JPH05207886A - 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−スレオニンの製造法Info
- Publication number
- JPH05207886A JPH05207886A JP1433592A JP1433592A JPH05207886A JP H05207886 A JPH05207886 A JP H05207886A JP 1433592 A JP1433592 A JP 1433592A JP 1433592 A JP1433592 A JP 1433592A JP H05207886 A JPH05207886 A JP H05207886A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ala
- leu
- arg
- strain
- gly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 必須アミノ酸の一つであり、医薬品、食品、
飼料などに広く利用されている重要な物質であるＬ−ス
レオニンを効率よく製造する。 【構成】 メチロバチルス属に属する微生物に由来しホ
モセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼおよび
スレオニンシンターゼのうち少なくとも１つの酵素の合
成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮ
Ａとの組換え体ベクターを保有するメチルバチルス属に
属する微生物を、メタノールを主炭素源として含有する
培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニンを生成蓄積さ
せ、該培養物からＬ−スレニオンを採取することを特徴
とするＬ−スレオニンの製造法。
飼料などに広く利用されている重要な物質であるＬ−ス
レオニンを効率よく製造する。 【構成】 メチロバチルス属に属する微生物に由来しホ
モセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼおよび
スレオニンシンターゼのうち少なくとも１つの酵素の合
成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮ
Ａとの組換え体ベクターを保有するメチルバチルス属に
属する微生物を、メタノールを主炭素源として含有する
培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニンを生成蓄積さ
せ、該培養物からＬ−スレニオンを採取することを特徴
とするＬ−スレオニンの製造法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、必須アミノ酸の一つで
あり、医薬品、食品、飼料などに広く利用されている重
要な物質であるＬ−スレオニンの製造法に関する。
あり、医薬品、食品、飼料などに広く利用されている重
要な物質であるＬ−スレオニンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、安価に大量に入手可能な発酵原料
であるメタノールからＬ−スレオニンを製造する方法と
しては、アクロモバクター属およびシュードモナス属に
属する微生物を用いる方法（特公昭４５−２５２７３号
公報）、プロタミノバクター属に属する微生物を用いる
方法（特開昭５０−２５７９０号公報）、ミクロサイク
ラス属に属する微生物を用いる方法（特開昭５２−１８
８８６号公報）などが知られている。本出願人もメチロ
バチルス属に属する変異株を用いる方法を特願平２−２
０５５６７に開示している。
であるメタノールからＬ−スレオニンを製造する方法と
しては、アクロモバクター属およびシュードモナス属に
属する微生物を用いる方法（特公昭４５−２５２７３号
公報）、プロタミノバクター属に属する微生物を用いる
方法（特開昭５０−２５７９０号公報）、ミクロサイク
ラス属に属する微生物を用いる方法（特開昭５２−１８
８８６号公報）などが知られている。本出願人もメチロ
バチルス属に属する変異株を用いる方法を特願平２−２
０５５６７に開示している。
【０００３】遺伝子組換え手法を用いてＬ−スレオニン
を製造する方法としては、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物由来のホモセリン
デヒドロゲナーゼおよびホモセリンキナーゼの合成に関
与する遺伝子を担うＤＮＡ断片を用いる方法（特開昭６
２−９１１９３号公報）、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物由来のホモセリン
デヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼおよびスレオニ
ンシンターゼの合成に関与する遺伝子を担うＤＮＡ断片
を用いる方法（特開昭６２−１８６７９５号公報）、コ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属す
る微生物由来のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵
素またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの合
成に関与する遺伝子を担うＤＮＡ断片を用いる方法（特
開昭６２−７９７８８号公報）などが知られている。メ
チロバチルス属に属する微生物由来の遺伝子を用いてア
ミノ酸の生産性を向上させた例は知られていない。
を製造する方法としては、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物由来のホモセリン
デヒドロゲナーゼおよびホモセリンキナーゼの合成に関
与する遺伝子を担うＤＮＡ断片を用いる方法（特開昭６
２−９１１９３号公報）、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物由来のホモセリン
デヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼおよびスレオニ
ンシンターゼの合成に関与する遺伝子を担うＤＮＡ断片
を用いる方法（特開昭６２−１８６７９５号公報）、コ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属す
る微生物由来のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵
素またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの合
成に関与する遺伝子を担うＤＮＡ断片を用いる方法（特
開昭６２−７９７８８号公報）などが知られている。メ
チロバチルス属に属する微生物由来の遺伝子を用いてア
ミノ酸の生産性を向上させた例は知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、医薬
品、食品、飼料などに有用なＬ−スレオニンをメタノー
ルを主炭素源とすることにより工業的により安価に製造
する方法を提供することにある。
品、食品、飼料などに有用なＬ−スレオニンをメタノー
ルを主炭素源とすることにより工業的により安価に製造
する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、メチロ
バチルス属に属する微生物に由来しホモセリンデヒドロ
ゲナーゼ（以下ＨＤと略す）、ホモセリンキナーゼ（以
下ＨＫと略す）およびスレオニンシンターゼ（以下ＴＳ
と略す）のうち少なくとも１つの酵素の合成に関与する
遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え
体ベクターを保有するメチロバチルス属に属する微生物
を、メタノールを主炭素源として含有する培地に培養
し、培養物中にＬ−スレオニンを生成蓄積させ、該培養
物からＬ−スレオニンを採取することを特徴とするＬ−
スレオニンの製造法を提供することができる。
バチルス属に属する微生物に由来しホモセリンデヒドロ
ゲナーゼ（以下ＨＤと略す）、ホモセリンキナーゼ（以
下ＨＫと略す）およびスレオニンシンターゼ（以下ＴＳ
と略す）のうち少なくとも１つの酵素の合成に関与する
遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え
体ベクターを保有するメチロバチルス属に属する微生物
を、メタノールを主炭素源として含有する培地に培養
し、培養物中にＬ−スレオニンを生成蓄積させ、該培養
物からＬ−スレオニンを採取することを特徴とするＬ−
スレオニンの製造法を提供することができる。
【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
おけるＤＮＡ断片の供与微生物としては、メチロバチル
ス属に属し、ＨＤ活性、ＨＫ活性およびＴＳ活性のうち
少なくとも１つを有する微生物であれば、いかなる微生
物でも使用できる。微生物は野生株、それから誘導した
変異株のいずれでもよい。具体的にはシュードモナス・
インスエタ（Pseudomonas insueta ）ＡＴＣＣ２１２７
６株、プロタミノバクター・チアミノファーガス（Prot
aminobacter thiaminophagus）ＡＴＣＣ２１３７１株
〔いずれの菌株もメチロバチルス・グリコゲネス（Meth
ylobacillus glycogens ）に菌名変更されている。この
ことは、インターナショナル・ジャーナル・オブ・シス
テマティック・バクテリオロジー（International Jour
nal of Systematic Bacteriology) Vol. 36,ｐ５０２−
５１１（１９８６）に明記されている。以下、本明細書
中においてはＡＴＣＣ２１２７６株をメチロバチルス・
グリコゲネス１０１１株、ＡＴＣＣ２１３７１株をメチ
ロバチルス・グリコゲネス１００６株と記載する。〕お
よびメチロバチルス・グリコゲネス１００６株から誘導
された変異株メチロバチルス・グリコゲネスＡＴＲ８０
株をあげることができる。
おけるＤＮＡ断片の供与微生物としては、メチロバチル
ス属に属し、ＨＤ活性、ＨＫ活性およびＴＳ活性のうち
少なくとも１つを有する微生物であれば、いかなる微生
物でも使用できる。微生物は野生株、それから誘導した
変異株のいずれでもよい。具体的にはシュードモナス・
インスエタ（Pseudomonas insueta ）ＡＴＣＣ２１２７
６株、プロタミノバクター・チアミノファーガス（Prot
aminobacter thiaminophagus）ＡＴＣＣ２１３７１株
〔いずれの菌株もメチロバチルス・グリコゲネス（Meth
ylobacillus glycogens ）に菌名変更されている。この
ことは、インターナショナル・ジャーナル・オブ・シス
テマティック・バクテリオロジー（International Jour
nal of Systematic Bacteriology) Vol. 36,ｐ５０２−
５１１（１９８６）に明記されている。以下、本明細書
中においてはＡＴＣＣ２１２７６株をメチロバチルス・
グリコゲネス１０１１株、ＡＴＣＣ２１３７１株をメチ
ロバチルス・グリコゲネス１００６株と記載する。〕お
よびメチロバチルス・グリコゲネス１００６株から誘導
された変異株メチロバチルス・グリコゲネスＡＴＲ８０
株をあげることができる。
【０００７】ＨＤをコードする遺伝子（ＨＤ遺伝子）、
ＴＳをコードする遺伝子（ＴＳ遺伝子）およびＨＫをコ
ードする遺伝子（ＨＫ遺伝子）は、アミノ酸要求性株の
栄養要求性相補による方法、コロニーハイブリダイゼー
ションによる方法などにより、クローニングすることが
できる。 (1) 大腸菌アミノ酸要求性株の栄養要求性相補による遺
伝子のクローニング 供与菌からの染色体ＤＮＡの抽出、該ＤＮＡの部分切
断、特定ベクターへの遺伝子ＤＮＡ断片の導入、該組換
え体ベクターへの遺伝子ＤＮＡ断片の導入を行ったの
ち、該組換え体ベクターをＨＤ、ＨＫあるいはＴＳ遺伝
子欠失由来の要求性変異欠損株に形質転換し、該要求性
が相補された形質転換体の選択により目的遺伝子をクロ
ーニングすることができる。ＨＤ遺伝子を得るための形
質転換に用いる受容菌は、ＨＤ遺伝子欠損由来のホモセ
リン要求性変異株、すなわちＨＤ遺伝子ＤＮＡを有する
ベクターを用いて形質転換された際にベクター上のＨＤ
遺伝子の情報を発現し、ホモセリン要求性が回復するよ
うな微生物であればいずれの微生物であってもよい。た
とえば大腸菌（Escherichia coli) Ｋ−12株由来のホモ
セリン要求性変異欠損株 Gif102 株〔ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology), 117
, 133, (1974) 〕が用いられる。ＴＳ遺伝子はメチロ
バチルス属細菌においてはＨＤ遺伝子と近接して存在し
ており、ＨＤ遺伝子をクローニングする際、適当な制限
酵素を用いて染色体ＤＮＡを大きめに部分切断すること
で、上記のＨＤ遺伝子のクローニング手法によりＨＤ遺
伝子とともにクローニングすることができる。
ＴＳをコードする遺伝子（ＴＳ遺伝子）およびＨＫをコ
ードする遺伝子（ＨＫ遺伝子）は、アミノ酸要求性株の
栄養要求性相補による方法、コロニーハイブリダイゼー
ションによる方法などにより、クローニングすることが
できる。 (1) 大腸菌アミノ酸要求性株の栄養要求性相補による遺
伝子のクローニング 供与菌からの染色体ＤＮＡの抽出、該ＤＮＡの部分切
断、特定ベクターへの遺伝子ＤＮＡ断片の導入、該組換
え体ベクターへの遺伝子ＤＮＡ断片の導入を行ったの
ち、該組換え体ベクターをＨＤ、ＨＫあるいはＴＳ遺伝
子欠失由来の要求性変異欠損株に形質転換し、該要求性
が相補された形質転換体の選択により目的遺伝子をクロ
ーニングすることができる。ＨＤ遺伝子を得るための形
質転換に用いる受容菌は、ＨＤ遺伝子欠損由来のホモセ
リン要求性変異株、すなわちＨＤ遺伝子ＤＮＡを有する
ベクターを用いて形質転換された際にベクター上のＨＤ
遺伝子の情報を発現し、ホモセリン要求性が回復するよ
うな微生物であればいずれの微生物であってもよい。た
とえば大腸菌（Escherichia coli) Ｋ−12株由来のホモ
セリン要求性変異欠損株 Gif102 株〔ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology), 117
, 133, (1974) 〕が用いられる。ＴＳ遺伝子はメチロ
バチルス属細菌においてはＨＤ遺伝子と近接して存在し
ており、ＨＤ遺伝子をクローニングする際、適当な制限
酵素を用いて染色体ＤＮＡを大きめに部分切断すること
で、上記のＨＤ遺伝子のクローニング手法によりＨＤ遺
伝子とともにクローニングすることができる。
【０００８】ＨＫ遺伝子を得るため形質転換に用いられ
る受容菌としてはＨＫ遺伝子欠損由来のスレオニン要求
性変異株、すなわちＨＫ遺伝子ＤＮＡを有するベクター
を用いて形質転換された際にベクター上のＨＤ遺伝子の
情報を発現し、スレオニン要求性が回復するような微生
物であればいずれの微生物であってもよい。たとえば大
腸菌Ｋ−12株由来のスレオニン要求性ＨＫ変異欠損株 H
fr3000 YA73 株〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（Journal of Bacteriology), 117 , 133, (1974) 〕が
用いられる。 (2) コロニーハイブリダイゼーションによる遺伝子のク
ローニング 精製した酵素のアミノ酸配列に対応するＤＮＡをプロー
ブとし、供与体ＤＮＡを有するベクターを形質転換した
微生物よりモレキュラー・クローニング（Molecular Cl
oning)第２版1.85章に記載されている方法でコロニーハ
イブリダイゼーションを行い、放射活性を示すコロニー
から目的遺伝子をクローニングすることができる。
る受容菌としてはＨＫ遺伝子欠損由来のスレオニン要求
性変異株、すなわちＨＫ遺伝子ＤＮＡを有するベクター
を用いて形質転換された際にベクター上のＨＤ遺伝子の
情報を発現し、スレオニン要求性が回復するような微生
物であればいずれの微生物であってもよい。たとえば大
腸菌Ｋ−12株由来のスレオニン要求性ＨＫ変異欠損株 H
fr3000 YA73 株〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（Journal of Bacteriology), 117 , 133, (1974) 〕が
用いられる。 (2) コロニーハイブリダイゼーションによる遺伝子のク
ローニング 精製した酵素のアミノ酸配列に対応するＤＮＡをプロー
ブとし、供与体ＤＮＡを有するベクターを形質転換した
微生物よりモレキュラー・クローニング（Molecular Cl
oning)第２版1.85章に記載されている方法でコロニーハ
イブリダイゼーションを行い、放射活性を示すコロニー
から目的遺伝子をクローニングすることができる。
【０００９】すなわちＤＮＡ供与菌の菌体を超音波破砕
等により破壊し、遠心分離して得られる抽出液からＨ
Ｄ，ＨＫまたはＴＳ酵素をカラムクロマトグラフィー等
の常法により精製する。その酵素たんぱくの一部のアミ
ノ酸配列、たとえばＮ末端アミノ酸配列をアミノ酸シー
クエンサーにより決定する。次にそのアミノ酸配列に対
応するＤＮＡをＤＮＡ合成機等を用いて合成し、その一
部をラジオアイソトープでラベルしプローブとする。
等により破壊し、遠心分離して得られる抽出液からＨ
Ｄ，ＨＫまたはＴＳ酵素をカラムクロマトグラフィー等
の常法により精製する。その酵素たんぱくの一部のアミ
ノ酸配列、たとえばＮ末端アミノ酸配列をアミノ酸シー
クエンサーにより決定する。次にそのアミノ酸配列に対
応するＤＮＡをＤＮＡ合成機等を用いて合成し、その一
部をラジオアイソトープでラベルしプローブとする。
【００１０】供与菌から染色体ＤＮＡを抽出し、該ＤＮ
Ａを部分切断、特定ベクターへの遺伝子ＤＮＡ断片の導
入を行った後該組換え体ベクターを用いて受容菌を形質
転換する。受容菌はプラスミドを安定して保持できる菌
株であればいずれの微生物でも構わない。たとえば大腸
菌Ｋ−12株由来のＤＨ５α株（コスモバイオ社製）があ
げられる。出現したコロニーをニトロセルロース膜に転
写後、溶菌し、ＤＮＡを膜に固定したのち上記のプロー
ブでハイブリダイゼーションを行う。放射活性を示すコ
ロニーからＨＤ，ＨＫ，ＴＳ遺伝子を取得することがで
きる。
Ａを部分切断、特定ベクターへの遺伝子ＤＮＡ断片の導
入を行った後該組換え体ベクターを用いて受容菌を形質
転換する。受容菌はプラスミドを安定して保持できる菌
株であればいずれの微生物でも構わない。たとえば大腸
菌Ｋ−12株由来のＤＨ５α株（コスモバイオ社製）があ
げられる。出現したコロニーをニトロセルロース膜に転
写後、溶菌し、ＤＮＡを膜に固定したのち上記のプロー
ブでハイブリダイゼーションを行う。放射活性を示すコ
ロニーからＨＤ，ＨＫ，ＴＳ遺伝子を取得することがで
きる。
【００１１】用いられるベクターは、前記したような各
受容菌において自律複製できるものであればよい。たと
えばプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９
などがあげられる。このようにして得られた形質転換体
の保有するＨＤ，ＨＫ，ＴＳ遺伝子ＤＮＡは、他の適当
なプラスミドに再度組み換えて、メチロバチルス属に属
する微生物に導入することができる。
受容菌において自律複製できるものであればよい。たと
えばプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９
などがあげられる。このようにして得られた形質転換体
の保有するＨＤ，ＨＫ，ＴＳ遺伝子ＤＮＡは、他の適当
なプラスミドに再度組み換えて、メチロバチルス属に属
する微生物に導入することができる。
【００１２】再度の組み換えに用いるベクターとして
は、メチロバチルス属に属する微生物において複製で
き、ＨＤ，ＨＫ，ＴＳ遺伝子ＤＮＡを受容菌へ持ち込み
その形質を発現できるものであればいずれも用いられ
る。たとえば、プラスミドpLA2905〔ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー（Jornual of Bacteriology)、161
、955 （1985）〕（図１）、プラスミドpMFY42〔遺
伝、44，53(1990)〕（図２）などがあげられる。これら
のプラスミドは、ニュークレイック・アシッド・リサー
チ（Nucleic Acid Research)、７巻、1513ページ、１９
７９年に記載されている方法（以下、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
とＤｏｌｙの方法と略す)に従い製造することができ
る。
は、メチロバチルス属に属する微生物において複製で
き、ＨＤ，ＨＫ，ＴＳ遺伝子ＤＮＡを受容菌へ持ち込み
その形質を発現できるものであればいずれも用いられ
