CN1180082C - 新的突变型n-乙酰谷氨酸合酶和l-精氨酸生产方法 - Google Patents

新的突变型n-乙酰谷氨酸合酶和l-精氨酸生产方法 Download PDF

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Abstract

利用带有突变型N-乙酰谷氨酸合酶的大肠杆菌属细菌生产L-精氨酸，其中野生型N-乙酰谷氨酸合酶第15-19位的氨基酸序列被SEQ IDNOS：1-4之任一的氨基酸序列替换，且L-精氨酸的反馈抑制被脱敏。

Description

新的突变型N-乙酰谷氨酸合酶 和L-精氨酸生产方法
本发明涉及到微生物工业，涉及到精氨酸的生产方法，还涉及到将新型抗反馈的突变酶应用到大肠杆菌的精氨酸生物合成途径中。
在大肠杆菌中，精氨酸生物合成是经由一系列反应来完成的，最开始的反应是基因argA编码的N-乙酰谷氨酸合酶(NAGS)催化谷氨酸的乙酰化作用。大肠杆菌是通过arg调控元的转录阻遏以及精氨酸反馈抑制NAGS来调控精氨酸合成过程的[Cunin R.，et al.，Microbiol.Rev.，vol.50，p.314-352，1986]。在大肠杆菌中，L-精氨酸不仅能够以250倍以上的比率抑制argA基因的表达，而且能抑制NAGS的酶活性(Ki＝0.02mM)[Leisinger T.，Haas.，J.Biol.Chem.，Vol.250，p.1690-1693，1975]。为了增强精氨酸在大肠杆菌中的生物合成，有必要获得抗反馈(可称之为‘fbr’)的NAGS酶。
通过自发、化学或定点突变的方式都能获得fbr酶突变体。
有些argA fbr突变体已被分离、研究。携带染色体fbr argA基因突变的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)不稳定，产生的突变型argA要么酶活性低，要么对谷氨酸的亲和性发生了变化[Takagi T.，et al.，J.Biochem.Vol.99，p.357-364，1986]。
从5个携带fbr NAGS的大肠杆菌菌株中克隆了fbr argA基因，发现在每个菌株的argA基因上都存在不同的单碱基替代，研究表明碱基替换使得，如His-15变为Tyr，Tyr-19变为Cys，Ser-54变为Asn，Arg-58变为His，Gly-287变为Ser，Gln变为Arg[Rajagopal B.S.et al.，Appl.Environ.Microbiol.，1998，Vol.64，No.5，p.1805-1811]。
一般地，酶的fbr表型是由于蛋白质序列中一个或几个位点的氨基酸替换引起的，通常这些氨基酸的替代会导致酶活性的降低。例如，在大肠杆菌中，用其它19种氨基酸残基替代丝氨酸乙酰转移酶(SAT)(cysE基因)Met-256，绝大多数产生fbr表型，但突变型SAT酶未能恢复到天然SAT的活性水平(Nakamori S.et al.，AEM，64(5)：1607-11，1998)。
所以，通过上述方法获得突变型酶与野生型酶相比，缺点是降低了酶活性。
本发明的目的是提供既抗反馈又具有高活性的突变型酶，该酶在大肠杆菌合成精氨酸的过程中起重要作用。
在本发明中，提出了利用完全随机化argA基因片段来合成一大套argA基因的新方法。在已具有fbr突变型的蛋白质片段中同时替换一些氨基酸残基，这样由于较多的修改恢复了酶的三维结构就有可能产生接近于野生型酶的活性。因此，完成了下述的本发明。
本发明提供了：
(1)突变型N-乙酰谷氨酸合酶，其中野生型N-乙酰谷氨酸合酶第15-19位的氨基酸序列被SEQ ID NOS：1-4之任一的氨基酸序列所替换，使得L-精氨酸的反馈抑制作用脱敏；
(2)(1)的突变型N-乙酰谷氨酸合酶，其中野生型N-乙酰谷氨酸合酶指的是大肠杆菌中的N-乙酰谷氨酸合酶。
(3)(1)的突变型N-乙酰谷氨酸合酶包括，在第15-19个氨基酸残基之外的一个或多个位点上缺失、替换、插入或增加一个或几个氨基酸，使得L-精氨酸的反馈抑制作用脱敏感；
(4)一种编码(1)-(3)中任一项的突变型N-乙酰谷氨酸合酶的DNA；
(5)一种用(4)的DNA转化的且能产生L-精氨酸的大肠杆菌属菌株；
(6)一种生产L-精氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养(5)的菌株并在培养基中产生和积累L-精氨酸以及从培养基中收集L-精氨酸的步骤。
具有上述任何fbr突变型的NAGS可称为‘突变型NAGS’，编码突变型NAGS的DNA称为‘突变型argA基因’，没有突变的NAGS称作‘野生型NAGS’。
发明详述：
<1>突变型NAGS和突变型argA基因
