CN100471949C

CN100471949C - 丝氨酸乙酰转移酶突变体和生产l-半胱氨酸的方法

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Publication number: CN100471949C
Application number: CNB2004800202648A
Authority: CN
Inventors: 柏木立己; 开裕子; 石川弘纪; 铃木荣一郎; 高木博史; M·K·齐野蒂洛夫; E·I·雷德基纳; M·M·谷斯野蒂纳
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-07-16
Filing date: 2004-07-16
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2024-07-16
Also published as: CN1823162A; RU2003121601A

Abstract

通过培养埃希氏菌属的细菌可以生产O-乙酰丝氨酸、L-半胱氨酸和由其衍生而来的亚硫化合物，该细菌保留有乙酰转移酶变体，所述变体是相当于第89-96位的氨基酸序列被SEQ ID NOS：4至9所示的任何一个氨基酸序列取代，并且对L-半胱氨酸产生的反馈抑制脱敏的野生型丝氨酸乙酰转移酶。

Description

丝氨酸乙酰转移酶突变体和生产L-半胱氨酸的方法

发明领域

本发明涉及微生物工业，和更具体而言涉及生产氨基酸的方法。更具体而言，本发明涉及参与半胱氨酸生物合成的新抗反馈酶的用途。更具体而言，本发明涉及新的抗反馈丝氨酸乙酰转移酶突变体、携带该酶的大肠杆菌(E.coli)菌株和使用该菌株通过发酵生产L-半胱氨酸的方法.

相关技术描述

通常，已利用从天然来源获得的微生物菌株或已被修饰以提高L-氨基酸生产能力的所述菌株突变体通过发酵方法来工业生产L-氨基酸。

已经公开了提高L-氨基酸生产能力的很多技术，例如通过用重组DNA转化微生物(见例如美国专利No.4,278,765).这些技术基于增加参与氨基酸生物合成的酶的活性和/或使目标酶对由产生的L-氨基酸产生的反馈抑制脱敏(见例如日本公开申请No.56-18596(1981)、WO 95/16042或美国专利No.5,661,012和6,040,160)。

在大肠杆菌中由L-丝氨酸生物合成L-半胱氨酸是通过cysE基因编码的丝氨酸乙酰转移酶、cysK和cysM基因编码的命名为-A和-B的O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶同工酶进行的。丝氨酸乙酰转移酶(也称作“SAT”；EC 2.3.1.30)催化由乙酰辅酶A和L-丝氨酸形成O-乙酰-L-丝氨酸并在通过L-半胱氨酸反馈抑制的半胱氨酸生物合成中起着调节作用(Escherichia coli and Salmonella，Second Edition，Editor in Chief：F.C.Neidhardt，ASM Press，Washington D.C.，1996)。

Denk D.和Bock A.分离了来自大肠杆菌的对L-半胱氨酸无反馈敏感性的SAT突变体和野生型SAT(J.Gen.Microbiol.，1987，133(Pt 3)，515-25).cysE基因突变体显示第767位单个碱基改变，导致第256位甲硫氨酸置换为异亮氨酸。这个突变体分泌L-半胱氨酸。

用cysE基因编码的大肠杆菌SAT中19个其它氨基酸残基取代野生型Met-256，或引入终止密码子以截短256-273C末端区在大多数情况下引起抗反馈(fbr)表型。然而SAT突变体蛋白不保留野生型SAT的活性水平(Nakamori S.等人，Appl.Environ.Microbiol.，1998，64，5，1607-1611，WO 97/15673)。携带有这些改变的cysE基因的质粒的菌株产生最高达200mg/l的半胱氨酸，包括胱氨酸。

来自大肠杆菌的很多反馈不敏感SAT突变体是通过随机诱变由PCR获得的。沿SAT全部氨基酸序列鉴定突变，但是所有SAT突变体都显示显著降低的比活性水平(Takagi，H.等人，FEBS Lett.，1999，452，323-327)。

Mino K.等人(Biosci.Biotechnol.Biochem.1999，63，1，168-179)也表明SAT的C末端区在L-半胱氨酸产生的反馈抑制中的重要作用.截短的SAT，它在Ser 253和Met 254之间切开野生型SAT，导致C末端20个氨基酸残基的缺失，对反馈抑制的敏感性比野生型SAT小得多。

也报道了属于埃希氏菌属(Escherichia)的菌株可以产生L-半胱氨酸，其特征是受到抑制的L-半胱氨酸分解系统，例如半胱氨酸脱巯基酶活性较低，和L-半胱氨酸产生的反馈抑制降低的SAT的保留，例如野生型SAT第256位的第256个甲硫氨酸被另一个氨基酸残基置换的SAT突变体(JP11155571A2)。

在氨基酸97-100、164-169、237、239-240、245-259和267-269序列区具有突变或在氨基酸237-240、245-259和267-269C末端序列区具有缺失的重组丝氨酸乙酰转移酶与野生型酶相比显示出对L-半胱氨酸的敏感性降低，并在美国专利6,218,168中公开。SAT中由双重突变型cysEXIV等位基因编码的下列突变显示对半胱氨酸的良好抗性(K₁>1000μM)，具有相对高的活性(0.453μM/分钟x mg)：在第721位A变为G导致Thr 167变为Ala 167和在第988-990位ATG变为TAG导致产生终止密码子而不是Met256。用cysEXIV等位基因转化的JM15菌株在进料分批发酵方法48小时后产生2.3g/l L-半胱氨酸。然而，L-半胱氨酸的最佳产量(3.9g/1)是使用cysEDe1_255突变型等位基因获得的，从而C末端区18个氨基酸被截断(美国专利6,218,168)。

