CN1071378C

CN1071378C - 发酵生产l-苏氨酸的方法

Info

Publication number: CN1071378C
Application number: CN94102007A
Authority: CN
Inventors: 佐野孝之辅; 儿岛宏之; 尾川由理
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1992-11-10
Filing date: 1994-02-15
Publication date: 2001-09-19
Anticipated expiration: 2014-02-15
Also published as: ES2158867T3; WO1994011517A1; CN1107179A; RU94035744A; EP0643135A4; CZ285453B6; CZ165894A3; RU2113484C1; SK81994A3; ATE203769T1; DK0643135T3; EP0643135B1; DE69330518D1; US5661012A; SK279915B6; DE69330518T2; JP3331472B2; EP0643135A1

Abstract

含有一种基因的DNA，该基因编码来源于埃希氏杆菌的天冬氨酸激酶Ⅲ，并在编码区中有一个解除赖氨酸对天冬氨酸激酶Ⅲ反馈抑制作用的突变；重组DNA，其中上述DNA与能在埃希氏杆菌中自主复制的载体DNA相连；属于埃希氏杆菌属的微生物，该微生物已通过在其细胞中引入上述重组DNA而被转化；利用上述微生物发酵生产L-苏氨酸的方法。

Description

发酵生产L-苏氨酸的方法

本发明涉及微生物工业，描述了一种发酵生产L-苏氨酸的方法。L-苏氨酸是一种必需氨基酸，它作为各种营养混合物的一个组分而用于医药目的。另外，它也用作动物饲料添加剂，用作制药和化学工业中的一种试剂，并作为生长因子用于由微生物来生产诸如赖氨酸和高丝氨酸等氨基酸。

过去，曾用从天然环境中分离出的细菌或该细菌的人工突变株作为发酵生产L-苏氨酸的微生物。许多产L-苏氨酸的人工突变株都是已知的，其中大多数都对α-氨基-β-羟基戊酸有抗性，属于埃希氏杆菌属、沙雷氏菌属、短杆菌属或棒状杆菌属。关于埃希氏杆菌，JPA 55-131397、JPA-59-31691、JPA 56-15696和JPW 3-501682描述了用已被合苏氨酸操纵子的重组质粒转化的细菌生产L-苏氨酸的方法。

另外，在迄今已知的产苏氨酸细菌中，大肠杆菌BK Ⅱ M(VKPM)B-3996株的苏氨酸产量和消耗系数最为优越(JPW3-501682)。本发明中“消耗系数”是指生产1克苏氨酸所需的糖的克数。如果该细菌在实验用发酵罐中培养，并对pH传感器的信号作出响应而在培养基中加入糖-氨，则苏氨酸的最高生物合成量为85克/升，消耗系数为每1克苏氨酸2克糖。

天冬氨酸激酶(以下简写为AK)是一种将天冬氨酸转化成β-磷酸天冬氨酸的酶，它是天冬氨酸及其衍生氨基酸生物合成途径的主要调节部位。如图1所示，大肠杆菌有三种类型的AK(AK Ⅰ、AK Ⅱ、AK Ⅲ)，头两种是具有高丝氨酸脱氢酶(以下有时简写为HD)活性的双功能酶，一种是由thrA基因编码的AKⅠ-HDⅠ，另一种是由MetL(M)基因编码的AK Ⅱ-HD Ⅱ。

只有AK Ⅲ是单功能酶，它是称为lysC的基因的产物，并已知受赖氨酸的阻遏和反馈抑制。另一方面，AK Ⅰ受苏氨酸和异亮氨酸的协同阻遏，并受苏氨酸抑制，而AK Ⅱ则受甲硫氨酸阻遏。其细胞内活性的比例约为AK Ⅰ∶AK Ⅱ∶AKⅢ=5∶1∶4。

已克隆了大肠杆菌的lysC基因，并测定了其碱基顺序(Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.和Patte.J.C.,J.Biol.Chem.,261:1052,1986)。另外Mizukami等人(Mizukami,T．等，Agric.Biol.Chem.,50:1015,1986)描述了用已增强了AK Ⅲ活性的大肠杆菌株来发酵生产L-苏氨酸。然而，尚未充分解除对Mizukami等人所报道的AK Ⅲ的赖氨酸依赖性反馈抑制作用。

因此，本发明的主题是获得充分解除了赖氨酸反馈抑制作用的AK Ⅲ，以及提供一种大大优于先有技术的L-苏氨酸发酵生产方法。

本发明的发明人为克服上述问题而进行了勤奋的研究，结果成功地获得一种编码大肠杆菌中的AK Ⅲ并充分解除了赖氨酸反馈抑制作用的基因(突变lysC或lysC*)，并且发现，把该基因引入产苏氨酸细菌中能使L-苏氨酸有效积累，这样便完成了本发明。

换句话说，本发明涉及合有一种基因的DNA，该基因编码存在于埃希氏杆菌中的天冬氨酸激酶Ⅲ，并在编码区中有一个解除赖氨酸对上述天冬氨酸激酶Ⅲ反馈抑制作用的突变。具体地说，本发明涉及上述DNA，其中解除赖氨酸对天冬氨酸激酶Ⅲ反馈抑制作用的突变位于天冬氨酸激酶Ⅲ的A结构域或B结构域。更具体地说，本发明涉及上述DNA，其中解除赖氨酸对天冬氨酸激酶Ⅲ反馈抑制作用的突变(参照下面的顺序表中的1号顺序)选自：例如，323位Gly被Asp置换的突变；323位Gly被Asp置换，408位Gly被Asp置换的突变；34位Arg被Cys置换，323位Gly被Asp置换的突变；325位Leu被Phe置换的突变；318位Met被Ile置换的突变；318位Met被Ile置换，349位Val被Met置换的突变；345位Ser被Leu置换的突变；347位Val被Met置换的突变；352位Thr被Ile置换的突变；352位Thr被Ile置换，369位Ser被Phe置换的突变；164位Glu被Lys置换的突变；417位Met被Ile置换，419位Cys被Tyr置换的突变。

另外，本发明涉及上述DNA，该DNA是一种与能够在埃希氏杆菌中自主复制的载体DNA相连的重组DNA。此外，本发明涉及一些属于埃希氏杆菌属的微生物，这些微生物已由于将上述重组DNA引入细胞而得以转化。落在本发明范围内的还有由于在其染色体DNA中引入DNA而被转化的微生物，所引入的DNA编码上述得自埃希氏杆菌的天冬氨酸激酶Ⅲ，并含有一种在编码区中带有突变的基因，该突变解除赖氨酸对上述天冬氨酸激酶Ⅲ的反馈抑制。

本发明还涉及一种生产L-苏氨酸的方法，其特征是：在发酵培养基中培养任一种上述微生物，在培养物中产生并积累L-苏氨酸，从培养物中收集L-苏氨酸。

下面给出本发明的详细描述。

作为供给含AK Ⅲ编码基因(lysC)的DNA的供体菌，可以使用属于埃希氏杆菌属的任何微生物，具体地说是那些在Neidhardt的文章中提到的微生物(Neidhardt,F.C.等人，“大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌”，美国微生物学会，Washington,D.C.,1208，表1)，其实例包括大肠杆菌JM109株和MC1016株。

