JP5813907B2 - 変異型アセト乳酸合成酵素及び分岐鎖l−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Description
ア・コリK12の分析によって、この株が3つのAHAS(アイソザイムAHAS I、AHAS II、及びAHAS IIIと称される)の活性に対する構造遺伝子群を含むことが示されている。AHAS I及びAHAS IIIの両方がバリンによって阻害されるのに対し、AHAS IIはバリンに耐性がある。しかし、AHAS IIは通常、エシェリヒア・コリK12細胞では発現していない(Guardiola, J. et al., Mol. Gen. Genet. 156:17-25(1977))。腸内細菌由来の全てのAHASアイソザイムは、α 2 β 2構造の大サブユニット及び小サブユニットから構成され、大サブユニットは触媒機能を有しており、また小サブユニットは調節機能を有している。この小サブユニットは、フィードバック阻害因子であるバリンに対する酵素活性の感受性には絶対に必要である。AHAS Iサブユニット及びAHAS IIIサブユニットそれぞれの特性の研究(Weinstock O. et
al., J. Bacteriol. 174:5560-5566(1992))により、小サブユニットが酵素全体の触媒能を有する構造を特異的に誘導し、遷移状態を安定化させることが示された。
a)前記変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子のコピー数を増大させること、
b)前記遺伝子の発現が増強されるように、この遺伝子の発現制御配列を改変すること、及び
c)それらの組み合わせ
から成る群から選択される方法によって増強される、上記の細菌を提供することである。
「細菌のアセト乳酸合成酵素」という用語は、腸内細菌科の細菌、コリネバクテリア、及びバチルス属に属する細菌等に存在する野生型又は内因生のアセト乳酸合成酵素を意味する。腸内細菌科には、エシェリヒア属、エルビニア属、プロビデンシア属及びセラチア属に属する細菌が包含される。エシェリヒア属が好ましい。
ードする。ilvB遺伝子(GeneBankアクセッション番号NC_000913.2の3849119位〜3850807位のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、gi:16129170)は、エシェリヒア・コリK−12の染色体上のilvN遺伝子とivbL遺伝子との間に位置している。
and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA)」(Methods in Enzymology, 1990 183:63-98))。ClustalW法は、Thompson J.D.、Higgins D.G.及びGibson
T.J.によって記載されている(「CLUSTAL W:配列の重み付け、位置特異的なギャップペナルティ、及び重み付けマトリクスの選択による進歩的な複数の配列アライメントの感度の改善(CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and
weight matrix choice)」(Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680))。
本発明の細菌は、アセト乳酸合成酵素の変異型小サブユニットをコードするDNAを含む腸内細菌科の分岐鎖L−アミノ酸生産菌である。さらに、本発明の細菌は、変異型アセト乳酸合成酵素の活性が増大した腸内細菌科の分岐鎖L−アミノ酸生産菌である。具体的には、本発明の細菌は、腸内細菌科の分岐鎖L−アミノ酸生産菌であって、本発明の変異型小サブユニットをコードする変異型ilvN遺伝子の当該細菌への導入により、分岐鎖L−アミノ酸の生産が増大した細菌である。本発明の細菌は、エシェリヒア属に属する分岐鎖L−アミノ酸生産菌であって、当該細菌においてアセト乳酸合成酵素、すなわちバリン耐性の変異型アセト乳酸合成酵素の活性を増強することにより、分岐鎖L−アミノ酸の生産が増大した細菌である。さらに具体的には、本発明の細菌は、当該細菌の染色体上又はプラスミド中に変異型ilvN遺伝子を含んでおり、その遺伝子は過剰発現され、この細菌は分岐鎖L−アミノ酸の生産能力が高められている。
L−イソロイシン及びL−バリンが挙げられる。
ー等である。
K. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(4), 672-679(1999))、又は欧州公開特許第685555A1号に記載されているAJ12919株等のエシェリヒア属に属するL−イソロイシン生産菌を使用することもできる。
本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養し、分岐鎖L−アミノ酸を培地中に生成させ、培地から分岐鎖L−アミノ酸を回収することにより、L−ロイシン、L−イソロイシン、及びL−バリン等の分岐鎖L−アミノ酸を製造することを含む。