一般说来，酶的fbr表型是用蛋白序列中其它氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基而产生的且这些取代降低酶活性。

因此由如上所述方法获得的酶突变体的缺点是与野生型酶相比酶突变体的活性降低。很清楚，本领域需要维持fbr表型酶突变体的活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种在野生型丝氨酸乙酰转移酶第89至96位氨基酸序列中具有一个或几个突变，并且对L-半胱氨酸产生的反馈抑制脱敏的丝氨酸乙酰转移酶突变体。

本发明的又一目的是提供如上所述的丝氨酸乙酰转移酶突变体，其中相当于野生型丝氨酸乙酰转移酶第89至96位的氨基酸序列被选自SEQ ID NO：4、5、6、7、8和9的氨基酸序列取代。

本发明的又一目的是提供如上所述的丝氨酸乙酰转移酶突变体，其中野生型丝氨酸乙酰转移酶源自于大肠杆菌；

本发明的又一目的是提供如上所述的丝氨酸乙酰转移醇突变体，所述突变体包括在除第89至96位之外的一个或多个位置缺失、置换、插入或添加一个或几个氨基酸，其中排除第51位Asn置换为Lys，第91位Arg置换为His和第233位His置换为Tyr。

本发明的又一目的是提供编码如上所述的丝氨酸乙酰转移酶突变体的DNA。

本发明的又一目的是提供属于埃希氏菌属的细菌，所述细菌用如上所述的DNA转化并且具有产生L-半胱氨酸的能力。

本发明的又一目的是提供一种生产L-半胱氨酸的方法，所述方法包括在培养基中培养如上所述的细菌并从该培养基中收集L-半胱氨酸。

具有如上所述任何fbr突变的SAT可以被称为“SAT突变体”，编码SAT突变体的DNA可以被称为“cysE基因突变体”，且无突变的SAT可以称为“野生型SAT”。

附图简述

图1显示了引物SEQ ID NO：18和19的构建.

图2显示了SAT的寡聚结构。

图3显示了SAT亚基的三维结构。

图4显示了cysE基因突变体库的构建方案.

图5显示了SAT突变体的催化性能.

发明的优选实施方案

本发明涉及抗反馈高活性酶突变体的构建，该酶在大肠杆菌生物合成半胱氨酸中起关键作用。本发明还涉及使用cysE基因片段的完全随机化合成一大组cysE基因突变体的方法。

存在fbr突变的蛋白片段中同时发生的氨基酸残基置换可以产生蛋白突变体，由于酶三维结构的正确评估，所述蛋白突变体具有接近于天然水平的活性水平。

现在将进一步详述本发明：

<1>SAT突变体和cysE基因突变体

根据本发明发明人获得的SAT三维结构，揭示了与L-半胱氨酸相互作用和负责SAT对L-半胱氨酸敏感性必要的新SAT区域(见实施例1)。

本发明的SAT突变体和cysE基因突变体通过随机片段-定向诱变获得.cysE基因中很多突变是通过cysE基因的24个核苷酸片段的随机化获得的.这个片段编码SAT蛋白序列中从第89位精氨酸至第96位天冬酰胺的区域。每次随机化两个相邻的氨基酸残基，所以蛋白的整个89-96区域在4个随后的实验过程中随机化.

具有克隆入表达载体的cysE基因突变体的重组克隆的随后选择和筛选允许选择具有不同生物学活性水平的SAT突变体的fbr变体，最高达到并包括去抑制的野生型(wt)SAT的活性水平。作为野生型SAT，包括来自大肠杆菌(EC-号2.3.1.30)的SAT(SEQ ID NO：2)。

本发明包括具有fbr表型的SAT突变体的氨基酸序列。SAT突变体可以通过使用普通方法将突变引入野生型cysE基因获得。野生型cysE基因可以通过例如利用基于该基因的核苷酸序列制备的引物的PCR(聚合酶链反应；参考White，T.J.等人，Trends Genet.，5,185(1989))获得.作为野生型cysE基因，包括大肠杆菌的cysE基因(GenBank登记号NC_000913.1；gi：16127994的序列中的核苷酸号3779368至3780189).编码野生型SAT或来自其它微生物的SAT突变体的基因可以以类似方式获得.将突变引入野生型cysE基因可以通过例如定点诱变进行。

本发明SAT突变体中第89至96位氨基酸序列含有一个或几个突变。优选地，本发明SAT突变体中第89至96位氨基酸序列是SEQ IDNO：4至9所示的任何一个序列。表1阐明了本发明SAT突变体的相应氨基酸序列，其中Val-95和Asp-96被Arg-95和Pro-96、Gly-95和Gly-96或Leu-95和Pro-96取代；Ala-94被Thr-94取代；Arg-89被Pro-89取代；Arg-89和Thr-90被Ser-89和Leu-90取代；和大肠杆菌野生型SAT。表1还显示了编码这些氨基酸序列的核苷酸序列的实例。

