BRPI0703528B1 - subunidade pequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (ahas i), acetolactato sintase mutante, dna, bactéria da família enterobacteriaceae, e, método para produzir um l-aminoácido de cadeia ramificada - Google Patents

Abstract

subunidade pequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (ahas 1), acetolactato sintase mutante, dna, bactéria da família enterobacteriaceae, e, metodo para produzir um l-aminoácido de cadeia ramificada uma acetolactato sintase bacteriana mutante (ai-ias 1) que é resistente à inibição da realimentação por l-valina é descrita. também é descrito um método para produzir l-aminoácidos de cadeia ramificada usando uma bactéria da família enterobacteriaceae em que a produtividade de l-aminoácido da referida bactéria é melhorada pelo uso de acetolactato sintase (ai-ias 1) que é resistente à inibição de realimentação por l-valina.esta acetolactato sintase contém uma subunidade pequena mutante codificada pelo gene ilvn mutante.

Description

“SUBUNIDADE PEQUENA MUTANTE DE ACETOLACTATO SINTASE BACTERIANA (AHAS I), ACETOLACTATO SINTASE MUTANTE, DNA, BACTÉRIA DA FAMÍLIA ENTEROBA CTER1A CEAE, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMÍNOÁCIDO DE CADEIA RAMIFICADA” ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção A presente invenção refere-se à biotecnologia, e especificamente a um método para produzir L-aminoácidos de cadeia ramificada. Mais especificamente, a presente invenção descreve o uso de uma nova enzima resistente a L-valina que está envolvida na biossíntese de L-aminoácidos de cadeia ramificada. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a acetolactato sintase mutante resistente a L-valina (AHAS 1) purificada de E. coli, uma bactéria da família Enterobacteriaceae que contém esta enzima sintase, e um método para produzir L-aminoácidos de cadeia ramificada por fermentação usando as cepas destas bactérias.

Breve Descrição da Arte Relacionada Tradicionalmente, L-aminoácidos foram industrialmente produzidos por fermentação utilizando cepas de microorganismos obtidos de fontes naturais, ou seus mutantes, que foram especificamente modificados para melhorar a produtividade de L-aminoácido.

Muitas técnicas foram previamente descritas para especificamente melhorar a produtividade de L-aminoácido, como, por exemplo, transformação de microorganismos com DNA recombinante (ver, patente US 4.278.765). Estas técnicas são baseadas em aumento das atividades das enzimas envolvidas em biossíntese de aminoácido e/ou dessenssibilização das enzimas alvo para realimentar a inibição do L-aminoácido produzido (ver, por exemplo, pedido de patente japonesa acessível ao público No. 56-18596 (1981), WO 95/16042 ou patentes US 5.661.012 e 6.040.160). A biossíntese de isoleucina, leucina, e valina ocorre através de uma via ramificada em que três etapas são comuns a cada produto final. A reação AHAS representa a primeira etapa biossintética comum aos três produtos. A reação é catalisada por isoenzimas que são o alvo da inibição do produto final por valina. Esta regulação desempenha um papel principal no controle fisiológico da via em bactérias. A reação inclui a condensação de acetaldeído ativo (derivado de piruvato) com ou a- cetobutirato ou piruvato para dar a-aceto-α- hidroxibutirato (um precursor de isoleucina) ou a-acetolactato (um precursor de leucina e valina), respectivamente.

Foi relatado que valina e seu precursor de ceto-ácido ácido a-cetoisovalérico inibem o crescimento de E. coli Kl2, e que isoleucina é contrária a esta inibição (Tatum, E. Ll, Fed. Proc. 8: 511 (1946)). Atualmente, é comumente aceito que a inibição de valina primariamente resulta do bloqueio da síntese de a-aceto-α- hidroxibutirato. Uma análise de E. coli Kl2 revelou que esta cepa contém os genes estruturais para as três atividades de AHAS, que são designadas como isoenzimas AHAS I, AHAS II e AHAS III. AHAS I e AHAS III são, ambos, inibidos por valina, enquanto AHAS II é resistente à mesma; no entanto, AHAS II não é normalmente expressada em células de E. coli K12 (Guardiola, J et al, Mol. Gen. Genet. 156: 17-25 (1977). Todas as isoenzimas AHAS de enterobactérias são compostas de uma subunidade grande e uma pequena em uma estrutura α2β2, com as grandes subunidades realizando uma função catalítica e as subunidades pequenas realizando uma função regulatória. As subunidades pequenas são absolutamente requeridas para sensibilidade da atividade de enzima para o inibidor de realimentação de valina. Um estudo das propriedades individuais de subunidades AHAS I e AHAS III (Weinstock O. et al, J. Bacteriol. 174: 5560-5566 (1992)) mostraram que as subunidades pequenas especificamente induziram uma conformação competente cataliticamente da enzima completa e estabilizaram o estado de transição.