突变型NAGS和突变型argA基因都是通过随机片段定向突变方法获得。为了在argA基因中获得大量的突变，编码蛋白质第15-19位氨基酸残基的argA基因的15nt片段被完全随机合成。完全随机合成的15nt片段可产生415或近105种不同的DNA序列，能够编码205种氨基酸残基序列不同的5-肽，在阅读框内不引入终止密码子的可能性约为0.955或78％，所以，编码NAGS第15-19氨基酸残基的完全随机的argA基因片段必能产生约250万种不同的蛋白质序列。随后筛选带有突变型argA基因的重组克隆，并将其克隆到表达载体上，进而选择与受反馈抑制的野生型NAGS活性相比具有不同程度生物学活性的突变型NAGSfbr变异株。在筛选时，本发明者考虑到带有突变型argA基因的菌株可通过应用argD-、proB-或proA-菌株获得，因为这种菌株由于NAGS的抑制作用不能产生L-脯氨酸，因此，如果培养基中存在过量的L-精氨酸，它就不能生长；但是带有fbr NAGS的菌株能够在极限培养基上生长，因为乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE产物)能够从N-乙酰谷氨酸-半醛(一种L-精氨酸前体)中提供一种L-脯氨酸的前体，即谷氨酸-半醛[Eckhardt T.，Leisinger T.，Mol.Gen.Genet.，Vol.138，p225-232，1975]。可是本发明者发现利用上述以及之后的例子中提及的方法难以获得高活性的fbr NAGS，通过将突变型argA导入野生型菌株再筛选生长滞后的菌株能够获得高活性fbr NAGS。
本发明已说明了具有fbr表型的突变型NAGS的氨基酸序列，因此，本发明者能以序列为基础，利用一般的方法将突变导入到野生型argA从而获得突变型NAGS。在本发明中提及的大肠杆菌argA基因即野生型argA，其GenBank登录号为Y00492。
本发明的突变型NAGS氨基酸序列的第15-19位残基是SEQ IDNOS：1-4中的任何一个。已知的突变型NAGS和大肠杆菌野生型NAGS的相应氨基酸序列见SEQ ID NOS：5-6，在已知的突变型NAGS的相应氨基酸序列中，Cys替换了大肠杆菌野生型NAGS的Tyr-19。编码这些氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ ID NOS：7-12。(表1列出了这些序列)。
                                     表1
     氨基酸序列    SEQ ID NOS：     核苷酸序列   SEQ ID NOS：
 Val Val Trp Arg Ala     1   GTAGTATGGCGGGCA     7
 Leu Phe Gly Leu His     2   TTGTTCGGATTGCAC     8
 Ser Arg Arg Ser Arg     3   TCGCGGCGGTCCAGA     9
 Gly Trp Pro Cys Val     4   GGGTGGCCATGCGTG     10
 His Ser Val Pro Cys     5   CATTCGGTTCCCTGT     11
 His Ser Val Pro Tyr     6   CATTCGGTTCCCTAT     12
突变型NAGS可能包括在第15-19位氨基酸残基之外的一个和多个位置缺失、替换、插入或增加一个或几个氨基酸，只要NAGS活性，即催化L-谷氨酸的乙酰化生成N-乙酰谷氨酸的活性，不受到损坏。
在蛋白质三维结构中氨基酸残基的类型或位置决定了‘几个’氨基酸数的差异。正是由于下列理由，即一部分氨基酸彼此高度同源，这类氨基酸之间的差异对蛋白质的三维结构影响不大。因此，本发明中的突变型NAGS可能是这样的，组成NAGS的全部氨基酸残基之间的同源性不低于30-50％，优选50-70％，而且具有fbr NAGS活性。
在本发明中，第15-19位氨基酸残基的序列指的是对应于大肠杆菌野生型NAGS的氨基酸序列的第15-19位氨基酸残基的序列。氨基酸残基的位置也有可能发生变化。例如，如果一个氨基酸残基插入到蛋白质的N-端序列中，则本来位于第15位的氨基酸残基就变成第16位了。但是在本发明中，如此的情况下，对应于原来第15位的氨基酸残基仍然指定为第15位。
通过改变核苷酸序列有可能获得编码的蛋白质与上述突变型NAGS基本上相同的DNA，例如通过定点突变方法改变核苷酸序列以致于特异性位点上的一个或多个氨基酸发生缺失、替换、插入或添加。上述变异的DNA也可以通过传统的突变处理方法获得。突变处理包括体外用羟胺处理含有突变型argA基因的DNA方法，还包括用紫外线照射或诱变剂[如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸]处理微生物体，如一种带有突变型argA基因的大肠杆菌属细菌。