表1

cysE基因的等位基因	SAT蛋白随机化区域的序列(89→96氨基酸)	SEQIDNO：	cysE基因的随机化片段的DNA序列(5′→3′)	SEQIDNO：
cysE基因的等位基因	SAT蛋白随机化区域的序列(89→96氨基酸)	SEQIDNO：	cysE基因的随机化片段的DNA序列(5′→3′)	SEQIDNO：	Wt	Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp	3	ogt aoo ogo gaoo oog goa gto gat	10
CysE5	Arg Thr Arg Asp Pro Ala <u>Arg Pro</u>	4	ogt aoo ogo gao oog goa AGACCC	11	Wt	Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp	3	ogt aoo ogo gaoo oog goa gto gat	10
CysE5	Arg Thr Arg Asp Pro Ala <u>Arg Pro</u>	4	ogt aoo ogo gao oog goa AGACCC	11	CysE12	Arg Thr Arg Asp Pro Ala <u>Gly Gly</u>	5	ogt aoo ogo gao oog goa GGT GGT	12
CysE15	Arg Thr Arg Asp Pro Ala <u>Leu Pro</u>	6	ogt aoo ogo gao oog goa CTA CCA	13	CysE12	Arg Thr Arg Asp Pro Ala <u>Gly Gly</u>	5	ogt aoo ogo gao oog goa GGT GGT	12
CysE15	Arg Thr Arg Asp Pro Ala <u>Leu Pro</u>	6	ogt aoo ogo gao oog goa CTA CCA	13	CysE1	Pro Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp	7	CCC aoo ogo gao oog goa gto gat	14
CysE102	Arg Thr Arg Asp Pro <u>Thr</u> Val Asp	8	ogt aoo ogo gao oot ACA gto gat	15	CysE1	Pro Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp	7	CCC aoo ogo gao oog goa gto gat	14
CysE102	Arg Thr Arg Asp Pro <u>Thr</u> Val Asp	8	ogt aoo ogo gao oot ACA gto gat	15	CysE142	Ser Leu Arg Asp Pro Ala Val Asp	9	AGT CTA ogo gao oog goa gto gat	16

SAT突变体可以包括在除了第89至96位之外的一个或多个位置缺失、置换、插入或添加一个或几个氨基酸，前提是SAT活性不降低。术语“SAT活性”意思是催化乙酰基从乙酰辅酶A转移至L-丝氨酸的反应的活性.可以用例如Kredich，N.M.和Tomkins，G.M.(J.Biol.Chem.1966，241，21，4955-4965)描述的方法测量SAT活性。排除具有第51位Asn置换为Lys、第91位Arg置换为His和第233位His置换为Tyr的三重突变体，因为Takagi，H.等人(FEBS Lett.，1999，452，323-327)以前已描述过所述突变体。

“几个”氨基酸的数目依赖于蛋白三维结构中氨基酸残基的位置和氨基酸类型而不同。这是由于下列理由。也就是说，一些氨基酸彼此具有高同源性，且这种氨基酸的不同不会大大影响蛋白的三维结构。因此，本发明的SAT突变体可以是与组成SAT的全部氨基酸残基具有不低于30至50％，优选不低于50至70％，更优选不低于70至90％，最优选不低于95％同源性，并且具有fbr SAT活性的突变体。或者，在此提及的“几个”氨基酸残基的数目具体地说可以是2至20，优选2至10，更优选2至15.

在本发明中，“相当于第89至96位序列的氨基酸序列”意思是相当于大肠杆菌野生型SAT的氨基酸序列中第89至96位氨基酸序列的氨基酸序列。氨基酸残基的位置可以改变。例如，如果一个氨基酸残基插入N-末端部分，那么固有位于89位的氨基酸残基变为90位。在这种情况下，第90位的氨基酸残基指定为相当于本发明原始第89位的氨基酸残基。

因此，如上所述的那些SAT的改变一般是保守的，从而保持SAT活性.置换改变包括其中氨基酸序列中至少一个残基已被除去并在它的位置插入不同残基的改变.可以代替SAT蛋白中原始氨基酸和被认为是保守置换的氨基酸实例包括：用ser或thr代替Ala；用gln、his或lys代替arg；用glu、gln、lys、his、asp代替asn；用asn、glu或gln代替asp；用ser或ala代替cys；用asn、glu、lys、his、asp或arg代替gln；用asn、gln、lys或asp代替glu；用pro代替gly；用asn、lys、gln、arg、tyr代替his；用leu、met、val、phe代替ile；用ile、met、val、phe代替leu；用asn、glu、gln、his、arg代替lys；用ile、leu、val、phe代替met；用trp、tyr、met、ile或leu代替phe；用thr、ala代替ser；用ser或ala代替thr；用phe、tyr代替trp；用his、phe或trp代替tyr和用met、ile、leu代替val。

编码基本上与如上所述的SAT突变体相同的蛋白的DNA可以通过如下方法获得，例如通过修饰该核苷酸序列，例如通过定点诱变方法从而使具体位点的一个或多个氨基酸残基被缺失、置换、插入或添加。如上所述修饰的DNA可以通过通常已知的突变处理获得。这种突变处理包括处理含有体外cysE基因突变体的DNA的方法，例如用羟胺，和处理微生物的方法，例如用紫外线照射或突变剂处理携带cysE基因突变体的属于埃希氏菌属的细菌，所述突变剂如通常用于这种处理的N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸.