Com base em um modelo da região de ligação a valina da subunidade pequena regulatória de AHAS III de E. coli, truncagens da extremidade carboxila da subunidade pequena foram feitas. Estas truncagens induziram uma falta de sensibilidade a valina nas enzimas AHAS III truncadas (Mendel S. et al. J. Mol. Biol., 10; 325(2) 275-85 (2003)).

Mas, atualmente, não se tem relatórios descrevendo acetolactato sintase bacteriano mutante (AHAS I) que é resistente à realimentação a valina e o uso desta acetolactato sintase mutante para melhorar a produção de L-aminoácido de cadeia ramificada em cepas produzindo L-aminoácido correspondente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção provê uma nova acetolactato sintase bacteriana mutante para o fim de desenvolver cepas produzindo L-aminoácido de cadeia ramificada com melhorada produtividade de L-aminoácidos de cadeia ramificada e para prover um método para produzir L-aminoácidos de cadeia ramificada usando estas cepas. A presente invenção foi obtida pela construção de nova acetolactato sintase mutante a partir de E. coli. Esta acetolactato sintase mutante de E. coli tem uma mutação na unidade regulatória IIvN, especificamente Asn-17, Ala-30, e/ou Ile-44. Esta acetolactato sintase mutante foi mostrada como melhorando a produção de L-aminoácido de cadeia ramificada quando DNA codificando a enzima mutante é introduzida na cepa produtora de L-aminoácido de cadeia ramificada. E um aspecto da presente invenção prover uma subunidade pequena de acetolactato sintase bacteriana mutante (AHAS I) compreendendo a subunidade pequena de acetolactato sintase de tipo selvagem de Escherichia coli compreendendo uma mutação selecionada dentre o grupo consistindo de : substituir o L-aminoácido na posição 17 e/ou 30 na referida subunidade pequena de acetolactato sintase de tipo selvagem com outro L-aminoácido, substituir a porção N-término a jusante do L-aminoácido na posição 44 na referida subunidade pequena de acetolactato sintase de tipo selvagem com vários L-aminoácidos, e suas combinações, em que referida subunidade pequena mutante de acetolactato sintase é dessenssibilizada para inibição da realimentação por valina. É um outro aspecto da presente invenção prover a subunidade pequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (AHAS I) descrita acima, em que referido L-aminoácido na posição 17 é substituído com um resíduo de lisina. É um outro aspecto da presente invenção prover a subunidade pequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (AHAS I) descrita acima, em que o L-aminoácido na posição 30 é substituído com um resíduo prolina. É um outro aspecto da presente invenção prover a subunidade pequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (AHAS I) descrita acima, em que a referida porção N-término a jusante de L-aminoácido na posição 44 é substituída com arginina e fenilalanina. É um outro aspecto da presente invenção prover a subunidade pequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (AHAS I) descrita acima, em que referido L-aminoácido na posição 17 que é substituído com um resíduo lisina é asparagina. É um outro aspecto da presente invenção prover a subunidade pequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (AHAS I) descrita acima, em que referido L-aminoácido na posição 30, que é substituído com um resíduo de prolina, é alanina. E um outro aspecto da presente invenção prover a subunidade pequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (AHAS I) descrita acima, em que referido L-aminoácido na posição 44, que é substituído com arginina e fenilalanina, é isoleucina. É um outro aspecto da presente invenção prover uma acetolactato sintase bacteriana mutante compreendendo a subunidade pequena descrita acima. É um outro aspecto da presente invenção prover a acetolactato sintase mutante descrita acima, em que referida acetolactato sintase mutante compreende a subunidade grande de Escherichia coli. É um outro aspecto da presente invenção prover a acetolactato sintase bacteriana mutante descrita acima, em que a subunidade pequena inclui deleções, substituições, inserções, ou adições de um ou vários aminoácidos em uma ou mais posições diferentes de posições 17, 30 e/ou 44, e em que referida acetolactato sintase mutante