上述的核苷酸替换、缺失、插入或增加也包括自然条件下发生的突变，例如：携带NAGS的细菌在个体或种、属之间的差异。
通过在适合的细胞中表达带有如上所述的突变DNA并分析其表达产物的NAGS活性，可以获得基本上与突变型argA基因编码相同的DNA。
利用已知的argA基因序列或探针在严紧条件下杂交，从带有突变型NAGS的细胞中分离编码的蛋白具有NAGS活性的DNA，也可以获得编码的蛋白质与突变型NAGS基本上相同的DNA。
此处‘严紧条件’指的是形成所谓的特异性杂交，而非特异性杂交不能形成的条件。这种条件用具体的数值难以清楚地表述。例如：严紧条件包括高度同源，例如彼此同源性不低于50％的DNAs可以杂交，而低于上述同源性的DNAs则不能杂交的条件。可以举个严紧条件的例子，在与Southern杂交洗涤的一般条件相对应的一种盐浓度下DNA可以彼此杂交的条件，也就是说，一般是60℃，则优选65℃；一般1×SSC，0.1％SDS，则优选0.1×SSC，0.1％SDS。
在上述条件下可以杂交的基因既包括那些在基因编码区含终止密码子的基因，也包括那些由于活性中心发生突变而失去活性的基因。但上述不利因素很容易通过将基因连接到表达载体上，分析其NAGS活性而排除。
<2>本发明的大肠杆菌属细菌
本发明中的细菌是一种大肠杆菌属细菌，上述的突变型argA基因就是导入这种细菌的。利用由载体和突变型argA基因构建的重组DNA转化本发明中所指的细菌从而导入突变型argA基因。也可以通过利用突变型argA基因替换染色体上argA基因的方式导入突变型argA基因。
用于导入突变型argA基因的载体有：质粒载体如pBR322、pMW118、pUC19等，噬菌体载体如l1059、lBF101、M13mp9等，转座子如Mu、Tn10、Tn5等。
将DNA导入一种大肠杆菌属细菌可以采用D.A.Morrison的方法[Methods in Enzymology，68，326，(1979)]或者采用氯化钙处理受体菌以增加其对DNA通透性[Mandel，M.，and Niga，A.，J.Mol.Biol.，53，159，(1970)]等方法。
如果突变型argA基因导入产生L-精氨酸的上述大肠杆菌属菌株，就可能提高L-精氨酸的产量。此外，产生L-精氨酸的能力也可能会对导入突变型argA基因的细菌造成危害。大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)被用作生产L-精氨酸菌株。该菌株自2000年4月10日起一直保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National collectionof Industrial microorganisms)(VKPM)，保藏号为VKPM B-7925，按照布达佩斯条约，2001年5月18日被转移到国际保藏库。
<3>精氨酸生产方法
将突变型argA基因导入产生L-精氨酸的细菌后，经培养能够高效地产生L-精氨酸，产生的L-精氨酸在培养基中积累，然后再从培养基里收集L-精氨酸。
在本发明的方法中，细菌的培养、收集和纯化L-精氨酸采用的方法与细菌发酵生产L-精氨酸的传统方法相似。培养基既可用合成的培养基也可用天然的培养基，只要培养基中含有碳源、氮源、矿质，如果有必要的话，还可以加一些促进细菌适度生长必需的物质。根据所用细菌的同化能力，碳源包括多种糖类如葡糖、蔗糖，也可以是多种有机酸。也可以用醇类如乙醇和甘油作为碳源。氨、硫酸铵等多种氨盐以及其他含氮化合物如胺等均可作为氮源，天然氮源如蛋白胨、大豆水解物以及消化的发酵微生物等。矿质包括磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。细菌培养优选在振荡、通气、搅拌等有氧条件下培养。培养温度通常20-40℃，优选30-38℃。培养的pH值一般为5-9之间，优选在6.5-7.2之间，pH值可用氨、碳酸钙、多种酸或碱以及缓冲液来调整。通常，培养1-3天，即有L-精氨酸在培养基中积累。
细菌培养后，先离心或过滤将细胞等固体物质从培养基中除去，然后采用离子交换、浓缩、晶体片段等方法收集纯化L-精氨酸。
附图简述
图1.突变型argA基因库构建
本发明实现的最佳方式
参照下述实施例案具体解释本发明。
                             实施例1
<1>随机化片段定向突变
染色体经BamHI-SalI酶切，获得带有wt argA基因的DNA片段(2.02kb)，然后将其克隆到质粒pUC19中(即获得质粒pUC19-ArgA)，用于PCR扩增的PyrobestTM DNA聚合酶购自TAKARA Shuzo公司(日本)，并在商家推荐地条件下使用。