如上所述的核苷酸的置换、缺失、插入或添加还包括天然发生的突变(突变体或变体)，例如随机突变、携带SAT的细菌的物种或属的差异。

编码基本上与SAT突变体相同的蛋白的DNA可以通过下述方法获得，从携带SAT突变体的细胞分离在严格条件下与作为探针的已知cysE基因序列(SEQ ID NO：1)或其一部分杂交，并编码具有SAT活性的蛋白的DNA。

术语“严格条件”包括形成所谓的特异性杂交和不形成非特异性杂交的条件.很难使用任何数值精确表达这个条件。然而例如严格条件包括如下条件，在该条件下彼此之间具有高同源性，例如具有不低于50％同源性的DNAs杂交，而彼此之间具有比上述同源性更低同源性的DNAs不杂交。或者，严格条件包括在该条件下DNA以相当于DNA印迹杂交中洗涤的普通条件下的盐浓度彼此杂交的条件，即60℃、1x SSC、0.1％ SDS，优选0.1 x SSC、0.1％ SDS.

将在如上所述条件下杂交的基因包括具有基因编码区内产生的终止密码子的基因，和由于活性中心突变而没有活性的基因。然而，用市场上可获得的表达载体连接该基因，并研究所表达蛋白的SAT活性可以容易地消除这种不便。

<2>本发明的属于埃希氏菌属的细菌。

本发明的细菌是其中引入如上所述的cysE基因突变体的属于埃希氏菌属的细菌。术语“属于埃希氏菌属的细菌”意思是根据微生物学技术人员已知的分类法被分类为埃希氏菌属的细菌。属于埃希氏菌属的细菌实例包括大肠杆菌。

“具有产生L-半胱氨酸的能力的细菌”意思是一种细菌，当在培养基中培养本发明的细菌时，所述细菌具有在培养基中累积L-半胱氨酸的能力。通过育种可以给予或提高产生L-半胱氨酸的能力。在此使用的术语“具有产生L-半胱氨酸的能力的细菌”意思也是一种细菌，它能够在培养基中产生并累积比野生型或亲本菌株更大量的L-半胱氨酸。野生型大肠杆菌菌株的实例包括大肠杆菌菌株MG1655(ATCC47076、ATCC700926、VKPM B-6195)、K-12等等。MG1655菌株可以从美国典型培养物保藏中心(10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110，美国)获得。

可以通过例如用包含在属于埃希氏菌属的细菌中有功能的载体和cysE基因突变体的重组DNA转化属于埃希氏菌属的细菌来引入cysE基因突变体.也可以通过在染色体上用cysE基因突变体取代cysE基因而引入cysE基因突变体。

引入cysE基因突变体的合适载体实例包括质粒载体如pBR322、pMW118、pUC19等等，噬菌体载体如11059、1BF101、M13mp9等等和转座子如Mu、Tn10、Tn5等等。

将DNA引入属于埃希氏菌属的细菌可以通过例如D.A.Morrison(Methods in Enzymology，68，326(1979))的方法或用氯化钙处理细菌受体细胞以增加DNA渗透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159，(1970))等等进行。

通过将cysE基因突变体引入如上所述产生L-半胱氨酸的属于埃希氏菌属的细菌可以增加产生的L-半胱氨酸量。同样，预先已引入cysE基因突变体的细菌可以被赋予产生L-半胱氨酸的能力。

具有产生L-半胱氨酸活性的属于埃希氏菌属的细菌实例包括大肠杆菌菌株JM15，它被编码抗反馈丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化(美国专利6,218,168)；具有编码适于分泌细胞毒性物质、超表达的蛋白的基因的大肠杆菌菌株W3110(美国专利5,972,663)；具有较低半胱氨酸脱巯基酶活性的大肠杆菌菌株(JP11155571A2)和cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正转录调节剂活性增加的大肠杆菌菌株W3110(PCT申请WO0127307A1)等等。

<3>本发明的方法。

本发明的方法包括一种生产L-半胱氨酸的方法，其包括以下步骤，在培养基中培养本发明的细菌、允许产生L-半胱氨酸和从培养基中累积的L-半胱氨酸中收集L-半胱氨酸.

在本发明中，从培养基培养、收集和纯化L-半胱氨酸等等可以用常规发酵方法进行，其中使用微生物产生氨基酸。

本发明中使用的培养基可以是合成培养基或天然培养基，只要该培养基包括碳源、氮源、硫源和矿物质，和如有必要，包括微生物生长所需的适当量营养物。

碳源可以包括各种碳水化合物如葡萄糖和蔗糖和各种有机酸。根据所使用微生物的同化模式，可以使用醇，包括乙醇和甘油。

作为氮源，可以使用各种铵盐如氨和铵盐、其它氮化合物如胺、天然氮源如胨、大豆水解产物和消化的发酵微生物。作为硫源，可以使用硫酸盐和硫代硫酸盐。

作为矿物质，可以使用一磷酸钾、氯化钠、氯化钙、镁盐、亚铁盐、锰盐等等。

如有必要可以向培养基中添加另外的营养物。例如，如果微生物生长需要甲硫氨酸(甲硫氨酸营养缺陷型)，则可以向培养基中添加足量甲硫氨酸。

优选在需氧条件下进行培养，如在20至42℃的温度下通风摇动和搅拌培养物，优选37至40℃。培养物的pH通常是5至9，优选6.5至7.2。培养物的pH可以用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液调节。通常，1至5天培养导致液体培养基中累积目标L-氨基酸。

培养后，可以用离心或膜滤法从液体培养基中除去固体如细胞，然后可以收集目标L-氨基酸并用离子交换、浓缩和结晶方法纯化。

实施例

将参考下列非限制性实施例具体解释本发明.