é dessenssilizada para inibição de realimentação por valina. É um outro aspecto da presente invenção prover um DNA codificando para a subunidade pequena mutante da acetolactato sintase descrita acima. É um outro aspecto da presente invenção prover uma bactéria da família Enterobacteriaceae, que contém o DNA descrito acima e tem a capacidade de prover L-aminoácidos de cadeia ramificada. É um outro aspecto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que referidos L-aminoácidos de cadeia ramificada são selecionados dentre o grupo consistindo de L-leucina, L-isoleucina, e L-valina. r E um outro aspecto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que a atividade da acetolactato sintase mutante é melhorada na bactéria. E um outro aspecto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que a bactéria pertence ao gênero Escherichia. E um outro aspecto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que a atividade da acetolactato sintase mutante é melhorada por aumento da expressão do gene acetolactato sintase mutante. É um outro aspecto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que a atividade da acetolactato sintase mutante é melhorada por um método selecionado dentre o grupo consistindo de: a) aumentar o número de cópias do gene de acetolactato sintase mutante, b) modificar uma seqüência de controle de expressão do gene, de modo que a expressão do gene é melhorada, e c) suas combinações. É um outro aspecto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que o número de cópias é melhorado pela integração de cópias múltiplas do gene acetolactato sintase mutante no cromossomo da bactéria. r E um outro aspecto da presente invenção prover um método para produzir L-aminoácídos de cadeia ramificada compreendendo cultivar a bactéria descrita acima em um meio de cultura, e coletar os L-aminoácidos de cadeia ramificada do meio de cultura. É um outro aspecto da presente invenção prover o método descrito acima, em que a bactéria tem melhorada expressão de genes envolvidos em biossíntese de L-aminoácido de cadeia ramificada. r E um outro aspecto da presente invenção prover o método descrito acima, em que referido L-aminoácido de cadeia ramificada é selecionado dentre o grupo consistindo de L-leucina, L-isoleucina, e L-valina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra a construção do plasmídeo pMIV-PjVfaL- iívBN. A figura 2 mostra a estratégia para o seqüencíamento de operon ilvBN33. A figura 3 mostra um alinhamento das seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de ilvN e ilvN33. A seqüência de nucleotídeos é mostrada em letras minúsculas, os aminoácidos em maiúsculas. Uma repetição direta de 34 bp em ilvN33 é mostrada em negrito e marcada com setas. A figura 4 mostra a construção do plasmídeo pM12. A figura 5 mostra a construção do plasmídeo pM12-ter(thr). A figura 6 mostra a construção do cassete integrativo inUS. A figura 7 mostra a construção do plasmídeo pMIV-5JS. A figura 8 mostra a construção do fragmento de DNA cromossômico com o gene ilvBN inativado.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Além disso, a presente invenção será explicada em detalhes. <1> A subunidade pequena mutante de acetolactato sintase e gene ilvN mutante O termo “acetolactato sintase bacteriana” significa a acetolactato sintase de tipo selvagem, ou endógena, presente em bactérias da família Enterobacteriaceae, corinebactérias, bactérias pertencendo ao gênero Bacillus etc. A família Enterobacteriaceae inclui bactérias pertencendo ao gênero Escherichia, Erwinia, Providencia e Serratia. O gene Escherichia é preferido. A expressão “atividade de acetolactato sintase” significa a atividade que catalisa a formação de 2-aceto-2-hidróxi~butirato e CO2 a partir de piruvato e 2-oxobutanoato, ou a formação de 2-acetolactato e CO2 a partir de duas moléculas de piruvato. Esta atividade pode ser medida em extratos bacterianos usando o método de F.C. Stormer e H.E. Umbarger (Biochem. Biophys. Res. Commun. 17, 5, 587- 592 (1964)). A acetohidroxibutanoato sintase I, também chamada acetolactato sintase I (AHAS I) é uma proteína heterotetrâmera que inclui dois domínios catalíticos e dois regulatórios (Weinstock, O. et al, J. Bacteriol. 