(プロリン栄養要求性)、十分量のプロリンを培地に加えてもよい。
エシェリヒア・コリのAHAS IをコードするilvBNオペロンのクローニング
ilvBNオペロンを、2439bpのPCR産物の一部としてpMIV5JSベクターにクローニングした。pMIV5JSベクターの構築は、後述の参考例1において記載する。MG1655の染色体をPCRの鋳型として使用した。合成オリゴヌクレオチドilvBX60(配列番号3)及びilvBR64(配列番号4)をプライマーとして使用した。プライマーilvBX60は5’末端にXbaI制限部位を含み、プライマーilvBR64は5’末端にSalI制限部位を含む。PCRの条件では以下のとおりであった。94℃で5分間変性;30サイクルのプロファイル:94℃で30秒、59℃で30秒、72℃で2分;最終ステップ:72℃で7分間。アガロースゲル中で2449bpのPCR産物を精製し、XbaI及びSalIで処理して、同じ制限酵素(restrictases)で処理したpMIV5JSベクターにクローニングした。B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH株をクローニングのための受容株として使用した。B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH株の構築は、参考例2において後述する。得られたプラスミドpMIV−PivbL−ilvBN(図1)は、B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH株のAHAS-表現型を補完した。
エシェリヒア・コリのアセト乳酸合成酵素アイソフォームIのバリン耐性変異体(IlvBNValR)の育種
実施例1に記載されたB7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH/pMIV−PivbL−ilvBN株は、AHASをコードするオペロンを一つだけ含む(ilvBNオペロン)。バリン耐性の自然発生変異体を、1g/lのバリンを補充した最小培地プレート上で選抜した。粗抽出物のアセト乳酸合成酵素活性及び酵素のL−バリン阻害耐性は、F.C. Stomer及びH.E. Umbargerの方法(Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592(1964))によって測定した。粗抽出物を得るために、細胞を対数増殖期の終期までM9最小培地で生育させ、100mMのKClを補充した100mMのKH2PO4/K2HPO4緩衝液(pH7.0)で洗浄した。同じ緩衝液中で細胞を超音波処理することによって、粗細胞抽出物を調製した。AHAS欠損株であるB7ΔilvBNΔilvGMΔilvIHを再度形質転換するために、選抜したバリン耐性変異体から単離されたプラスミドを使用した。結果的に、プラスミドpMIV−PivbL−ilvBNValR33が得られ、これによりAHAS欠損受容株のバリン耐性生育がもたらされた。このプラスミドは、バリン阻害に耐性のAHAS Iをコードするオペロンを含む。10mMのL−バリン存在下で残存するAHAS活性を測定した。残存AHAS活性は、L−バリン存在下における活性(nmol/分・mg)×100(%)/L−バリン非存在下における活性(nmol/分・mg
)で計算される。AHAS活性は、F.C. Stormer及びH.E. Umbarger(Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592(1964))の方法によって測定した。この株に関するAHAS活性の測定結果を表1に示す。
バリン耐性のAHAS Iをコードする遺伝子のヌクレオチド配列
pMIV−PivbL−ilvBN33:ML74(配列番号5)、LattRS1(配列番号6)、ilvbS31(配列番号7)、ilvbS32(配列番号8)、及びilvbS33(配列番号9)にクローニングされたilvBN DNAのフラグメントをシークエンシングするために、5つのオリゴヌクレオチドを使用した。このシークエンシングの方法を図2に示す。
AHAS欠損株の染色体へのPivbL−ilvBNValR33オペロンの組込みと、その後のcatマーカーの除去
1.cat−PivbL−ilvBNValR33遺伝子の染色体への組込み
mini−Mu::cat−PivbL−ilvBNValR33を細菌の染色体に組込むために、標準的な手法を使用した。pMIV−PivbL−ilvBNValR33をB7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH/pMH10細胞に導入した。pMH10(KmR遺伝子、MuトランスポザーゼをコードするMuファージA及びBの遺伝子、Muリプレッサーをコードするcts62遺伝子、及びファージ−λリプレッサー遺伝子cI857を有するpACYC177誘導体)によってコードされるMuトランスポザーゼ(欧州特許第1149911号)は、形質転換の直後に44℃で20分間インキュベートすることにより誘導された。