如果使用野生菌株作为供体菌来供给含AKⅢ编码基因(lysC)的DNA，则可得到合野生型AK Ⅲ基因的DNA。为在该基因内引入突变以得到解除了L-赖氨酸反馈抑制作用的AKⅢ基因(lysC*)，可以通过直接用羟胺处理来实现DNA的体外突变。羟胺是一种化学诱变剂，它通过将胞嘧啶转化为N⁴-羟基胞嘧啶而诱导C→T突变。

此外，使用解除了L-赖氨酸对AK Ⅲ活性反馈抑制作用的突变株作为DNA供体株，可以得到其中所合的AK Ⅲ基因解除了L-赖氨酸反馈抑制作用的DNA。这种突变株可以如下获得：对细胞用常规方法进行诱变处理、紫外线照射或用诱变剂(如N-甲基-N＇-硝基-N-亚硝基胍)处理。

现在对含AK Ⅲ编码基因(lysC)的DNA的制备进行叙述。先培养带有野生型lysC的大肠杆菌，例如MC1061株，得到培养细胞。上述微生物的培养可以用常规固体培养方法进行，但是从细胞收集的观点看优选用液体培养方法进行培养。另外，培养基可以是用下列方法制备的培养基：例如，在一种或更多种氮源中加入一种或更多种无机盐，必要时再加入碳水化合物、维生素等。无机盐的例子有：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、硫酸镁、氯化钠、氯化镁、氯化铁、硫酸铁、或硫酸锰。氮源的例子有：酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏、玉米浸液、或大豆或小麦的渗出液。培养基的初始pH大致调到7-8。培养用深层通气搅拌培养法、振荡培养法、静止培养法等，在30-42℃下(优选约37℃)进行4-24小时。对以这种方式获得的培养产物进行离心分离，例如以3,000rpm离心5分钟，得到大肠杆菌MC1061株的细胞。

可以由这些细胞制得染色体DNA，例如用Saito和Miura的方法(Biochem.Biophys.Acta.72:619,1963)、K.S.Kirby的方法(Biochem.J.64:405,1956)等。

为分离lysC基因，用适当的限制酶切割用上述方法制得的染色体DNA。如果通过控制切割反应时间等条件来控制切割程度，则可使用多种限制酶。接着，可使该基因与能够在埃希氏杆菌中复制的载体DNA相连，所得的重组DNA可用于转化埃希氏杆菌的突变株，例如缺乏天冬氨酸激酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的GT3(以建立基因文库)，并可以从所得的转化株中分离出已能够在不含赖氨酸的基本培养基上生长的菌株，从而分离出含lysC基因的重组DNA。

具体地说，在30℃或更高的温度下(优选37℃)，在1-10单位/ml的酶浓度下，用限制酶(如Sau3A Ⅰ)消化染色体DNA不同的时间(1分钟至2小时)，以达到完全消化或部分消化，得到含有各种染色体DNA片段的混合物。在30℃或更高的温度下，在1-100单位/ml的酶浓度下，用限制酶(如BamHⅠ)消化能够在埃希氏杆菌中复制的载体DNA 1小时或更长的时间，优选1-3小时，以使其达到完全消化，得到经过切割的DNA。该限制酶所产生的末端碱基顺序与切割染色体DNA时所用的限制酶Sau3A所产生的顺序相同。接着，使含有得自大肠杆菌MC1061并包含以上述方式制备的lysC基因的DNA片段的混合物，与经过切割的载体DNA混合，并在4-16℃的温度下，在1-100单位/ml的酶浓度下，使DNA连接酶(优选T4 DNA连接酶)作用于上述混合物1小时或更长的时间，优选6-24小时，得到重组DNA。

按本发明使用的载体DNA优选为质粒载体DNA，例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等。此外还可以使用噬菌体DNA载体。可在微生物中发挥作用的启动子，例如lac、trp、PL等，可用于高效表达用于所需目的的基因。本文所用的术语“重组DNA”，包括由上述基因掺入染色体而得到的DNA，掺入的方法利用了转座子(Berg,D.E．和Berg,C.M.,Bio/Technol.,1:417,1983)、μ噬菌体(日本特开平2-109985)或同源重组(Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Lab.,1972)。

用该重组DNA转化(例如)大肠杆菌K-12株，优选GT3株等，然后由具有较高水平AK活性的菌株，或者由已补足了营养需要的菌株，得到带有含lysC基因的重组DNA的菌株。这一转化可以按D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology,68:326,1979)或用氯化钙处理细胞以提高DNA穿透程度的方法(Mandel,M．和Higa,A.,J.Mol.Biol.,53:159,1970)进行。然后，可以按照(例如)P.Guerry等人的方法(J.Bacteriol.,116:1064,1973)或D.B.Clewell的方法(J.Bacteriol.,110:667,1972)，从上述菌株中分离出重组DNA，这种重组DNA是通过把合有lysC基因的DNA插入到载体DNA中而制得的。

可以确认候选菌株确实具有含lysC的重组DNA，确认方法是：制备细胞提取液，然后由该提取液制备粗制酶溶液供确认天冬氨酸激酶活性。测定天冬氨酸激酶活性的方法可以是Stadtman等人的方法(Stadtman,E.R.,Cohen,G.N.,LeBras,G.和Robichon-Szulmajster,H.,J.Biol.Chem.,236:2033,1961)。

另外，lysC基因也可用下列方法制得：由Saito和Miura的方法制得染色体DNA，利用PCR法(聚合酶链反应，参见White,T.J.等，Trends Genet.5:185,1989)由该染色体DNA扩增lysC基因。用于扩增的DNA引物与含有整个lysC基因区或其片段的双链DNA的3＇端互补。如果只需扩增一部分lysC基因，则必须用DNA片段作引物筛选基因文库中含整个基因区的DNA片段。如果要扩增整个基因区，则可对该DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，然后切下所要的条带回收含lysC基因的DNA片段。

DNA引物可以适当地根据(例如)大肠杆菌的已知顺序来制备(Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N．和Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261:1052,1986)，优选的是两类引物：5＇-CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG-3＇(2号顺序)和5＇-GAATTCCTTTGCGAGCAG-3＇(3号顺序)，这两个引物能够扩增1347个碱基的lysC基因编码区。DNA的合成可以利用Applied Biosystems公司生产的380B型DNA合成仪和亚磷酰胺法(见Tetrahedron Letters,22:1859,1981)，以常规方式进行。PCR反应可以利用Takara Shuzo公司生产的PJ2000型DNA热循环仪和Takara Shuzo公司生产的Taq DNA聚合酶，按照供货商指明的方法进行。