174 (17), 5560-5566 (1992)). É geralmente aceito que as subunidades grandes (cerca de 60 kDa) são catalíticas, enquanto as pequenas são regulatórias. AHAS I é codificado pelos genes ilvB e ilvN. A substituição de asparagina na posição 17 e/ou a alanina na posição 30 na subunidade pequena de acetolactato sintase de Escherichia coli [EC 4.1.3.18] com qualquer aminoácido, preferivelmente lisina na posição 17, e prolina na posição 30, resulta em uma proteína mutante que é resistente à inibição de realimentação por valina. Também, substituindo a porção N-término a jusante do L-aminoácido na posição 44 com um ou vários aminoácidos, preferivelmente 2 aminoácidos, como arginina e fenilalalina, resulta em uma proteína mutante que é resistente à inibição de realimentação por valina. Um exemplo típico deste mutante é ILvN33 (SEQ ID NO: 11). Vários aminoácidos podem ser substituídos a jusante de posição 44, mas tipicamente podem estar entre 1 a 20, preferivelmente 1 a 10, e mais preferivelmente 2. A subunidade pequena de acetolactato sintase de tipo selvagem que tem uma substituição(ões) na posição 17 e/ou posição 30, ou tem vários aminoácidos substituídos na porção de N-término a jusante da posição 44, pode ser referida como a “subunidade pequena mutante”. A acetolactato sintase contendo a subunidade pequena mutante pode ser referida como a “acetolactato sintase mutante”. Um DNA codificando para a subunidade pequena mutante pode ser referido como o “gene ilvN mutante”. A subunidade pequena de acetolactato sintase sem quaisquer substituições pode ser referida como “subunidade pequena de tipo selvagem”. Uma acetolactato sintase que contém subunidades pequenas de tipo selvagem pode ser referida como uma “acetolactato sintase de tipo selvagem”. Além disso, um DNA codificando a subunidade pequena mutante da presente invenção e uma subunidade grande de acetolactato sintase podem ser referidas como o “gene de acetolactato sintase mutante”. O gene ilvB (sinônimo - b3671) codifica a subunidade grande de acetolactato sintase. O gene ilvB (nucleotídeos complementares a posições de nucleotídeos 3849119 a 3850807; número de acesso do GeneBank NC_000913.2; gi:16129170) está localizado entre o gene zYvJV e o gene ivbL no cromossomo de E. coli K-12. O gene ilvN (sinônimo b3670) codifica a subunidade pequena de acetolactato sintase. O gene ilvN (nucleotídeos complementares a posições de nucleotídeos 3848825 a 3849115; número de acesso do GeneBank NC_000913.2; gi:49175990) está localizado entre os genes uhpA e ilvB no cromossomo de E. coli K-12. A seqüência de nucleotídeos do gene ilvN e a seqüência de aminoácidos de subunidade pequena de acetolactato sintase codificada pelo gene ilvN são mostradas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. Os genes ilvB e ilvN formam o operon ilvBN. A subunidade pequena mutante é obtida por introdução de mutações em um gene ilvN de tipo selvagem usando métodos conhecidos. O operon ilvBN pode ser obtido por PCR (reação de cadeia polimerase, fazer referência a White, T.J. et al, Trends Genet. 5, 185 (1989) usando iniciadores com base na seqüência de nucleotídeos do operon. Os genes codificando para acetolactato sintase de outros microorganismos podem ser obtidos em um modo similar. A subunidade pequena mutante pode incluir deleções, substituições, inserções ou adições de um ou vários aminoácidos em uma ou mais posições diferentes de 17, 30 e/ou 44, desde que a atividade de acetolactato sintase, que contém as subunídades mutantes seja obtida. O número de “vários” aminoácidos difere dependendo a posição na estrutura tridimensional da proteína ou o tipo de resíduos de aminoácidos. Isto é porque alguns aminoácidos são similares entre si em sua estrutura e função dentro de uma proteína, e a inter-mudança destes aminoácidos não afeta muito a estrutura tri-dimensional ou a função da proteína. Assim, a acetolactato sintase mutante da presente invenção pode ser uma que tem homologia de não menos que 70%, preferivelmente 80%, e mais preferivelmente 90%, e mais preferivelmente 95% com relação à seqüência de aminoácidos completa para acetolactato sintase, e que mantém a atividade de acetolactato sintase. Altemativamente, o número de “vários” aminoácidos pode ser 1 a 30, preferivelmente 1 a 15, e mais preferivelmente 1 a 5.

As substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos é/são mutação(ões) conservativa(s) de modo que se mantém a atividade. A mutação conservativa representativa fé uma substituição conservativa. Os exemplos de substituições conservativas incluem substituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de Gin, His ou Lys por Arg, substituição de Glu, Gin, Lys, His ou Asp por Asn, substituição de Asn, Glu ou Gin por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gin, substituição de Asn, Gin, Lys ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr por His, substituição de Leu, Met, Vai ou Phe por Ile, substituição de Ile, Met, Vai ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gin, His ou Arg por Lys, substituição de Ile, Leu, Vai ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por Ser, substituição de Ser ou Ala por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His, Phe ou Trp por Tyr, e substituição de Met, Ile ou Leu por Vai. A subunidade grande de acetolactato sintase codificada pelo gene UvB também pode incluir deleções, substituições, inserções ou adições de um ou vários aminoácidos em uma ou mais posições.

Na presente invenção, a expressão “L-aminoácido na posição 17, 30 e/ou 44” significa um resíduo de aminoácído correspondendo ao resíduo de aminoácido na posição 17, 30 e/ou 44 na seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, que é a seqüência de subunidade pequena de tipo selvagem de E. coli, de acetolactato sintase. Na subunidade pequena de acetolactato sintase a partir de E. coli, o resíduo de aminoácido na posição 17 é asparagina, o resíduo de aminoácido na posição 30 é alanina, e o resíduo de aminoácido na posição 44 é isoleucina. A posição de um resíduo de aminoácido pode mudar. Por exemplo, se um resíduo de aminoácido for inserido na porção N-término, o resíduo de aminoácido na posição 17, 30, e/ou 44 se toma posição 18, 31 e/ou 45. Em tal caso, o resíduo de aminoácido na posição original 17, 30 e/ou 44 é designado como o resíduo de aminoácido na posição 17, 30 e/ou 44 na presente invenção.

Para determinar o L-aminoácido na posição 17, 30 e/ou 44 de uma subunidade pequena de acetolactato sintase de uma bactéria de interesse, a seqüêiicia de aminoácido de subunidade pequena de acetolactato sintase de E. coli (SEQ ID NO: 2) é alinhada com a seqüência de aminoácido da subunidade pequena de acetolactato sintase de bactéria de interesse, e os L-aminoácidos nas posições 17, 30 e/ou 44 na subunidade pequena de acetolactato sintase da bactéria de interesse podem ser determinados. O DNA que codifica por substancialmente a mesma proteína como a subunidade pequena mutante descrita acima é obtido, por exemplo, por modificação da seqüência de nucleotídeos por mutagênese sítio-dirigida de modo que um ou mais resíduos de aminoácidos em um sítio especificado são deletados, substituídos, inseridos ou adicionados, DNA modificado como descrito acima é obtido por tratamentos de mutação convencionalmente conhecidos. Estes tratamentos de mutação incluem o tratamento de um DNA contendo o gene ilvN mutante in vitro, por exemplo com hidroxilamina, e tratando um microorganismo, por exemplo uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia abrigando o gene ilvN mutante, com irradiação ultravioleta ou um agente de mutação conhecido como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) e ácido nitroso.

As substituições, deleções, inserções ou adições de nucleotídeos, como acima descrito, também incluem mutações de ocorrência natural (mutante ou variante), por exemplo, na base de diferenças individuais ou diferenças em espécie ou gênero da bactéria, que contém acetolactato sintase. O DNA que codifica para substancialmente a mesma proteína como a subunidade pequena mutante pode ser obtido por isolamento do DNA que hibridiza com DNA tendo uma seqüência complementar a seqüência de gene ilvN conhecido ou parte do mesmo, sob condições estringentes, e que codifica para uma proteína que forma uma enzima completa tendo atividade de acetolactato sintase, com uma subunidade grande, de uma célula que foi submetida a tratamento de mutação. “Condições estringentes” incluem as sob as quais um híbrido específico, por exemplo, um híbrido tendo homologia de não menos que 60%, preferivelmente não menos que 70%, mais preferivelmente não menos que 80%, ainda mais preferivelmente não menos que 90% e o mais preferivelmente não menos que 95%, é formado e um híbrido não específico, por exemplo, um híbrido tendo homologia menor do que acima, não é formado. Por exemplo, condições estringentes são exemplificadas por lavagem uma vez ou mais, preferivelmente duas ou três vezes, em uma concentração de sal de 1 x SSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 60 °C. A duração de lavagem depende do tipo de membrana usada para blotting, e como uma regra, deve ser a recomendada pelo fabricante. Por exemplo, a duração recomendada de lavagem para a membrana Hybond ™ N+ nylon (Amersham) sob condições estringentes é de 15 minutos. Preferivelmente, a lavagem por ser realizada 2 a 3 vezes. O comprimento da sonda pode ser selecionado de modo apropriado dependendo das condições de hibridização, e é geralmente de 100 bp a 1 kbp.