る。たとえば、プラスミドpLA2905〔ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー（Jornual of Bacteriology)、161
、955 （1985）〕（図１）、プラスミドpMFY42〔遺
伝、44，53(1990)〕（図２）などがあげられる。これら
のプラスミドは、ニュークレイック・アシッド・リサー
チ（Nucleic Acid Research)、７巻、1513ページ、１９
７９年に記載されている方法（以下、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
とＤｏｌｙの方法と略す)に従い製造することができ
る。
【００１３】ベクタープラスミドにＨＤ，ＨＫ，ＴＳ遺
伝子ＤＮＡを挿入するには、適当な制限酵素によりプラ
スミドを切断し、常法により遺伝子ＤＮＡを連結するこ
とによって行う。ＨＤ，ＨＫ，ＴＳ遺伝子ＤＮＡを有す
る組換え体ベクターをメチロバチルス属に属する微生物
に導入する方法としては、メソッズ・イン・エンザイモ
ロジー〔（Methods in Enzymology)， 118, 640（198
6）〕に記載されている方法、すなわち、ＨＤ，ＨＫ，
ＴＳ遺伝子ＤＮＡを有する組換え体ベクターを保持した
大腸菌Ｓ17−１株と受容菌を寒天平板上で混合し接合に
より受容菌へ導入する方法が用いられる。ＨＤ，ＨＫ，
ＴＳ遺伝子ＤＮＡを挿入した組換え体ベクターを含む形
質転換体は、ベクターの薬剤選択性により容易に同定す
ることができる。
伝子ＤＮＡを挿入するには、適当な制限酵素によりプラ
スミドを切断し、常法により遺伝子ＤＮＡを連結するこ
とによって行う。ＨＤ，ＨＫ，ＴＳ遺伝子ＤＮＡを有す
る組換え体ベクターをメチロバチルス属に属する微生物
に導入する方法としては、メソッズ・イン・エンザイモ
ロジー〔（Methods in Enzymology)， 118, 640（198
6）〕に記載されている方法、すなわち、ＨＤ，ＨＫ，
ＴＳ遺伝子ＤＮＡを有する組換え体ベクターを保持した
大腸菌Ｓ17−１株と受容菌を寒天平板上で混合し接合に
より受容菌へ導入する方法が用いられる。ＨＤ，ＨＫ，
ＴＳ遺伝子ＤＮＡを挿入した組換え体ベクターを含む形
質転換体は、ベクターの薬剤選択性により容易に同定す
ることができる。
【００１４】受容菌としては、たとえばＬ−スレオニン
生産菌であるメチロバチルス・グリコゲネスＡＴＲ８０
株、メチロバチルス・グリコゲネスＡ５１３株などがあ
げられる。このようにして得られたＨＤ、ＨＫ、ＴＳ遺
伝子を含むＤＮＡを有する組換え体ベクターを導入した
微生物を、メタノールを主炭素源とした培地に培養して
Ｌ−スレオニンを培養物中に生成蓄積させることができ
る。
生産菌であるメチロバチルス・グリコゲネスＡＴＲ８０
株、メチロバチルス・グリコゲネスＡ５１３株などがあ
げられる。このようにして得られたＨＤ、ＨＫ、ＴＳ遺
伝子を含むＤＮＡを有する組換え体ベクターを導入した
微生物を、メタノールを主炭素源とした培地に培養して
Ｌ−スレオニンを培養物中に生成蓄積させることができ
る。
【００１５】本発明で用いられる微生物は、通常メタノ
ール資化性微生物の培養に用いられる方法で培養され
る。本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地は、炭
素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の
有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地
のいずれでも用いられる。
ール資化性微生物の培養に用いられる方法で培養され
る。本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地は、炭
素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の
有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地
のいずれでも用いられる。
【００１６】炭素源としてはメタノールを主に用い、培
地中に0.05〜30％添加する。菌の生育、Ｌ−スレオニン
の生産性が向上する場合には、ピルビン酸、２−ケトグ
ルタル酸などの有機酸、酵母エキス、ペプトン、コーン
・スティープ・リカーなどの天然有機成分などを0.01〜
４％程度培地に添加してもよい。窒素源としては、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、
硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素などを 0.1〜８％培地に添加し
て用いる。これらのほかに、通常、リン酸カリウム、リ
ン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸
マンガンなどの微量成分が少量添加される。
地中に0.05〜30％添加する。菌の生育、Ｌ−スレオニン
の生産性が向上する場合には、ピルビン酸、２−ケトグ
ルタル酸などの有機酸、酵母エキス、ペプトン、コーン
・スティープ・リカーなどの天然有機成分などを0.01〜
４％程度培地に添加してもよい。窒素源としては、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、
硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素などを 0.1〜８％培地に添加し
て用いる。これらのほかに、通常、リン酸カリウム、リ
ン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸
マンガンなどの微量成分が少量添加される。
【００１７】培養は振盪培養または通気攪拌培養などの
好気的条件下、pH５〜９、温度24〜37℃に保持しておこ
なわれ、通常24〜120 時間で終了する。培養物からのＬ
−スレオニンの採取は、培養物から菌体などの沈澱物を
除去しし、得られた培養液を通常の方法たとえば、イオ
ン交換処理法、濃縮法、塩析法などに付すことによりお
こなわれる。たとえば、菌体を除去した培養液上清を塩
酸でpH２に調整した後、強酸性カチオン交換樹脂に通液
後、希アンモニア水で吸着成分を溶出し、脱アンモニア
後濃縮する。これにアルコールを添加し、冷却保存下で
生成した結晶を集めることによりＬ−スレオニンを得る
ことができる。以下に本発明の実施例を示す。
好気的条件下、pH５〜９、温度24〜37℃に保持しておこ
なわれ、通常24〜120 時間で終了する。培養物からのＬ
−スレオニンの採取は、培養物から菌体などの沈澱物を
除去しし、得られた培養液を通常の方法たとえば、イオ
ン交換処理法、濃縮法、塩析法などに付すことによりお
こなわれる。たとえば、菌体を除去した培養液上清を塩
酸でpH２に調整した後、強酸性カチオン交換樹脂に通液
後、希アンモニア水で吸着成分を溶出し、脱アンモニア
後濃縮する。これにアルコールを添加し、冷却保存下で
生成した結晶を集めることによりＬ−スレオニンを得る
ことができる。以下に本発明の実施例を示す。
【００１８】
【００１９】実施例1. メチロバチルス・グリコゲネス
1011株、1006株のＨＤ遺伝子のクローニング (1) メチロバチルス・グリコゲネス1011株、1006株から
の染色体ＤＮＡおよびプラスミドｐＬＡ2905の調製 メチロバチルス・グリコゲネス1011株、1006株を 300ml
容の三角フラスコ内の30mlシード培地で30℃で24時間振
盪培養した。得られた培養液10mlを１リットル容の三角
フラスコ中のメタノールを 1.5％添加した発酵培地 100
mlに加え、培養24時間後に 2.5％のメタノールをさらに
加え、30℃で合計48時間振盪培養を行なった。培養終了
後、遠心分離して菌体を集め、50mM Tris-HClおよび50m
M EDTAからなる溶液（pH８）30mlに懸濁した。これに４
mlの１％ラウリル硫酸ナトリウム、１mlの5U／mlプロテ
アーゼ（シグマ社製Ｐ−5147）および２mlの5U／mlプロ
テアーゼ（シグマ社製Ｐ−4880）を加え、37℃で60分保
持した。1M Tris-HCl(pH8) で飽和したフェノール溶液
（以下Tris飽和フェノール溶液と略す）を等量加えて混
合した後遠心し、上清を回収して変性蛋白を除去した。
この上清に対して再度Tris飽和フェノール溶液を等量加
えて混合した後、遠心して上清を回収した。この上清に
クロロホルム・イソアミルアルコール混液（クロロホル
ム・イソアミルアルコール＝24：１）を等量加えて混合
したのち、遠心して上清を回収し変性蛋白を除去した。
得られた上清に上記クロロホルム・イソアミルアルコー
ル混液を等量加えて同様に操作し、変性蛋白の除去操作
を繰り返した。上清に10分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウム
（pH4.8)と２倍量のエチルアルコールを加えて染色体Ｄ
ＮＡを沈澱させた。染色体ＤＮＡはガラス棒で巻き取
り、70％エチルアルコールで洗ったのち真空乾燥して10
mM Tris-HClおよび１mM EDTA からなる溶液（pH８）
（以下TE緩衝液と略す）２mlに溶解した。この操作によ
り、100mg の染色体ＤＮＡを得た。
1011株、1006株のＨＤ遺伝子のクローニング (1) メチロバチルス・グリコゲネス1011株、1006株から
の染色体ＤＮＡおよびプラスミドｐＬＡ2905の調製 メチロバチルス・グリコゲネス1011株、1006株を 300ml
容の三角フラスコ内の30mlシード培地で30℃で24時間振
盪培養した。得られた培養液10mlを１リットル容の三角
フラスコ中のメタノールを 1.5％添加した発酵培地 100
mlに加え、培養24時間後に 2.5％のメタノールをさらに
加え、30℃で合計48時間振盪培養を行なった。培養終了
後、遠心分離して菌体を集め、50mM Tris-HClおよび50m
M EDTAからなる溶液（pH８）30mlに懸濁した。これに４
mlの１％ラウリル硫酸ナトリウム、１mlの5U／mlプロテ
アーゼ（シグマ社製Ｐ−5147）および２mlの5U／mlプロ
テアーゼ（シグマ社製Ｐ−4880）を加え、37℃で60分保
持した。1M Tris-HCl(pH8) で飽和したフェノール溶液
（以下Tris飽和フェノール溶液と略す）を等量加えて混
合した後遠心し、上清を回収して変性蛋白を除去した。
この上清に対して再度Tris飽和フェノール溶液を等量加
えて混合した後、遠心して上清を回収した。この上清に
クロロホルム・イソアミルアルコール混液（クロロホル
ム・イソアミルアルコール＝24：１）を等量加えて混合
したのち、遠心して上清を回収し変性蛋白を除去した。
得られた上清に上記クロロホルム・イソアミルアルコー
ル混液を等量加えて同様に操作し、変性蛋白の除去操作
を繰り返した。上清に10分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウム
（pH4.8)と２倍量のエチルアルコールを加えて染色体Ｄ
ＮＡを沈澱させた。染色体ＤＮＡはガラス棒で巻き取
り、70％エチルアルコールで洗ったのち真空乾燥して10
mM Tris-HClおよび１mM EDTA からなる溶液（pH８）
（以下TE緩衝液と略す）２mlに溶解した。この操作によ
り、100mg の染色体ＤＮＡを得た。
【００２０】プラスミドpLA2905 は、エッシェリヒア・
コリATCC37354 株を500ml のスーパーブロスで30℃、16
時間培養した後遠心して菌体を集め、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
とＤｏｌｙの方法で精製を行ない９mgの精製標品を得
た。
コリATCC37354 株を500ml のスーパーブロスで30℃、16
時間培養した後遠心して菌体を集め、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
とＤｏｌｙの方法で精製を行ない９mgの精製標品を得
た。
【００２１】(2) HD遺伝子、TS遺伝子のクローニング (1)で得られた染色体ＤＮＡ(500μｇ／ml）90μｌ、Y15
0緩衝液〔100mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM MgCl2 ,1.5M
NaCl, 60mMメルカプトエタノール〕10μｌおよび100 単
位のPstI（宝酒造製）を混合し、37℃で1.5 時間反応さ
せ、さらに65℃で15分加温して反応を停止した。染色体
ＤＮＡのPstI反応液は0.8 ％アガロースで分離し、２〜
６キロベース（以下、Kbと記載する。）に相当するＤＮ
ＡをManiatisらの著書〔モレキュラー・クローニング(M
olecular Cloning)（1982年）コールドスプリングハー
バーラボラトリーズ(Cold Spring Harbor Laboratorie
s)：以下、Maniatisらの著書とは本書のことをいう。〕
に記載された方法で分画した。分画したＤＮＡは10μｌ
のＴＥ緩衝液に溶解した。一方、500 μｇ／mlのプラス
ミドpBR322（宝酒造製）18μｌ、Y150緩衝液２μｌおよ
び10単位のPstI（宝酒造製）を混合し、37℃で 1.5時間
反応させ、さらに65℃で15分加温して反応を停止した。
染色体ＤＮＡとpBR322各々のPst1反応液を混合し、Ｔ４
リガーゼ用緩衝液〔250mM Tris-HCl(pH7.6), 50mM MgCl
2 ,25 ％ポリエチレングリコール8000, 5mM ATP, 5mM
ジチオスレイトール〕を５分の１量添加し、Ｔ４リガー
ゼを100 単位加えて16℃で16時間反応させた。
0緩衝液〔100mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM MgCl2 ,1.5M
NaCl, 60mMメルカプトエタノール〕10μｌおよび100 単
位のPstI（宝酒造製）を混合し、37℃で1.5 時間反応さ
せ、さらに65℃で15分加温して反応を停止した。染色体
ＤＮＡのPstI反応液は0.8 ％アガロースで分離し、２〜
６キロベース（以下、Kbと記載する。）に相当するＤＮ
ＡをManiatisらの著書〔モレキュラー・クローニング(M
olecular Cloning)（1982年）コールドスプリングハー
バーラボラトリーズ(Cold Spring Harbor Laboratorie
s)：以下、Maniatisらの著書とは本書のことをいう。〕
に記載された方法で分画した。分画したＤＮＡは10μｌ
のＴＥ緩衝液に溶解した。一方、500 μｇ／mlのプラス
ミドpBR322（宝酒造製）18μｌ、Y150緩衝液２μｌおよ
び10単位のPstI（宝酒造製）を混合し、37℃で 1.5時間
反応させ、さらに65℃で15分加温して反応を停止した。
染色体ＤＮＡとpBR322各々のPst1反応液を混合し、Ｔ４
リガーゼ用緩衝液〔250mM Tris-HCl(pH7.6), 50mM MgCl
2 ,25 ％ポリエチレングリコール8000, 5mM ATP, 5mM
ジチオスレイトール〕を５分の１量添加し、Ｔ４リガー
ゼを100 単位加えて16℃で16時間反応させた。
【００２２】このリガーゼ反応液を、Maniatisらの著書
に記載された方法で作成した大腸菌Gif102株（CGSC5075
株）のコンピテント化した菌液 200μｌに混ぜ、４℃で
30分間、次いで42℃で２分間保ち、Ｌ培地１mlを加えて
37℃２時間振盪培養した。培養液を遠心して菌体を集
め、生理食塩水10mlで２回洗ったのち、１mlの生理食塩
水に懸濁した。これをM9S1培地に塗布し、37℃で１日間
培養した。宿主はHD遺伝子を欠損しているためホモセリ
ンの含まれていなM9S1培地で生育することができない。
メチロバチルス属に属する微生物由来のHD遺伝子を保持
する形質転換株は、メチロバチルス属に属する微生物由
来のHD遺伝子が働くことにより、M9S1培地で生育するこ
とができる。M9S1培地で生育する形質転換株から容易に
メチロバチルス属由来のHD遺伝子を分離することができ
る。M9S1培地に出現したコロニーをテトラサイクリン
（シグマ社製）20mg／ｌを含んだＬ培地５mlに植え、30
℃で16時間培養し、培養液よりＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏ
ｌｙの方法でプラスミドを精製した。1011株由来の染色
体ＤＮＡよりクローニングされたHD遺伝子を含むプラス
ミドをpIHD-1、1006株由来の染色体ＤＮＡよりクローニ
ングされたHD遺伝子を含むプラスミドをpTHD-1と呼称す
る。pIHD-1、pTHD-1を数種の制限酵素で切断し、各々図
３、図４に示す制限酵素地図を作成した。〔メチロバチ
ルス・グリコゲネス1011株から得られるHD遺伝子を含む
ＤＮＡは約3.1kbの制限酵素PstI断片であり（図３参
照）、メチロバチルス・グリコゲネス1006株から得られ
るHD遺伝子を含むＤＮＡは約4.15Kbの制限酵素PstI断片
である（図４参照）。〕得られた形質転換株のホモセリ
ンデヒドロゲナーゼ活性を確認した。pIHD-1またはpTHD
-1を含むGif102株をテトラサイクリン20mg／ｌを含んだ
Ｌ培地 300mlを入れた2リットル容の三角フラスコに植
菌し、30℃で24時間振盪培養した。遠心して菌体を集
め、0.2M Tris-HCl(pH7.2) および20mMメルカプトエタ
ノールからなる溶液（以下超音波処理用緩衝液と略す）
50mlに懸濁し、超音波破砕装置（ブランソン社製）で菌
体を破砕、遠心して細胞抽出液を得た。５mg／mlの形質
転換株の細胞抽出液 100μｌ、50mMアスパラギン酸セミ
アルデヒド〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリ（J.
Biol.Chem.), 213，39,(1955）に記載された方法で合
成〕75μｌ、２mM NADH 75μｌおよび1.25mlの超音波処
理用緩衝液を混合し、340nm の吸光度の減少を測定する
ことでホモセリンデヒドロゲナーゼ活性の存在を調べ
た。宿主の細胞抽出液を用いた場合には、ホモセリンデ
ヒドロゲナーゼ活性に由来する340nm の吸光度の減少が
観察されないが、形質転換株の細胞抽出液を用いた場合
には、340nm の吸光度の減少が観察された。以上のこと
からメチロバチルス1011株、1006株から確かにHD遺伝子
をクローニングしたことを確認した。
に記載された方法で作成した大腸菌Gif102株（CGSC5075
株）のコンピテント化した菌液 200μｌに混ぜ、４℃で
30分間、次いで42℃で２分間保ち、Ｌ培地１mlを加えて
37℃２時間振盪培養した。培養液を遠心して菌体を集
め、生理食塩水10mlで２回洗ったのち、１mlの生理食塩
水に懸濁した。これをM9S1培地に塗布し、37℃で１日間
培養した。宿主はHD遺伝子を欠損しているためホモセリ
ンの含まれていなM9S1培地で生育することができない。
メチロバチルス属に属する微生物由来のHD遺伝子を保持
する形質転換株は、メチロバチルス属に属する微生物由
来のHD遺伝子が働くことにより、M9S1培地で生育するこ
とができる。M9S1培地で生育する形質転換株から容易に
メチロバチルス属由来のHD遺伝子を分離することができ
る。M9S1培地に出現したコロニーをテトラサイクリン
（シグマ社製）20mg／ｌを含んだＬ培地５mlに植え、30
℃で16時間培養し、培養液よりＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏ
ｌｙの方法でプラスミドを精製した。1011株由来の染色
体ＤＮＡよりクローニングされたHD遺伝子を含むプラス
ミドをpIHD-1、1006株由来の染色体ＤＮＡよりクローニ
ングされたHD遺伝子を含むプラスミドをpTHD-1と呼称す
る。pIHD-1、pTHD-1を数種の制限酵素で切断し、各々図
３、図４に示す制限酵素地図を作成した。〔メチロバチ
ルス・グリコゲネス1011株から得られるHD遺伝子を含む
ＤＮＡは約3.1kbの制限酵素PstI断片であり（図３参
照）、メチロバチルス・グリコゲネス1006株から得られ
るHD遺伝子を含むＤＮＡは約4.15Kbの制限酵素PstI断片
である（図４参照）。〕得られた形質転換株のホモセリ
ンデヒドロゲナーゼ活性を確認した。pIHD-1またはpTHD
-1を含むGif102株をテトラサイクリン20mg／ｌを含んだ
Ｌ培地 300mlを入れた2リットル容の三角フラスコに植
菌し、30℃で24時間振盪培養した。遠心して菌体を集
め、0.2M Tris-HCl(pH7.2) および20mMメルカプトエタ
ノールからなる溶液（以下超音波処理用緩衝液と略す）
50mlに懸濁し、超音波破砕装置（ブランソン社製）で菌
体を破砕、遠心して細胞抽出液を得た。５mg／mlの形質
転換株の細胞抽出液 100μｌ、50mMアスパラギン酸セミ
アルデヒド〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリ（J.
