondiente a unas condiciones ordinarias
de lavado en la hibridación Southern, es decir, 60ºC,
preferentemente 65ºC, 1 x SSC, 0,1% SDS, preferentemente 0,1 x SSC,
0,1% SDS.
Los genes susceptibles de hibridación en las
condiciones descritas más arriba son los que tienen un codón de
finalización de lectura generado dentro de una región codificadora
del mismo y los que no tienen actividad debido a una mutación del
centro activo. Sin embargo, dichos inconvenientes pueden ser
eliminados fácilmente mediante el ligamiento del gen con un vector
de expresión comercial e investigando la actividad NAGS.
La bacteria perteneciente al género
Escherichia de la presente invención es una bacteria del
género Escherichia a la que se ha introducido el gen mutante
argA. Un ejemplo de bacteria del género Escherichia es
E. coli. El gen argA mutante puede ser introducido,
por ejemplo, mediante la transformación de una bacteria del género
Escherichia con un ADN recombinante en un vector que funciona
en una bacteria del género Escherichia y contiene el gen
mutante argA. El gen mutante argA también puede ser
introducido por sustitución del gen argA en un cromosoma por
el gen argA mutante.
El uso de vectores para la introducción de un gen
argA mutante es ejemplificado por plásmidos vectores tales
como pBR322, pMW118, pUC19 y similares, fagos vectores, tales como
11059, 1BF101, M13mp9 y similares y transposones como Mu, TN10, TN5
y similares.
La introducción de un ADN en una bacteria
perteneciente al género Escherichia puede ser realizada, por
ejemplo, por el procedimiento de D. A. Morrison (Methods in
Enzimology, 68, 326 (1979), o por un procedimiento en el que las
células bacterianas receptoras son tratadas con cloruro cálcico para
incrementar la permeabilidad al ADN (Mandel, M., y Higa, A., J.
Mol. Biol., 53, 159, (1970) y similares.
Si el gen argA mutante es introducido en
bacterias pertenecientes al género Escherichia que producen
L-arginina, según se describe más arriba, se puede
incrementar la cantidad de L-arginina producida.
Además, se puede conferir la capacidad de producción de
L-arginina a una bacteria en la que se ha
introducido el gen argA mutante. El ejemplo de bacteria
perteneciente al género Escherichia que tiene actividad de
producción de L-arginina es la cepa de E.
coli 237 (VKPM B-7925). Esta cepa 237 ha sido
depositada en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos
Industriales (VKPM) con el número de catálogo VKPM
B-7925 el 10 de abril de 2000 y transferida del
depósito original al depósito internacional, en base al Tratado de
Budapest, el 18 de mayo de 2001.
La L-arginina puede ser producida
de forma eficiente cultivando en un medio de cultivo bacterias con
capacidad para producir L-arginina a las cuales se
ha introducido el gen argA mutante, produciéndose y
acumulándose la L-arginina en el medio, del cual se
recolecta L-arginina.
En el procedimiento de la presente invención, el
cultivo de las bacterias pertenecientes al género
Escherichia y la recolección y purificación de la
L-arginina del medio líquido se pueden realizar de
forma similar al procedimiento convencional de producción de
L-arginina por fermentación, usando bacterias. El
medio utilizado para el cultivo puede ser sintético o natural, con
la condición de que contenga una fuente de carbono y nitrógeno y
sales minerales y, si es necesario, los nutrientes que las bacterias
utilizadas requieran para su crecimiento en una cuantía apropiada.
La fuente de carbono puede ser diversos hidratos de carbono, como
glucosa y sacarosa, y distintos ácidos orgánicos, dependiendo de la
capacidad de asimilación de las bacterias utilizadas. Pueden usarse
alcoholes, como etanol o glicerol. Como fuente de nitrógeno, se
puede usar amoníaco, diversas sales de amonio, como sulfato de
amonio, otros compuestos nitrogenados como aminas, una fuente
natural de nitrógeno, como peptona, hidrolizado de soja y microbios
fermentadores digeridos. Como minerales se usan fosfato
monopotásico, sulfato de manganeso y carbonato cálcico. El cultivo
se realiza preferentemente en condiciones aerobias, como cultivo
con agitación, aireación y remoción. La temperatura del cultivo
suele ser de 20 a 40ºC, preferentemente de 30 a 38ºC. El pH del
cultivo suele estar entre 5 y 9, preferentemente entre 6,5 y 7,2.
El pH del cultivo puede ajustarse con amoníaco, carbonato cálcico,
diversos ácidos, diversas bases y tampones. En general, el cultivo
de 1 a 3 días se sigue de la acumulación de
L-arginina en el medio.