Para avaliar o grau de homologia de DNA ou proteína, vários métodos de cálculo, como busca BLAST, busca FASTA, e ClustalW, podem ser usados. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) é o algoritmo de busca heurístico empregado pelos programas blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn, e tblastx. Estes programas atribuem significância a suas descobertas usando os métodos estatísticos de Karlin, Samuel e Stephen F. Aítschul (“Methods for assessing the statistical sígnificance of molecular sequence features for using general scoring schemes”, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1990, 87: 2264-68; “Applications and statisties for multiple high scoring segments in molecular sequences”, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993, 90: 5873-7). O método de busca FASTA é descrito por W.R. Pearson (“Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP e FASTA”, Methods in Enzymology, 1990, 183: 63-98). O método ClustalW é descrito por Thompson J.D. Higgins D.G. e Gibson T.J. (“CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673- 4680). . O gene que é capaz de hibridizar sob as condições como descrito acima, inclui genes que tem um códon de parada dentro da região de codificação e genes que são inativos devido à mutação do sítio ativo. No entanto, estas inconveniências podem ser facilmente removidas por ligação do gene com um vetor de expressão comercialmente disponível, e investigando a atividade de acetolactato sintase de enzima completa contendo a proteína expressada. <2> Bactéria da presente invenção A bactéria da presente invenção é uma bactéria produzindo L-aminoácido de cadeia ramificada da família Enterobacteriaceae que contém um DNA que codifica para a subunidade pequena mutante de acetolactato sintase. Além disso, a bactéria da presente invenção é uma bactéria produzindo L-aminoácido de cadeia ramificada da família Enterobacteriaceae que tem uma aumentada atividade de acetolactato sintase mutante. Especificamente, a bactéria da presente invenção é uma bactéria produzindo L-aminoácido de cadeia ramificada da família Enterobacteriaceae, em que a produção de L-aminoácido de cadeia ramificada é aumentada devido à introdução, na bactéria, do gene ilvN mutante que codifica a subunidade pequena mutante da presente invenção. A bactéria da presente invenção é uma bactéria produzindo L-aminoácido de cadeia ramificada pertencendo ao gênero Escherichia, em que a produção de L-aminoácido de cadeia ramificada é aumentada por melhorada da atividade de acetolactato sintase, ou seja acetolactato sintase mutante resistente a valina, na bactéria. Mais concretamente, a bactéria da presente invenção contém o gene ilvN mutante sobre o cromossomo bacteriano ou em um plasmídeo, em que o gene é super-expressado, e esta bactéria tem uma capacidade melhorada para produzir L-aminoácidos de cadeia ramificada. A expressão “bactéria que tem a capacidade de produzir L-aminoácidos de cadeia ramificada” indica uma bactéria que tem a capacidade de causar acúmulo de L-aminoáddos de cadeia ramificada em um meio, como L-leucina, L-isoleucina e L-valina, quando a bactéria da presente invenção é cultivada no meio. A capacidade produtora de L-aminoácido de cadeia ramificada pode ser conferida ou melhorada por criação. A expressão “bactéria que tem a capacidade de produzir L-aminoácido de cadeia ramificada” usada aqui também indica uma bactéria que é capaz de produzir e causar acúmulo, no meio de cultura, de uma quantidade maior de L-aminoácidos de cadeia ramificada do que uma cepa parental ou tipo selvagem, e preferivelmente significa que a bactéria é capaz de produzir e causar acúmulo no meio de não menos que 0,5 g/L, mais preferivelmente não menos que 1,0 g/L dos L-aminoácidos de cadeia ramificada. Os L-aminoácidos exemplares incluem L-leucina, L-isoleucina, e L-valina. A família Enterobacteriaceae inclui bactérias pertencendo aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella e Yersinia, etc.. Especificamente, os classificados como Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada na base de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?Íd=91347) pode ser usado. Uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia ou Pantoea is preferida. O termo “uma bactéria um pertencendo ao gênero Escherichia” significa a bactéria classificada como o gênero Escherichia de acordo com a classificação bem conhecida do versado em microbiologia. Um exemplo é Escherichia coli (E. coli). A expressão “atividade da acetolactato sintase mutante é melhorada” significa que a atividade por célula é maior do que a da cepa não modificada, por exemplo uma cepa de tipo selvagem. As atividades melhoradas exemplares incluem quando o número das moléculas de acetolactato sintase mutante por célula aumentada, e quando a atividade específica por molécula de acetolactato sintase mutante aumentada, e assim em diante. Além disso, uma cepa de tipo selvagem exemplar que pode ser usada para comparação, por exemplo, é Escherichia coli KI-12. Como um resultado da melhora da atividade intracelular da acetolactato sintase mutante, a quantidade de L-aminoácidos de cadeia ramificada no meio é aumentada. A atividade de acetolactato sintase mutante em uma célula bacteriana pode ser melhorada por aumento da expressão do gene codificando para a acetolactato sintase mutante. Qualquer gene que codifica para acetolactato sintase mutante derivada ou isolada de bactérias da família Enterobacteriaceae ou bactérias corineformes pode ser usado. Dentre estes, genes derivados de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia são preferidos. A transformação de uma bactéria com um DNA codificando para uma proteína significa introduzir o DNA em uma bactéria, por exemplo, por métodos convencionais, para aumentar a expressão do gene codificando para a proteína da presente invenção e para melhorar a atividade da proteína na célula bacteriana.