Biol.Chem.), 213，39,(1955）に記載された方法で合
成〕75μｌ、２mM NADH 75μｌおよび1.25mlの超音波処
理用緩衝液を混合し、340nm の吸光度の減少を測定する
ことでホモセリンデヒドロゲナーゼ活性の存在を調べ
た。宿主の細胞抽出液を用いた場合には、ホモセリンデ
ヒドロゲナーゼ活性に由来する340nm の吸光度の減少が
観察されないが、形質転換株の細胞抽出液を用いた場合
には、340nm の吸光度の減少が観察された。以上のこと
からメチロバチルス1011株、1006株から確かにHD遺伝子
をクローニングしたことを確認した。
【００２３】HD遺伝子の近傍には、スレオニン生合成経
路の他の遺伝子、アスパルトキナーゼ（AKと略す）遺伝
子、HK遺伝子、TS遺伝子が存在することが知られてい
る。メチロバチルス・グリコゲネス1011株、1006株より
クローニングしたHD遺伝子を含むpIHD-1, pTHD-1にAK,H
K,TS遺伝子が含まれているかどうか、pIHD-1, pTHD-1を
AK, HK,TS 遺伝子のそれぞれの欠損株、GT３株〔ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.) 117 ,
133 (1974)〕、Hfr3000YA73(CGSC#5076)株，Gif41(CGSC
#5077)株に形質転換し、それぞれの株のアミノ酸要求性
（GT3 株−−スレオニン、メチオニン、ジアミノピメリ
ン酸同時要求性）（Hfr3000YA73, Gif41株−−スレオニ
ン要求性）を相補するかどうかにより調べた。pIHD-1は
どの株のアミノ酸要求性も相補しなかったが、pTHD-1は
Gif41株のスレオニン要求性を相補し、pTHD-1には1006
株HD遺伝子の他にTS遺伝子も含まれていることが明らか
となった。
路の他の遺伝子、アスパルトキナーゼ（AKと略す）遺伝
子、HK遺伝子、TS遺伝子が存在することが知られてい
る。メチロバチルス・グリコゲネス1011株、1006株より
クローニングしたHD遺伝子を含むpIHD-1, pTHD-1にAK,H
K,TS遺伝子が含まれているかどうか、pIHD-1, pTHD-1を
AK, HK,TS 遺伝子のそれぞれの欠損株、GT３株〔ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.) 117 ,
133 (1974)〕、Hfr3000YA73(CGSC#5076)株，Gif41(CGSC
#5077)株に形質転換し、それぞれの株のアミノ酸要求性
（GT3 株−−スレオニン、メチオニン、ジアミノピメリ
ン酸同時要求性）（Hfr3000YA73, Gif41株−−スレオニ
ン要求性）を相補するかどうかにより調べた。pIHD-1は
どの株のアミノ酸要求性も相補しなかったが、pTHD-1は
Gif41株のスレオニン要求性を相補し、pTHD-1には1006
株HD遺伝子の他にTS遺伝子も含まれていることが明らか
となった。
【００２４】(3) HD遺伝子のサブクローニングとＤＮＡ
塩基配列の決定 500μｇ／mlのpIHD-1, pTHD-1各々６μｌ、Ｋ50緩衝液
〔500mM KCl, 70mM MgCl2 , 61mM２−メルカプトメタノ
ール，100mM Tris-HCl(pH7.5)２μｌ、SmaI（宝酒造社
製）10単位およびTE緩衝液11μｌを混合し、37℃で１時
間反応させた。これを 0.8％アガロースで分離し、2.1k
b のHD遺伝子を含むゲル断片よりＤＮＡ回収および精製
のためのキット、ＤＮＡ Prep （ダイアヤトロン社製）
よりHD遺伝子を含む2.1kb のＤＮＡ断片を精製し、10μ
ｌのTE緩衝液に溶解した。 500μｇ／mlのpUC18(宝酒造
社製）６μｌをＫ50緩衝液２μｌ、HincII（宝酒造社
製）10単位およびTE緩衝液11μl と混合し、37℃で１時
間反応させ、65℃で15分間保持して反応を止めた。1011
株由来のHDを含むＤＮＡ断片、または1006株由来のHDを
含むＤＮＡ断片10μｌとpUC18 のHincII処理溶液５μｌ
にT4リガーゼ用緩衝液を４μｌ添加し、T4リガーゼを 1
00単位加えて16℃で16時間反応させた。この溶液をGif1
02株に対しManiatisらの著書に記載された方法で形質転
換し、寒天1.5％およびアンピシリン100 μｇ／mlを含
むＬ培地に塗布し、37℃で24時間培養した。この培地に
出現したコロニーをアンピシリン100 μｇ／mlを含むＬ
培地５mlに植え、30℃で16時間培養し、培養液よりＢｉ
ｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法でプラスミドを精製し
た。pIHD-1の2.1kb SmaI 断片がpUC18 に連結したもの
をpIHD-41 、pTHD-1の2.1kbSmaI 断片がpUC18 に連結し
たものをpTHD-41 と呼称する。pIHD-41 の制限酵素地図
を図５、 pTHD-41の制限酵素地図を図６に示した。pIHD
-41 またはpTHD-41 を有するGif102株はM9S1培地で生育
することができ、クローニングしたHD遺伝子は1011株、
1006株ともSmaI 2.1kb 内に存在することが明らかとな
った。pIHD-41 、pTHD-41 に含まれるHD遺伝子のＤＮＡ
塩基配列をジデオキシ法により決定した。1011株由来HD
遺伝子の構造遺伝子部分のＤＮＡ塩基配列を配列番号１
に、1006株由来HD遺伝子の構造遺伝子部分のＤＮＡ塩基
配列を配列番号２に示した。
塩基配列の決定 500μｇ／mlのpIHD-1, pTHD-1各々６μｌ、Ｋ50緩衝液
〔500mM KCl, 70mM MgCl2 , 61mM２−メルカプトメタノ
ール，100mM Tris-HCl(pH7.5)２μｌ、SmaI（宝酒造社
製）10単位およびTE緩衝液11μｌを混合し、37℃で１時
間反応させた。これを 0.8％アガロースで分離し、2.1k
b のHD遺伝子を含むゲル断片よりＤＮＡ回収および精製
のためのキット、ＤＮＡ Prep （ダイアヤトロン社製）
よりHD遺伝子を含む2.1kb のＤＮＡ断片を精製し、10μ
ｌのTE緩衝液に溶解した。 500μｇ／mlのpUC18(宝酒造
社製）６μｌをＫ50緩衝液２μｌ、HincII（宝酒造社
製）10単位およびTE緩衝液11μl と混合し、37℃で１時
間反応させ、65℃で15分間保持して反応を止めた。1011
株由来のHDを含むＤＮＡ断片、または1006株由来のHDを
含むＤＮＡ断片10μｌとpUC18 のHincII処理溶液５μｌ
にT4リガーゼ用緩衝液を４μｌ添加し、T4リガーゼを 1
00単位加えて16℃で16時間反応させた。この溶液をGif1
02株に対しManiatisらの著書に記載された方法で形質転
換し、寒天1.5％およびアンピシリン100 μｇ／mlを含
むＬ培地に塗布し、37℃で24時間培養した。この培地に
出現したコロニーをアンピシリン100 μｇ／mlを含むＬ
培地５mlに植え、30℃で16時間培養し、培養液よりＢｉ
ｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法でプラスミドを精製し
た。pIHD-1の2.1kb SmaI 断片がpUC18 に連結したもの
をpIHD-41 、pTHD-1の2.1kbSmaI 断片がpUC18 に連結し
たものをpTHD-41 と呼称する。pIHD-41 の制限酵素地図
を図５、 pTHD-41の制限酵素地図を図６に示した。pIHD
-41 またはpTHD-41 を有するGif102株はM9S1培地で生育
することができ、クローニングしたHD遺伝子は1011株、
1006株ともSmaI 2.1kb 内に存在することが明らかとな
った。pIHD-41 、pTHD-41 に含まれるHD遺伝子のＤＮＡ
塩基配列をジデオキシ法により決定した。1011株由来HD
遺伝子の構造遺伝子部分のＤＮＡ塩基配列を配列番号１
に、1006株由来HD遺伝子の構造遺伝子部分のＤＮＡ塩基
配列を配列番号２に示した。
【００２５】(4) TS遺伝子のサブクローニングとＤＮＡ
塩基配列の決定 500 μｇ／mlのpTHD-1 ６μｌ、Y150緩衝液〔1500mM K
Cl, 70mM MgC1 2 , 60mM２−メルカプトメタノール，10
0mM Tris-HCl(pH7.5)〕２μｌ、PstIおよびEcoRV(宝酒
造社製）各10単位およびTE緩衝液11μｌを混合し、37℃
で１時間反応させた。これを 0.8％アガロースで分離
し、2.3kb のTS遺伝子を含むゲル断片より、ＤＮＡ回収
および精製のためのキット、ＤＮＡ Prep （ダイアヤト
ロン社）より2.3kb のＤＮＡ断片を精製し、10μｌのTE
緩衝液に溶解した。ＤＮＡの末端をＤＮＡブランチング
キット（宝酒造製）で平滑末端化し、TE緩衝液10μｌに
溶解した。 500μｇ／mlのpUC19(宝酒造製）６μｌをＫ
50緩衝液２μｌ、SmaI（宝酒造製）10単位およびTE緩衝
液11μｌと混合し、37℃で１時間反応させ、65℃で15分
間保持して反応を止めた。
塩基配列の決定 500 μｇ／mlのpTHD-1 ６μｌ、Y150緩衝液〔1500mM K
Cl, 70mM MgC1 2 , 60mM２−メルカプトメタノール，10
0mM Tris-HCl(pH7.5)〕２μｌ、PstIおよびEcoRV(宝酒
造社製）各10単位およびTE緩衝液11μｌを混合し、37℃
で１時間反応させた。これを 0.8％アガロースで分離
し、2.3kb のTS遺伝子を含むゲル断片より、ＤＮＡ回収
および精製のためのキット、ＤＮＡ Prep （ダイアヤト
ロン社）より2.3kb のＤＮＡ断片を精製し、10μｌのTE
緩衝液に溶解した。ＤＮＡの末端をＤＮＡブランチング
キット（宝酒造製）で平滑末端化し、TE緩衝液10μｌに
溶解した。 500μｇ／mlのpUC19(宝酒造製）６μｌをＫ
50緩衝液２μｌ、SmaI（宝酒造製）10単位およびTE緩衝
液11μｌと混合し、37℃で１時間反応させ、65℃で15分
間保持して反応を止めた。
【００２６】1006株由来のTS遺伝子を含むＤＮＡ断片10
μｌとpUC19 のSmaI処理溶液５μｌにＴ４リガーゼ用緩
衝液を４μｌ添加し、Ｔ４リガーゼを 100単位加えて16
℃で16時間反応させた。この溶液をGif41 株に対しMani
atisらの著書に記載された方法で形質転換し、寒天 1.5
％およびアンピシリン 100μｇ／mlを含むＬ培地に塗布
し、37℃で24時間培養した。この培地に出現したコロニ
ーをアンピシリン 100μｇ／mlを含むＬ培地５mlに植
え、30℃16時間培養し、培養液よりＢｉｒｎｂｏｉｍと
Ｄｏｌｙの方法でプラスミドを精製した。pTHD-1の2.3k
b のＤＮＡ断片がpUC19 に連結したものをpTTS-1と呼称
する。pTTS-1の制限酵素地図を図７に示した。
μｌとpUC19 のSmaI処理溶液５μｌにＴ４リガーゼ用緩
衝液を４μｌ添加し、Ｔ４リガーゼを 100単位加えて16
℃で16時間反応させた。この溶液をGif41 株に対しMani
atisらの著書に記載された方法で形質転換し、寒天 1.5
％およびアンピシリン 100μｇ／mlを含むＬ培地に塗布
し、37℃で24時間培養した。この培地に出現したコロニ
ーをアンピシリン 100μｇ／mlを含むＬ培地５mlに植
え、30℃16時間培養し、培養液よりＢｉｒｎｂｏｉｍと
Ｄｏｌｙの方法でプラスミドを精製した。pTHD-1の2.3k
b のＤＮＡ断片がpUC19 に連結したものをpTTS-1と呼称
する。pTTS-1の制限酵素地図を図７に示した。
【００２７】pTTS-1を有するGif41 株はM9S1培地で生育
することができ、クローニングしたTS遺伝子はEcoRV お
よびPstIで切断した2.3kb のＤＮＡ断片内に存在するこ
とが明らかとなった。pTTS-1に含まれるTS遺伝子のＤＮ
Ａ塩基配列をジデオキシ法により決定した。1006株由来
のTS遺伝子の構造遺伝子部分のＤＮＡ塩基配列を配列番
号３に示した。
することができ、クローニングしたTS遺伝子はEcoRV お
よびPstIで切断した2.3kb のＤＮＡ断片内に存在するこ
とが明らかとなった。pTTS-1に含まれるTS遺伝子のＤＮ
Ａ塩基配列をジデオキシ法により決定した。1006株由来
のTS遺伝子の構造遺伝子部分のＤＮＡ塩基配列を配列番
号３に示した。
【００２８】実施例2. (1) アミノ酸アナログ耐性株、イソロイシン要求性株の
造成 HD、HK、TS遺伝子をベクターに連結してメチロバチルス
属に属する微生物に導入し、スレオニンの効率良い生産
を行う場合、HD、HK、TS遺伝子を導入する菌株は、野生
株を用いるより、スレオニンを作ることができる変異株
を用いるほうが、スレオニンの高生産が期待できる。そ
こでアミノ酸アナログ耐性株の中から、スレオニンの生
産株を選択した。
造成 HD、HK、TS遺伝子をベクターに連結してメチロバチルス
属に属する微生物に導入し、スレオニンの効率良い生産
を行う場合、HD、HK、TS遺伝子を導入する菌株は、野生
株を用いるより、スレオニンを作ることができる変異株
を用いるほうが、スレオニンの高生産が期待できる。そ
こでアミノ酸アナログ耐性株の中から、スレオニンの生
産株を選択した。
【００２９】メチロバチルス・グリコゲネス1006株から
得られた薬剤感受性の向上したK-224 株（ATCC21969
株）を常法によりＮＴＧ処理(500mg／ｌ、30℃で30分）
し、Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（シグマ社
製）3000μｇ／mlおよびスレオニン3000μｇ／mlを含ん
だM1寒天培地に塗布し、30℃で３〜14日培養し生育する
株を得た。この株をATR80 株と呼称する。ATR80 株を２
mlのシード培地を含む試験管に植菌し、30℃で24時間振
盪培養した。得られた培養液 0.5mlをメタノールを 1.5
％添加した発酵培地５mlを含む50ml容太型試験管に加
え、培養24時間後に2.5％のメタノールをさらに加え、3
0℃で合計48時間振盪培養を行った。培養終了後、菌体
を遠心で除去し、培養上清に含まれるＬ−スレオニン濃
度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグ
ラフィー、アミノ酸分析システム）で定量したところ、
1.30ｇ／ｌのスレオニンが蓄積していた。
得られた薬剤感受性の向上したK-224 株（ATCC21969
株）を常法によりＮＴＧ処理(500mg／ｌ、30℃で30分）
し、Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（シグマ社
製）3000μｇ／mlおよびスレオニン3000μｇ／mlを含ん
だM1寒天培地に塗布し、30℃で３〜14日培養し生育する
株を得た。この株をATR80 株と呼称する。ATR80 株を２
mlのシード培地を含む試験管に植菌し、30℃で24時間振
盪培養した。得られた培養液 0.5mlをメタノールを 1.5
％添加した発酵培地５mlを含む50ml容太型試験管に加
え、培養24時間後に2.5％のメタノールをさらに加え、3
0℃で合計48時間振盪培養を行った。培養終了後、菌体
を遠心で除去し、培養上清に含まれるＬ−スレオニン濃
度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグ
ラフィー、アミノ酸分析システム）で定量したところ、
1.30ｇ／ｌのスレオニンが蓄積していた。
【００３０】スレオニン生産菌にイソロイシン要求性を
付与することで、スレオニンの分解経路が遮断された変
異株を造成することができ、その変異株に、HD遺伝子を
導入すれば、スレオニンのより効率良い発酵生産が期待
できる。そこで以下の操作によりATR80 株にトランスポ
ゾンTn5 を作用させ、イソロイシン要求性株を分離し
た。ATR80 株を20ml容のＬ型試験管内の10mlのＬ培地に
植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。一方トランス
ポゾンTn5 をプラスミド上に有するプラスミドpSUP5011
を保持する大腸菌S17-1 株を10mlのＬ培地を含む20ml容
のＬ型試験管に植菌し、30℃で16時間振盪培養した。AT
R80 株の培養液 2.5mlとS17-1 株の培養液2.5ml を混合
した後５mlの無菌注射器（テルモ社製）に移し、ホルダ
ーに固定されたメンブレンフィルター（ミリポア社製、
0.45μｍ）に押し出し、メンブレンフィルター上に両菌
株を固定した。メンブレンフィルターを寒天 1.5％を含
むシード培地に載せ、30℃で24時間静置した。メンブレ
ンフィルターを10mlの生理食塩水で洗い、遠心して菌体
を集めた。この菌体に１mlの生理食塩水を加えて懸濁し
た。この菌体懸濁液を300ml 容の三角フラスコ内のフェ
ニルアラニン50μｇ／mlを含むM1培地30mlに懸濁し、30
℃で３時間培養した。この培養液にペニシリンＧ（明治
製菓製）を終濃度200 単位／mlになるように加え、30℃
で16時間振盪培養した。培養後、遠心して菌体を集め、
10mlの生理食塩水で洗ったのち、１mlの生理食塩水に懸
濁した。この菌体懸濁液を生理食塩水で100 倍に希釈
し、フェニルアラニン50μｇ／mlおよびイソロイシン50
μｇ／mlを含むM1寒天培地に塗布した。30℃で４日間培
養し、出現したコロニー3800株からイソロイシン要求性
株をスクリーニングしたところ、１株のイソロイシン要
求性株が得られた。この株をA513株と呼称する。この株
をATR80 株と同様の手法で太型試験管で培養を行ない、
菌体を遠心で除去し、培養上清に含まれるＬ−スレオニ
ン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマ
トグラフィー、アミノ酸分析システム）で定量したとこ
ろ、1.6 ｇ／ｌのスレオニンが蓄積していた。
付与することで、スレオニンの分解経路が遮断された変
異株を造成することができ、その変異株に、HD遺伝子を
導入すれば、スレオニンのより効率良い発酵生産が期待
できる。そこで以下の操作によりATR80 株にトランスポ
ゾンTn5 を作用させ、イソロイシン要求性株を分離し
た。ATR80 株を20ml容のＬ型試験管内の10mlのＬ培地に
植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。一方トランス
ポゾンTn5 をプラスミド上に有するプラスミドpSUP5011
を保持する大腸菌S17-1 株を10mlのＬ培地を含む20ml容
のＬ型試験管に植菌し、30℃で16時間振盪培養した。AT
R80 株の培養液 2.5mlとS17-1 株の培養液2.5ml を混合
した後５mlの無菌注射器（テルモ社製）に移し、ホルダ
ーに固定されたメンブレンフィルター（ミリポア社製、
0.45μｍ）に押し出し、メンブレンフィルター上に両菌
株を固定した。メンブレンフィルターを寒天 1.5％を含
むシード培地に載せ、30℃で24時間静置した。メンブレ
ンフィルターを10mlの生理食塩水で洗い、遠心して菌体
を集めた。この菌体に１mlの生理食塩水を加えて懸濁し
た。この菌体懸濁液を300ml 容の三角フラスコ内のフェ
ニルアラニン50μｇ／mlを含むM1培地30mlに懸濁し、30
℃で３時間培養した。この培養液にペニシリンＧ（明治
製菓製）を終濃度200 単位／mlになるように加え、30℃
で16時間振盪培養した。培養後、遠心して菌体を集め、
10mlの生理食塩水で洗ったのち、１mlの生理食塩水に懸
濁した。この菌体懸濁液を生理食塩水で100 倍に希釈
し、フェニルアラニン50μｇ／mlおよびイソロイシン50
μｇ／mlを含むM1寒天培地に塗布した。30℃で４日間培
養し、出現したコロニー3800株からイソロイシン要求性
株をスクリーニングしたところ、１株のイソロイシン要
求性株が得られた。この株をA513株と呼称する。この株
をATR80 株と同様の手法で太型試験管で培養を行ない、
菌体を遠心で除去し、培養上清に含まれるＬ−スレオニ
ン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマ
トグラフィー、アミノ酸分析システム）で定量したとこ
ろ、1.6 ｇ／ｌのスレオニンが蓄積していた。
【００３１】(2) HD遺伝子、TS遺伝子のpLA2905 への連
結 500 μｇ／mlのpTHD-1 ６μｌ、Y150緩衝液２μｌ、Ps
tI（宝酒造製）10単位およびTE緩衝液11μｌを混合し、
37℃１時間反応させた。これを0.8 ％アガロースで分離
し、4.1kb のHD,TS 遺伝子を含むゲル断片よりＤＮＡ回
収および精製のためのキット、ＤＮＡ Prep （ダイアヤ
トロン社）よりHD,TS 遺伝子を含む4.1kb のＤＮＡ断片
を精製し、10μｌのTE緩衝液に溶解した。500 μｇ／ml
のpLA2905 ６μｌ，Y100緩衝液〔1000mM NaCl, 70mM Mg
Cl2 , 60mM ２−メルカプトエタノール、100mM Tris-H
Cl(pH7.5)〕２μｌ、PstI（宝酒造製）10単位およびTE
緩衝液11μｌを混合し、37℃で１時間反応させ、65℃で
15分間保持して反応を止めた。1006株由来のHD,TS 遺伝
子を含むＤＮＡ断片10μｌとpLA2905 のPstI処理溶液５
μｌにT4リガーゼ用緩衝液を４μｌ添加し、T4リガーゼ
を１００単位加えて16℃で16時間反応させた。
結 500 μｇ／mlのpTHD-1 ６μｌ、Y150緩衝液２μｌ、Ps
tI（宝酒造製）10単位およびTE緩衝液11μｌを混合し、
37℃１時間反応させた。これを0.8 ％アガロースで分離
し、4.1kb のHD,TS 遺伝子を含むゲル断片よりＤＮＡ回
収および精製のためのキット、ＤＮＡ Prep （ダイアヤ
トロン社）よりHD,TS 遺伝子を含む4.1kb のＤＮＡ断片
を精製し、10μｌのTE緩衝液に溶解した。500 μｇ／ml
のpLA2905 ６μｌ，Y100緩衝液〔1000mM NaCl, 70mM Mg
Cl2 , 60mM ２−メルカプトエタノール、100mM Tris-H
Cl(pH7.5)〕２μｌ、PstI（宝酒造製）10単位およびTE
緩衝液11μｌを混合し、37℃で１時間反応させ、65℃で
15分間保持して反応を止めた。1006株由来のHD,TS 遺伝
子を含むＤＮＡ断片10μｌとpLA2905 のPstI処理溶液５
μｌにT4リガーゼ用緩衝液を４μｌ添加し、T4リガーゼ
を１００単位加えて16℃で16時間反応させた。
【００３２】このT4リガーゼ反応液を用いて大腸菌S17-
1 株をManiatisらの著書に記載された方法で形質転換
し、寒天1.5 ％およびテトラサイクリン20μｇ／mlを含
むＬ培地に塗布した。37℃で16時間培養して出現したコ
ロニーをテトラサイクリン20μｇ／mlを含むＬ培地５ml
を入れた試験管に植菌した。30℃16時間振盪培養し、遠
心して集めた菌体をＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法
に従い処理し、プラスミドを単離した。1006株由来のH
D,TS 遺伝子を含むプラスミドをpTHD-30 と呼称する。p
THD-30 の制限酵素地図を図８に示した。
1 株をManiatisらの著書に記載された方法で形質転換
し、寒天1.5 ％およびテトラサイクリン20μｇ／mlを含
むＬ培地に塗布した。37℃で16時間培養して出現したコ
ロニーをテトラサイクリン20μｇ／mlを含むＬ培地５ml
を入れた試験管に植菌した。30℃16時間振盪培養し、遠
心して集めた菌体をＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法
に従い処理し、プラスミドを単離した。1006株由来のH
D,TS 遺伝子を含むプラスミドをpTHD-30 と呼称する。p
THD-30 の制限酵素地図を図８に示した。
【００３３】500 μｇ／mlのpIHD-41, pTHD-41各々６μ