实施例1：SAT的三维结构

如下进行SAT三维结构的测定.

<1>硒代甲硫氨酰SAT的制备和纯化

为了在大肠杆菌中生产重组SAT，使用载体pQE*构建编码SAT的cysE基因的表达质粒.这个载体是通过修饰大肠杆菌表达载体pQE30(Qiagen)产生的。

使用pQE30作为模板，和用寡核苷酸引物SEQ ID NO：17和18实施PCR。基于载体pQE30(www.qiagen.com)的核苷酸序列构建引物.引物SEQ ID NO：18含有图1描述的SphI识别位点和错配。用限制性内切酶XhoI和SphI消化150bp的唯一扩增带以回收80bp的片段。使这个片段与预先已用相同限制性内切酶消化的pQE30大片段连接。生成的质粒pQE*在起始密码子处含有SphI切割位点，而不是编码六个连续His氨基酸残基的序列和BamHI位点。

用大肠杆菌DH5α的基因组DNA和根据cysE基因核苷酸序列(GenBank登记号M15745)构建的寡核苷酸引物SEQ ID NO：19和20，通过PCR制备cysE基因的DNA片段。引物SEQ ID NO：19含有图1描述的SphI识别位点和错配。引物SEQ ID NO：20在5’末端含有HindIII识别位点。用限制性内切酶SphI和HindIII消化840bp的唯一扩增带，然后与预先已用相同限制性内切酶消化的pQE*大片段连接而构建质粒pQE-SAT.结果，重组SAT中第2位的TCG三联体编码的天然丝氨酸残基被CCG三联体编码的脯氨酸取代。

在37℃用含氨苄青霉素(5μg/ml)的LB培养基[20g/1细菌用胰蛋白胨、10g/l细菌用酵母抽提物、20g/l NaCl]培养携带SAT表达质粒pQE-SAT的大肠杆菌B834/DE3细胞(Novagen Co.，美国)过夜。随后，将这个种子培养物转移到含硒代甲硫氨酸(40μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)的M9培养基中[15.1g/l Na₂HPO₄12H₂O、3g/lKH₂PO₄、0.5g/l NaCl、1g/l NH4Cl、4g/l葡萄糖、2ml1M MgSO₄、1ml1M CaCl₂、1ml FeCl₃(3.5mg/ml)、2.4ml硫胺素(1mg/ml)]。在37℃继续培养。当560nm光密度达到0.6时，添加1mM异丙基-1-β-D-吡喃半乳糖苷诱导硒代甲硫氨酰SAT表达。离心收获培养的细胞。

将细胞沉淀悬浮于50mM Tris-HCl(盐酸三羟甲基氨基甲烷)、2mM(±)-二硫苏糖醇、5mMEDTA-Na₂(乙二胺四乙酸二钠二水合物)溶液中并通过超声进行破碎.上清液在60℃温育10分钟并在冰上冷却10分钟。离心除去沉淀。用硫酸铵沉淀纯化溶解的硒代甲硫氨酰SAT溶液并通过50mM Tris-HCl，pH7.5，2mM(±)二硫苏糖醇和5mMEDTA-Na₂溶液透析。然后将它应用于用50mM Tris-HCl，pH7.5，2mM(±)二硫苏糖醇和5mMEDTA-Na₂平衡的阴离子交换柱(ResourceQ 6ml，Amersham Pharmacia Biotech，东京，日本)。用1柱体积的相同缓冲液洗涤该柱后，用0至1M线性梯度氯化钠于10柱体积，以6ml/分钟的流速洗脱硒代甲硫氨酰SAT。收集洗脱的级分。添加硫酸铵后，将该溶液应用于用0.75M硫酸铵、50mM Tris-HCl，pH7.5、2mM(±)二硫苏糖醇和5mM EDTA-Na₂平衡的疏水相互作用层析柱(HiPrep16/10 Butyl；Amersham Pharmacia Biotech，东京，日本)。用1柱体积的相同缓冲液洗涤该柱后，用0.75至0M线性梯度硫酸铵于10柱体积，以5ml/分钟的流速洗脱硒代甲硫氨酰SAT。对于缓冲液更换，用50mM Tris-HCl，pH7.5、2mM(±)二硫苏糖醇、5mM EDTA-Na₂溶液透析合并的级分。

<2>结晶

进行硒代甲硫氨酰SAT的结晶。得到生长至足以在约5天内通过X射线衍射的大小(0.2 x 0.2 x 0.2mm)的立方晶体。

<3>数据收集和加工

使用在Photon Factory of the National Laboratory for HighEnergy Physics，Tsukuba，日本的射束线(beamline)6B上安装的Quantam 4R CCD检测器(ADSC)收集硒代甲硫氨酰SAT晶体的多波长反常色散(MAD)数据.收集X射线衍射数据之前，记录X射线荧光光谱并用于选择进行MAD数据收集的最佳波长。在测量X射线荧光光谱和数据收集期间，在针对含有35v/v％2-甲基-2，4-戊二醇、0.1M2-(N-吗啉代)乙磺酸-NaOH(pH6.2)和1mML-半胱氨酸的冰冻溶剂平衡后，硒代甲硫氨酰SAT晶体以95K闪冷却(flash-cool).以