La recolección de la L-arginina
tras el cultivo se puede realizar separando los sólidos, como las
células, del medio mediante centrifugación o filtración a través de
una membrana y la posterior recolección y purificación de la
L-arginina mediante procedimientos de intercambio
iónico, concentración y fracción cristalina y similares.
La Fig. 1 muestra un esquema de la construcción
del conjunto de genes argA mutantes.
La presente invención se explicará ahora
específicamente con referencia a los siguientes ejemplos.
Se clonó el fragmento de ADN cromosómico
BamHI-Sa1I (2,02 kb) con el gen de tipo
salvaje argA en el plásmido pUC19 (plásmido
pUC19-argA). Para la amplificación mediante PCR se
usó Pyrobest™ DNA Polymerase, obtenida de Takara Shuzo Co. (Japón),
que se empleó según las indicaciones recomendadas por el
fabricante.
Para construir del conjunto de genes argA
mutantes se amplificó en una primera etapa, el fragmento del gen
argA codificador de la secuencia desde el residuo aminoácido
20 hasta el final de la NAGS (Fig. 1). Se usó como cadena plantilla
el plásmido pUC19-argA, el cebador codificador
(sentido) P1:5'-CGAGGGATTCCGCNNNNNNNNNNNN
NNNATCAATACCCACCGGG-3' (SEC ID NO:13) fue diseñado sobre la base de la secuencia de nucleótidos de argA y se usó como un cebador antisentido, P2, la secuencia inversa estándar M13. La secuencia fija del extremo 3' de 16-nucleótidos del cebador P1 es homóloga a la secuencia del gen argA corriente abajo del codón de Tyr-19 y la porción fija del extremo 5' de 13 nucleótidos a la secuencia corriente arriba de His-15. La homología del extremo 3' de P1 y la secuencia argA se usó para sintetizar el fragmento de ADN de 1,5 kbp usando veinte ciclos de PCR.
NNNATCAATACCCACCGGG-3' (SEC ID NO:13) fue diseñado sobre la base de la secuencia de nucleótidos de argA y se usó como un cebador antisentido, P2, la secuencia inversa estándar M13. La secuencia fija del extremo 3' de 16-nucleótidos del cebador P1 es homóloga a la secuencia del gen argA corriente abajo del codón de Tyr-19 y la porción fija del extremo 5' de 13 nucleótidos a la secuencia corriente arriba de His-15. La homología del extremo 3' de P1 y la secuencia argA se usó para sintetizar el fragmento de ADN de 1,5 kbp usando veinte ciclos de PCR.
A la solución de PCR (50 \mul) conteniendo los
dos cebadores (40 pmoles), se añadieron como plantilla 100 ng de
pUC19-ArgA. Se realizaron veinte ciclos de PCR
(94ºC durante 0,6 minutos, 55ºC durante 0,5 minutos, 72ºC durante 2
minutos) usando un termociclador modelo 2400 DNA
(Perkin-Elmer Co., Foster City, California).
En la segunda etapa de amplificación se
realizaron ocho ciclos (94ºC durante 1 minuto, 37ºC durante 1
minuto, 72ºC durante 0,5 minutos) en los que la cadena (-) de este
fragmento funciona como "cebador" para extenderlo y alcanzar
la secuencia completa del gen.
En la tercera etapa, se añadió una alícuota de 10
\mul de la mezcla de la solución a una mezcla de reacción fresca
(40 \mul) que contiene 100 pmoles del cebador sentido P3:
5'-TGCCATGGTAAAGGAACGTAAAACC-3' (SEC
ID NO:14), homólogo a la secuencia del extremo 5'- del gen
argA, y del cebador P2, como antisentido y se realizaron
diez ciclos adicionales (94º durante 0,5 minutos, 52ºC durante 0,5
minutos, 72ºC durante 2 minutos).
El fragmento de ADN de 1,78 kbp que codifica el
conjunto de variantes mutantes de genes argA completos se
purificó mediante electroforesis en gel de agarosa, se digirió con
NcoI (el sitio que incluye el codón ATG inicial del gen
argA) y HindIII y se ligó al vector
pKK233-2 (Pharmacia, Suecia) digerido con
NcoI y HindIII.
En experimentos posteriores, aproximadamente 150
ng del ADN ligado se utilizaron para la transformación de las
células de E. coli receptoras, con lo que se obtienen
aproximadamente 2000 clones recombinantes en cada caso.
Para la clonación y expresión de variantes del
gen argA se usó el plásmido vector pKK 233-2
(Pharmacia, Suecia). La cepa receptora de E. coli fue TG1
(supE hsd\Delta5 thi\Delta(lac-proAB)
F'2 [traD36 proAB^{+} lacI^{q} lacZ\DeltaM15]) (J.