为了构建突变型argA基因库，首先扩增了argA基因编码NAGS第20位直至末端氨基酸残基的部分片段(图1)，其中质粒pUC19-ArgA充当扩增的模板，有义链引物P1序列为：5’-CGAGGGATTCCGCNNNNNNNNNNNNNNNATCAATACCCACCGGG-3’(SEQ ID NO：13)，这个引物是根据argA的核苷酸序列设计的；而标准的M13反向序列引物用作反义链引物P2。引物P1的3’端固定化的(fixed)16nt序列与argA基因Tyr-19密码子下游序列同源，而5’端固定化的13nt序列和His-15密码子上游序列同源。通过20次PCR循环，利用引物P1的3’端与argA序列同源部分合成1.75kbp的DNA片段。
50μl的PCR反应体系中包括100ng的模板pUC19-ArgA，2条引物均为40pmol。反应条件为：94℃下0.6min，55℃下0.5min，72℃下2min，共20次循环。反应在Model 2400 DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司，Foster City，Calif.)上完成。
扩增反应的第二步是完成下面反应，即94℃下1min，37℃下1min，72℃下0.5min，循环8次。在这一步反应中，此片段的(-)链充当引物并延伸获得完整的基因序列。
第三步取上述反应混合液10μl，加到40μl新的反应混合液中，其中含100pmol有义链引物P3，其序列与argA基因的5’-端序列同源，为5’-TGCCATGGTAAAGGAACGTAAAACC-3’(SEQ ID NO：14)，此处引物P2作为反义链引物。然后再进行10次循环反应(94℃下0.5min，52℃下0.5min，72℃下2min)。
扩增获得的DNA片段长1.78kb，包含了全长argA基因的突变库。经琼脂糖凝胶电泳纯化后，再用限制性内切酶NcoI(酶切位点包含了argA基因的起始密码子ATG)和HindIII消化后，连接到经NcoI和HindIII消化的pKK233-1载体(Pharmacia公司)上。
用150ng连接好的DNA转化受体大肠杆菌，在之后的实验中，每种情况下可得到约2000个重组克隆。
<2>新型argA突变体的分离及氨基酸替换对NAGS催化特性的影响质粒载体pKK233-2(Pharmacia公司)用于克隆和表达突变型argA基因。受体大肠杆菌菌株是TG1(supE hsdΔ5 thiΔ(lac-proAB)F1’[traD36 proAB+lacIq lac2ΔM15])(J.Sambrook et al.，MolecularCloning，1989)。筛选含有重组质粒pKK-argA突变型的TG1是在LB平板上完成的。有些重组克隆生长滞后，这种效应可能与产生活性fbrNAGS突变型的酶有关。部分克隆的质粒被提纯并通过双脱氧链终止法测定了突变型argA基因的5’端DNA片段的序列(表2)。
为了确定NAGS的活性，本发明者用上述质粒转化了精氨酸营养缺陷型大肠杆菌菌株B3083(argA-，MetB-)。超声波破碎重组细胞并用硫酸铵沉淀法纯化了上述酶，然后按下述方法进行分析。携带质粒pKK-argA-r11(3390nmol/min×mg)、pKK-argA-r12(1220nmol/min×mg)以及pKK-argA-r13(3120nmol/min×mg)的菌株的NAGS酶活性要比携带质粒pKK-argA-r4(300nmol/min×mg)的菌株酶活性高得多。最后一个质粒携带的突变型argA基因和Rajagopal等所描述的最具活性的突变型argA基因一样具有单一替换(Y19C)(RajagpalB.S.et al.，Appl.Environ.Microbiol.，1998，v.64，No.5，p.1805-1811)。
携带质粒pKK-argA(wt)(野生型argA基因)的菌株NAGS酶活性也比带pKK-argA-r11、-r12、-r13情况下低。在10mM精氨酸条件下，突变型酶的活性几乎是相同的，但野生型酶活性则受到精氨酸明显抑制(低于1/10)。这些结果表明第15-19位氨基酸残基的多肽片段影响了L-精氨酸对NAGS反馈抑制和突变型NAGS催化效率。
(酶活性分析)
乙酰辅酶A和所有化学试剂均购自Sigma公司(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，Mo.)。为了确定NAGS活性，带有重组质粒的大肠杆菌B3083(argA-，MetB-)均在5ml M9培养基中培养至对数生长后期，用0.14M NaCl溶液洗，并悬浮于含100mM KCl的2ml 40mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。用超声波破碎细胞，然后离心。含有NAGS的部分用5体积饱和硫酸铵沉淀，将沉淀悬浮于含100mM KCl和30％(V/V)甘油的2ml 40mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。将获得的NAGS溶液加到0.1ml的反应混合液中(100mM Tris-HCl(pH8.5)，35mMKCl，20mM谷氨酸，1.2mM乙酰辅酶A)，并将反应混合液置于37下温育10min，然后加0.3ml的乙醇终止反应，将反应混合液离心，在上清液中加0.95ml 0.24mM DTNB(5，5-二硫代-二-硝基苯甲酸)溶液，混合物再温育15min，最后在412nm处测定光吸收值分析NAGS活性。