(荧光光谱的拐点，f′最小)、

(f″最大)、

(远距离高能波长)和

(远距离低能波长)收集数据。全部四组数据从相同晶体，以220mm的晶体-检测器距离和使用每个图像1.0°振幅来收集.使用程序DPS/MOSFLM加工衍射数据(Rossman，M.G.和vanBeek，C.G.(1999)Acta Crystallogr.Sect.D55，1631-1640)。硒代甲硫氨酰SAT的晶体衍射最高达

的分辨率。它属于空间群R3，晶胞大小

，

.晶体的每个不对称单元含有四个硒代甲硫氨酰SAT分子(分子A、B、C和D)，其具有35.3％的溶剂含量。

<4>MAD成相(Phasing)和相改善

用CCP4(Beiley，S.(1994)Acta Crystallogr.Sect.D50，760-763)程序SCALEIT测量MAD数据.不对称单元中预期的36个Se位点中有19个使用程序SOLVE确定(Terwilliger，T.C.和Berendzen，J.(1996)Acta Crystallogr.Sect.D52，743-748)。用CCP4中程序MLPHARE计算初始MAD相。特征值的最终数字变为0.541(分辨率).

使用CCP4中程序DM改善MAD相。首先，在30％溶剂含量的条件下反复地做溶剂消光(flattening)步骤，其中使用分辨率数据。尽管电子密度图显示相对清晰的蛋白-溶剂边界，但是它的质量差且难以解释.在Octane图形工作站(Silicon Graphics Inc.)上使用程序QUANTA(Accelrys Inc.)进行电子密度图和模型建立的解释。

下一步，通过分子平均步骤进一步改善相.通过叠加Se原子的位置初步确定非晶体学对称(NCS)参数.分子A和B和分子C和D分别通过非晶体学2重轴联系起来。分子A和C和分子B和D分别通过沿c轴的1/2平移联系起来。在

分辨率下进行的分子平均步骤过程中精制NCS参数。成功完成分子平均步骤，从而产生组合相的平均特征数字(0.644)和相关系数(0.617→0.868)的改善值。图被改善并显示许多二级结构。在这个图上构建硒代甲硫氨酰SAT的三维结构。

<5>SAT的三维结构

图2显示了SAT的寡聚结构.如图1所示，SAT形成具有32点对称的六聚结构.三个非晶体学2重轴相关的二聚体通过晶体学3重轴联系起来。

图3显示了SAT亚基的三维结构。SAT亚基由两个结构域形成。N末端结构域含有许多α-螺旋。SAT六聚物中N末端结构域螺旋彼此紧密相互作用，并在六聚物的稳定中起重要作用。C末端结构域的结构是左手平行β螺旋结构域(LβH)。LβH结构折叠成大卷曲棱柱，似乎卷为围绕棱柱表面的左手螺旋。LβH结构的面由三个平面平行β-折叠形成。在SAT六聚物结构中，相邻LβH构造域之间有大的裂口，所述裂口通过晶体学3重轴联系起来。负责对反馈抑制脱敏的许多残基(Takagi，H.等人(1999)FEBS Lett.452，323-327)广泛分布在这个裂口中。因此，这个裂口可能是反馈抑制的必需区域。含有残基89-96的区域也存在于这个裂口中，且因此被选为用于进行诱变。

实施例2：获得具有含随机化残基89-96的区域的SATs突变体

<1>随机化片段-定点诱变

首先，获得两个质粒pMW-P_ompC和pMW-P_nlpD.

质粒pMW-P_ompC是通过将含有ompC基因启动子区域的0.3kb DNA片段克隆到质粒pMW118的PaeI-SalI位点获得的。含有ompC启动子的DNA片段是使用引物P4(SEQ ID NO：21)和P6(SEQ ID NO：22)，和使用来自大肠杆菌菌株MG1655的染色体DNA作为模板通过PCR获得的。ompC启动子区域用作引物4的杂交靶。任意序列可以代替ompC启动子，只要引物P4被设计用来与该序列杂交.

质粒pMW-P_nlpD是通过将含nlpD基因启动子区域的0.3kb DNA片段克隆到质粒pMW118的PaeI-SalI位点获得的。含有nlpD启动子的DNA片段是使用引物P5(SEQ ID NO：23)和P7(SEQ ID NO：24)，和使用来自大肠杆菌菌株MG1655的染色体DNA作为模板通过PCR获得的.nlpD启动子区域不与上述引物杂交。任意序列可以代替刀lpD启动子，只要引物P4不与该序列杂交。

完整野生型cysE基因是用引物P1(SEQ ID NO：25)和P2(SEQ IDNO：26)，并使用来自大肠杆菌菌株MG1655的染色体DNA作为模板通过PCR获得的。将获得的DNA片段(0.83kb)克隆到质粒pMW-P_ompC和pMW-P_nlpD的SalI-XbaI位点，分别产生质粒pMW-P_ompC-cysE和pMW-P_nlpD-cysE。