Sambrook et al., Molecular cloning, 1989). La
selección de las células TG1 portadoras del conjunto de plásmidos
recombinantes pKK-argA-aleatorios
(con mutantes del gen argA) se llevó a cabo en placas de
agar LB. Se observó el retraso en el crecimiento de algunos clones
mutantes y consideró que este efecto se correlacionaba con la
producción de enzimas mutantes NAGS "fbr" activas. Se
purificaron los plásmidos de algunos clones y se determinó la
secuencia del ADN de los fragmentos 5'- de los genes mutantes
argA usando el procedimiento didesoxi de terminación de
cadena (tabla 2).
Para determinar la actividad NAGS, la cepa de
E. coli B3083 auxotrofa para arginina (argA^{-},
metB^{-}) es transformada con estos plásmidos. Las enzimas de las
fracciones solubles obtenidas de las células recombinantes
sonicadas son parcialmente purificadas mediante la precipitación con
sulfato de amonio y analizadas como se describe más adelante. La
actividad NAGS de las cepas portadoras de los plásmidos
pKK-argA-r11 (3390 nmoles/min x mg),
pKK-argA-r12 (1220 nmoles/min x mg)
y pKK-argA-r13 (3120 nmoles/min x
mg) es significativamente superior a la actividad NAGS de la cepa
portadora de pKK-argA-r4 (300
nmol/min x mg). El último plásmido portaba el gen argA
mutante con la misma sustitución (Y19C) descrita para la variante
más activa del gen argA con una única sustitución por
Rajagopal B.S. et al., (Rajagopal B.S. et al.,
Appl.Environ. Microbiol., 1998, v.64, No.5, p.
1805-1811).
Además, la actividad NAGS en la cepa portadora
del plásmido pKK-argA(wt) (tipo salvaje del
gen argA) es inferior a la de
pKK-argA-r11, -r12 y -r13. Las
actividades de las enzimas mutantes son aproximadamente iguales en
presencia de arginina, 10mM, en tanto que las enzimas de tipo
salvaje resultan marcadamente inhibidas por la arginina (menos de
la décima parte). Estos resultados indican que el fragmento
peptídico de los residuos aminoácidos 15 a 19 es responsable de la
retroinhibición de la NAGS por la L-arginina y del
grado de eficiencia catalítica de la NAGS mutante.
La acetilcoenzima A y todos los productos
químicos utilizados fueron adquiridos en Sigma Chemical Co., St.
Louis, Mo. Para determinar las actividades NAGS, se cultivaron en
medio M9 (5 ml), hasta la última fase exponencial, las células
E. coli B3083 (argA^{-}, metB^{-}) portando los plásmidos
recombinantes, se lavaron con solución de NaCl 0,14 M y se
resuspendieron en 2 ml de tampón fosfato-K, 40 mM,
(pH 7,0) con KCl, 100 mM. Las células fueron sonicadas y
centrifugadas. Las fracciones que contenían NAGS se precipitaron
con 5 volúmenes de (NH_{4})_{2}SO_{4} saturado y los
"pellets" se disolvieron en 2 ml de tampón
fosfato-K, 40 nM, (pH 7,0) con KCl,100mM, y
glicerol al 30% (vol/vol). Se añadió la solución de NAGS a 0,1 ml de
la mezcla de reacción (tris-HCl, 100 mM, (pH 8,5),
KCl, 35 mM, L-arginina-glutamato,
20 mM, y acetilcoenzima A, 1,2 mM) y se incubó la mezcla de
reacción a 37ºC durante 10 minutos. La reacción se paró añadiendo
0,3 ml de etanol y se centrifugó la mezcla de reacción. Se añadió
al sobrenadante 0,95 ml de solución de DTNB, 0,24 mM,
(5,5-ditio-bis-2-nitrobenzoato)
y se incubó la mezcla durante 15 minutos. La actividad NAGS se
determinó midiendo la absorbencia a 412 nm.