ｌ、K50 緩衝液２μｌ、PstI（宝酒造製）10単位、BamH
I 10単位（宝酒造製）およびTE緩衝液11μｌを混合し、
37℃で１時間反応させた。これを0.8 ％アガロースで分
離し、2.1kb のHD遺伝子を含むゲル断片よりＤＮＡ回収
および精製のためのキット、ＤＮＡ Prep （ダイアヤト
ロン社）よりHD遺伝子を含む2.1kb のＤＮＡ断片を精製
し、10μｌのTE緩衝液に溶解した。 500μｇ／mlのpLA2
905 ６μｌ，Y100緩衝液２μｌ、PstI（宝酒造製）10単
位、BglII 10 単位（宝酒造製）およびTE緩衝液11μｌ
を混合し、37℃で１時間反応させ、65℃で15分間保持し
て反応を止めた。1011株由来のHD遺伝子を含むＤＮＡ断
片、または1006株由来のHD遺伝子を含むＤＮＡ断片10μ
ｌとpLA2905 のBglII, PstI 処理溶液５μｌにT4リガー
ゼ用緩衝液を４μｌ添加し、T4リガーゼを１００単位加
えて16℃で16時間反応させた。
ｌ、K50 緩衝液２μｌ、PstI（宝酒造製）10単位、BamH
I 10単位（宝酒造製）およびTE緩衝液11μｌを混合し、
37℃で１時間反応させた。これを0.8 ％アガロースで分
離し、2.1kb のHD遺伝子を含むゲル断片よりＤＮＡ回収
および精製のためのキット、ＤＮＡ Prep （ダイアヤト
ロン社）よりHD遺伝子を含む2.1kb のＤＮＡ断片を精製
し、10μｌのTE緩衝液に溶解した。 500μｇ／mlのpLA2
905 ６μｌ，Y100緩衝液２μｌ、PstI（宝酒造製）10単
位、BglII 10 単位（宝酒造製）およびTE緩衝液11μｌ
を混合し、37℃で１時間反応させ、65℃で15分間保持し
て反応を止めた。1011株由来のHD遺伝子を含むＤＮＡ断
片、または1006株由来のHD遺伝子を含むＤＮＡ断片10μ
ｌとpLA2905 のBglII, PstI 処理溶液５μｌにT4リガー
ゼ用緩衝液を４μｌ添加し、T4リガーゼを１００単位加
えて16℃で16時間反応させた。
【００３４】このT4リガーゼ反応液を用いて大腸菌S17-
1 株をManiatisらの著書に記載された方法で形質転換
し、寒天1.5 ％およびテトラサイクリン20μｇ／mlを含
むＬ培地に塗布した。37℃で16時間培養して出現したコ
ロニーを、テトラサイクリン20μｇ／mlを含むＬ培地５
mlを入れた試験管に植菌した。30℃で16時間振盪培養
し、遠心して集めた菌体をＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙ
の方法に従い処理し、プラスミドを単離した。1011株由
来のHD遺伝子を含むプラスミドをpIHD-31 、1006株由来
のHD遺伝子を含むプラスミドをpTHD-31 と呼称する。pI
HD-31 、pTHD-31 の制限酵素地図を各々図９、図10に示
した。
1 株をManiatisらの著書に記載された方法で形質転換
し、寒天1.5 ％およびテトラサイクリン20μｇ／mlを含
むＬ培地に塗布した。37℃で16時間培養して出現したコ
ロニーを、テトラサイクリン20μｇ／mlを含むＬ培地５
mlを入れた試験管に植菌した。30℃で16時間振盪培養
し、遠心して集めた菌体をＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙ
の方法に従い処理し、プラスミドを単離した。1011株由
来のHD遺伝子を含むプラスミドをpIHD-31 、1006株由来
のHD遺伝子を含むプラスミドをpTHD-31 と呼称する。pI
HD-31 、pTHD-31 の制限酵素地図を各々図９、図10に示
した。
【００３５】(3) HD遺伝子のA513株への接合による導入 pLA2905,pTHD-30,pIHD-31 またはpTHD-31 を含むS17-1
株をテトラサイクリン20μｇ／mlを含むＬ培地10mlを入
れた20ml容のＬ型試験管に植菌し、30℃で16時間振盪培
養した。一方ATR80,A513株をフェニルアラニン50μｇ／
mlおよびイソロイシン50μｇ／mlを含むM1培地10mlを入
れた20ml容のＬ型試験管に植菌し、30℃で16時間振盪培
養した。pLA2905,pTHD-30,pIHD-31 またはpTHD-31 を含
むS17-1株の菌体を遠心分離して集め、10mlの生理食塩
水で一回洗った後、10mlの生理食塩水に懸濁した。pLA2
905,pTHD-30,pIHD-31 またはpTHD-31 を含むS17-1 株の
細胞懸濁液2.5ml とATR80 株またはA513株の培養液2.5m
l を混合した後、５mlの無菌注射器（テルモ社製）に移
し、ホルダーに固定されたメンブレンフィルター（ミリ
ポア社製、0.45μｍ）に押し出し、メンブレンフィルタ
ー上に両菌株を固定した。
株をテトラサイクリン20μｇ／mlを含むＬ培地10mlを入
れた20ml容のＬ型試験管に植菌し、30℃で16時間振盪培
養した。一方ATR80,A513株をフェニルアラニン50μｇ／
mlおよびイソロイシン50μｇ／mlを含むM1培地10mlを入
れた20ml容のＬ型試験管に植菌し、30℃で16時間振盪培
養した。pLA2905,pTHD-30,pIHD-31 またはpTHD-31 を含
むS17-1株の菌体を遠心分離して集め、10mlの生理食塩
水で一回洗った後、10mlの生理食塩水に懸濁した。pLA2
905,pTHD-30,pIHD-31 またはpTHD-31 を含むS17-1 株の
細胞懸濁液2.5ml とATR80 株またはA513株の培養液2.5m
l を混合した後、５mlの無菌注射器（テルモ社製）に移
し、ホルダーに固定されたメンブレンフィルター（ミリ
ポア社製、0.45μｍ）に押し出し、メンブレンフィルタ
ー上に両菌株を固定した。
【００３６】メンブレンフィルターは寒天1.5 ％を含む
シード培地に載せ、30℃で24時間静置した。メンブレン
フィルターは10mlの生理食塩水で洗い、遠心して菌体を
集めた。この菌体に１mlの生理食塩水を加えて懸濁し
た。この菌体懸濁液を生理食塩水で1000〜10000 倍に希
釈し、フェニルアラニン50μｇ／ml、イソロイシン50μ
ｇ／mlおよびテトラサイクリン20μｇ／mlを含むM1寒天
培地に塗布した。
シード培地に載せ、30℃で24時間静置した。メンブレン
フィルターは10mlの生理食塩水で洗い、遠心して菌体を
集めた。この菌体に１mlの生理食塩水を加えて懸濁し
た。この菌体懸濁液を生理食塩水で1000〜10000 倍に希
釈し、フェニルアラニン50μｇ／ml、イソロイシン50μ
ｇ／mlおよびテトラサイクリン20μｇ／mlを含むM1寒天
培地に塗布した。
【００３７】30℃で４日間培養したところコロニーが出
現した。pLA2905,pTHD-30,pIHD-31またはpTHD-31 を有
するATR80 株を各々ATR80/pLA2905, ATR80/pTHD-30, AT
R80/pIHD-31, ATR80/pTHD-31株と呼称する。A513株につ
いても同様にpLA2905,pTHD-30,pIHD-31,pTHD-31 を有す
るA513株を各々A513/pLA2905,A513/pTHD-30,A513/pIHD-
31,A513/pTHD-31 株と呼称する。
現した。pLA2905,pTHD-30,pIHD-31またはpTHD-31 を有
するATR80 株を各々ATR80/pLA2905, ATR80/pTHD-30, AT
R80/pIHD-31, ATR80/pTHD-31株と呼称する。A513株につ
いても同様にpLA2905,pTHD-30,pIHD-31,pTHD-31 を有す
るA513株を各々A513/pLA2905,A513/pTHD-30,A513/pIHD-
31,A513/pTHD-31 株と呼称する。
【００３８】メチロバチルス・グリコゲネス（Methylob
acillus glycogenes) A513/pTHD-30, メチスバチルス・
グリコゲネス（Methylobacillus glycogenes) A513/pTH
D-31およびメチロバチルス・グリコゲネス（Methylobac
illus glycogenes) A513/pIHD-31はブダペスト条約に基
づいて平成３年１２月１９日付で工業技術院微生物工業
技術研究所に各々微工研条寄第3684号（FERM BP-3684)
、微工研条寄第3685号（FERM BP-3685) および微工研
条寄第3686号（FERM BP-3686) として寄託されている。
acillus glycogenes) A513/pTHD-30, メチスバチルス・
グリコゲネス（Methylobacillus glycogenes) A513/pTH
D-31およびメチロバチルス・グリコゲネス（Methylobac
illus glycogenes) A513/pIHD-31はブダペスト条約に基
づいて平成３年１２月１９日付で工業技術院微生物工業
技術研究所に各々微工研条寄第3684号（FERM BP-3684)
、微工研条寄第3685号（FERM BP-3685) および微工研
条寄第3686号（FERM BP-3686) として寄託されている。
【００３９】実施例3. HDおよびTS 遺伝子を有する菌
株によるＬ−スレオニンの生産 ATR80,ATR80/pLA2905,ATR80/pTHD-30,ATR80/pIHD-31,AT
R80/pTHD-31,A513,A513/pLA2905,A513/pTHD-30,A513/pI
HD-31 およびA513/pTHD-31株を３mlのシード培地を含む
試験管に各々植菌し、30℃で24時間振盪培養した。得ら
れた培養液0.5mlをメタノールを1.5 ％添加した発酵培
地10mlを入れた50ml容の太型試験管に加え、培養24時間
後に2.5 ％のメタノールをさらに加え、30℃で合計48時
間振盪培養を行った。
株によるＬ−スレオニンの生産 ATR80,ATR80/pLA2905,ATR80/pTHD-30,ATR80/pIHD-31,AT
R80/pTHD-31,A513,A513/pLA2905,A513/pTHD-30,A513/pI
HD-31 およびA513/pTHD-31株を３mlのシード培地を含む
試験管に各々植菌し、30℃で24時間振盪培養した。得ら
れた培養液0.5mlをメタノールを1.5 ％添加した発酵培
地10mlを入れた50ml容の太型試験管に加え、培養24時間
後に2.5 ％のメタノールをさらに加え、30℃で合計48時
間振盪培養を行った。
【００４０】培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを遠心
で除去し、培養液上清中に含まれているＬ−スレオニン
濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマト
グラフィー、アミノ酸分析システム）で定量したとこ
ろ、第１表に示す結果を得た。ATR80, A513 株において
pIHD-31, pTHD-31を導入した場合、ベクターpLA2905 を
導入した場合に比べ、有意にスレオニン生産力価の向上
が認められた。
で除去し、培養液上清中に含まれているＬ−スレオニン
濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマト
グラフィー、アミノ酸分析システム）で定量したとこ
ろ、第１表に示す結果を得た。ATR80, A513 株において
pIHD-31, pTHD-31を導入した場合、ベクターpLA2905 を
導入した場合に比べ、有意にスレオニン生産力価の向上
が認められた。
【００４１】
【表１】
【００４２】実施例4. Ｌ−スレオニンの採取 実施例３で示した方法で、ATR80/pTHD-31 株を培養し、
その培養液上清800mlを集め、塩酸でpH2 に調整した
後、強カチオン交換樹脂ダイヤイオンSK1B(H型)のカラ
ムに通した。カラムを水洗後、2Nアンモニア水でカラム
の吸着成分を溶出し、Ｌ−スレオニンに相当する画分を
集め、減圧濃縮した。これにエタノールを加え、４℃に
冷却し、生成した結晶を集めて乾燥した結果、純度98％
以上のＬ−スレオニンの結晶を1.56ｇ得た。
その培養液上清800mlを集め、塩酸でpH2 に調整した
後、強カチオン交換樹脂ダイヤイオンSK1B(H型)のカラ
ムに通した。カラムを水洗後、2Nアンモニア水でカラム
の吸着成分を溶出し、Ｌ−スレオニンに相当する画分を
集め、減圧濃縮した。これにエタノールを加え、４℃に
冷却し、生成した結晶を集めて乾燥した結果、純度98％
以上のＬ−スレオニンの結晶を1.56ｇ得た。
【００４３】実施例5. (1) メチロバチルス・グリコゲネスATR80 株からの染色
体ＤＮＡおよびプラスミドpMFY42の調製 メチロバチルス・グリコゲネス ATR80株を30mlシード培
地を含む300ml 容の三角フラスコに植え、30℃で24時間
振盪培養した。得られた培養液10mlをメタノールを1.5
％添加した発酵培地 100mlを入れた１リットル容三角フ
ラスコに加え、培養24時間後に2.5 ％のメタノールをさ
らに加え、30℃で合計48時間振盪培養を行った。培養終
了後、遠心分離して菌体を集め、50mM Tris-HClおよび5
0mM EDTAからなる溶液（pH8)30mlに懸濁した。これに4m
l の１％ラウリル硫酸ナトリウム、１mlの5U/ml プロテ
アーゼ（シグマ社製P-5147) および２mlの5U/ml プロテ
アーゼ（シグマ社製P-4880) を加え、37℃で60分保持し
た。Tris飽和フェノール溶液を等量加えて混合した後遠
心し、上清を回収して変性蛋白を除去した。この上清に
対して再度Tris飽和フェノール溶液を等量加えて混合し
た後、遠心して上清を回収した。この上清にクロロホル
ム・イソアミルアルコール混液（クロロホルム：イソア
ミルアルコール＝24：１）を等量加えて混合したのち、
遠心して上清を回収し変性蛋白を除去した。得られた上
清に上記クロロホルム・イソアミルアルコール混液を等
量加えて同様に操作し、変性蛋白の除去操作を繰り返し
た。上清に10分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH4.8)と
２倍量のエチルアルコールを加えて染色体ＤＮＡを沈澱
させた。染色体ＤＮＡはガラス棒で巻き取り、70％エチ
ルアルコールで洗ったのち真空乾燥して２mlのTE緩衝液
に溶解した。この操作により、100mg の染色体ＤＮＡを
得た。
体ＤＮＡおよびプラスミドpMFY42の調製 メチロバチルス・グリコゲネス ATR80株を30mlシード培
地を含む300ml 容の三角フラスコに植え、30℃で24時間
振盪培養した。得られた培養液10mlをメタノールを1.5
％添加した発酵培地 100mlを入れた１リットル容三角フ
ラスコに加え、培養24時間後に2.5 ％のメタノールをさ
らに加え、30℃で合計48時間振盪培養を行った。培養終
了後、遠心分離して菌体を集め、50mM Tris-HClおよび5
0mM EDTAからなる溶液（pH8)30mlに懸濁した。これに4m
l の１％ラウリル硫酸ナトリウム、１mlの5U/ml プロテ
アーゼ（シグマ社製P-5147) および２mlの5U/ml プロテ
アーゼ（シグマ社製P-4880) を加え、37℃で60分保持し
た。Tris飽和フェノール溶液を等量加えて混合した後遠
心し、上清を回収して変性蛋白を除去した。この上清に
対して再度Tris飽和フェノール溶液を等量加えて混合し
た後、遠心して上清を回収した。この上清にクロロホル
ム・イソアミルアルコール混液（クロロホルム：イソア
ミルアルコール＝24：１）を等量加えて混合したのち、
遠心して上清を回収し変性蛋白を除去した。得られた上
清に上記クロロホルム・イソアミルアルコール混液を等
量加えて同様に操作し、変性蛋白の除去操作を繰り返し
た。上清に10分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH4.8)と
２倍量のエチルアルコールを加えて染色体ＤＮＡを沈澱
させた。染色体ＤＮＡはガラス棒で巻き取り、70％エチ
ルアルコールで洗ったのち真空乾燥して２mlのTE緩衝液
に溶解した。この操作により、100mg の染色体ＤＮＡを
得た。
【００４４】プラスミドpMFY42は、pMFY42を含むNV1184
株〔遺伝、44、53（1990）〕を500ml のスーパーブロス
で30℃、16時間培養した後遠心して菌体を集め、Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法で精製を行ない９mgの精製
標品を得た。
株〔遺伝、44、53（1990）〕を500ml のスーパーブロス
で30℃、16時間培養した後遠心して菌体を集め、Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法で精製を行ない９mgの精製
標品を得た。
【００４５】(2) HK遺伝子のクローニング 実施例５(1) で得られた染色体ＤＮＡ（3000μｇ／ml）
300 μｌ、Ｈ緩衝液（宝酒造製）40μｌ、100 単位のSa
u3AI（宝酒造製）およびTE緩衝液50μｌを混合し、37℃
で2.5 時間反応させた後、反応停止液（50mM EDTA 、２
％ザルコシル、60％グリセロール、0.05％ブロムフェノ
ールブルー） 200μｌを加えて反応を停止した。染色体
ＤＮＡのSau3AI反応液は0.8 ％アガロースで分離し、２
〜６kbに相当するＤＮＡをManiatisらの著書に記載され
た方法で分画した。分画したＤＮＡは400 μｌのTE緩衝
液に溶解した。
300 μｌ、Ｈ緩衝液（宝酒造製）40μｌ、100 単位のSa
u3AI（宝酒造製）およびTE緩衝液50μｌを混合し、37℃
で2.5 時間反応させた後、反応停止液（50mM EDTA 、２
％ザルコシル、60％グリセロール、0.05％ブロムフェノ
ールブルー） 200μｌを加えて反応を停止した。染色体
ＤＮＡのSau3AI反応液は0.8 ％アガロースで分離し、２
〜６kbに相当するＤＮＡをManiatisらの著書に記載され
た方法で分画した。分画したＤＮＡは400 μｌのTE緩衝
液に溶解した。
【００４６】500 μｇ／mlのpUC19 （宝酒造製）18μ
ｌ、Ｋ緩衝液（宝酒造製）２μｌに10単位のBamHI （宝
酒造製）を添加し、37℃で1.5 時間反応させ、さらに65
℃で15分加温して反応を停止した。この反応液にTris飽
和フェノール溶液20μｌを加えて、激しく混合したの
ち、14000 回転で５分遠心して上清を回収した。上清に
クロロホルム・イソアミノアルコール混液20μｌを加え
て、激しく混合したのち、14000 回転で５分遠心して上
清を回収した。さらに上清に10分の１容量の３Ｍ酢酸ナ
トリウムと２倍容量のエタノールを加え、−20℃で１時
間保持した後、４℃で14000 回転、５分遠心して沈澱を
回収した。沈澱は500 μｌの70％エタノールで軽く洗っ
た後真空乾燥し、10μｌのTE緩衝液に溶解した。この溶
液に２μｌの1M Tris-HCl(pH9.0) 、１単位の大腸菌ア
ルカリフォスファターゼおよび６μｌのTE緩衝液を加え
65℃で１時間保持しpUC19 末端の脱リン酸化を行なっ
た。この反応液にTris飽和フェノール溶液20μｌを加え
て、激しく混合したのち、14000回転で５分遠心して上
清を回収した。上清にクロロホルム・イソアミルアルコ
ール混液20μｌを加えて、激しく混合したのち、14000
回転で５分遠心して上清を回収した。上清に10分の１容
量の3M酢酸ナトリウムと２倍容量のエタノールを加え、
−20℃で１時間保持した後、４℃で14000 回転、５分遠
心して沈澱を回収した。沈澱は500 μｌの70％エタノー
ルで軽く洗った後真空乾燥し、10μｌのTE緩衝液に溶解
した。
ｌ、Ｋ緩衝液（宝酒造製）２μｌに10単位のBamHI （宝
酒造製）を添加し、37℃で1.5 時間反応させ、さらに65
℃で15分加温して反応を停止した。この反応液にTris飽
和フェノール溶液20μｌを加えて、激しく混合したの
ち、14000 回転で５分遠心して上清を回収した。上清に
クロロホルム・イソアミノアルコール混液20μｌを加え
て、激しく混合したのち、14000 回転で５分遠心して上
清を回収した。さらに上清に10分の１容量の３Ｍ酢酸ナ
トリウムと２倍容量のエタノールを加え、−20℃で１時
間保持した後、４℃で14000 回転、５分遠心して沈澱を
回収した。沈澱は500 μｌの70％エタノールで軽く洗っ
た後真空乾燥し、10μｌのTE緩衝液に溶解した。この溶
液に２μｌの1M Tris-HCl(pH9.0) 、１単位の大腸菌ア
ルカリフォスファターゼおよび６μｌのTE緩衝液を加え
65℃で１時間保持しpUC19 末端の脱リン酸化を行なっ
た。この反応液にTris飽和フェノール溶液20μｌを加え
て、激しく混合したのち、14000回転で５分遠心して上
清を回収した。上清にクロロホルム・イソアミルアルコ
ール混液20μｌを加えて、激しく混合したのち、14000
回転で５分遠心して上清を回収した。上清に10分の１容
量の3M酢酸ナトリウムと２倍容量のエタノールを加え、
−20℃で１時間保持した後、４℃で14000 回転、５分遠
心して沈澱を回収した。沈澱は500 μｌの70％エタノー
ルで軽く洗った後真空乾燥し、10μｌのTE緩衝液に溶解
した。
【００４７】上記の2kb から6kb のATR80 株染色体ＤＮ
Ａ断片を含む溶液100 μｌに、BamHI で切断し末端の脱
リン酸化を行なったpUC19 の溶液２μｌ、T4リガーゼ用
緩衝液50μｌ、TE緩衝液100 μｌおよびT4リガーゼを10
0 単位加えて16℃で16時間反応させた。このリガーゼ反
応液をManiatisらの著書に記載された方法で作成した大
腸菌DH5 α（コスモバイオ社製）のコンピテント化した
菌液200 μｌに混ぜ、４℃で30分間、次いで42℃で２分
間保ち、Ｌ培地１mlを加えて37℃で２時間振盪培養した
のち、アンピシリン（シグマ社製）100mg/l および寒天
1.5 ％を含むＬ培地に塗布した。寒天培地は37℃で１日
培養した後、出現したコロニーをアンピシリン１００mg
/lを含むL培地に植え、37℃で16時間培養し、Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍとＤｏｌｙの方法でプラスミドの分離精製を行な
い、１μｇ／μｌの濃度のプラスミドの溶液が500 μｌ
得られた。
Ａ断片を含む溶液100 μｌに、BamHI で切断し末端の脱
リン酸化を行なったpUC19 の溶液２μｌ、T4リガーゼ用
緩衝液50μｌ、TE緩衝液100 μｌおよびT4リガーゼを10
0 単位加えて16℃で16時間反応させた。このリガーゼ反
応液をManiatisらの著書に記載された方法で作成した大
腸菌DH5 α（コスモバイオ社製）のコンピテント化した
菌液200 μｌに混ぜ、４℃で30分間、次いで42℃で２分
間保ち、Ｌ培地１mlを加えて37℃で２時間振盪培養した
のち、アンピシリン（シグマ社製）100mg/l および寒天
1.5 ％を含むＬ培地に塗布した。寒天培地は37℃で１日
培養した後、出現したコロニーをアンピシリン１００mg
/lを含むL培地に植え、37℃で16時間培養し、Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍとＤｏｌｙの方法でプラスミドの分離精製を行な
い、１μｇ／μｌの濃度のプラスミドの溶液が500 μｌ
得られた。
【００４８】このプラスミドの溶液５μｌをManiatisら
の著書に記載された方法で作成した大腸菌Hfr3000YA73
株〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacterio
logy) 117 , 133(1974) 〕 のコンピテント化した菌液
200 μｌに混ぜ、４℃で30分間、次いで42℃で２分間保
ち、Ｌ培地１mlを加えて37℃で２時間振盪培養したのち
培養液を遠心して菌体を集め、生理食塩水10mlで２回洗