使已用PCR法扩增的lysC基因与能够在埃希氏杆菌中复制的载体DNA相连，并将其引入埃希氏杆菌细胞中。应采用的用载体DNA转化宿主的方法及确认lysC存在的方法，与前已述及的方法相同。

在所得的lysC中诱导突变的方法，例如氨基酸的置换、插入或缺失，可以用重组PCR法(Higuchi,R.,61,in PCR Technology,Erlich,H.A.,Eds.,Stockton Press,1989)、定位诱变法(Kramer,W.和Frits,H.J.,Meth.in Enzymol.,154:350,1987；Kunkel,T.A.等，Meth.in Enzymol.,154:367,1987)等方法进行。利用这些方法可以在所需的位点诱导出所需的突变。另外，对随机突变的引入来说，可以采用用羟胺直接处理染色体DNA或质粒上的目标基因的方法(Hashimoto,T.和Sekiguchi,M.,J.Bacteriol.,159:1039,1984)；用紫外线照射或用化学试剂(如N-甲基-N＇-亚硝基胍、亚硝酸等)处理含目标DNA的细胞的方法；或者化学合成目标基因的方法。

选择解除抑制作用的突变基因lysC*的方法包括：先用突变的重组DNA转化AK缺陷型菌株，如大肠杆菌GT3株。接着，在含有大量赖氨酸的基本培养基(如M9)中培养转化株。带有合野生型lysC的质粒的菌株中，唯一的AK即AKⅢ受到赖氨酸的抑制，因此再也不可能合成苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)，因此其生长受到抑制。相比之下，所带的质粒含有解除赖氨酸抑制作用的lysC*的菌株，应能在合有大量赖氨酸的基本培养基上生长。利用这一现象，可以选择出所需的菌株，也就是说，所带的质粒含有解除抑制作用的lysC*的菌株，即对赖氨酸或S-2-氨基乙基半胱氨酸(AEC，赖氨酸的类似物)有抗性的菌株。

以这种方式得到的上述突变基因，可以用作重组DNA引入适当的微生物(宿主)，并可在其中表达而得到其AK已解除了反馈抑制作用的微生物。

上述野生埃希氏杆菌株可以用作宿主，可以向其中引入所得到的lysC基因或突变lysC基因(lysC*)，然后在其中扩增，以生产苏氨酸，但除此之外也可用任何其他细菌作宿主，条件是：此处构建的重组载体DNA的复制起点和lysC基因或突变lysC基因(lysC*)都能在其中发挥作用；重组载体DNA能够在其中复制；lysC基因或突变lysC基因(lysC*)可以在其中得到增强。最优选的宿主是大肠杆菌B-3996株。

培养以上述方式得到的转化株，在培养液中生产和积累目标L-苏氨酸，然后收集L-苏氨酸。所述转化株所带的重组载体DNA合有编码解除了赖氨酸反馈抑制作用的天冬氨酸激酶Ⅲ的基因。

需用于生产L-苏氨酸的培养基是常规培养基，其中合有碳源、氮源、无机离子，必要时还含有其他有机成分。

需使用的碳源可以是糖(如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖)、水解淀粉、醇类(如甘油或山梨醇)、或有机酸(如富马酸、柠檬酸、琥珀酸等)。

需使用的氮源可以是无机铵盐(如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等)、有机氮(如大豆水解产物)、或氨气、氨水等。

优选加入适量的所需物质作为有机微量营养源，例如维生素B1、L-高丝氨酸等，或酵母提取物。除此之外，必要时加入少量磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。

培养优选在通气条件下进行16-72小时，其间培养温度控制在25℃-45℃，培养物pH控制在5-8。为控制pH，可以使用无机酸或有机酸、碱性物质、或氨气等。发酵液中L-苏氨酸的收集是把常规离子交换树脂法、沉淀法和任何其他公知方法组合起来进行的。

图1是苏氨酸生物合成途径的示意图。

图2是pLYSC1和pLYSC2的限制酶图谱(见实施例1)。

图3是显示引入羟胺诱导的突变对lysC影响的曲线图(见实施例2(2-4))。

图4显示由各种不同lysC*基因编码的天冬氨酸激酶的赖氨酸依赖性抑制的程度(见实施例3(3-4))。横轴的赖氨酸浓度以对数表示。纵轴的比活以比例表示，其中加入0mM赖氨酸时野生型AKⅢ的活性定义为100％。

图5显示构建pLLC*的示意图(见实施例4(4-1))。

图6显示构建pVICLC*A和pVICLC*B的示意图(见实施例4(4-3))。

图7显示每个lysC*的突变点(见实施例5(5-3))。

以下参照实施例更具体地叙述本发明。

实施例1：野生lysC基因的克隆

大肠杆菌lysC基因的碱基顺序已有报道(Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N．和Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261:1052,1986),已知其开放读码(ORF)有1,347个碱基，编码449个氨基酸。因为存在一个与赖氨酸阻遏作用有关的操纵基因，所以将该操纵基因区除去，克隆时用PCR法只扩增含SD顺序和ORF的区域。

制备两种不同的引物：5＇-CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG-3＇(2号顺序)和5＇-GAATTCCTTTGCGAGCAG-3＇(3号顺序)，用Saito和Miura的方法(Biochem.Biophys.Acta.,72:619,1963)回收大肠杆菌K-12 MC1061株的整个基因组DNA。用这两个引物和整个基因组DNA按Erlich等人的方法(PCR Technology,StocktonPress,1989)进行PCR反应，以扩增目标DNA。所得DNA用BamHI和AseⅠ消化，然后制成平末端，再将该DNA插入多拷贝载体pUC18的SmaⅠ位点。这样便得到两种质粒，就lacZ启动子而言，一种为反义质粒(pLYSC1)，一种是有意义质粒(pLYSC2)(见图2)。

用这些质粒转化完全缺乏AKⅠ、AKⅡ、AKⅢ的大肠杆菌GT3株(thrA1016b、metLM1005、lysC1004)，由于GT3的高丝氨酸+二氨基庚二酸需要已补足，证实了该基因是编码活性AKⅢ的lysC。

实施例2：解除抑制的突变基因lysC*的制取

(2-1)：

为有效地制取解除了抑制作用的lysC基因(lysC*)，对实施例1中制备的重组质粒DNA上的基因进行诱变处理。

作为一种制取解除了抑制作用的突变基因lysC*的方法，先掺入野生lysC重组质粒，以便转化到完全缺乏AK的大肠杆菌GT3中。在具有下表1所列组成的M9基本培养基中加入大量的赖氨酸，并在该培养基中培养转化株。所带的质粒合有野生型lysC的菌株，其唯一的AK即AKⅢ受到赖氨酸的抑制，所以再也不可能合成苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)，因此生长受到抑制。

表1:M9基本培养基

A:20×M9 (g/l)