B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini−Mu::cat−PivbL−ilvBNValR33株からクロラムフェニコール耐性マーカーを除去するために、細胞をプラスミドpMW118−int−xis(ApR)(WO2005/010175号)で形質転換した。150mg/lのアンピシリンを含むLB寒天プレート上で、30℃でApRクローンを生育させた。数十個のApRクローンを拾い、クロラムフェニコール感受性に
ついて試験した。LB寒天プレート上で、42℃でインキュベートすることにより、CmS細胞からプラスミドpMW118−int−xisを除去した。結果的に、同定されていない染色体座に組込みカセットmini−Mu::PivbL−ilvBNValR33を含む、B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini−Mu::PivbL−ilvBNValR33株を得た。10mMのL−バリン存在下での残存AHAS活性を測定した。この株におけるAHAS活性の測定結果を表1に示す。
ilvBNValR33オペロンの天然プロモーターの、人工の調節領域による置換
1.ilvBNValR33オペロンの調節領域の改変
ilvBNValR33オペロンの調節領域の改変すなわちilvBNオペロンの天然のプロモーター領域のPLプロモーターによる置換は、「Red駆動型組込み(Red-driven integration)」と呼ばれるDatsenko及びWanner(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645)によって初めて開発された方法によって達成された。この手法に従い、PCRプライマーであるilvB−attR1(配列番号12)及びilvB−PLSD(配列番号13)を構築した。オリゴヌクレオチドilvB−attR1(配列番号12)は、ilvB遺伝子の上流に位置する領域及びBW25113cat−PL−yddGの染色体DNAに存在する抗生物質耐性を付与する遺伝子に隣接する領域と相同性を有する。オリゴヌクレオチドilvB−PLSD(配列番号13)は、ilvB領域及びBW25113cat−PL−yddGの染色体に存在するPLプロモーターの下流に位置する領域の両者と相同性を有する。BW25113cat−PL−yddGの取得については既に詳細に記載されている(欧州公開特許第1449918A1号、ロシア特許第2222596号)。BW25113cat−PL−yddG株の染色体DNAをPCRの鋳型として使用した。PCRの条件は以下のとおりであった。95℃で3分間変性;最初の2サイクルのプロファイル:95℃で1分、34℃で30秒、72℃で40秒;最後の30サイクルのプロファイル:95℃で30秒、50℃で30秒、72℃で40秒;最終ステップ:72℃で5分間。その結果、PCR産物が得られ(配列番号14)、アガロースゲル中で精製し、温度感受性の複製起点を有するプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリB7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini−Mu::PivbL−ilvBNValR33株のエレクトロポレーションに使用した。プラスミドpKD46(Datsenko及びWanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45)は、アラビノース誘導性のParaBプロモーター制御下にあるλ Red相同組換え系の遺伝子(γ、β、エキソ遺伝子)を含み、ファージλ(GenBankアクセッション番号J02459)の2154塩基(31088〜33241)のDNAフラグメントを含む。プラスミドpKD46は、PCR産物をB7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini−Mu::PivbL−ilvBNValR33株の染色体に組込むのに必要である。
L寒天上での継代を2回行い、得られたコロニーについてアンピシリンに対する感受性を試験した。
B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini−Mu::cat−PL−ilvBNValR33クローンが得られたが、これには、Cm耐性遺伝子で標識された、ファージλPLプロモーターの制御下でフィードバック耐性のAHAS Iをコードする変異型のilvBNValR33オペロンを有するmini−Mu::cat−PL−ilvBNValR33のカセットが含まれる。天然のilvBN調節領域の、Cm耐性遺伝子で標識されたPLプロモーターによる置換をPCRによって確認した。ファージMuの右側接着部位に特異的なプライマーMR74(配列番号15)及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子Cm−test2に特異的なプライマー(配列番号16)を、確認のためのPCRで使用した。