用于PCR扩增的Pyrobest^TM DNA聚合酶从Takara Shuzo Co.(日本)获得，并在供应商推荐的条件下使用。

为构建具有随机化285至291位的cysE基因突变体库，首先，通过PCR扩增编码SAT第1位至102位氨基酸残基的序列的cysE基因片段.进行PCR，其中使用质粒pMW-P_ompC-cysE作为模板，和含有6个随机化核苷酸的引物P3(SEQ ID NO：27)和与ompC基因启动子区域序列同源的引物P4(SEQ ID NO：21)(参见图1)。引物P3固定的19-核苷酸3’末端序列与cysE基因Asp-96密码子下游序列同源，而固定的20-核苷酸5’末端与cysE基因Val-95上游序列同源。同样，引物P3含有SEQ ID NO：27中以字母“n”描述的6个随机核苷酸。向含有两种引物的每一种(10pmol)的PCR溶液(50μl)中添加20ng质粒pMW-P_ompC-cysE作为模板。用2400型DNA热循环仪(Perkin-ElmerCo.，Foster City，California，美国)进行25个PCR循环(96℃ 0.4分钟、60℃ 0.4分钟、72℃ 1分钟)。PCR 25个循环过程中获得0.3kbDNA片段。

第二步，通过琼脂糖凝胶电泳纯化在前面步骤获得的0.3kbp DNA片段并将其用作引物延伸步骤中的“引物”，以通过10个循环的扩增(96℃ 1分钟、40℃ 1分钟、72℃ 0.5分钟)得到cysE基因的全部序列。将质粒pMW-P_nlpD-cysE用作模板以防止在PCR第三步中野生型cysE基因的扩增。

第三步，向含有50pmol与ompC基因启动子区域序列同源的引物P4(SEQ ID NO：21)(参见图4)和引物P2(SEQ ID NO：26)的新鲜反应混合物(40μl)中添加10μl等分试样反应混合物，并进行另外15个循环(94℃0.5分钟、57℃0.5分钟、72℃2分钟)。

通过琼脂糖凝胶电泳纯化编码cysE基因突变体库的0.83kbpDNA片段，用SalI和XbaI消化，然后与用相同限制性内切酶消化的pMW-PompC载体连接.

将所得大约100ng pMW-P_ompC-cysE(随机)用于大肠杆菌受体细胞的转化。

<2>新cysE基因突变体的分离

将大肠杆菌菌株LE392 cysE：：Km^R用作受体菌株进行进一步实验。该菌株是由大肠杆菌菌株LE392(J.Sambrook等人，MolecularCloning，1989)通过破坏cysE基因获得的。使用菌株JC7623通过引入卡那霉素抗性基因进行cysE基因的破坏，如Kushner，S.R.，H.Nagaishi和A.J.Clark.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1972，69：1366-1370)所述。

用质粒pMW-P_ompC-cysE(随机)库转化大肠杆菌受体菌株LE392cysE：：Km^R.在补充0.5％葡萄糖和50mg/l甲硫氨酸的M9琼脂平板上，通过大肠杆菌菌株LE392 cysE：：Km^R中染色体cysE突变的互补选择编码有活性SAT的cysE基因突变体。

测试所有获得的克隆供应半胱氨酸营养缺陷体的能力，并选中大约15个变体。纯化来自这些克隆的质粒并用双脱氧链终止法测定cysE基因结构部分的DNA序列。为测定SAT活性，用这些质粒再转化半胱氨酸营养缺陷体、菌株LE392 cysE：：Km^R。

通过标准定点诱变技术获得第767位具有单个碱基改变的cysE基因突变体(cysE256)，从而导致用异亮氨酸取代甲硫氨酸256(DenkD.和Bock A.，J.Gen.Microbiol.，1987，133(Pt 3)，515-25)。

实施例3：氨基酸置换对SAT催化性能的影响

用Kredich，N.M.和Tomkins，G.M.(J.Biol.Chem.，1966，241，21，4955-4965)描述的方法测定SATs突变体的催化性能，该方法做了轻微改动。使用的乙酰辅酶A和其它化学试剂来自Sigma ChemicalCo.(St.Louis，MO，美国)。

为测定SAT突变体的活性，将携带重组质粒的大肠杆菌细胞LE392 cysE：：Km^R在5ml M9培养基中生长直至指数生长期晚期，用0.14M NaCl溶液洗涤，并重悬于2ml缓冲液(pH7.5、50mM磷酸钾和100mM KCl)中。超声处理细胞并以13000rpm离心分离沉淀。用5倍体积饱和(NH₄)₂SO₄沉淀所得上清液中含有SAT的蛋白级分，并将沉淀溶于2ml缓冲液(pH7.5、50mM磷酸钾和100mM KCl)中。将获得的溶液添加至0.1ml反应混合物(500mM Tris-HCl(pH 8.5)、5mM L-丝氨酸、0.1mM乙酰辅酶A)并在37℃温育10分钟。通过添加0.3ml乙醇终止反应，随后以13000rpm离心。将0.95ml 0.24mM DTNB(5，5-二硫代-双-2-硝基苯甲酸盐)溶液添加至上清液中，并将混合物温育15分钟。通过测量412nm的吸光度来测定SAT活性。表2和图5提供了获得的数据。