Na₂HPO₄·12H₂O 303

KH₂PO₄ 60

NaCl 10

NH₄Cl 20

B:1 M MgSO₄

C:50％葡萄糖

D:1 g/l硫胺素

将A、B、C、D和水分别灭菌，并以A∶B∶C∶D∶水=5∶0.1∶1∶0.1∶95的比例混合。

相比之下，所带的质粒含有解除赖氨酸抑制作用的lysC*的菌株，预计能够在合有大量赖氨酸的基本培养基中生长。利用这一现象，选择其生长对赖氨酸或S-2-氨基乙基半胱氨酸(AEC，赖氨酸的类似物)有抗性的菌株，即那些所带的质粒含有解除抑制作用的lysC*的菌株。

(2-2)：反馈抑制抗性lysC突变株(lysC*)选择条件的研究

先将pLYSC1和pLYSC2分别掺入大肠杆菌GT3中使其转化，得到两种不同的转化株，在含有赖氨酸或AEC的M9琼脂平板基本培养基上进行培养。另外，测定赖氨酸或AEC的生长抑制浓度，并研究选择lysC*的条件。

如表2所示，很清楚，就pLYSC2而言，表达量被lacZ启动子扩增，因此甚至野生型lysC也对相当高浓度的赖氨酸或AEC有抗性，但是由于pLYSC1的lysC基因就lacZ启动子而言是反义的，而且缺乏该lysC基因本身的启动子，所以表达量不高，在较低浓度的赖氨酸或AEC下生长受到抑制(加入约0.2mM的赖氨酸或AEC使生长完全受到抑制。表中的“+”表示转化株生长，“-”表示不生长)。发现同时加入高丝氨酸和DAP使这种生长抑制作用得到恢复。

表2：带有lysC质粒的完全缺乏AK的GT3株的生长与添加的赖氨酸或赖氨酸类似物AEC之间的关系(a):Lys浓度和生长

	0 0.2 0.4 0.8 1.5 3 6 12 25 50 100 200(mM)
	0 0.2 0.4 0.8 1.5 3 6 12 25 50 100 200(mM)	GT3/pLYSC1GT3/pLYSC2	+ - - - - - - - - - - -+ + + + + + + + + + ± -

(b):AEC浓度和生长

	0 0.2 0.4 0.8 1.5 3 6 12 25 50(mM)
	0 0.2 0.4 0.8 1.5 3 6 12 25 50(mM)	GT3/pLYSC1GT3/pLYSC2	+ - - - - - - - - -+ ± ± ± ± ± - - - -

M9琼脂培养基，37℃下培养2天

+：生长；±：部分生长；-：不生长

于是，用pLYSC1进行突变引入实验，在M9基本培养基中加入10mM赖氨酸或0.2mM AEC制得用于选择lysC*的选择培养基。

(2-3)：诱变处理

羟胺是一种化学诱变剂，它通过将胞嘧啶转化为N⁴-羟基胞嘧啶而诱导C→T突变。为在质粒中引入突变，采用两种方法，一种是直接用羟胺处理质粒的体外诱变处理法，另一种是提供多种突变(即C→T以外的突变)的体内诱变处理法，后一种方法是用亚硝基胍(NTG)处理带有质粒的细胞，再提取质粒。

(2-4)：用羟胺进行体外诱变处理

取一份2μg的DNA，在下表3所示的反应液即0.4M羟胺中，于75℃下处理1-4小时。处理过的DNA用玻璃粉纯化，然后用于转化到完全缺乏AK的GT3株中，将该菌株涂布到完全培养基(L-液体培养基；1％细菌胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％琼脂)上以形成菌落。将所形成的菌落复制到(2-1)得到的选择培养基上。转化株出现的比例和突变比例各不相同，如图3所示。处理4小时时，突变株的产率为0.5-0.8％，这是一个相当高的数值。

表3：反应液组成

0.1M KH₂PO₄-1mM EDTA(pH6.0) 100μl

1M羟胺-1mM EDTA(pH6.0) 80μl

DNA 2μg

水余量

总量 200μl

(2-5)：用亚硝基胍(NTG)进行体内诱变处理

用pLYSC1转化大肠杆菌MC1061，将细胞直接用NTG进行处理。将处理过的细胞培养过夜以使突变固定，然后从细胞中提取质粒用于转化到GT3中，以与(2-4)中相同的方式进行筛选，得到赖氨酸抗性(lys^R)或AEC抗性(AEC^R)突变株。该处理概述于下面的表4。

表4：处理概述

(1)在2×TY培养基(1.6％细菌胰胨、1％酵母提取物、0.5％NaCl)中培养含目标质粒的细胞，然后在660nm处的O.D．约为0.3时收集细胞。

(2)用TM缓冲液洗涤。

(3)悬浮于NTG溶液(TM缓冲液中的0.2mg/ml溶液)中，然后在37℃下处理0-90分钟。

(4)用TM缓冲液和2×TY培养基洗涤，然后在2×TY培养基中培养过夜并固定突变。

(5)从细胞中提取质粒DNA，转化GT3菌株，筛选重组菌株。

TM缓冲液的组成如下：

Tris 50mM

马来酸 50mM

(NH₄)₂SO₄ 1g/l

MgSO₄·7H₂O 0.1g/l

Ca(NO₃)₂ 5mg/l

FeSO₄·7H₂O 0.25mg/l

用NaOH调至pH6.0。

实施例3:lysC*基因的分离

(3-1)：

将实施例2中得到的总共180个候选菌株(其中经羟胺处理的48个菌株，经NTG处理的132个菌株)再次点样到选择培养基上，并确认AEC或赖氨酸抗性的存在，得到153个菌株。根据培养基中氨基酸积累方式的不同，将这153个菌株分成14组，每组选择出一个代表菌株进行AK活性测定。由于用羟胺处理的突变株和用NTG处理的突变株之间没有大的差别，所以后续的实验在这两者之间不加区别。

(3-2)：天冬氨酸激酶活性的测定

用完全缺乏AK的GT3菌株作为宿主，分别用上述的14个突变pLYSC1(称为pLYSC1*系列)和野生pLYSC1质粒转化该宿主，然后从转化株中制备无细胞提取液，测定AKⅢ的酶活性。测定酶活性的方法如下。

(3-3):AKⅢ活性的测定方法

(3-3-1)：制备粗制酶溶液的方法

(1)在2×TY培养基中培养细胞，然后在660nm处O.D．约为0.8时收集细胞。

(2)在0℃下用0.02M KH₂PO₄(pH6.75)-0.03M β-巯基乙醇洗涤。

(3)超声破碎细胞(0℃，100瓦，30秒×4次)。

(4)在0℃下以33krpm离心1小时，然后在上清液中加入硫酸铵至80％饱和。

(5)离心，然后把沉淀溶于(2)的缓冲液中，并于-20℃下保存。

(3-3-2)：测定酶活性的方法

测定酶活性的方法为Stadtman等人的方法(Stadtman,E.R.,Cohen,G.N.,Lebras,G．和Robichon-Szulmajster,H.,J.Biol.Chem.,236:2033,1961)。