La selección de argA mutante
(pKK-argA-random) en la cepa E.
coli B16-4 (pro^{-} argD^{-}) se llevó a
cabo por el procedimiento descrito más arriba. Los clones
recombinantes de las placas de agar fueron suspendidos en medio M9
con L-arginina y se cultivaron hasta la fase
estacionaria. La alícuota del cultivo fue suspendida en el medio
fresco y se repitió el procedimiento del cultivo cuatro veces. A
continuación, esta alícuota del cultivo se sembró en agar M9 con 5
mg/ml de L-arginina y 100 \mug de ampicilina. Los
plásmidos de algunos clones se purificaron, se secuenciaron los
fragmentos 5'- de los genes argA mutantes y se determinaron
los grados de actividad de la NAGS mutante como se ha descrito
anteriormente. El 60% de los mutantes portaban la secuencia
-Gly-Trp-Pro-Cys-Val-
(SEC ID NO: 4) en un fragmento mutado de la enzima y poseían una
débil (aproximadamente 10 nmoles/min x mg) actividad NAGS, pero de
tipo "fbr". Obviamente, esta proteína mutante proporciona el
grado óptimo de actividad NAGS para el crecimiento de células
pro^{-} argD^{-} en las condiciones de selección usadas. Por
consiguiente, se considera que las condiciones de selección
determinan la actividad de la NAGS mutante obtenida.
Se digirieron los plásmidos recombinantes
pKKArgA-r4, 11, 12, 13 y 32 con BamHI y
SalI y los fragmentos que contenían los genes argA
mutantes bajo el promotor trc fueron subclonados en el plásmido de
bajas copias pMW119 (Nippon Gene Co., Tokio). Los plásmidos
resultantes se designaron pMADS4, pMADS11, pMADS12, pMADS13 y
pMADS32, respectivamente. Estos plásmidos fueron introducidos en
una cepa de E. coli 237 productora de
L-arginina (VKPM B-7925). En la
Tabla 3 se muestran la producción de L-arginina
(Arg) y citrulina (Cit) de los transformantes. La mayoría de las
cepas productoras con la nueva mutante NAGS tienen una producción
de Arg + Cit superior a la cepa receptora o cepa con la mutante
conocida de NAGS Tir19Cis (pMADS4).
El medio de fermentación contenía 60 g/l de
glucosa, 25 g/l de sulfato de amonio, 2 g/l de KH_{2}PO_{4},
1 g/l de MgSO_{4}, 0,1 mg/l de tiamina, 5 g/l de extracto de
levadura Difco, 25 g/l de carbonato de calcio por 1 l de agua
corriente (pH 7,2). La glucosa y el carbonato de calcio se
esterilizaron separadamente. Se pusieron 2 ml del medio en un tubo
de ensayo, se inoculó con un asa de los microorganismos analizados,
y se cultivó a 32ºC durante 3 días, con agitación.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevo mutante
N-acetilglutamato sintasa y procedimiento para la
producción de L-arginina
\vskip0.400000\baselineskip
<130> EPA-53648
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-06-18
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> RU 2000116481
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-06-28
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<150> RU 20001112869
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<151>
2001-05-15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia parcial de aminoácidos codificados por secuencia
aleatoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Trp Arg Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia parcial de aminoácidos codificados por secuencia
aleatoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Phe Gly Leu His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia parcial de aminoácidos codificados por secuencia
aleatoria
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ala Ala Ser Arg}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia parcial de aminoácidos codificados por secuencia
aleatoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Trp Pro Cys Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia parcial de aminoácidos codificados por secuencia
aleatoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ser Val Pro Cys}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ser Val Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia aleatoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtagtatggc gggca
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia aleatoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgttcggat tgcac
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia aleatoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcggcggcgt ccaga
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia aleatoria
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtggccat gcgtg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia aleatoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattcggttc cctgt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattcggttc cctat
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador que comprende una secuencia aleatoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14) .. (28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a ó g ó c ó t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgagggattc cgcnnnnnnn nnnnnnnnat caatacccac cggg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccatggta aaggaacgta aaacc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (5)
1. N-acetilglutamato sintasa
mutante en la que la secuencia de aminoácidos correspondiente a las
posiciones 15 a 19 en una acetilglutamato sintasa de Escherichia
coli es sustituida por cualquiera de las secuencias de
aminoácidos de las SEC ID n^{os}: 1 a 4 y la inhibición por
retroalimentación por la L-arginina resulta
desensibilizada.
2. N-acetilglutamato sintasa
mutante según la reivindicación 1, que comprende la deleción,
sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en una
o varias posiciones distintas de las posiciones 15 a 19, en las que
la inhibición por retroalimentación por la
L-arginina resulta desensibilizada.
3. ADN que codifica la
N-acetilglutamato sintasa mutante según se define
en la reivindicación 1 ó 2.
4. Bacteria perteneciente al género
Escherichia coli que contiene el ADN definido según la
reivindicación 3.
5. Procedimiento para la producción de
L-arginina que comprende las etapas del cultivo de
la bacteria según se define en la reivindicación 4 en un medio para
producir y acumular L-arginina en el medio.
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