い、１mlの生理食塩水に懸濁した。これをM9S1培地に塗
布し、37℃で１日間培養した。宿主はHK遺伝子を欠損し
ているためスレオニンの含まれていないM9S1培地で生育
するすことができない。メチロバチルス属に属する微生
物由来のHK遺伝子を保持する形質転換株は、メチロバチ
ルス属に属する微生物のHK遺伝子が働くことにより、M9
S1培地で生育することができる。M9S1培地で生育する形
質転換株から容易にメチロバチルスHK遺伝子を分離する
ことができる。
の著書に記載された方法で作成した大腸菌Hfr3000YA73
株〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacterio
logy) 117 , 133(1974) 〕 のコンピテント化した菌液
200 μｌに混ぜ、４℃で30分間、次いで42℃で２分間保
ち、Ｌ培地１mlを加えて37℃で２時間振盪培養したのち
培養液を遠心して菌体を集め、生理食塩水10mlで２回洗
い、１mlの生理食塩水に懸濁した。これをM9S1培地に塗
布し、37℃で１日間培養した。宿主はHK遺伝子を欠損し
ているためスレオニンの含まれていないM9S1培地で生育
するすことができない。メチロバチルス属に属する微生
物由来のHK遺伝子を保持する形質転換株は、メチロバチ
ルス属に属する微生物のHK遺伝子が働くことにより、M9
S1培地で生育することができる。M9S1培地で生育する形
質転換株から容易にメチロバチルスHK遺伝子を分離する
ことができる。
【００４９】M9S1培地に出現したコロニーをアンピシリ
ン（シグマ社製）100mg ／ｌを含むＬ培地５mlを入れた
試験管に植え、30℃で16時間培養し、培養液よりＢｉｒ
ｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法でプラスミドを精製した。
ATR80 株由来の染色体ＤＮＡよりクローニングされた4.
3kb のHK遺伝子を含むプラスミドをpAHK-1と呼称する。
pAHK-1を数種の制限酵素で切断し図11に示す制限酵素地
図を作成した。
ン（シグマ社製）100mg ／ｌを含むＬ培地５mlを入れた
試験管に植え、30℃で16時間培養し、培養液よりＢｉｒ
ｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法でプラスミドを精製した。
ATR80 株由来の染色体ＤＮＡよりクローニングされた4.
3kb のHK遺伝子を含むプラスミドをpAHK-1と呼称する。
pAHK-1を数種の制限酵素で切断し図11に示す制限酵素地
図を作成した。
【００５０】(3) HK遺伝子のサブクローニング、ＤＮＡ
塩基配列の決定 500 μｇ／mlのpAHK-1 ６μｌ、Y100緩衝液 ２μｌ、
EcoRV （宝酒造製）10単位、Ncol（宝酒造製）10単位お
よびTE緩衝液10μｌを混合し、37℃で１時間反応させ
た。これを0.8 ％アガロースで分離し、2.35kbのＤＮＡ
断片を含むゲル断片よりＤＮＡ回収および精製のための
キット、ＤＮＡ Prep （ダイアヤトロン社製）を用いて
2.35kbのＤＮＡ断片を精製し、８μｌのTE緩衝液に溶解
した。この溶液をＤＮＡブランチングキット（宝酒造
製）で処理し、ＤＮＡ末端を平滑化した。末端を平滑化
したＤＮＡは10μｌのTE緩衝液に溶解した。
塩基配列の決定 500 μｇ／mlのpAHK-1 ６μｌ、Y100緩衝液 ２μｌ、
EcoRV （宝酒造製）10単位、Ncol（宝酒造製）10単位お
よびTE緩衝液10μｌを混合し、37℃で１時間反応させ
た。これを0.8 ％アガロースで分離し、2.35kbのＤＮＡ
断片を含むゲル断片よりＤＮＡ回収および精製のための
キット、ＤＮＡ Prep （ダイアヤトロン社製）を用いて
2.35kbのＤＮＡ断片を精製し、８μｌのTE緩衝液に溶解
した。この溶液をＤＮＡブランチングキット（宝酒造
製）で処理し、ＤＮＡ末端を平滑化した。末端を平滑化
したＤＮＡは10μｌのTE緩衝液に溶解した。
【００５１】500 μｇ／mlのpUC19 （宝酒造製）２μ
ｌ、Ｈ緩衝液（宝酒造製）２μｌに10単位のHincII（宝
酒造製）を添加し、37℃で1.5 時間反応させ、さらに65
℃で15分加温して反応を停止した。この反応液５μｌ、
上記の末端を平滑化したＤＮＡを含む溶液10μｌ、T4リ
ガーゼ用緩衝液４μｌ、T4リガーゼを350 単位加えて16
℃で16時間反応させた。
ｌ、Ｈ緩衝液（宝酒造製）２μｌに10単位のHincII（宝
酒造製）を添加し、37℃で1.5 時間反応させ、さらに65
℃で15分加温して反応を停止した。この反応液５μｌ、
上記の末端を平滑化したＤＮＡを含む溶液10μｌ、T4リ
ガーゼ用緩衝液４μｌ、T4リガーゼを350 単位加えて16
℃で16時間反応させた。
【００５２】このリガーゼ反応液を大腸菌Hfr3000YA73
株のコンピテント化した菌液200 μｌに混ぜ、４℃で30
分間、次いで42℃で２分間保ち、Ｌ培地１mlを加えて37
℃で２時間振盪培養したのち、アンピシリン（シグマ社
製）100mg ／ｌおよび寒天1.5 ％を含むＬ培地に塗布し
た。寒天培地は37℃で１日培養した。出現したコロニー
を試験管内のアンピシリン（シグマ社製）20μｇ／mlを
含むＬ培地５mlに植菌した。30℃で16時間振盪培養し、
遠心して集めた菌体をＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方
法に従い処理し、プラスミドを単離した。このプラスミ
ドをpAHK-14 と呼称する。pAHK-14 の制限酵素地図を図
12に示した。pAHK-14 にはpAHK-1由来のEcoRV, NcoI 2.
35kbの断片が含まれていた。またpAHK-14 を含むコロニ
ーはM9S1培地で生育することができ、このことから2.35
kbのEcoRV, NcoI 断片にHK遺伝子が含まれていることが
分かった。pAHK-14 上のHK遺伝子のＤＮＡ塩基配列をジ
デオキシ法〔メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth
ods in Enzymology), 101，20，（1983）〕により決定
した。HK遺伝子の構造遺伝子部分のＤＮＡ塩基配列を配
列番号４に示した。
株のコンピテント化した菌液200 μｌに混ぜ、４℃で30
分間、次いで42℃で２分間保ち、Ｌ培地１mlを加えて37
℃で２時間振盪培養したのち、アンピシリン（シグマ社
製）100mg ／ｌおよび寒天1.5 ％を含むＬ培地に塗布し
た。寒天培地は37℃で１日培養した。出現したコロニー
を試験管内のアンピシリン（シグマ社製）20μｇ／mlを
含むＬ培地５mlに植菌した。30℃で16時間振盪培養し、
遠心して集めた菌体をＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方
法に従い処理し、プラスミドを単離した。このプラスミ
ドをpAHK-14 と呼称する。pAHK-14 の制限酵素地図を図
12に示した。pAHK-14 にはpAHK-1由来のEcoRV, NcoI 2.
35kbの断片が含まれていた。またpAHK-14 を含むコロニ
ーはM9S1培地で生育することができ、このことから2.35
kbのEcoRV, NcoI 断片にHK遺伝子が含まれていることが
分かった。pAHK-14 上のHK遺伝子のＤＮＡ塩基配列をジ
デオキシ法〔メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth
ods in Enzymology), 101，20，（1983）〕により決定
した。HK遺伝子の構造遺伝子部分のＤＮＡ塩基配列を配
列番号４に示した。
【００５３】(4) HK遺伝子のpMFY42への連結 500 μｇ／mlのpAHK-14 ６μｌ、Ｍ緩衝液（宝酒造製）
２μｌ、PuvII(宝酒造製）10単位およびTE緩衝液11μｌ
を混合し、37℃で１時間反応させた。これを0.8 ％アガ
ロースで分離し、2.6kb のＤＮＡ断片を含むゲル断片よ
り、ＤＮＡ回収および精製のためのキット、ＤＮＡ Pre
p （ダイアヤトロン社）を用いて2.6kbのＤＮＡ断片を
精製し、10μｌのTE緩衝液に溶解した。
２μｌ、PuvII(宝酒造製）10単位およびTE緩衝液11μｌ
を混合し、37℃で１時間反応させた。これを0.8 ％アガ
ロースで分離し、2.6kb のＤＮＡ断片を含むゲル断片よ
り、ＤＮＡ回収および精製のためのキット、ＤＮＡ Pre
p （ダイアヤトロン社）を用いて2.6kbのＤＮＡ断片を
精製し、10μｌのTE緩衝液に溶解した。
【００５４】500 μｇ／mlのpMFY42 ６μｌ、Ｍ緩衝液
（宝酒造製）２μｌに10単位のPvuII （宝酒造製）、TE
緩衝液11μｌを添加し、37℃で1.5 時間反応させ、さら
に65℃で15分加温して反応を停止した。この反応液５μ
ｌ、2.6kb のＤＮＡを含む溶液10μｌ、T4リガーゼ用緩
衝液４μｌ、T4リガーゼを350 単位加えて16℃で16時間
反応させた。
（宝酒造製）２μｌに10単位のPvuII （宝酒造製）、TE
緩衝液11μｌを添加し、37℃で1.5 時間反応させ、さら
に65℃で15分加温して反応を停止した。この反応液５μ
ｌ、2.6kb のＤＮＡを含む溶液10μｌ、T4リガーゼ用緩
衝液４μｌ、T4リガーゼを350 単位加えて16℃で16時間
反応させた。
【００５５】このリガーゼ反応液をManiatisらの著書に
記載された方法で作成した大腸菌S17-1 株のコンピテン
ト化した菌液200 μｌに混ぜ、４℃で30分間、次いで42
℃で２分間保ち、Ｌ培地１mlを加えて37℃で２時間振盪
培養したのち、テトラサイクリン（シグマ社製）10mg／
ｌおよび寒天1.5 ％を含むＬ培地に塗布した。寒天培地
は37℃で１日培養し、出現したコロニーをテトラサイク
リン20μｇ／mlを含むＬ培地５mlを入れた試験管に植菌
した。30℃で16時間振盪培養し、遠心して集めた菌体を
ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法に従い処理し、プラ
スミドを単離した。このプラスミドをpMAHK-1 と呼称す
る。pMAHK-1 の制限酵素地図を図13に示す。
記載された方法で作成した大腸菌S17-1 株のコンピテン
ト化した菌液200 μｌに混ぜ、４℃で30分間、次いで42
℃で２分間保ち、Ｌ培地１mlを加えて37℃で２時間振盪
培養したのち、テトラサイクリン（シグマ社製）10mg／
ｌおよび寒天1.5 ％を含むＬ培地に塗布した。寒天培地
は37℃で１日培養し、出現したコロニーをテトラサイク
リン20μｇ／mlを含むＬ培地５mlを入れた試験管に植菌
した。30℃で16時間振盪培養し、遠心して集めた菌体を
ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法に従い処理し、プラ
スミドを単離した。このプラスミドをpMAHK-1 と呼称す
る。pMAHK-1 の制限酵素地図を図13に示す。
【００５６】実施例6. (1) HK遺伝子のA513,ATR80株への接合による導入 pMFY42またはpMAHK-1 を含むS17-1 株をテトラサイクリ
ン20μｇ／mlを含むＬ培地10mlを入れた20ml容のＬ型試
験管に植菌し、30℃で16時間振盪培養した。一方、ATR8
0, A513 株をフェニルアラニン50μｇ／mlおよびイソロ
イシン50μｇ／mlを含むM1培地10mlを入れた20ml容のＬ
型試験管に植菌し、30℃で16時間振盪培養した。pMFY42
またはpMAHK-1 を含むS17-1 株の菌体を遠心分離して集
め、10mlの生理食塩水で一回洗った後、10mlの生理食塩
水に懸濁した。pMFY42またはpMAHK-1 を含むS17-1 株の
細胞懸濁液2.5ml とATR80 株またはA513株の培養液2.5m
lを混合した後、5ml の無菌注射器（テルモ社製）に移
し、ホルダーに固定されたメンブレンフィルター（ミリ
ポア社製、0.45μｍ）に押し出し、メンブレンフィルタ
ー上に両菌株を固定した。
ン20μｇ／mlを含むＬ培地10mlを入れた20ml容のＬ型試
験管に植菌し、30℃で16時間振盪培養した。一方、ATR8
0, A513 株をフェニルアラニン50μｇ／mlおよびイソロ
イシン50μｇ／mlを含むM1培地10mlを入れた20ml容のＬ
型試験管に植菌し、30℃で16時間振盪培養した。pMFY42
またはpMAHK-1 を含むS17-1 株の菌体を遠心分離して集
め、10mlの生理食塩水で一回洗った後、10mlの生理食塩
水に懸濁した。pMFY42またはpMAHK-1 を含むS17-1 株の
細胞懸濁液2.5ml とATR80 株またはA513株の培養液2.5m
lを混合した後、5ml の無菌注射器（テルモ社製）に移
し、ホルダーに固定されたメンブレンフィルター（ミリ
ポア社製、0.45μｍ）に押し出し、メンブレンフィルタ
ー上に両菌株を固定した。
【００５７】メンブレンフィルターは寒天1.5 ％を含む
シード培地に載せ、30℃で24時間静置した。メンブレン
フィルターは10mlの生理食塩水で洗い、遠心して菌体を
集めた。この菌体に１mlの生理食塩水を加えて懸濁し
た。この菌体懸濁液を生理食塩水で1000〜10000 に希釈
し、フェニルアラニン50μｇ／ml、イソロイシン50μｇ
／mlおよびテトラサイクリン20μｇ／mlを含むM1寒天培
地に塗布した。
シード培地に載せ、30℃で24時間静置した。メンブレン
フィルターは10mlの生理食塩水で洗い、遠心して菌体を
集めた。この菌体に１mlの生理食塩水を加えて懸濁し
た。この菌体懸濁液を生理食塩水で1000〜10000 に希釈
し、フェニルアラニン50μｇ／ml、イソロイシン50μｇ
／mlおよびテトラサイクリン20μｇ／mlを含むM1寒天培
地に塗布した。
【００５８】30℃で４日間培養したところコロニーが出
現した。pMFY42またはpMAHK-1 を有するATR80 株、A513
株を各々ATR80/pMFY42, ATR80/pMAHK-1, A513/pMFY42,
A513/pMAHK-1株と呼称する。メチロバチルス・グリコゲ
ネス（Methylobacillus glycogenes) A513/pMAHK-1はブ
ダペスト条約に基づいて平成３年１２月１９日付で工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第3687号（FE
RM BP-3687) として寄託されている。
現した。pMFY42またはpMAHK-1 を有するATR80 株、A513
株を各々ATR80/pMFY42, ATR80/pMAHK-1, A513/pMFY42,
A513/pMAHK-1株と呼称する。メチロバチルス・グリコゲ
ネス（Methylobacillus glycogenes) A513/pMAHK-1はブ
ダペスト条約に基づいて平成３年１２月１９日付で工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第3687号（FE
RM BP-3687) として寄託されている。
【００５９】(2) HK遺伝子を有する菌株によるＬ−スレ
オニンの生産 ATR80/pMFY42, ATR80/pMAHK-1, A513/pMFY42, A513/pMA
HK-1株を試験管内のシード培地３mlに植菌し、30℃で24
時間振盪培養した。得られた培養液0.5ml をメタノール
1.5 ％添加した発酵培地５mlを含む50ml容の太型試験管
に加え、培養24時間後に2.5 ％のメタノールをさらに加
え、30℃で合計48時間振盪培養を行った。
オニンの生産 ATR80/pMFY42, ATR80/pMAHK-1, A513/pMFY42, A513/pMA
HK-1株を試験管内のシード培地３mlに植菌し、30℃で24
時間振盪培養した。得られた培養液0.5ml をメタノール
1.5 ％添加した発酵培地５mlを含む50ml容の太型試験管
に加え、培養24時間後に2.5 ％のメタノールをさらに加
え、30℃で合計48時間振盪培養を行った。
【００６０】培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを遠心
で除去し、培養液上清中に含まれているＬ−スレオニン
濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマト
グラフィー、アミノ酸分析システム）で定量したとこ
ろ、第２表に示す結果を得た。ATR80,A513株においてpM
AHK-1 を導入した場合、pMFY42を導入した場合に比べ、
有意にスレオニン生産力価の向上が認められた。
で除去し、培養液上清中に含まれているＬ−スレオニン
濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマト
グラフィー、アミノ酸分析システム）で定量したとこ
ろ、第２表に示す結果を得た。ATR80,A513株においてpM
AHK-1 を導入した場合、pMFY42を導入した場合に比べ、
有意にスレオニン生産力価の向上が認められた。
【００６１】
【表２】
【００６２】
【発明の効果】本発明によれば、Ｌ−スレオニンを安価
な原料から効率よく生産することができる。
な原料から効率よく生産することができる。
【００６３】
【００６４】配列番号：1 配列の長さ：1308 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：YES アンチセンス：NO 起源： 生物名：メチロバチルス・グリコゲネス（Methylobacil
lus glycogenes） 株名：１０１１（ＡＴＣＣ２１２７６） 配列： ATG AAA CCC ATC AAT GTT GGC CTG CTC GGC ATC GGT ACT GTC GGT GGC 48 Met Lys Pro Ile Asn Val Gly Leu Leu Gly Ile Gly Thr Val Gly Gly 1 5 10 15 GGC ACC TAT ACC GTT CTT ACA CGC AAC CAG GAA GGA AAT CGC GCG CCG 96 Gly Thr Tyr Thr Val Leu Thr Arg Asn Gln Glu Gly Asn Arg Ala Pro 20 25 30 TGC CGG CCG CCC AAT TGC CAT CAC GCG CGT CGC GAC CGC AAT CTT GAA 144 Cys Arg Pro Pro Asn Cys His His Ala Arg Arg Asp Arg Asn Leu Glu 35 40 45 TTG GCC CGC AAG GTA ACG GGA GGC CAG ATT GAC GTC ACC GAC GAT GCA 192 Leu Ala Arg Lys Val Thr Gly Gly Gln Ile Asp Val Thr Asp Asp Ala 50 55 60 TTC GCC GTG GTG GTC AGA CCC AGA CAT CGA CAT CGT GGT CGA ATT GAT 240 Phe Ala Val Val Val Arg Pro Arg His Arg His Arg Gly Arg Ile Asp 65 70 75 80 CGG CGG ATA CAC CAT CGC GCG CGA ACT GGC TAT GAA GGC GAT CGA GAA 288 Arg Arg Ile His His Arg Ala Arg Thr Gly Tyr Glu Gly Asp Arg Glu 85 90 95 CGG CAA GCA CGT GTA GCG GCC AAC AAG GCG CTG ATG CTT GCA TGG CAA 336 Arg Gln Ala Arg Val Ala Ala Asn Lys Ala Leu Met Leu Ala Trp Gln 100 105 110 CGA GAT TTT CGC CGC GTT GCA CAA CAG AAG GGC GTG ATT GTG GCG TTC 384 Arg Asp Phe Arg Arg Val Ala Gln Gln Lys Gly Val Ile Val Ala Phe 115 120 125 GAG GCG GCA GTG GCG GGC GGT ATT CCC ATC ATC AAG GCC GTG GCG GCA 432 Glu Ala Ala Val Ala Gly Gly Ile Pro Ile Ile Lys Ala Val Ala Ala 130 135 140 GGC GCT GGC CGC CAA CCG TCA TCG AGG GTA TTG CGC GCT ATC ATC AAC 480 Gly Ala Gly Arg Gln Pro Ser Ser Arg Val Leu Arg Ala Ile Ile Asn 145 150 155 160 GGC ACC ACC AAT TTC ATT CTC TCG GAA ATG CGC GAG AAG GGC CTG GCC 528 Gly Thr Thr Asn Phe Ile Leu Ser Glu Met Arg Glu Lys Gly Leu Ala 165 170 175 TTT GCC GAC GTG CTC AAG GAG GCG CAG CCT AGG CTA TGC GAG GCG ACC 576 Phe Ala Asp Val Leu Lys Glu Ala Gln Pro Arg Leu Cys Glu Ala Thr 180 185 190 CGA CCT TCG ACG TCG AGG GCG TGG ACC GCG CAC AAG CTC ATG ATC CTG 624 Arg Pro Ser Thr Ser Arg Ala Trp Thr Ala His Lys Leu Met Ile Leu 195 200 205 GCC GCG ATC GGC TTC GGC ATC CCG ATG CAG TTC GAC AAG GCC TAC GTA 672 Ala Ala Ile Gly Phe Gly Ile Pro Met Gln Phe Asp Lys Ala Tyr Val 210 215 220 GAG GGC ATC AGC AAG CTG GAT GCC CTT GAT ATC CGC TAT GCG GAG GAA 720 Glu Gly Ile Ser Lys Leu Asp Ala Leu Asp Ile Arg Tyr Ala Glu Glu 225 230 235 240 CTG GGC TAC CGT CAA GCT GCC TGG CAT GCA CCA AGC GCA CCA GCA AGG 768 Leu Gly Tyr Arg Gln Ala Ala Trp His Ala Pro Ser Ala Pro Ala Arg 245 250 255 GGC GTG GAA CTT GCG CGT GCA CCC GAC CCT GAT CCC CGA GAA ACG CCT 816 Gly Val Glu Leu Ala Arg Ala Pro Asp Pro Asp Pro Arg Glu Thr Pro 260 265 270 GAT CGC CAA TGT CAA CGG CGC CAT AAT GCC GTA CTG GTA AGC GAT GCA 864 Asp Arg Gln Cys Gln Arg Arg His Asn Ala Val Leu Val Ser Asp Ala 275 280 285 TGT CGG TCC CAC CTT GTA TAT CGG CCG GAT GCG TGC CGA CGC CAC GCG 912 Cys Arg Ser His Leu Val Tyr Arg Pro Asp Ala Cys Arg Arg His Ala 290 295 300 AGC GCC GTG GTT GCG GAT ATC GTC GAC GGT ACG CGC ACC GCA TAC CAC 960 Ser Ala Val Val Ala Asp Ile Val Asp Gly Thr Arg Thr Ala Tyr His 305 310 315 320 CGA CGT GCA CCA GCG GTG CCG CAC CTG CTT TCC AGC CCG ACC AGC TCG 1008 Arg Arg Ala Pro Ala Val Pro His Leu Leu Ser Ser Pro Thr Ser Ser 325 330 335 TGG ACT TGC CGA TTC GCT ATC GGC GAG GTG AGC AGC GCC TAT TAC CTG 1056 Trp Thr Cys Arg Phe Ala Ile Gly Glu Val Ser Ser Ala Tyr Tyr Leu 340 345 350 CGC CTG CGC GCG GTG GAC AAG CCG GGC CGT GAT GGC CAT GTG ACC CGC 1104 Arg Leu Arg Ala Val Asp Lys Pro Gly Arg Asp Gly His Val Thr Arg 355 360 365 ATC CTG GCG ACC GGC AGT TTG CAT CGA TGC GAT GAT TCA GAA GGC AAC 1152 Ile Leu Ala Thr Gly Ser Leu His Arg Cys Asp Asp Ser Glu Gly Asn 370 375 380 CGC AGG CAG GCG GAG CGG CGA AGA TCA GGC CGA CAT CAT CAT CCT GAC 1200 Arg Arg Gln Ala Glu Arg Arg Arg Ser Gly Arg His His His Pro Asp 385 390 395 400 CAT GTC ACG GTC GAG AAG AAC ATG GAT GAC GCG ATT GTC GCC ATC GAG 1248 His Val Thr Val Glu Lys Asn Met Asp Asp Ala Ile Val Ala Ile Glu 405 410 415 GCA TTG CCT GCC ATT TCC GGC AGC GTG ACC CGC TTG CGC ATG GAA GAG 1296 Ala Leu Pro Ala Ile Ser Gly Ser Val Thr Arg Leu Arg Met Glu Glu 420 425 430 CTA AGC CGA TAA 1308 Leu Ser Arg 435