反应液的组成如下表5所示。

表5：反应液组成

反应混合物^-1 0.3ml

羟胺溶液^-2 0.2ml

0.1M天冬氨酸钾(pH7.0) 0.1ml

酶溶液

水余量

总量 1.0ml

*1:9ml 1M Tris-HCl(pH8.1)+0.5ml 0.3M MgSO₄+5ml 0.2M ATP(pH7.0)

*2：临用前用KOH中和过的8M羟胺

不含天冬氨酸钾的反应液定义为空白。

测定方法概述于下表6。

表6：测定方法概述

(1)将反应液于27℃下保温45分钟。

(2)加入FeCl₃溶液(0.4ml 2.8N HCl+0.4ml 12％TCA+0.7ml 5％FeCl₃·6H₂O/0.1N HCl)以生色。

(3)离心，然后测定上清液在540nm处的光吸收值(A₅₄₀)。

活性以1分钟内生成的异羟肟酸的量表示。

1单位=1微摩尔/分。摩尔吸光系数=600。

结果示于图4。

(3-4)：赖氨酸依赖性抑制作用解除的程度

为测定AK酶活性，在酶反应液中以各种不同浓度加入赖氨酸，并测定赖氨酸依赖性抑制的水平。赖氨酸对野生型AKⅢ的抑制很强，例如，约0.45mM赖氨酸产生50％抑制，5mM赖氨酸产生约100％抑制(图4)。

对比之下，这里得到的突变型AKⅢ表现出不同程度的解除，但所有14个突变型的赖氨酸依赖性抑制作用都有一定程度的解除(图4和表7)。具体地说，在第24、80、117、169和172号的情况下，甚至100mM赖氨酸也几乎末观察到抑制作用，50％抑制浓度为200倍或更高。

另外，即使把细胞生长条件和样品制备的影响考虑进去，比活(即单位蛋白的酶活性)也等于或高于野生型的比活，并且没有观察到由于引入突变而使活性下降的问题(表7)。由此假定，AKⅢ的活性位点和负责受赖氨酸调节的位点是彼此独立的。

表7中，抑制解除程度以100mM赖氨酸存在下的活性相对于无赖氨酸反应液活性的百分比表示，热稳定性以在55℃下处理1.5小时后剩余活性相对于末加热时活性的百分比表示。

表7：赖氨酸抑制作用解除程度和热稳定性

	比活(μ/mg蛋白)	抑制解除程度(％)	热稳定性(％)
	比活(μ/mg蛋白)	抑制解除程度(％)	热稳定性(％)	野生型	0.0247	0	18
No.117No.24No.80No.172No.169No.150No.126No.149No.167No.48No.60No.158No.156No.43	0.00690.02180.02440.01890.01280.00620.02500.02560.00830.02280.01440.02240.01010.0212	120100999796776159433835221817	030360225399454294220	野生型	0.0247	0	18

(3-5)：热稳定性

在提高某些酶的活性水平以对其进行改进时，重要的是要使这些酶稳定保持在细胞内。由于蛋白酶在细胞内外活性的差异及保存用缓冲液的影响，这些酶的测定优选在体内进行，但在这里为方便起见，在体外测试热稳定性作为每种突变型AKⅢ的参数。

作为对AKⅢ失活温度进行各种测试的结果，将温度设定在56℃，并测定处理90分钟后的活性剩余率。如上表7所示，有半数的突变型优于野生型。一般来说，突变蛋白往往不如其野生型稳定，但这里得到的某些突变型AKⅢ的稳定性却高于野生型，其中有许多都被认为是很有用的，可作为实际生产L-苏氨酸的酶。

实施例4：用引入了lysC*的菌株发酵生产L-苏氨酸

(4-1)：

在迄今已知的产苏氨酸大肠杆菌中，B-3996株的苏氨酸生产能力最高。这里决定使用B-3996株作为宿主来评定lysC*。B-3996株已保藏在工业微生物遗传和选择研究所，保藏号为BKⅡ M(VKPM)B-3996。另外，作为欲评定的lysC*，取抑制解除程度和比活不同的6种类型(表7中第24、43、60、80、149和167号)用于下列实验。

首先，为提高lysC*的表达程度，将pLYSCl*上的上述6种lysC*分别转移到载体pHSG399(Takara Shuzo公司的产品)的lacZ启动子的下游，以造成每个lysC*的倒位插入。以这种方式得到的新质粒统称为pLLC*系列(图5)。已插入了合上述80号和167号lysC*的质粒的大肠杆菌HB101株，分别称为AJ12750和AJ12751，这两个菌株最早于1992年9月1日保藏在国立生物科学和人类工程研究所(日本)。AJ12750的保藏号为FERM P13136(于1993年11月4日变更为国际保藏，保藏号为FERM BP-4462)，AJ12751的保存藏号为FERM13137(于同一天变更为国际保藏，保藏号为FERM BP-4463)。其余菌株未保藏，但由于已发现了每种lysC*的所有突变点(如下所述)，本领域普通技术人员容易按Maniatis等人的方法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1:21,1989)由上述保藏的细菌回收质粒，进而按定位诱变法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning,Cold SpringHarbor Laboratory Press,15:83,1989)获得目标静止lysC*基因。用常规方法将这些质粒插入到B-3996菌株中以进行评定。

用下表8所示的下列培养基(组分A、B和C已分别灭菌)进行培养，培养时间为38小时，温度为37℃，并伴以114-116rpm的搅拌。

表8：苏氨酸生产培养基

(g/l)A:(NH₄)₂SO₄ 16

KH₂PO₄ 1

MgSO₄·7H₂O 1

FeSO₄·7H₂O 0.01

MnSO₄·5H₂O 0.01

酵母提取物(Difco) 2

L-Met 0.5

用KOH调至pH7.0，于115℃高压灭菌10分钟(16/20体积)。B:20％葡萄糖，于115℃高压灭菌10分钟(4/20体积)。C:药典级CaCO₃，于180℃高压灭菌2天(30g/l)。D：抗生素(100μg/ml链霉素、5μg/ml卡那霉素)。

(4-2):lysC*的评定

用6个pLLC*系列质粒中的每个质粒转化B-3996株，每个转化株都分别在加1g/l赖氨酸和不加赖氨酸两种条件下培养。作为对照，制备带有和不带有含野生型lysC的质粒(pLLC1)的宿主B-3996株。

结果示于下表9。在该表中，括号中的数值为每消耗1克糖的赖氨酸产量(克)与在不加赖氨酸条件下培养B-3996时(对照)得到的每消耗1克糖的赖氨酸产量(克)之间的比例。这意味着后一产量指定为1.00。赖氨酸敏感度定义为(加赖氨酸时单位耗糖量的赖氨酸产量)/(不加赖氨酸时单位耗糖量的赖氨酸产量)。就B-3996株而言，在加赖氨酸培养物中观察到的单位耗糖量的产量下降，按不加赖氨酸的培养物中观察到的数值计算，约为0.74。但是，在已引入lysC*的菌株(例如B-3996/pLLC*149)的情形，在加赖氨酸培养物中观察到的单位耗糖量产量的下降，按不加赖氨酸培养物中观察到的数值计算约为0.96。由此推断，由lysC编码的AK Ⅲ对苏氨酸的生物合成有贡献，加入赖氨酸对AKⅢ活性的抑制作用又与对苏氨酸生物合成的抑制作用相关。使用本发明的lysC*时，这一现象消失。