Os métodos para melhorar a expressão de genes incluem aumentar o número de cópias de genes. A introdução de um gene em um vetor que é capaz de funcionar em uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia aumenta o número de cópias do gene. Para estes fins, vetores de múltiplas cópias podem ser preferivelmente usados, como pBR322, pUC19, pBluescript KS+, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b, ou outros. A expressão dos genes também pode ser melhorada por introdução de cópias múltiplas do gene no cromossomo bacteriano por, por exemplo, recombinação homóloga, ou outros. A expressão de genes também pode ser melhorada por colocação do DNA da presente invenção sob o controle de um promotor que é mais forte do que o promotor nativo. A potência de um promotor é definida pela freqüência de iniciação de síntese de RNA. Os métodos para avaliar a potência de um promotor e exemplos de promotores potentes são descritos por Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength índicates altemate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994). Por exemplo, o promotor PR é conhecido como um promotor constitutivo potente. Outros potentes promotores conhecidos são o promotor PL) promotor lac, promotor trp, promotor trc, do fago lambda, e semelhantes. A tradução pode ser melhorada por introdução no DNA da presente invenção de uma seqüência de Shine-Dalgamo mais eficiente (seqüência SD) em vez da seqüência SDe nativa, quando a seqüência SD está a montante do códon de partida do mRNA que interage com o 16S RNA de ribossoma (Shine J. e Dalgamo L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1974, 71, 4, 1342-6).

Uso de um promotor potente pode ser combinado com o uso de cópias de genes múltiplas.

Os métodos para preparar DNA cromossômico, hibridização, PCR, preparação de DNA plasmídeo digestão e ligação de DNA, transformação, seleção de um oligonucleotídeo como um iníciador, e outros, podem ser métodos típicos que são bem conhecidos dos versados. Estes métodos são descritos em Sambrook, J., e Russell D., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3a. ed.”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), e semelhantes. A bactéria da presente invenção pode ser obtida por introdução dos DNAs acima mencionados em uma bactéria que é inerentemente capaz de produzir L-aminoácidos de cadeia ramificada. Altemativamente, a bactéria da presente invenção pode ser obtida ao conferir a capacidade de produzir L-aminoácido de cadeia ramificada em uma bactéria já contendo os DNAs.