lus glycogenes） 株名：１０１１（ＡＴＣＣ２１２７６） 配列： ATG AAA CCC ATC AAT GTT GGC CTG CTC GGC ATC GGT ACT GTC GGT GGC 48 Met Lys Pro Ile Asn Val Gly Leu Leu Gly Ile Gly Thr Val Gly Gly 1 5 10 15 GGC ACC TAT ACC GTT CTT ACA CGC AAC CAG GAA GGA AAT CGC GCG CCG 96 Gly Thr Tyr Thr Val Leu Thr Arg Asn Gln Glu Gly Asn Arg Ala Pro 20 25 30 TGC CGG CCG CCC AAT TGC CAT CAC GCG CGT CGC GAC CGC AAT CTT GAA 144 Cys Arg Pro Pro Asn Cys His His Ala Arg Arg Asp Arg Asn Leu Glu 35 40 45 TTG GCC CGC AAG GTA ACG GGA GGC CAG ATT GAC GTC ACC GAC GAT GCA 192 Leu Ala Arg Lys Val Thr Gly Gly Gln Ile Asp Val Thr Asp Asp Ala 50 55 60 TTC GCC GTG GTG GTC AGA CCC AGA CAT CGA CAT CGT GGT CGA ATT GAT 240 Phe Ala Val Val Val Arg Pro Arg His Arg His Arg Gly Arg Ile Asp 65 70 75 80 CGG CGG ATA CAC CAT CGC GCG CGA ACT GGC TAT GAA GGC GAT CGA GAA 288 Arg Arg Ile His His Arg Ala Arg Thr Gly Tyr Glu Gly Asp Arg Glu 85 90 95 CGG CAA GCA CGT GTA GCG GCC AAC AAG GCG CTG ATG CTT GCA TGG CAA 336 Arg Gln Ala Arg Val Ala Ala Asn Lys Ala Leu Met Leu Ala Trp Gln 100 105 110 CGA GAT TTT CGC CGC GTT GCA CAA CAG AAG GGC GTG ATT GTG GCG TTC 384 Arg Asp Phe Arg Arg Val Ala Gln Gln Lys Gly Val Ile Val Ala Phe 115 120 125 GAG GCG GCA GTG GCG GGC GGT ATT CCC ATC ATC AAG GCC GTG GCG GCA 432 Glu Ala Ala Val Ala Gly Gly Ile Pro Ile Ile Lys Ala Val Ala Ala 130 135 140 GGC GCT GGC CGC CAA CCG TCA TCG AGG GTA TTG CGC GCT ATC ATC AAC 480 Gly Ala Gly Arg Gln Pro Ser Ser Arg Val Leu Arg Ala Ile Ile Asn 145 150 155 160 GGC ACC ACC AAT TTC ATT CTC TCG GAA ATG CGC GAG AAG GGC CTG GCC 528 Gly Thr Thr Asn Phe Ile Leu Ser Glu Met Arg Glu Lys Gly Leu Ala 165 170 175 TTT GCC GAC GTG CTC AAG GAG GCG CAG CCT AGG CTA TGC GAG GCG ACC 576 Phe Ala Asp Val Leu Lys Glu Ala Gln Pro Arg Leu Cys Glu Ala Thr 180 185 190 CGA CCT TCG ACG TCG AGG GCG TGG ACC GCG CAC AAG CTC ATG ATC CTG 624 Arg Pro Ser Thr Ser Arg Ala Trp Thr Ala His Lys Leu Met Ile Leu 195 200 205 GCC GCG ATC GGC TTC GGC ATC CCG ATG CAG TTC GAC AAG GCC TAC GTA 672 Ala Ala Ile Gly Phe Gly Ile Pro Met Gln Phe Asp Lys Ala Tyr Val 210 215 220 GAG GGC ATC AGC AAG CTG GAT GCC CTT GAT ATC CGC TAT GCG GAG GAA 720 Glu Gly Ile Ser Lys Leu Asp Ala Leu Asp Ile Arg Tyr Ala Glu Glu 225 230 235 240 CTG GGC TAC CGT CAA GCT GCC TGG CAT GCA CCA AGC GCA CCA GCA AGG 768 Leu Gly Tyr Arg Gln Ala Ala Trp His Ala Pro Ser Ala Pro Ala Arg 245 250 255 GGC GTG GAA CTT GCG CGT GCA CCC GAC CCT GAT CCC CGA GAA ACG CCT 816 Gly Val Glu Leu Ala Arg Ala Pro Asp Pro Asp Pro Arg Glu Thr Pro 260 265 270 GAT CGC CAA TGT CAA CGG CGC CAT AAT GCC GTA CTG GTA AGC GAT GCA 864 Asp Arg Gln Cys Gln Arg Arg His Asn Ala Val Leu Val Ser Asp Ala 275 280 285 TGT CGG TCC CAC CTT GTA TAT CGG CCG GAT GCG TGC CGA CGC CAC GCG 912 Cys Arg Ser His Leu Val Tyr Arg Pro Asp Ala Cys Arg Arg His Ala 290 295 300 AGC GCC GTG GTT GCG GAT ATC GTC GAC GGT ACG CGC ACC GCA TAC CAC 960 Ser Ala Val Val Ala Asp Ile Val Asp Gly Thr Arg Thr Ala Tyr His 305 310 315 320 CGA CGT GCA CCA GCG GTG CCG CAC CTG CTT TCC AGC CCG ACC AGC TCG 1008 Arg Arg Ala Pro Ala Val Pro His Leu Leu Ser Ser Pro Thr Ser Ser 325 330 335 TGG ACT TGC CGA TTC GCT ATC GGC GAG GTG AGC AGC GCC TAT TAC CTG 1056 Trp Thr Cys Arg Phe Ala Ile Gly Glu Val Ser Ser Ala Tyr Tyr Leu 340 345 350 CGC CTG CGC GCG GTG GAC AAG CCG GGC CGT GAT GGC CAT GTG ACC CGC 1104 Arg Leu Arg Ala Val Asp Lys Pro Gly Arg Asp Gly His Val Thr Arg 355 360 365 ATC CTG GCG ACC GGC AGT TTG CAT CGA TGC GAT GAT TCA GAA GGC AAC 1152 Ile Leu Ala Thr Gly Ser Leu His Arg Cys Asp Asp Ser Glu Gly Asn 370 375 380 CGC AGG CAG GCG GAG CGG CGA AGA TCA GGC CGA CAT CAT CAT CCT GAC 1200 Arg Arg Gln Ala Glu Arg Arg Arg Ser Gly Arg His His His Pro Asp 385 390 395 400 CAT GTC ACG GTC GAG AAG AAC ATG GAT GAC GCG ATT GTC GCC ATC GAG 1248 His Val Thr Val Glu Lys Asn Met Asp Asp Ala Ile Val Ala Ile Glu 405 410 415 GCA TTG CCT GCC ATT TCC GGC AGC GTG ACC CGC TTG CGC ATG GAA GAG 1296 Ala Leu Pro Ala Ile Ser Gly Ser Val Thr Arg Leu Arg Met Glu Glu 420 425 430 CTA AGC CGA TAA 1308 Leu Ser Arg 435
【００６５】配列番号：２ 配列の長さ：1239 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：YES アンチセンス：NO 起源： 生物名：メチロバチルス・グリコゲネス（Methylobacil
lus glycogenes） 株名：１００６（ＡＴＣＣ２１３７１） 配列： ATG AAA CCC ATC AAT GTT GGC CTG CTC GGC ATC GGT ACT GTC GGT GGC 48 Met Lys Pro Ile Asn Val Gly Leu Leu Gly Ile Gly Thr Val Gly Gly 1 5 10 15 GGC ACC TAT ACT GTT TTA ACC CGT AAC CAG GAA GAA ATC GCA CGC CGT 96 Gly Thr Tyr Thr Val Leu Thr Arg Asn Gln Glu Glu Ile Ala Arg Arg 20 25 30 GCT GGA CGC CCA ATC GCC ATT ACC CGT GTT GCC GAT CGT AAT CTG GAG 144 Ala Gly Arg Pro Ile Ala Ile Thr Arg Val Ala Asp Arg Asn Leu Glu 35 40 45 CTG GCT CGC CAG GTG ACT GGT GGA AAA ATT GAT GTC ACC GAT GAT GCT 192 Leu Ala Arg Gln Val Thr Gly Gly Lys Ile Asp Val Thr Asp Asp Ala 50 55 60 TTT GCC ATC GTG TCT GAT CCG GCA ATT GAT ATT GTT GTT GAA CTG ATC 240 Phe Ala Ile Val Ser Asp Pro Ala Ile Asp Ile Val Val Glu Leu Ile 65 70 75 80 GGT GGC TAC ACC GTG GCG CGT GAA CTG GTG CTG AAG GCC ATT GAG AAT 288 Gly Gly Tyr Thr Val Ala Arg Glu Leu Val Leu Lys Ala Ile Glu Asn 85 90 95 GGC AAG CAC GTG GTC ACG GCC AAT AAG GCC TTG ATT GCC TGC ATG GCA 336 Gly Lys His Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Ile Ala Cys Met Ala 100 105 110 ATG AAA TTT TTG CCG CTG CGC AGA AAA AAG GCG TCA TCG TCG CTT TTG 384 Met Lys Phe Leu Pro Leu Arg Arg Lys Lys Ala Ser Ser Ser Leu Leu 115 120 125 AAG CTG CCG TTG CTG GTG GTA TCC CCA TTA TTC AAG GCC GTA CGT GAA 432 Lys Leu Pro Leu Leu Val Val Ser Pro Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu 130 135 140 GGC CTG GCG GCC AAT CGT ATT GAG TGG ATT GCT GGC ATC ATC AAT GGC 480 Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ile Glu Trp Ile Ala Gly Ile Ile Asn Gly 145 150 155 160 ACG ACC AAT TTC ATT CTC TCG GAA ATG CGT GAA AAG GGT CTG GCG TTT 528 Thr Thr Asn Phe Ile Leu Ser Glu Met Arg Glu Lys Gly Leu Ala Phe 165 170 175 GCT GAT GTG CTT AAG GAA GCT CAA CGC CTG GGT TAT GCC GAG GCA GAC 576 Ala Asp Val Leu Lys Glu Ala Gln Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp 180 185 190 CCG ACT TTC GAT GTC GAA GGC ATT GAT GCT GCG CAC AAG CTC ATG ATC 624 Pro Thr Phe Asp Val Glu Gly Ile Asp Ala Ala His Lys Leu Met Ile 195 200 205 CTT GCT GCG ATG CTT TGG CTA TTC GTG CAC AGC TTA TGT CGA GGC ATC 672 Leu Ala Ala Met Leu Trp Leu Phe Val His Ser Leu Cys Arg Gly Ile 210 215 220 ACG AAG CTG GAT GCC GTG GAT ATC ACC AAG CGT ACC GAT AAG GGC GTG 720 Thr Lys Leu Asp Ala Val Asp Ile Thr Lys Arg Thr Asp Lys Gly Val 225 230 235 240 GAG TTG CGT GTG CAC CCA ACC TTG ATC CCG GAA AAG CGC TTG ATT TGC 768 Glu Leu Arg Val His Pro Thr Leu Ile Pro Glu Lys Arg Leu Ile Cys 245 250 255 CAA TGT GAA TGG CGC AAT GAA TGC TGT GCT GGT CAA GGG CGA TGC TGT 816 Gln Cys Glu Trp Arg Asn Glu Cys Cys Ala Gly Gln Gly Arg Cys Cys 260 265 270 TGG CCT ACC TTG TAT TAT GGT GCC GGT GCT GGT GCA GAA CCT ACC GCT 864 Trp Pro Thr Leu Tyr Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Glu Pro Thr Ala 275 280 285 AGT GCG GTT GCC GAC TTG GTC GAT GGT ACC GAC CGT GGC ATC AGC TGT 912 Ser Ala Val Ala Asp Leu Val Asp Gly Thr Asp Arg Gly Ile Ser Cys 290 295 300 CCA CAC CTG GCT TTC CAG CCA GAC CGC TTG GTA GAC TTG CCC ATC CTG 960 Pro His Leu Ala Phe Gln Pro Asp Arg Leu Val Asp Leu Pro Ile Leu 305 310 315 320 CCT ATC GGC GAG ATT AGC AGT GCC TAT TAC CTG CGC CTG CGT GCA GTG 1008 Pro Ile Gly Glu Ile Ser Ser Ala Tyr Tyr Leu Arg Leu Arg Ala Val 325 330 335 GAT AAG CCA GGC GTG CTC GCT GAC GTG ACC CGT ATC CTC GGT GAC CGT 1056 Asp Lys Pro Gly Val Leu Ala Asp Val Thr Arg Ile Leu Gly Asp Arg 340 345 350 CAG ATT TCG ATC GAT GCG ATG ATC CAG AAA GAG CCA CAA GAG GGC GAA 1104 Gln Ile Ser Ile Asp Ala Met Ile Gln Lys Glu Pro Gln Glu Gly Glu 355 360 365 GAC CAG GCC GAC ATC ATC ATT CTC ACC CAC GTC ACA GTT GAG AAA AAC 1152 Asp Gln Ala Asp Ile Ile Ile Leu Thr His Val Thr Val Glu Lys Asn 370 375 380 ATG GAT GAT GCC ATC GCC GCC ATT GAG GCA CTA CCT GCC ATT TCC GGC 1200 Met Asp Asp Ala Ile Ala Ala Ile Glu Ala Leu Pro Ala Ile Ser Gly 385 390 395 400 AAG GTC ACG CGT TTG CGC ATG GAA GAA CTA AGC CGA TAA 1239 Lys Val Thr Arg Leu Arg Met Glu Glu Leu Ser Arg 405 410