表9

	Lys加入量(g/l)	残余糖(g/l)	Thr(g/l)	单位耗糖量的产量(％)	赖氨酸敏感度
	Lys加入量(g/l)	残余糖(g/l)	Thr(g/l)	单位耗糖量的产量(％)	赖氨酸敏感度	B-3996	0	0.09	12.1	30.7(1.00)
1	0.12	8.9	22.6	0.74			0	0.09	12.1	30.7(1.00)
1	0.12	8.9	22.6	0.74	B-3996/pLLCl(野生)		0	0.07	13.1	33.0(1.07)
1	0.14	11.1	28.3	0.87			0	0.07	13.1	33.0(1.07)
1	0.14	11.1	28.3	0.87		B-3996/pLLC 24	0	0.11	15.4	38.5(1.25)
1	0.08	12.7	32.3	0.84			0	0.11	15.4	38.5(1.25)
1	0.08	12.7	32.3	0.84	B-3996/pLLC 43		0	0.09	15.1	38.3(1.25)
1	0.12	14.4	35.5	0.93			0	0.09	15.1	38.3(1.25)
1	0.12	14.4	35.5	0.93		B-3996/pLLC 60	0	1.32	13.8	36.3(1.18)
1	2.66	11.6	31.4	0.86			0	1.32	13.8	36.3(1.18)
1	2.66	11.6	31.4	0.86	B-3996/pLLC 80		0	0.10	15.7	39.7(1.29)
1	0.09	13.9	35.6	0.90			0	0.10	15.7	39.7(1.29)
1	0.09	13.9	35.6	0.90		B-3996/pLLC 149	0	0.07	12.8	32.1(1.04)
1	1.80	11.3	30.7	0.96			0	0.07	12.8	32.1(1.04)
1	1.80	11.3	30.7	0.96	B-3996/pLLC 167		0	0.07	15.5	39.8(1.30)
1	0.10	13.9	35.3	0.89			0	0.07	15.5	39.8(1.30)

另外，关于无赖氨酸培养物的苏氨酸产量，很清楚，带野生lysC质粒的菌株所达到的生产率，此不带该质粒的B-3996株有改进，而带突变lysC*菌株的生产率进一步提高(在80号的情形约为宿主生产率的1.3倍)。这些结果表明，AKⅢ是B-3996株苏氨酸生产过程中的限速因子之一。使用已引入突变lysC*的细胞时，无赖氨酸培养达到的产量比用已引入野生lysC的细胞达到的产量有改进。据认为，这是由于后者细胞本身生物合成的赖氨酸抑制了野生型AKⅢ。

(4-3)：突变lysC*质粒的稳定化

从B-3996株中提取质粒pVIC40，在其BamHⅠ位点以两个方向掺入lysC*，制得如图6所示的一些质粒。从B-3996株中收集pVIC40的方法前已述及。选择具有高水平苏氨酸产量的80号作为lysC*，选择43号供与其作比较，得到4个不同的质粒，即，pVICLC*80A、pVICLC*80B、pVICLC*43A和pVICLC*43B。

通过清除B-3996株而新制备B-399株(除去了pVIC40的B-3996株)用作宿主。清除方法是：用无链霉素的L-液体培养基相对于B-3996株培养液重复100倍稀释三次。这里的培养温度为40℃。在以这种方式得到的B-399株中，分别引入4个掺有lysC*的质粒中的pVICLC*80A和pVICLC*43A，并进行培养。结果示于表10。引入了pVICLC*80A或pVICLC*43A的菌株所达到的产量，比用作对照的pVIC40转化株(B-3996)有所提高(pVICLC*80A为1.10倍，pVICLC*43A为1.07倍)。

表10

质粒	残余糖(g/l)	Thr(g/l)	单位耗糖量的产量(％)
质粒	残余糖(g/l)	Thr(g/l)	单位耗糖量的产量(％)	pVIC40	0.15	14.0	35.7(1.00)
pVICLC^43ApVICLC^80APVIC40+pLLC^43pVIC40+pLLC^80	0.090.090.976.15	14.915.315.813.7	38.0(1.07)39.1(1.10)41.1(1.15)41.3(1.16)	pVIC40	0.15	14.0	35.7(1.00)

据认为，产量提高的程度比(4-2)的结果有所有下降的原因是由于换用pVIC40作载体而造成拷贝数较低，但生长情况与B-3996株相同，质粒也稳定保持。

(4-4)：突变lysC*基因掺入染色体

利用同源重组现象，通过在产苏氨酸B-3996的染色体上定靶野生lysC基因而在该B-3996中引入突变型lysC*。这里所用的方法是经过修改的Russel等人的方法(Russel,M.和Model,P.,J.Bacteriol.,159:1034,1984)。

如果宿主是大肠杆菌突变株，即MM382株(polAts，可从美国大肠杆菌遗传原种中心得到)，则质粒pHSG399可以在37℃(许可温度)下复制，但不能在高温如42℃(非许可温度)下复制。利用这一事实来进行同源重组。

首先，在可以复制的温度37℃下，将pLLC43*和pLLC80*分别引入作为宿主的突变株MM383中，分别得到转化株MM383/pLLC*43和MM383/pLLC*80。在42℃下培养这些转化株，并选择出那些缺乏质粒但仍对氯霉素有抗性的转化株。质粒已掺入这些菌株的染色体中。所得到的菌株分别命名为MM383-C43和MM383-C80。用P1噬菌体感染这些菌株，并制备噬菌体溶液用于感染B-3996株。利用氯霉素抗性作标记，选择出那些染色体上已转导有lysC*的菌株，这些菌株分别命名为B-3996-C43和B-3996-C80。

在与(4-1)相同的条件下进行B-3996-C-43和B-3996-C-80的培养，得到下表11所示的结果。观察到苏氨酸产量提高约4％。

表 11

	Lys加入量(g/l)	Thr(g/l)	单位耗糖量的产量(％)
	Lys加入量(g/l)	Thr(g/l)	单位耗糖量的产量(％)	B-3996	0	14.1	34.8(1.00)
1	9.9	24.6			0	14.1	34.8(1.00)
1	9.9	24.6	B-3996-C43		0	14.3	35.4(1.02)
1	11.4	28.1			0	14.3	35.4(1.02)
1	11.4	28.1		B-3996-C80	0	14.6	36.1(1.04)
1	11.2	27.7			0	14.6	36.1(1.04)