PCRでの確認の条件は以下のとおりであった。94℃で3分間変性;30サイクルのプロファイル:94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分;最終ステップ:72℃で7分間。B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini−Mu::cat−PivbL−ilvBNValR33細胞を鋳型として使用して得られたPCR産物は、586塩基の長さであった(配列番号17)。B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini−Mu::cat−PL−ilvBNValR33細胞を鋳型として使用して得られたPCR産物は、879塩基長であった(配列番号18)。10mMのL−バリン存在下での、B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini−Mu::cat−PL−ilvBNValR33株における残存AHAS活性を測定した。この株におけるAHAS活性の測定結果を表1に示す。
バリン耐性のAHAS Iを有するエシェリヒア・コリの株によるL−バリンの生産
エシェリヒア・コリB7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini−Mu::PivbL−ilvBNValR33株及びB7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini−Mu::cat−PL−ilvBNValR33の両者を、L寒天プレート上で37℃で18時間生育させた。その後、プレート表面の約0.5cm2からの細胞を発酵培地(2ml)に導入し、32℃で72時間、通気をしながら試験管で培養した。栄養要求性のAHAS欠損株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIHに対しては、発酵培地にそれぞれ1
00μg/mlのイソロイシン及びバリンをさらに補充した。蓄積したL−バリンをTLCにより測定した。結果を表2に示す。
発酵培地の組成(g/l):
グルコース 60.0
(NH4)2SO4 18.0
KH2PO4 3H2O 2.0
MgSO4 7H2O 1.0
CaCO3 25.0
チアミン 0.02
豆濃(Mameno) 4.0
ilvBNの発現が改変された、AHAS Iがバリン耐性である、新規エシェリヒア・コリ変異体
B7ΔilvIHΔilvGM株において、実施例5で記載されたものと同様の方法により、ilvBNオペロンの天然の調節領域をファージλPLプロモーターで置換した(参考例2のセクション5を参照のこと)。この株はAHAS Iのみを有する。得られたB7ΔilvIHΔilvGM cat−PL−ilvBN株はバリン感受性であった。この株から、AHAS Iの新規のバリン耐性自然発生変異体が得られた。1g/lのバリンでより良好に生育した株の特徴付けを行った(表3)。
バリン耐性のAHAS Iを有するエシェリヒア・コリの株によるL−ロイシンの生産
cat−PL−ilvBN ValR4カセットをL−ロイシン生産性のエシェリヒア・コリ57株に導入した(ロシア特許第2140450号、VKPM B−7386)。この目的のため、エシェリヒア・コリ57株に、ドナー株であるB7ΔilvIHΔilvGM cat−PL−ilvBNValR4上で生育させたP1virを感染させた。クロラムフェニコール(20μg/ml)を補充したL寒天プレート上で形質導入株を選抜した。前記57株は、アクセッション番号VKPM B−7386で、1997年5月19日にロシア国立産業微生物保存機関(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)に寄託された。
プラスミドpMIV5JSの構築
PMIV−5JSを以下のスキームに従って構築した。最初に、Mu由来の組込みカセットをpMW119の誘導体であるプラスミドpMW1にin vivoで組込むことによって、プラスミドpM12を構築した(図4)。互いに相補的な2つのターミネーターオリゴヌクレオチド配列を合成した(配列番号19及び配列番号20)。順方向(配列番号19)及び逆方向(配列番号20)にこれらの合成オリゴヌクレオチドをアニーリングさせることによって、ターミネーターthrLを得た。ターミネーターthrLはHindIII部位及びPstI部位により両側を挟まれている。次いで、合成ターミネーター配列Ter(thr)を、HindIII及びMph1103Iで消化したpM12に挿入することによって、プラスミドpM12−ter(thr)を構築した(図5)。
a)上流のプライマー(配列番号21)(BglIIに関する部位を下線で示す)及びリン酸化した下流のプライマー(配列番号22)を用いたPCR増幅によって、0.12kbpのLattLフラグメントを得た。鋳型として、プラスミドpMW118−attL−tet−attR−ter_rrnBを使用した(WO2005/010175号)。