<3>新argA突变型的分离
按照上述步骤，在大肠杆菌B16-4菌株(pro-argD-)中筛选除了突变型argA。从琼脂平板上挑选重组克隆，悬浮于含L-精氨酸的M9培养基中培养生长至静止期。取部分培养物至新鲜培养基中培养，如此重复4次，再取出部分培养物涂布于含有5mg/ml L-精氨酸、100μg氨苄的M9琼脂平板上。提纯部分克隆的质粒，测定突变型argA基因的5’端部分序列，并按上述方法分析了突变型NAGS的活性。60％的突变型含有序列-Gly-Trp-Pro-Cys-Val-(SEQ ID NO：4)，且其酶活性较弱(约10nmol/min×mg)，但都有fbr NAGS活性。很显然，在所用的选择条件下，这种突变型为pro-argD-细胞提供了最适NAGS活性，所以，筛选条件决定了所获得的突变型NAGS的活性。
                   表2.通过随机化的片段定向突变方法获得的NAGS(ArgA)
含重组子的克隆  突变型arg基因变异的序列  NAGS变异的序列(蛋白质第15-19位的a.a.)  NAGS活性nmol/min×mg*  L-精氨酸(10mM)存在时的NAGS活性，％**
PKKArgA-r11  GTAGTATGGCGGGCA  ValValTrpArgAla  3390  103％
PKKArgA-r12  TTGTTCGGATTGCAC  LeuPheGlyLeuHis  1220  100％
PKKArgA-r13  TCGCGGCGGTCCAGA  SerArgArgSerArg  3120  107％
PKKArgA-32-34，36，38，39  GGGTGGCCATGCGTG  GlyTrpProCysVal  10.3  103％
PKKArgA-r4  CATTCGGTTCCCTGT  HisSerValProCys  300  91％
PKKArgA-wt  CATTCGGTTCCCTAT  HisSerValProTyr  1200  ＜10％
*细胞总蛋白；
**100％表示无L-精氨酸时的活性
<4>利用突变型argA基因生产L-精氨酸
用BamHI和SalI消化重组质粒pKKArgA-r4，11，12，13，32，将酶切片段(含突变型argA基因)亚克隆到低拷贝质粒pMW119(Nippon基因公司)，获得的质粒依次称为pMADS4、pMADS11、pMADS12、pMADS13、pMAD32。将上述质粒导入产生L-精氨酸的大肠杆菌237(VPKM B-7925)中。转化子的L-精氨酸(Arg)和瓜氨酸(Cit)产量见表3。大多数转化新突变型NAGS的菌株Arg+Cit产量比受体菌株和转化Tyr19Cys突变型NAGS(pMADS4)的菌株要高。
             表3.L-精氨酸和瓜氨酸的产量
 菌株  Arg(g/l)  Cit(g/l)  Arg+Cit(g/l)
 237  4.7  0  4.7
 237/pMADS4  8.7  0  8.7
 237/pMADS11  10.0  3.0  13.0
 237/pMADS12  7.6  2.6  10.2
 237/pMADS13  9.1  3.7  12.8
 237/pMADS14  8.2  0  8.2
发酵培养条件：
发酵培养基含60g/l葡糖，25g/L硫酸铵，2g/l KH2PO4，1g/lMgSO4，0.1mg/l维生素B1，5g/l Difco酵母提取物，25g/l白垩，1升自来水(pH7.2)。葡糖和白垩分开灭菌，取2ml培养基置于试管，接种后，置于32℃振荡培养3天。
                                    序列表
<110>味之素公司
<120>新的突变N-乙酰谷氨酸合酶及生产精氨酸的方法
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<160>14
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：由随机序列编码的部分氨基酸序列
<400>1
Val Val Trp Arg Ala
  1               5
<210>2