实施例5：野生lysC和突变lysC*碱基顺序的测定

(5-1)：

使用“ABI 373A型”DNA测序仪(得自ABI公司)，用常规方法测定野生lysC基因的碱基顺序。结果列在所附顺序表中的1号顺序中。据发现，该顺序有6个碱基与大肠杆菌K-12 JC411的已公开的lysC碱基顺序(Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.和Patta,J.C.,J.Biol.Chem,261:1052,1986)不同(导致两个氨基酸残基的改变)。这6个不同据认为是由于所用的菌株不同而造成的。

(5-2)：反馈抑制抗性突变lysC*的碱基顺序

按与(5-1)相同的方式测定实施例3中所研究的14种lysC*的碱基顺序，清楚地找到了突变点。结果示于表12。在这14种lysC*中，有两对完全相同，因此实际上有12种突变体。第149、150、156、158、167、169和172号突变体是用羟胺处理得到的，第24、43、48、60、80、117和126号突变体是用NTG处理得到的。但是突变形式均为C→T或G→A，其中G→A突变是由于互补链上的C→T突变造成的。

表12:lysC*突变点的鉴定

突变型lysC*	诱变剂(a)	突变点(氨基酸改变)
突变型lysC*	诱变剂(a)	突变点(氨基酸改变)	NO.126NO.43NO.149NO.43/167NO.150	NNHN/HH	GGT→GA^T(³²³Gly→Asp)GGT→GA^T(³²³Gly→Asp)GGC→GA^C (⁴⁰⁸Gly→Asp)CGT→T^GT(³⁴Arq→Cys)GGT→GA^T(³²³Gly→Asp)CTC→T^TC (³²⁵Leu→Phe)ATG→ATA^*(³¹⁸Met→Ile)
NO.172	H	⁷⁷⁵C→T(静息)ATG→ATA^(³¹⁸Met→Ile)GTG→A^TG(³⁴⁹Val→Met)	NO.126NO.43NO.149NO.43/167NO.150	NNHN/HH
NO.172	H	⁷⁷⁵C→T(静息)ATG→ATA^(³¹⁸Met→Ile)GTG→A^TG(³⁴⁹Val→Met)	NO.117NO.158No.24/80NO.169	NHN/NH	TCA→TT^A(³⁴⁵Ser→Leu)GTG→A^TG(³⁴⁷Val→Met)ACC→AT^C(³⁵²Thr→Ile)⁹²³C→T(静息)ACC→AT^C( ³⁵²Thr→Ile)TCT→TT^*T(³⁶⁹Ser→phe)

NO.60NO.156

NH

⁸⁵⁹G→A(静息)GAA→A^*AA(¹⁶⁴Glu→Lys)ATG→ATA^*(⁴¹⁷Met→Ile)TGT→TA^*T(⁴¹⁹Cys→Tyr)²⁰¹⁴C→T(静息)

(a)H：羟胺处理；N:NTG处理

(5-3)：与解除反馈抑制有关的结构域的鉴定

C末端有大量的突变，这些突变在图7的A结构域(从318位Met残基到325位Leu残基)和B结构域(从345位Ser残基到352位Thr残基)特别集中(见表12的“突变点”一栏)。大肠杆菌除lysC(AKⅢ)外还有两种AK，即thrA(AKI-HDI)和metL(M)(AKⅡ-HDⅡ)。突变lysC*有两个与这两种AK有高度同源性的位置，这两个结构域被认为是AK的活性中心(Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.和Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261:1052,1986)。C末端的A和B结构域在这些共有结构域之外，因此A和B结构域很可能是AKⅢ特有的受赖氨酸控制的结构域。具体地说，具有高度抑制解除作用的第24/80、172、169和117号在B结构域有一些突变，据认为这一事实很重要。在这12种中，有10种或者在A结构域有突变，或者在B结构域有突变。60号和158号是例外，其抑制解除作用和热稳定性水平都很低(上表7)，据认为这是由于突变造成酶整体结构改变而使抑制部分解除的结果。另外，在有多个突变点的突变型的情形，存在着哪个突变点有效的问题，根据与在同一位点只有一个突变的突变型所作的比较，可以作出下列解释。

(1)126号(1个点)、43号(2个点)和149号(2个点)

126号在A结构域中的突变点是这三个突变型所共有的，而149号和126号的抑制解除程度相同，43号中更多的突变点造成颇为相反的效应。这便引出了如下的假定：126号在A结构域中的突变点是造成抑制解除作用的突变点。

(2)24/80号(1个点)和169号(2个点)

在169号的两个突变点中，B结构域中的突变点与24/80号中的突变点相同。二者的抑制解除程度都达到100％，因此，24/80号中的突变点就足够了。

(3)150号(1个点)和172号(2个点)

150号在A结构域中有一个突变点，而172号有两个突变点，在A结构域(与150号相同)和B结构域中各有一个。172号的抑制解除程度更强，由此可见，A结构域和B结构域都对抑制解除作用有贡献。

以上述方式，本发明人在A结构域(如以氨基酸残基表示则为从318位Met残基到325位Leu残基)和B结构域(从345位Ser残基到352位Thr残基)中鉴定出了与赖氨酸依赖性天冬氨酸激酶活性抑制作用的解除有关的结构域。然而，本发明人尚未得出以下结论，即，赖氨酸依赖性天冬氨酸激酶活性抑制作用的解除只发生于某些特定氨基酸残基突变为某些其他氨基酸残基的情况。例如，表12表明，当323位甘氨酸残基变为天冬氨酸残基时便发生反馈抑制的解除，但本领域普通技术人员很清楚，即使用谷氨酸残基代替天冬氨酸残基来置换323位甘氨酸残基，也会发生同样的解除作用。这是因为，许多具有相似结构的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸，称为同源氨基酸，据认为，某个氨基酸与其同源氨基酸交换不会使蛋白功能发生任何大的变化(同源氨基酸表见Protein Engineering第31页，CMCCo.,1985)。

常常观察到某个氨基酸与非同源氨基酸交换具有与同源氨基酸交换相同的效应。相反，某个氨基酸与其同源氨基酸交换有时也使蛋白功能发生剧烈变化(Estell,D.A.,Graycar,T.P.和Wells,J.A.,J.Biol.Chem.,260:6518,1988；Schultz,S.C.和Richards,J.H.,Procedure.Natl.Acad.Sci.USA,83:1588,1986；Yutani,K．等，J.Biol.Chem.,262:13429,1987；Yutani,K.等,Procedure.Natl.Acad.Sci.USA,84:4441,1987；Nishiyama,M.等，J.Biol.Chem.,266:14294,1991)。

另外，根据本发明，A和B结构域中的某些氨基酸残基没有改变，但由于蛋白功能是在结构域单元的基础上确定的，所以可以合理地推断，在这些结构域中引入目前尚未引入的一个或更多个氨基酸残基突变，将观察到反馈抑制的解除。事实上，这样的例子已有许多报道(Furuya,H.等，Biochemistry,28:6848,1989；Furuya,H.等，Biochem.Biophys.Research.Commun.,160:669,1989；Cunningham,B.C.和Wells,J.A.,Science,244:1081,1989)。