lus glycogenes） 株名：１００６（ＡＴＣＣ２１３７１） 配列： ATG AAA CCC ATC AAT GTT GGC CTG CTC GGC ATC GGT ACT GTC GGT GGC 48 Met Lys Pro Ile Asn Val Gly Leu Leu Gly Ile Gly Thr Val Gly Gly 1 5 10 15 GGC ACC TAT ACT GTT TTA ACC CGT AAC CAG GAA GAA ATC GCA CGC CGT 96 Gly Thr Tyr Thr Val Leu Thr Arg Asn Gln Glu Glu Ile Ala Arg Arg 20 25 30 GCT GGA CGC CCA ATC GCC ATT ACC CGT GTT GCC GAT CGT AAT CTG GAG 144 Ala Gly Arg Pro Ile Ala Ile Thr Arg Val Ala Asp Arg Asn Leu Glu 35 40 45 CTG GCT CGC CAG GTG ACT GGT GGA AAA ATT GAT GTC ACC GAT GAT GCT 192 Leu Ala Arg Gln Val Thr Gly Gly Lys Ile Asp Val Thr Asp Asp Ala 50 55 60 TTT GCC ATC GTG TCT GAT CCG GCA ATT GAT ATT GTT GTT GAA CTG ATC 240 Phe Ala Ile Val Ser Asp Pro Ala Ile Asp Ile Val Val Glu Leu Ile 65 70 75 80 GGT GGC TAC ACC GTG GCG CGT GAA CTG GTG CTG AAG GCC ATT GAG AAT 288 Gly Gly Tyr Thr Val Ala Arg Glu Leu Val Leu Lys Ala Ile Glu Asn 85 90 95 GGC AAG CAC GTG GTC ACG GCC AAT AAG GCC TTG ATT GCC TGC ATG GCA 336 Gly Lys His Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Ile Ala Cys Met Ala 100 105 110 ATG AAA TTT TTG CCG CTG CGC AGA AAA AAG GCG TCA TCG TCG CTT TTG 384 Met Lys Phe Leu Pro Leu Arg Arg Lys Lys Ala Ser Ser Ser Leu Leu 115 120 125 AAG CTG CCG TTG CTG GTG GTA TCC CCA TTA TTC AAG GCC GTA CGT GAA 432 Lys Leu Pro Leu Leu Val Val Ser Pro Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu 130 135 140 GGC CTG GCG GCC AAT CGT ATT GAG TGG ATT GCT GGC ATC ATC AAT GGC 480 Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ile Glu Trp Ile Ala Gly Ile Ile Asn Gly 145 150 155 160 ACG ACC AAT TTC ATT CTC TCG GAA ATG CGT GAA AAG GGT CTG GCG TTT 528 Thr Thr Asn Phe Ile Leu Ser Glu Met Arg Glu Lys Gly Leu Ala Phe 165 170 175 GCT GAT GTG CTT AAG GAA GCT CAA CGC CTG GGT TAT GCC GAG GCA GAC 576 Ala Asp Val Leu Lys Glu Ala Gln Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp 180 185 190 CCG ACT TTC GAT GTC GAA GGC ATT GAT GCT GCG CAC AAG CTC ATG ATC 624 Pro Thr Phe Asp Val Glu Gly Ile Asp Ala Ala His Lys Leu Met Ile 195 200 205 CTT GCT GCG ATG CTT TGG CTA TTC GTG CAC AGC TTA TGT CGA GGC ATC 672 Leu Ala Ala Met Leu Trp Leu Phe Val His Ser Leu Cys Arg Gly Ile 210 215 220 ACG AAG CTG GAT GCC GTG GAT ATC ACC AAG CGT ACC GAT AAG GGC GTG 720 Thr Lys Leu Asp Ala Val Asp Ile Thr Lys Arg Thr Asp Lys Gly Val 225 230 235 240 GAG TTG CGT GTG CAC CCA ACC TTG ATC CCG GAA AAG CGC TTG ATT TGC 768 Glu Leu Arg Val His Pro Thr Leu Ile Pro Glu Lys Arg Leu Ile Cys 245 250 255 CAA TGT GAA TGG CGC AAT GAA TGC TGT GCT GGT CAA GGG CGA TGC TGT 816 Gln Cys Glu Trp Arg Asn Glu Cys Cys Ala Gly Gln Gly Arg Cys Cys 260 265 270 TGG CCT ACC TTG TAT TAT GGT GCC GGT GCT GGT GCA GAA CCT ACC GCT 864 Trp Pro Thr Leu Tyr Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Glu Pro Thr Ala 275 280 285 AGT GCG GTT GCC GAC TTG GTC GAT GGT ACC GAC CGT GGC ATC AGC TGT 912 Ser Ala Val Ala Asp Leu Val Asp Gly Thr Asp Arg Gly Ile Ser Cys 290 295 300 CCA CAC CTG GCT TTC CAG CCA GAC CGC TTG GTA GAC TTG CCC ATC CTG 960 Pro His Leu Ala Phe Gln Pro Asp Arg Leu Val Asp Leu Pro Ile Leu 305 310 315 320 CCT ATC GGC GAG ATT AGC AGT GCC TAT TAC CTG CGC CTG CGT GCA GTG 1008 Pro Ile Gly Glu Ile Ser Ser Ala Tyr Tyr Leu Arg Leu Arg Ala Val 325 330 335 GAT AAG CCA GGC GTG CTC GCT GAC GTG ACC CGT ATC CTC GGT GAC CGT 1056 Asp Lys Pro Gly Val Leu Ala Asp Val Thr Arg Ile Leu Gly Asp Arg 340 345 350 CAG ATT TCG ATC GAT GCG ATG ATC CAG AAA GAG CCA CAA GAG GGC GAA 1104 Gln Ile Ser Ile Asp Ala Met Ile Gln Lys Glu Pro Gln Glu Gly Glu 355 360 365 GAC CAG GCC GAC ATC ATC ATT CTC ACC CAC GTC ACA GTT GAG AAA AAC 1152 Asp Gln Ala Asp Ile Ile Ile Leu Thr His Val Thr Val Glu Lys Asn 370 375 380 ATG GAT GAT GCC ATC GCC GCC ATT GAG GCA CTA CCT GCC ATT TCC GGC 1200 Met Asp Asp Ala Ile Ala Ala Ile Glu Ala Leu Pro Ala Ile Ser Gly 385 390 395 400 AAG GTC ACG CGT TTG CGC ATG GAA GAA CTA AGC CGA TAA 1239 Lys Val Thr Arg Leu Arg Met Glu Glu Leu Ser Arg 405 410
【００６６】配列番号：３ 配列の長さ：1428 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：YES アンチセンス：NO 起源： 生物名：メチロバチルス・グリコゲネス（Methylobacil
lus glycogenes） 株名：１００６（ＡＴＣＣ２１３７１） 配列： ATG AAA TAC ATT TCC ACC CGC GGG CAA TCG CCT GCA CTG TCT TTC TCT 48 Met Lys Tyr Ile Ser Thr Arg Gly Gln Ser Pro Ala Leu Ser Phe Ser 1 5 10 15 GAA ATT CTG CTT GGC GGC TTG GCG CCT GAT GGC GGC TTG TAT TTG CCC 96 Glu Ile Leu Leu Gly Gly Leu Ala Pro Asp Gly Gly Leu Tyr Leu Pro 20 25 30 GAG CAA TAC CCG CAG TTT AGC GCT GAC GCA CTG AGC GCG ATG CGC GGC 144 Glu Gln Tyr Pro Gln Phe Ser Ala Asp Ala Leu Ser Ala Met Arg Gly 35 40 45 ATG AAT TAC CGC GAC CTG GCG TTC ACC ATC CTC TCG CGT CTG ATC GAC 192 Met Asn Tyr Arg Asp Leu Ala Phe Thr Ile Leu Ser Arg Leu Ile Asp 50 55 60 GAT ATT CCC GCT GAC GAC CTG CGC ATC ATC GTC GAC AAG ACC TAT CGC 240 Asp Ile Pro Ala Asp Asp Leu Arg Ile Ile Val Asp Lys Thr Tyr Arg 65 70 75 80 GCG GAT GTA TAT GCC TAT GCT CGC CCG GGC CAG GAT GCC GAA GAC ATT 288 Ala Asp Val Tyr Ala Tyr Ala Arg Pro Gly Gln Asp Ala Glu Asp Ile 85 90 95 ACG CCG ACC TAT AAG CTG GAG GAC GAC CTC TAC CTG CTT TCC CTG TCC 336 Thr Pro Thr Tyr Lys Leu Glu Asp Asp Leu Tyr Leu Leu Ser Leu Ser 100 105 110 AAT GGC CCA ACC CTG GCG TTC AAG GAT ATG GCG ATG CAG TTA TTG GGC 384 Asn Gly Pro Thr Leu Ala Phe Lys Asp Met Ala Met Gln Leu Leu Gly 115 120 125 AAC CTG TTC GAA TAC GTG TTG GCG CAA AAG GGC GAG ACG ACT AAT ATT 432 Asn Leu Phe Glu Tyr Val Leu Ala Gln Lys Gly Glu Thr Thr Asn Ile 130 135 140 CTC GGC GCG ACC TCC GGC GAT ACC GGT TCT GCG GCG GAA TAC GCC ATG 480 Leu Gly Ala Thr Ser Gly Asp Thr Gly Ser Ala Ala Glu Tyr Ala Met 145 150 155 160 CGC GGC AAG CAG GGC GTC AAG GTG TTC ATG CTC TCG CCG CAC CAG AAG 528 Arg Gly Lys Gln Gly Val Lys Val Phe Met Leu Ser Pro His Gln Lys 165 170 175 ATG AGC CGT TTC CAG ACC GCA CAG ATG TTC AGC CTG CAA GAC GAC AAT 576 Met Ser Arg Phe Gln Thr Ala Gln Met Phe Ser Leu Gln Asp Asp Asn 180 185 190 ATC TTC AAT ATC GCG GTC AAG GGC GTG TTT GAC GAC TGC CAG GAC ATC 624 Ile Phe Asn Ile Ala Val Lys Gly Val Phe Asp Asp Cys Gln Asp Ile 195 200 205 GTC AAG GCC GTG TCG AAC GAC CAT GCT TTC AAG GCC AAG AAT AAG ATC 672 Val Lys Ala Val Ser Asn Asp His Ala Phe Lys Ala Lys Asn Lys Ile 210 215 220 GGT GCC GTG AAT TCC ATC AAC TGG GCA CGC GTG GCT GCT CAG GTA GTG 720 Gly Ala Val Asn Ser Ile Asn Trp Ala Arg Val Ala Ala Gln Val Val 225 230 235 240 TAT TAC TTC AAG GGT TAT TTC GCC GTC ACT GCG GAT AAT GCG CAG CAG 768 Tyr Tyr Phe Lys Gly Tyr Phe Ala Val Thr Ala Asp Asn Ala Gln Gln 245 250 255 GTC AGC TTT GCC GTG CCT TCC GGC AAC TTC GGC AAT GTC TGT GCC GGG 816 Val Ser Phe Ala Val Pro Ser Gly Asn Phe Gly Asn Val Cys Ala Gly 260 265 270 CAT ATC GCC CGC ATG ATG GGC TTG CCG ATT GCC AAG CTG GTG GTA GCG 864 His Ile Ala Arg Met Met Gly Leu Pro Ile Ala Lys Leu Val Val Ala 275 280 285 ACC AAC GAA AAC GAC GTG CTG GAT GAG TTC TTC AAA ACT GGC GTC TAC 912 Thr Asn Glu Asn Asp Val Leu Asp Glu Phe Phe Lys Thr Gly Val Tyr 290 295 300 CGT CCG CGC GGC TCC GCC AAT ACC TAC CAT ACT TCC AGC CCC TCC ATG 960 Arg Pro Arg Gly Ser Ala Asn Thr Tyr His Thr Ser Ser Pro Ser Met 305 310 315 320 GAT ATT TCC AAG GCC TCC AAT TTC GAG CGT TTC GTC TTC GAC CTA GTG 1008 Asp Ile Ser Lys Ala Ser Asn Phe Glu Arg Phe Val Phe Asp Leu Val 325 330 335 GGC CGT GAC GCC GCC AAG GTG CGC GAG CTA TGG GGC AAG GTG GAT GCG 1056 Gly Arg Asp Ala Ala Lys Val Arg Glu Leu Trp Gly Lys Val Asp Ala 340 345 350 GGC GGC AGT TTC GAC CTT AAC GAC GGT GGC TGG TTT GCC AAG GTA GCG 1104 Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asn Asp Gly Gly Trp Phe Ala Lys Val Ala 355 360 365 GAT TAC GGC TTC GTT TCC GGC AGC AGC AAC CAT GCC AAC CGC ATG CAG 1152 Asp Tyr Gly Phe Val Ser Gly Ser Ser Asn His Ala Asn Arg Met Gln 370 375 380 ACC ATC AAG GCG ACG CAT GAG CGC TAC GGT GTC ACC ATT GAT ACC CAC 1200 Thr Ile Lys Ala Thr His Glu Arg Tyr Gly Val Thr Ile Asp Thr His 385 390 395 400 ACC GCG GAC GGT CTC AAG GTG GCG CTG GAA CAC CGC GAG GCA GGT ACC 1248 Thr Ala Asp Gly Leu Lys Val Ala Leu Glu His Arg Glu Ala Gly Thr 405 410 415 CCG ATG CTG GTG CTG GAA ACC GCA TTG CCG GCC AAA TTC GAG GAC GCG 1296 Pro Met Leu Val Leu Glu Thr Ala Leu Pro Ala Lys Phe Glu Asp Ala 420 425 430 ATT GTC GAG GCG TTA GGG CAT AAA CCC GAG CGT CCG CAC AGC CTG GAA 1344 Ile Val Glu Ala Leu Gly His Lys Pro Glu Arg Pro His Ser Leu Glu 435 440 445 GGC CTG GAA TCC CTG CCT CAG CGC TTT GAG GTG ATG GAG GCC GAT GCA 1392 Gly Leu Glu Ser Leu Pro Gln Arg Phe Glu Val Met Glu Ala Asp Ala 450 455 460 GCC GTC ATC AAA CAG TTC ATT GTT GAG CAT ATT TGA 1428 Ala Val Ile Lys Gln Phe Ile Val Glu His Ile 465 470 475
lus glycogenes） 株名：１００６（ＡＴＣＣ２１３７１） 配列： ATG AAA TAC ATT TCC ACC CGC GGG CAA TCG CCT GCA CTG TCT TTC TCT 48 Met Lys Tyr Ile Ser Thr Arg Gly Gln Ser Pro Ala Leu Ser Phe Ser 1 5 10 15 GAA ATT CTG CTT GGC GGC TTG GCG CCT GAT GGC GGC TTG TAT TTG CCC 96 Glu Ile Leu Leu Gly Gly Leu Ala Pro Asp Gly Gly Leu Tyr Leu Pro 20 25 30 GAG CAA TAC CCG CAG TTT AGC GCT GAC GCA CTG AGC GCG ATG CGC GGC 144 Glu Gln Tyr Pro Gln Phe Ser Ala Asp Ala Leu Ser Ala Met Arg Gly 35 40 45 ATG AAT TAC CGC GAC CTG GCG TTC ACC ATC CTC TCG CGT CTG ATC GAC 192 Met Asn Tyr Arg Asp Leu Ala Phe Thr Ile Leu Ser Arg Leu Ile Asp 50 55 60 GAT ATT CCC GCT GAC GAC CTG CGC ATC ATC GTC GAC AAG ACC TAT CGC 240 Asp Ile Pro Ala Asp Asp Leu Arg Ile Ile Val Asp Lys Thr Tyr Arg 65 70 75 80 GCG GAT GTA TAT GCC TAT GCT CGC CCG GGC CAG GAT GCC GAA GAC ATT 288 Ala Asp Val Tyr Ala Tyr Ala Arg Pro Gly Gln Asp Ala Glu Asp Ile 85 90 95 ACG CCG ACC TAT AAG CTG GAG GAC GAC CTC TAC CTG CTT TCC CTG TCC 336 Thr Pro Thr Tyr Lys Leu Glu Asp Asp Leu Tyr Leu Leu Ser Leu Ser 100 105 110 AAT GGC CCA ACC CTG GCG TTC AAG GAT ATG GCG ATG CAG TTA TTG GGC 384 Asn Gly Pro Thr Leu Ala Phe Lys Asp Met Ala Met Gln Leu Leu Gly 115 120 125 AAC CTG TTC GAA TAC GTG TTG GCG CAA AAG GGC GAG ACG ACT AAT ATT 432 Asn Leu Phe Glu Tyr Val Leu Ala Gln Lys Gly Glu Thr Thr Asn Ile 130 135 140 CTC GGC GCG ACC TCC GGC GAT ACC GGT TCT GCG GCG GAA TAC GCC ATG 480 Leu Gly Ala Thr Ser Gly Asp Thr Gly Ser Ala Ala Glu Tyr Ala Met 145 150 155 160 CGC GGC AAG CAG GGC GTC AAG GTG TTC ATG CTC TCG CCG CAC CAG AAG 528 Arg Gly Lys Gln Gly Val Lys Val Phe Met Leu Ser Pro His Gln Lys 165 170 175 ATG AGC CGT TTC CAG ACC GCA CAG ATG TTC AGC CTG CAA GAC GAC AAT 576 Met Ser Arg Phe Gln Thr Ala Gln Met Phe Ser Leu Gln Asp Asp Asn 180 185 190 ATC TTC AAT ATC GCG GTC AAG GGC GTG TTT GAC GAC TGC CAG GAC ATC 624 Ile Phe Asn Ile Ala Val Lys Gly Val Phe Asp Asp Cys Gln Asp Ile 195 200 205 GTC AAG GCC GTG TCG AAC GAC CAT GCT TTC AAG GCC AAG AAT AAG ATC 672 Val Lys Ala Val Ser Asn Asp His Ala Phe Lys Ala Lys Asn Lys Ile 210 215 220 GGT GCC GTG AAT TCC ATC AAC TGG GCA CGC GTG GCT GCT CAG GTA GTG 720 Gly Ala Val Asn Ser Ile Asn Trp Ala Arg Val Ala Ala Gln Val Val 225 230 235 240 TAT TAC TTC AAG GGT TAT TTC GCC GTC ACT GCG GAT AAT GCG CAG CAG 768 Tyr Tyr Phe Lys Gly Tyr Phe Ala Val Thr Ala Asp Asn Ala Gln Gln 245 250 255 GTC AGC TTT GCC GTG CCT TCC GGC AAC TTC GGC AAT GTC TGT GCC GGG 816 Val Ser Phe Ala Val Pro Ser Gly Asn Phe Gly Asn Val Cys Ala Gly 260 265 270 CAT ATC GCC CGC ATG ATG GGC TTG CCG ATT GCC AAG CTG GTG GTA GCG 864 His Ile Ala Arg Met Met Gly Leu Pro Ile Ala Lys Leu Val Val Ala 275 280 285 ACC AAC GAA AAC GAC GTG CTG GAT GAG TTC TTC AAA ACT GGC GTC TAC 912 Thr Asn Glu Asn Asp Val Leu Asp Glu Phe Phe Lys Thr Gly Val Tyr 290 295 300 CGT CCG CGC GGC TCC GCC AAT ACC TAC CAT ACT TCC AGC CCC TCC ATG 960 Arg Pro Arg Gly Ser Ala Asn Thr Tyr His Thr Ser Ser Pro Ser Met 305 310 315 320 GAT ATT TCC AAG GCC TCC AAT TTC GAG CGT TTC GTC TTC GAC CTA GTG 1008 Asp Ile Ser Lys Ala Ser Asn Phe Glu Arg Phe Val Phe Asp Leu Val 325 330 335 GGC CGT GAC GCC GCC AAG GTG CGC GAG CTA TGG GGC AAG GTG GAT GCG 1056 Gly Arg Asp Ala Ala Lys Val Arg Glu Leu Trp Gly Lys Val Asp Ala 340 345 350 GGC GGC AGT TTC GAC CTT AAC GAC GGT GGC TGG TTT GCC AAG GTA GCG 1104 Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asn Asp Gly Gly Trp Phe Ala Lys Val Ala 355 360 365 GAT TAC GGC TTC GTT TCC GGC AGC AGC AAC CAT GCC AAC CGC ATG CAG 1152 Asp Tyr Gly Phe Val Ser Gly Ser Ser Asn His Ala Asn Arg Met Gln 370 375 380 ACC ATC AAG GCG ACG CAT GAG CGC TAC GGT GTC ACC ATT GAT ACC CAC 1200 Thr Ile Lys Ala Thr His Glu Arg Tyr Gly Val Thr Ile Asp Thr His 385 390 395 400 ACC GCG GAC GGT CTC AAG GTG GCG CTG GAA CAC CGC GAG GCA GGT ACC 1248 Thr Ala Asp Gly Leu Lys Val Ala Leu Glu His Arg Glu Ala Gly Thr 405 410 415 CCG ATG CTG GTG CTG GAA ACC GCA TTG CCG GCC AAA TTC GAG GAC GCG 1296 Pro Met Leu Val Leu Glu Thr Ala Leu Pro Ala Lys Phe Glu Asp Ala 420 425 430 ATT GTC GAG GCG TTA GGG CAT AAA CCC GAG CGT CCG CAC AGC CTG GAA 1344 Ile Val Glu Ala Leu Gly His Lys Pro Glu Arg Pro His Ser Leu Glu 435 440 445 GGC CTG GAA TCC CTG CCT CAG CGC TTT GAG GTG ATG GAG GCC GAT GCA 1392 Gly Leu Glu Ser Leu Pro Gln Arg Phe Glu Val Met Glu Ala Asp Ala 450 455 460 GCC GTC ATC AAA CAG TTC ATT GTT GAG CAT ATT TGA 1428 Ala Val Ile Lys Gln Phe Ile Val Glu His Ile 465 470 475