b)リン酸化した上流のプライマー(配列番号23)及び下流のプライマー(配列番号24)(PstIに関する部位を下線で示す)を用いたPCR増幅によって、1.03kbpのCmRフラグメントを得た。鋳型として、プラスミドpACYC184を使用した。
c)上流のプライマー(配列番号25)(PstIに関する部位を下線で示す)及び下
流のプライマー(配列番号26)(SacIに関する部位を下線で示す)を用いたPCR増幅によって、0.16kbpのLattRフラグメントを得た。鋳型として、プラスミドpMW118−attL−tet−attR−ter_rrnBを使用した。
d)LattLフラグメント及びCmRフラグメントをライゲーションして、得られた1.15kbpのLattL−CmRフラグメントを精製した
e)LattL−CmRフラグメント及びLattRフラグメントをPstIで消化し、ライゲーションして、得られた1.31kbpのLattL−CmR−LattRフラグメントを精製した。
f)2つの合成されたオリゴヌクレオチド(配列番号27で示される配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号27に相補的な配列を有する別のオリゴヌクレオチド)をアニーリングすることによって、マルチクローニング部位(MCS)を含む70bpの二本鎖DNAフラグメントを得た。
g)LattL−CmR−LattRフラグメント及びMCSフラグメントをSacIで消化し、ライゲーションして、得られた1.38kbpのLattL−CmR−LattR−MCSのカセットを精製した。
不活性化したアセト乳酸合成酵素遺伝子を有する株の構築
1.ilvBNオペロンの欠失
「Red−駆動型組込み(Red-driven integration)」と呼ばれる、Datsenko及びWanner(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645)によって初めて開発された方法により、ilvBNオペロンを欠失させた。この手順に従って、ilvBNオペロンに隣接する領域及び鋳型プラスミド中のクロラムフェニコール耐性を与える遺伝子の両者と相同性を持つPCRプライマーilvBN1(配列番号28)及びilvBN2(配列番号29)を構築した。PCR反応の鋳型として、プラスミドpMW−attL−Cm−attR(WO05/010175号)を使用した。PCRの条件は以下のとおりであった。95℃で3分間の変性ステップ;最初の2サイクルのプロファイル:95℃で1分、34℃で30秒、72℃で40秒;最後の30サイクルのプロファイル:95℃で30秒、50℃で30秒、72℃で40秒;最終ステップ:72℃で5分間。
、氷冷した脱イオンH2Oで3回洗浄することによりエレクトロコンピテントな状態にした。細胞70μl及びPCR産物約100ngを使用して、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後に、細胞をSOC培地(Sambrook et al.著「モレキュラークローニング実験室マニュアル、第2版」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)))1mlで37℃で2.5時間インキュベートし、L寒天上にプレーティングして、37℃で生育させ、CmR組換え体を選抜した。次いで、pKD46プラスミドを除去するために、42℃で、Cmを含むL寒天上での継代を2回行い、得られたコロニーについてアンピシリンに対する感受性を試験した。このように、不活性化したilvBNオペロンを有する変異株MG1655ΔilvBN::catを構築した。
ilvBNオペロンを欠失し、Cm耐性遺伝子で標識された変異体を、PCRにより確認した。遺伝子座に特異的なプライマーilvBNC5(配列番号30)及びilvBNC6(配列番号31)を、確認のためのPCRに使用した。PCRでの確認の条件は以下のとおりであった。94℃で3分間の変性ステップ;30サイクルのプロファイル:94℃で30秒、53℃で30秒、72℃で1分;最終ステップ:72℃で7分間。ilvBN+である親株MG1655由来の染色体DNAを鋳型として使用した反応で得られたPCR産物は、2275塩基の長さであった。変異株MG1655ΔilvBN::cat株由来の染色体DNAを鋳型として使用した反応で得られたPCR産物は、1995塩基の長さであった(図8)。
セクション1に記載されたilvBNオペロンの欠失と同様の方法で、ilvIHオペロンを欠失させた。この手順に従って、ilvIHオペロンに隣接する領域及び鋳型プラスミド中のクロラムフェニコール耐性を与える遺伝子の両者と相同性を有するPCRプライマーilvIH1(配列番号32)及びilvIH2(配列番号33)を構築した。PCR反応の鋳型として、プラスミドpMW−attL−Cm−attR(PCT国際公開WO05/010175号)を使用した。PCRの条件は以下のとおりであった。95℃で3分間の変性ステップ;最初の2サイクルのプロファイル:95℃で1分、34℃で30秒、72℃で40秒;最後の30サイクルのプロファイル:95℃で30秒、50℃で30秒、72℃で40秒;最終ステップ:72℃で5分間。