简言之，本发明在特征上是建立在本发明人对与反馈抑制有关的结构域所作出的发现基础上的。实施例中只公开了结构域中的几种突变形式，但如上所述，本领域普通技术人员清楚，其他形式的突变可能会产生同样的效果。所以，这些突变也在本发明的范围内。

如上所述，现已获得了充分解除了赖氨酸反馈抑制作用的埃希氏杆菌来源的AKⅢ基因。把这些基因引入苏氨酸生产菌中，便有可能得到苏氨酸产量大大优于先有技术的其他苏氨酸生产菌。这些苏氨酸生产菌的成功应用，提供了一种大大优于常规方法的L-苏氨酸发酵生产方法。

顺序表

1号顺序：

顺序长度：2147

顺序类型：核酸

链数：双链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源：

生物体：大肠杆菌

菌株：MC1061

特征：

特征关键词：-35 signal

位置：242..249

特征测定方法：S

特征：

特征关键词：-10 signal

位置：265..273

特征测定方法：S特征：

特征关键词：primer bind

位置：536..555

特征测定方法：E特征：

特征关键词：primer bind

位置：2128..2147

特征测定方法：E特征：

特征关键词：RBS

位置：575..578

特征测定方法：S特征：

特征关键词：mat peptide

位置：584..1930

特征测定方法：S特征：

特征关键词：terminator

位置：1941..1968

特征测定方法：S

顺序描述：TCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT 60AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA 120AAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGCGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA 180AGCATTTATT AGCTGAACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT 240CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC 300CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG 360AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC 420TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC 480ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC 540CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595

Met Ser Glu Ile

1GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met5 10 15 20AAC CGC AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT GAT GCC AAC GTG CGT TTA GTT 691Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Arg Leu Val

25 30 35GTC CTC TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT AAT CTG CTG GTC GCT TTA GCT 739Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu Val Ala Leu Ala

40 45 50GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC GAA AAA CTC GAC GCT ATC CGC 787Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Ala Ile Arg

55 60 65AAC ATC CAG TTT GCC ATT CTG GAA CGT CTG CGT TAC CCG AAC GTT ATC 835Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val Ile

70 75 80CGT GAA GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG AAC ATT ACT GTT CTG GCA GAA 883Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr Val Leu Ala Glu85 90 95 100GCG GCG GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG CTG ACA GAT GAG CTG GTC AGC 931Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser

105 110 115CAC GGC GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG TTT GTT GAG ATC CTG CGC GAA 979His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu Ile Leu Arg Glu

120 125 130CGC GAT GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT GTA CGT AAA GTG ATG CGT ACC 1027Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr

135 140 145AAC GAC CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA GAT ATA GCC GCG CTG GCG GAA 1075ASh Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala Ala Leu Ala Glu

150 155 160CTG GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT CTC AAT GAA GGC TTA GTG ATC 1123Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val Ile165 170 175 180ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT 1171Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu

185 190 195GGC CGT GGA GGC AGC GAT TAT ACG GCA GCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA 1219Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Leu

200 205 210CAC GCA TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC GAC GTC CCG GGC ATC TAC ACC 1267His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro Gly Ile Tyr Thr

215 220 225ACC GAT CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CGC ATT GAT GAA ATC GCG 1315Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile Asp Glu Ile Ala

230 235 240TTT GCC GAA GCG GCA GAG ATG GCA ACT TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT 1363Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala Lys Val Leu His245 250 255 260CCG GCA ACG TTG CTA CCC GCA GTA CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC 1411Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile Pro Val Phe Val

265 270 275GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA 1459Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys

280 285 290ACT GAA AAT CCG CCG CTG TTC CGC GCT CTG GCG CTT CGT CGC AAT CAG 1507Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu Arg Arg Asn Gln

295 300 305ACT CTG CTC ACT TTG CAC AGC CTG AAT ATG CTG CAT TCT CGC GGT TTC 1555Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe

310 315 320CTC GCG GAA GTT TTC GGC ATC CTC GCG CGG CAT AAT ATT TCG GTA GAC 1603Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn Ile Ser Val Asp325 330 335 340TTA ATC ACC ACG TCA GAA GTG AGC GTG GCA TTA ACC CTT GAT ACC ACC 1651Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr Leu Asp Thr Thr

345 350 355GGT TCA ACC TCC ACT GGC GAT ACG TTG CTG ACG CAA TCT CTG CTG ATG 1699Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln Ser Leu Leu Met

360 365 370GAG CTT TCC GCA CTG TGT CGG GTG GAG GTG GAA GAA GGT CTG GCG CTG 1747Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala Leu

375 380 385GTC GCG TTG ATT GGC AAT GAC CTG TCA AAA GCC TGC GGC GTT GGC AAA 1795Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys Gly Val Gly Lys

390 395 400GAG GTA TTC GGC GTA CTG GAA CCG TTC AAC ATT CGC ATG ATT TGT TAT 1843Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg Met Ile Cys Tyr405 410 415 420GGC GCA TCC AGC CAT AAC CTG TGC TTC CTG GTG CCC GGC GAA GAT GCC 1891Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro Gly Glu Asp Ala

425 430 435GAG CAG GTG GTG CAA AAA CTG CAT AGT AAT TTG TTT GAG TAAATACTGT 1940Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe Glu

440 445ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA 2000ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT 2060ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA 2120TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC 2147

2号顺序：

顺序长度：20

顺序类型：核酸

链数：单链

拓扑结构：线性

分子类型：其他核酸，即合成DNA

顺序描述：

CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG

3号顺序：

顺序长度：18

顺序类型：核酸

链数：单链

拓扑结构：线性

分子类型：其他核酸，即合成DNA

顺序描述：

GAATTCCTTT GCGAGCAG

Claims

1．一种编码天冬氨酸激酶Ⅲ的DNA，所述天冬氨酸激酶Ⅲ在SEQ IDNo:1的埃希氏杆菌天然天冬氨酸激酶Ⅲ的氨基酸序列中具有突变，所述突变导致赖氨酸的反馈抑制作用比对天然天冬氨酸激酶减少超过17％，其中突变选自：

(1)323位Gly被Asp置换；

(2)323位Gly被Asp置换，408位Gly被Asp置换；

(3)34位Arg被Cys置换，323位Gly被Asp置换；

(4)325位Leu被Phe置换；

(5)318位Met被Ile置换；

(6)318位Met被Ile置换，349位Val被Met置换；

(7)345位Ser被Leu置换；

(8)347位Val被Met置换；

(9)352位Thr被Ile置换；

(10)352位Thr被Ile置换，369位Ser被Phe置换；

(11)164位Glu被Lys置换；

(12)417位Met被Ile置换，419位Cys被Tyr置换。

2．一种重组DNA，其在载体DNA中含有权利要求1的DNA，所述载体DNA能够在埃希氏杆菌宿主中复制。

3．一种埃希氏杆菌宿主，它被权利要求2的重组DNA转化。

4．一种生产L-苏氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求3的宿主。