表2

质粒上的比活性，在25μM半胱 50％抑制(I50)cysE基因相对单位氨酸存在下残留的半胱氨酸浓度，的活性，％μM
质粒上的比活性，在25μM半胱 50％抑制(I50)cysE基因相对单位氨酸存在下残留的半胱氨酸浓度，的活性，％μM	野生型cysE 2300 0 5cysE256 1400 88 120cysE5 900 100 >700cysE12 600 95 >700cysE15 480 100 >700cysE1 400 93 >700cysE102 650 85 130cysE142 2600 38 15

如从表2和图5提供的数据可见的，获得的编码SAT突变体的cysE基因突变体，尤其是cysE5、cysE12、cysE15和cysE1，显示对L-半胱氨酸产生的反馈抑制没有敏感性。对L-半胱氨酸产生的反馈抑制完全抗性的这种SATs突变体可用于使用产生L-半胱氨酸的细菌制备L-半胱氨酸.

实施例4：cysE基因突变体表达提高对L-半胱氨酸生产的影响

将大肠杆菌菌株MG1655(ATCC47076、ATCC700926)用作评估cysE基因突变体表达提高的L-半胱氨酸生产影响评估的亲本菌株。

将质粒pMW-P_ompC-cysEX(含有编码SAT突变体的cysEX基因突变体，其中Thr167被Ala取代，它在美国专利6,218,168中描述)和pMW-P_ompC-cysE5导入大肠杆菌菌株MG1655。所产生的菌株MG1655/pMW-P_ompC-cysEX和MG1655/pMW-P_ompC-cysE5在补充100mg/l氨苄青霉素的2ml营养物液体培养基中于34℃振荡培养过夜。将0.2ml获得的培养物接种到20 x 200mm试管中的含氨苄青霉素(100mg/l)的2ml发酵培养基中，并用旋转式摇瓶机以250rpm于34℃培养42小时。发酵培养基的组成如下：15.0g/l(NH₄)₂SO₄、1.5g/lKH₂PO₄、1.0g/l MgSO₄、20.0g/l CaCO₃、0.1mg/l硫胺素、1％ LB、4％葡萄糖、300mg/l L-甲硫氨酸和0.5g/l Na₂S₂O₃.

培养后，用Gaitonde，M.K.(Biochem.J.，104：2，627-33(1967))描述的方法测定培养基中累积的L-半胱氨酸的量。表3提供了获得的数据。

表3

菌株	L-半胱氨酸的量，g/l
菌株	L-半胱氨酸的量，g/l	MG1655/pMW-P<sub>ompC</sub>-cysEXMG1655/pMW-P<sub>ompC</sub>-cysE5	0.270.37

如从表3可以看出的，大肠杆菌菌株MG1655中cysE5基因突变体的超表达提高了该菌株的半胱氨酸生产能力。

工业实用性

根据本发明，提供了对L-半胱氨酸产生的反馈抑制脱敏的丝氨酸乙酰转移酶突变体.另外，根据本发明，可以增加属于埃希氏菌属的细菌的L-半胱氨酸生产能力。

序列表

<110>Ajinomoto Co.，Inc.

<120>丝氨酸乙酰转移酶突变体和生产L-半胱氨酸的方法

<130>C1770PC4094

<150>RU2003121601

<151>2003-07-16

<150>RU2003135291

<151>2003-12-05

<160>27

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>822

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(822)

<400>1

<210>2

<211>273

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>2

<210>3

<211>8

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>3

<210>4

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：SAT的随机化区域

<400>4

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：SAT的随机化区域

<400>5

<210>6

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：SAT的随机化区域

<400>6

<210>7

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：SAT的随机化区域

<400>7

<210>8

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：SAT的随机化区域

<400>8

<210>9

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：SAT的随机化区域

<400>9

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：cysE基因的随机化区域

<400>10

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：cysE基因的随机化区域

<400>11

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：cysE基因的随机化区域

<400>12

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：cysE基因的随机化区域

<400>13

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：cysE基因的随机化区域

<400>14

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：cysE基因的随机化区域

<400>15

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：cysE基因的随机化区域

<400>16

<210>17

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>17

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

<400>18

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>19

<210>20

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>20

<210>21

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>21

<210>22

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>22

<210>23

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>23

<210>24

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>24

<210>25

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>25

<210>26

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>26

<210>27

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：具有随机化区域的引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(26)

<223>n＝随机化的核苷酸

<400>27

Claims

1.一种由下述的氨基酸序列组成的丝氨酸乙酰转移酶突变体：

SEQ ID NO.2，其中相当于第89至96位的氨基酸序列含有一个或几个突变，所述一个或几个突变导致所述丝氨酸乙酰转移酶突变体对L-半胱氨酸产生的反馈抑制脱敏。

2.根据权利要求1的丝氨酸乙酰转移酶突变体，其中相当于第89至96位的氨基酸序列被选自SEQ ID NO：4、5、6、7、8和9的氨基酸序列取代。

3.编码权利要求1-2中任一项的丝氨酸乙酰转移酶突变体的DNA。

4.一种属于埃希氏菌属的细菌，所述细菌用权利要求3的DNA转化，并且其中所述细菌具有产生L-半胱氨酸的能力。

5.一种生产L-半胱氨酸的方法，其包括在培养基中培养权利要求4的细菌，并从该培养基中收集L-半胱氨酸。