セクション1に記載されたilvBNオペロンの欠失と同様の方法で、ilvGMオペロンを欠失させた。この手法に従って、ilvGMオペロンに隣接する領域及び鋳型プラスミド中のクロラムフェニコール耐性を与える遺伝子の両者と相同性を有するPCRプライマーilvGM1(配列番号36)及びilvGM2(配列番号37)を構築した。P
CR反応の鋳型として、プラスミドpMW−attL−Cm−attR(PCT国際公開WO05/010175号)を使用した。PCRの条件は以下のとおりであった。95℃で3分間の変性ステップ;最初の2サイクルのプロファイル:95℃で1分、34℃で30秒、72℃で40秒;最後の30サイクルのプロファイル:95℃で30秒、50℃で30秒、72℃で40秒;最終ステップ:72℃で5分間。
P1形質導入によって、野生型のエシェリヒア・コリK12株(VKPM B−7)において、ilvIH遺伝子(ΔilvIH::cat)を欠失させた(Sambrook et al.著「モレキュラークローニング実験室マニュアル、第2版」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)))。セクション3に記載されたエシェリヒア・コリMG1655ΔilvIH::cat株をドナー株として使用し、CmR形質導入株を選抜した。結果的に、B7ΔilvIH::cat株が得られた。B7ΔilvIH::catからクロラムフェニコール耐性マーカーを除去するために、プラスミドpMW118−int−xis(ApR)で細胞を形質転換した(WO2005/010175号)。ApRクローンを、30℃で150mg/lのアンピシリンを含むLB寒天プレート上で生育させた。数十個のApRクローンを拾い、クロラムフェニコール感受性について試験した。LB寒天プレート上で、42℃でインキュベートすることにより、プラスミドpMW118−int−xisをCmS細胞から除去した。結果的に、B7ΔilvIH株が得られた。
Claims (14)
- エシェリヒア・コリの野生型アセト乳酸合成酵素(AHAS I)の小サブユニットに下記の群から選択される変異が導入された、細菌のアセト乳酸合成酵素の変異型小サブユニットであって、バリンによるフィードバック阻害が脱感作された、細菌のアセト乳酸合成酵素の変異型小サブユニット:
A)17位のL−アミノ酸をリジン残基で置換すること、
B)30位のL−アミノ酸をプロリン残基で置換すること。 - 請求項1に記載の変異型小サブユニットを含む変異型アセト乳酸合成酵素。
- 前記変異型アセト乳酸合成酵素がエシェリヒア・コリの大サブユニットを含む、請求項2に記載の変異型アセト乳酸合成酵素。
- 請求項1に記載のアセト乳酸合成酵素の変異型小サブユニットをコードするDNA。
- 請求項4に記載のDNA及びエシェリヒア・コリのアセト乳酸合成酵素の大サブユニットをコードするDNAを含み、分岐鎖L−アミノ酸の生産能を有する、腸内細菌科の細菌。
- 前記分岐鎖L−アミノ酸が、L−ロイシン、L−イソロイシン、及びL−バリンから成る群から選択される、請求項5に記載の腸内細菌科の細菌。
- 前記変異型アセト乳酸合成酵素の活性が増強される、請求項5又は6に記載の腸内細菌科の細菌。
- 前記細菌がエシェリヒア属に属する、請求項5〜7のいずれか1項に記載の腸内細菌科の細菌。
- 前記変異型アセト乳酸合成酵素の活性が、前記変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子の発現を増大させることによって増強される、請求項7又は8に記載の腸内細菌科の細菌。
- 前記変異型アセト乳酸合成酵素の活性が、
a)前記変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子のコピー数を増大させること、
b)前記遺伝子の発現が高められるように、当該遺伝子の発現調節配列を改変すること、及び
c)それらの組み合わせ
から成る群から選択される方法によって増強される、請求項9に記載の腸内細菌科の細菌。 - 前記コピー数が、前記変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子の複数コピーを前記細菌の染色体に組込むことによって増大される、請求項10に記載の腸内細菌科の細菌。
- 請求項5〜11のいずれか1項に記載の細菌を培地中で培養すること、及び培地から分岐鎖L−アミノ酸を回収することを含む、分岐鎖L−アミノ酸の製造方法。
- 前記細菌は分岐鎖L−アミノ酸の生合成に関与する遺伝子の発現が増強されている、請求項12に記載の方法。
- 前記分岐鎖L−アミノ酸が、L−ロイシン、L−イソロイシン、及びL−バリンから成る群から選択される、請求項12又は13に記載の方法。
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