【００６７】配列番号：４ 配列の長さ：918 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：YES アンチセンス：NO 起源： 生物名：メチロバチルス・グリコゲネス（Methylobacil
lus glycogenes） 株名：ＡＴＲ８０ 配列： ATG GCT CCA AAG GCT ATG ACC TGG GAG AGT TGC TTG ACC TGC AGG GAT 48 Met Ala Pro Lys Ala Met Thr Trp Glu Ser Cys Leu Thr Cys Arg Asp 1 5 10 15 CGC GTC AGG TAT CAC CAA TAC CAA TTA TTT CGT GGC TAC CGC TAC CGG 96 Arg Val Arg Tyr His Gln Tyr Gln Leu Phe Arg Gly Tyr Arg Tyr Arg 20 25 30 CGC TAT GTA CTG ACG TTG TTT GAA GAG CAC AGC GCG GAA GAG CTG CCC 144 Arg Tyr Val Leu Thr Leu Phe Glu Glu His Ser Ala Glu Glu Leu Pro 35 40 45 AAC TTC CTC GAC CTG ATG ACG CAC CTG GCC GAA CGC GGC ATT CCG TGC 192 Asn Phe Leu Asp Leu Met Thr His Leu Ala Glu Arg Gly Ile Pro Cys 50 55 60 CCG TAT CCG GTC AAG AAC ATT GCA GGC CAG GCG CTT GGC GAG CTG AAC 240 Pro Tyr Pro Val Lys Asn Ile Ala Gly Gln Ala Leu Gly Glu Leu Asn 65 70 75 80 GGC AAA CCT GCC GCG CTG GTG AGC TGC CTG GCG GGG AAG TCG CTG GAC 288 Gly Lys Pro Ala Ala Leu Val Ser Cys Leu Ala Gly Lys Ser Leu Asp 85 90 95 AAC CCT TCC CCG CAG CAT TGC GCC GCG ATT GGC GAG GTG CTG TGC GCG 336 Asn Pro Ser Pro Gln His Cys Ala Ala Ile Gly Glu Val Leu Cys Ala 100 105 110 CAT GCA TCT TGC CGG TGC CTC GTT CGA GGT CAG CAT TAT CAA CCT GCG 384 His Ala Ser Cys Arg Cys Leu Val Arg Gly Gln His Tyr Gln Pro Ala 115 120 125 CTG CCA GCG CTG GCG CAT TGC ACG GTT GCC AAG GTG GGC GCC TTT CCT 432 Leu Pro Ala Leu Ala His Cys Thr Val Ala Lys Val Gly Ala Phe Pro 130 135 140 GGA TGC GGA AAA CCG GCC GCA TGC TGG ATG CGC AAC TCG AGT TCG AAC 480 Gly Cys Gly Lys Pro Ala Ala Cys Trp Met Arg Asn Ser Ser Ser Asn 145 150 155 160 AGG CGT TCG ACA ACC AGT GCA TTG TCG CGC GGG GTG ATC CAT GCG GAT 528 Arg Arg Ser Thr Thr Ser Ala Leu Ser Arg Gly Val Ile His Ala Asp 165 170 175 TTG TTC CGT GAC AAT GTG CTG ATG GAC GGG GAC AAG GTA GGA GGT GTC 576 Leu Phe Arg Asp Asn Val Leu Met Asp Gly Asp Lys Val Gly Gly Val 180 185 190 ACT GGA TTT CTA CTA CGC CTG GAA CGA TGT GCT GTT CTA CGA CAT TGC 624 Thr Gly Phe Leu Leu Arg Leu Glu Arg Cys Ala Val Leu Arg His Cys 195 200 205 GAT TGC GGT AAC ACG ACT GGT GCG TCA ACG CCG ATG GCA CGC GGG ATG 672 Asp Cys Gly Asn Thr Thr Gly Ala Ser Thr Pro Met Ala Arg Gly Met 210 215 220 TCG GCC GGG TAC GGG CTT TTC TCG ATG CCT ATC ATG CAG TGC GAC CCC 720 Ser Ala Gly Tyr Gly Leu Phe Ser Met Pro Ile Met Gln Cys Asp Pro 225 230 235 240 TCA CTG AAG AGG AGC ATG CCG CCT GGC CCG GGA TGT TGC GCG TTG CCG 768 Ser Leu Lys Arg Ser Met Pro Pro Gly Pro Gly Cys Cys Ala Leu Pro 245 250 255 GCA TAC GCT TCT GGC TGT CGC GCC TCA ACG ACC TGC ATT TCC CCA GGC 816 Ala Tyr Ala Ser Gly Cys Arg Ala Ser Thr Thr Cys Ile Ser Pro Gly 260 265 270 GGG CGA GCT CAT CCA TGC CAA GGA TCC GGC TAT TTC GAG CGC ATC CTG 864 Gly Arg Ala His Pro Cys Gln Gly Ser Gly Tyr Phe Glu Arg Ile Leu 275 280 285 CGT AAG GCT ATC GCG GCA CGC GAG CAG CTA CTG ACG ATG TGG GTC GAT 912 Arg Lys Ala Ile Ala Ala Arg Glu Gln Leu Leu Thr Met Trp Val Asp 290 295 300 AGT TAG 918 Ser Xaa 305
lus glycogenes） 株名：ＡＴＲ８０ 配列： ATG GCT CCA AAG GCT ATG ACC TGG GAG AGT TGC TTG ACC TGC AGG GAT 48 Met Ala Pro Lys Ala Met Thr Trp Glu Ser Cys Leu Thr Cys Arg Asp 1 5 10 15 CGC GTC AGG TAT CAC CAA TAC CAA TTA TTT CGT GGC TAC CGC TAC CGG 96 Arg Val Arg Tyr His Gln Tyr Gln Leu Phe Arg Gly Tyr Arg Tyr Arg 20 25 30 CGC TAT GTA CTG ACG TTG TTT GAA GAG CAC AGC GCG GAA GAG CTG CCC 144 Arg Tyr Val Leu Thr Leu Phe Glu Glu His Ser Ala Glu Glu Leu Pro 35 40 45 AAC TTC CTC GAC CTG ATG ACG CAC CTG GCC GAA CGC GGC ATT CCG TGC 192 Asn Phe Leu Asp Leu Met Thr His Leu Ala Glu Arg Gly Ile Pro Cys 50 55 60 CCG TAT CCG GTC AAG AAC ATT GCA GGC CAG GCG CTT GGC GAG CTG AAC 240 Pro Tyr Pro Val Lys Asn Ile Ala Gly Gln Ala Leu Gly Glu Leu Asn 65 70 75 80 GGC AAA CCT GCC GCG CTG GTG AGC TGC CTG GCG GGG AAG TCG CTG GAC 288 Gly Lys Pro Ala Ala Leu Val Ser Cys Leu Ala Gly Lys Ser Leu Asp 85 90 95 AAC CCT TCC CCG CAG CAT TGC GCC GCG ATT GGC GAG GTG CTG TGC GCG 336 Asn Pro Ser Pro Gln His Cys Ala Ala Ile Gly Glu Val Leu Cys Ala 100 105 110 CAT GCA TCT TGC CGG TGC CTC GTT CGA GGT CAG CAT TAT CAA CCT GCG 384 His Ala Ser Cys Arg Cys Leu Val Arg Gly Gln His Tyr Gln Pro Ala 115 120 125 CTG CCA GCG CTG GCG CAT TGC ACG GTT GCC AAG GTG GGC GCC TTT CCT 432 Leu Pro Ala Leu Ala His Cys Thr Val Ala Lys Val Gly Ala Phe Pro 130 135 140 GGA TGC GGA AAA CCG GCC GCA TGC TGG ATG CGC AAC TCG AGT TCG AAC 480 Gly Cys Gly Lys Pro Ala Ala Cys Trp Met Arg Asn Ser Ser Ser Asn 145 150 155 160 AGG CGT TCG ACA ACC AGT GCA TTG TCG CGC GGG GTG ATC CAT GCG GAT 528 Arg Arg Ser Thr Thr Ser Ala Leu Ser Arg Gly Val Ile His Ala Asp 165 170 175 TTG TTC CGT GAC AAT GTG CTG ATG GAC GGG GAC AAG GTA GGA GGT GTC 576 Leu Phe Arg Asp Asn Val Leu Met Asp Gly Asp Lys Val Gly Gly Val 180 185 190 ACT GGA TTT CTA CTA CGC CTG GAA CGA TGT GCT GTT CTA CGA CAT TGC 624 Thr Gly Phe Leu Leu Arg Leu Glu Arg Cys Ala Val Leu Arg His Cys 195 200 205 GAT TGC GGT AAC ACG ACT GGT GCG TCA ACG CCG ATG GCA CGC GGG ATG 672 Asp Cys Gly Asn Thr Thr Gly Ala Ser Thr Pro Met Ala Arg Gly Met 210 215 220 TCG GCC GGG TAC GGG CTT TTC TCG ATG CCT ATC ATG CAG TGC GAC CCC 720 Ser Ala Gly Tyr Gly Leu Phe Ser Met Pro Ile Met Gln Cys Asp Pro 225 230 235 240 TCA CTG AAG AGG AGC ATG CCG CCT GGC CCG GGA TGT TGC GCG TTG CCG 768 Ser Leu Lys Arg Ser Met Pro Pro Gly Pro Gly Cys Cys Ala Leu Pro 245 250 255 GCA TAC GCT TCT GGC TGT CGC GCC TCA ACG ACC TGC ATT TCC CCA GGC 816 Ala Tyr Ala Ser Gly Cys Arg Ala Ser Thr Thr Cys Ile Ser Pro Gly 260 265 270 GGG CGA GCT CAT CCA TGC CAA GGA TCC GGC TAT TTC GAG CGC ATC CTG 864 Gly Arg Ala His Pro Cys Gln Gly Ser Gly Tyr Phe Glu Arg Ile Leu 275 280 285 CGT AAG GCT ATC GCG GCA CGC GAG CAG CTA CTG ACG ATG TGG GTC GAT 912 Arg Lys Ala Ile Ala Ala Arg Glu Gln Leu Leu Thr Met Trp Val Asp 290 295 300 AGT TAG 918 Ser Xaa 305
【図１】 プラスミドｐＬＡ２９０５の制限酵素地図で
ある。
ある。
【図２】 プラスミドｐＭＦＹ４２の制限酵素地図であ
る。
る。
【図３】 プラスミドｐＩＨＤ−１の制限酵素地図であ
る。
る。
【図４】 プラスミドｐＴＨＤ−１の制限酵素地図であ
る。
る。
【図５】 プラスミドｐＩＨＤ−４１の制限酵素地図で
ある。
ある。
【図６】 プラスミドｐＴＨＤ−４１の制限酵素地図で
ある。
ある。
【図７】 プラスミドｐＴＴＳ−１の制限酵素地図であ
る。
る。
【図８】 プラスミドｐＴＨＤ−３０の制限酵素地図で
ある。
ある。
【図９】 プラスミドｐＩＨＤ−３１の制限酵素地図で
ある。
ある。
【図10】 プラスミドｐＴＨＤ−３１の制限酵素地図で
ある。
ある。
【図11】 プラスミドｐＡＨＫ−１の制限酵素地図であ
る。
る。
【図12】 プラスミドｐＡＨＫ−１４の制限酵素地図で
ある。
ある。
【図13】 プラスミドｐＭＡＨＫ−１の制限酵素地図で
ある。
ある。
Claims (7)
- 【請求項１】 メチロバチルス属に属する微生物に由来
しホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼお
よびスレオニンシンターゼのうち少なくとも１つの酵素
の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクター
ＤＮＡとの組換え体ベクターを保有するメチロバチルス
属に属する微生物を、メタノールを主炭素源として含有
する培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニンを生成蓄
積させ、該培養物からＬ−スレオニンを採取することを
特徴とするＬ−スレオニンの製造法。 - 【請求項２】 メチロバチルス属に属する微生物に由来
しホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼお
よびスレオニンシンターゼのうち少なくとも１つの酵素
の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクター
ＤＮＡ断片との組換え体ベクター。 - 【請求項３】 請求項２記載の組換え体ベクターを保有
する微生物。 - 【請求項４】 メチロバチルス属に属する微生物由来で
ホモセリンデヒドロゲナーゼの合成に関与する遺伝情報
を担い、かつ配列番号１のアミノ酸配列で表されるＤＮ
Ａ。 - 【請求項５】 メチロバチルス属に属する微生物由来で
ホモセリンデヒドロゲナーゼの合成に関与する遺伝情報
を担い、かつ配列番号２のアミノ酸配列で表されるＤＮ
Ａ。 - 【請求項６】 メチロバチルス属に属する微生物由来で
スレオニンシンターゼの合成に関与する遺伝情報を担
い、かつ配列番号３のアミノ酸配列で表されるＤＮＡ。 - 【請求項７】 メチロバチルス属に属する微生物由来で
ホモセリンキナーゼの合成に関与する遺伝情報を担い、
かつ配列番号４のアミノ酸配列で表されるＤＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1433592A JPH05207886A (ja) | 1992-01-29 | 1992-01-29 | 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1433592A JPH05207886A (ja) | 1992-01-29 | 1992-01-29 | 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05207886A true JPH05207886A (ja) | 1993-08-20 |
Family
ID=11858199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1433592A Withdrawn JPH05207886A (ja) | 1992-01-29 | 1992-01-29 | 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05207886A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1188822A4 (en) * | 1999-04-09 | 2003-09-03 | Ajinomoto Kk | L-AMINO ACID-PRODUCING BACTERIUM AND METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACID |
-
1992
- 1992-01-29 JP JP1433592A patent/JPH05207886A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1188822A4 (en) * | 1999-04-09 | 2003-09-03 | Ajinomoto Kk | L-AMINO ACID-PRODUCING BACTERIUM AND METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACID |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2201454C2 (ru) | Мутантная альфа-изопропилмалат синтаза (ipms), днк, кодирующая мутантную ipms, способ получения штамма escherichia coli, способ получения l-лейцина | |
| RU2215783C2 (ru) | МУТАНТНАЯ N-АЦЕТИЛГЛУТАМАТ СИНТАЗА (ВАРИАНТЫ), ФРАГМЕНТ ДНК, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ АРГИНИНА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА | |
| JP2944094B2 (ja) | 細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌 | |
| JP4561010B2 (ja) | Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| RU2144564C1 (ru) | ФРАГМЕНТ ДНК rhtB, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ БЕЛКА RhtB, ПРИДАЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К L-ГОМОСЕРИНУ БАКТЕРИЯМ ESCHERICHIA COLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ | |
| KR100760222B1 (ko) | 유전자 증폭에 의해 증가된 리신 생산 | |
| JP4108766B2 (ja) | 改良されたトランスアミナーゼ生物学的変換方法 | |
| JP2001046067A (ja) | 好熱性バチルス属細菌由来のｌ−リジン生合成系遺伝子 | |
| CA2234412C (en) | Method for producing optically active compound | |
| JPS59156292A (ja) | トリプトフアンの製造法 | |
| JP3408737B2 (ja) | ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子 | |
| GB2130216A (en) | Enzymatic synthesis of L-serine | |
| KR100244066B1 (ko) | D-N-카르바모일-α-아미노산의 제조법 | |
| CN1065916C (zh) | 生物合成钴胺素和/或钴胺酰胺有关的多肽、编码这些多肽的dna序列、其制备方法及应用 | |
| JP4561009B2 (ja) | Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| KR900004424B1 (ko) | 아미노산의 제조방법 | |
| US5786192A (en) | Farnesyl pyrophosphate synthetase and DNA sequence encoding the same | |
| EP0107400A1 (en) | Hybrid plasmid and process for producing glutathione using said plasmid | |
| JP2722504B2 (ja) | 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法 | |
| JPH03164185A (ja) | 改変されたｄｎａおよびその用途 | |
| JPH05207886A (ja) | 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 | |
| JPH022349A (ja) | ピリミジンアナログ耐性化遺伝子ｄｎａおよびその用途 | |
| JP2587764B2 (ja) | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 | |
| JPH0732711B2 (ja) | Ｌ−イソロイシンの製造法 | |
| PT906430E (pt) | Processo de biossíntese que permite a preparação de o-fosfo-l-treonina |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19990408 |