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：由随机序列编码的部分氨基酸序列
<400>2
Leu Phe Gly Leu His
  1               5
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：由随机序列编码的部分氨基酸序列
<400>3
Ser Ala Ala Ser Arg
  1               5
<210>4
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：由随机序列编码的部分氨基酸序列
<400>4
Gly Trp Pro Cys Val
  1               5
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：由随机序列编码的部分氨基酸序列
<400>5
His Ser Val Pro Cys
  1               5
<210>6
<211>5
<212>PRT
<213>大肠埃希氏杆菌
<400>6
His Ser Val Pro Tyr
  1               5
<210>7
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：随机序列
<400>7
gtagtatggc gggca                                                       15
<210>8
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：随机序列
<400>8
ttgttcggat tgcac                                                       15
<210>9
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：随机序列
<400>9
tcggcggcgt ccaga                                                       15
<210>10
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：随机序列
<400>10
gggtggccat gcgtg                                                       15
<210>11
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：随机序列
<400>11
cattcggttc cctgt                                                       15
<210>12
<211>15
<212>DNA
<213>大肠埃希氏杆菌
<400>12
cattcggttc cctat                                                       15
<210>13
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：含随机序列的引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(28)
<223>n＝a或g或c或t
<400>13
cgagggattc cgcnnnnnnn nnnnnnnnat caatacccac cggg                       44
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>14
tgccatggta aaggaacgta aaacc                                            25

Claims (4)

1.一种突变型N-乙酰谷氨酸合酶，其中大肠杆菌的野生型N-乙酰谷氨酸合酶第15-19位的氨基酸序列被SEQ ID NOS：1-4之任一的氨基酸序列所取代，而且精氨酸的反馈抑制被脱敏。
2.一种编码权利要求1的突变型N-乙酰谷氨酸合酶的DNA。
3.一种用权利要求2的DNA转化的且能产生L-精氨酸的大肠杆菌属菌株。
4.一种生产L-精氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求3的菌株以在培养基中产生和积累L-精氨酸以及从培养基中收集L-精氨酸的步骤。
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