Para a cepa parental da presente invenção, as bactérias produzindo L-valina pertencendo ao gênero Escherichia como H-81 (VKPM B- 8066), NRRL B-12287 e NRRL B-12288 (Patente US 4.391.907), VKPM B-4411 (Patente US 5.658.766), VKPM B-7707 (pedido de patente européia EP1016710A2), ou semelhantes são empregadas. Também, bactérias produzindo L-leucina pertencendo ao gênero Escherichia podem ser usadas, como H-9070 (FERM BP-4704) e H-9072 (FERM BP-4706) (US5744331), VKPM B-7386 e VKPM B-7388 (RU2140450), W1485atpA401/pMWdAR6, W14851ip2/pMWdAR6 e AJ12631/pMWdAR6 (EP0872547), ou semelhantes. Também, bactérias produzindo L-isoleucina pertencendo ao gênero Escherichia podem ser usadas, como cepas (NZ10) TDH6/pVIC40, pMWD5 (Hashiguchi, K. et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(4), 672-679 (1999)), ou cepa AJ12919 descritas em pedido de patente européia EP 685555 Al, ou semelhantes. <3> Método da presente invenção. O método da presente invenção inclui produzir um L- amínoácido de cadeia ramificada, como L-leucina, L-isoleucina, e L-valina, por cultivo da bactéria da presente invenção em um meio de cultura, permitindo que o L-aminoácido de cadeia ramificada seja produzido no meio de cultura, e coleta do L-aminoácido de cadeia ramificada do meio de cultura.

Na presente invenção, o cultivo, a coleta e purificação dos L-aminoácidos de cadeia ramificada do meio e outros podem ser realizados em um modo similar aos métodos de fermentação convencionais, em que um aminoácido é produzido usando um microorganismo. O meio usado para a cultura pode ser ou sintético ou natural, desde que ele inclua uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio e minerais e, se necessário, quantidades apropriadas de nutrientes que o microorganismo requer para crescimento. A fone de carbono pode incluir vários carboidratos como glicose e sacarose, e vários ácidos orgânicos. Dependendo do modo de assimilação do microorganismo selecionado, álcool incluindo etanol e glicerol pode ser usado. Como a fonte de nitrogênio, vários sais de amônio como amônia e sulfato de amônio, outros compostos de nitrogênio como aminas, uma fonte de nitrogênio natural como peptona, hidrolisado de soja e microorganismo fermentativo digerido são usados. Como minerais, monofosfato de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, cloreto de cálcio, e outros, são usados. Os nutrientes adicionais podem ser adicionados ao meio, se necessário. Por exemplo, se o microorganismo requerer prolina para crescimento (auxotrofia de prolina), uma quantidade suficiente de prolina pode ser adicionada ao meio. O cultivo é realizado preferivelmente sob condições aeróbicas como cultura em agitação, e uma cultura em agitação com aeração, a uma temperatura de 20 a 42°C, preferivelmente 37 a 40°C. O pH da cultura está geralmente entre 5 e 9, preferivelmente entre 6.5 e 7.2. O pH da cultura pode ser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases, e tampões. Geralmente, um cultivo de 1-5 dias leva ao acúmulo do L- aminoácido alvo no meio líquido.

Após cultivo, os sólidos como as células podem ser removidos do meio líquido por centrifugação ou filtração de membrana, e então o L-aminoácido alvo pode ser coletado e purificado por métodos de troca iônica, concentração e cristalização.

Exemplos A presente invenção será mais concretamente explicada abaixo com referência aos seguintes exemplos não Hmitativos.

Exemplo 1. Clonagem de operon ilvBN codificando AHAS I de E. coli O operon ilvBN foi clonado no vetor pMIVSJS como uma parte de um produto PCR de 2439 bp. Construção do vetor pMIV5JS é descrita abaixo em exemplo de referência 1. O cromossomo MG 1655 foi usado como um gabarito na reação PCR. Oligonucleotídeos sintéticos ilvBX60 (SEQ ID NO: 3) e ilvBR64 (SEQ ID NO: 4) foram usados como iniciadores. Iniciador ilvBXóO contém o sítio de restrição Xbal na extremidade 5’, e iniciador ilvBR64 contém o sítio de restrição Sall- na extremidade 5’. Condições para PCR foram as seguintes: desnaturação durante 5 min a 94°C; perfil para 30 ciclos: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 59°C, 2 min a 72°C; etapa final: 7 min a 72°C. O produto PCR de 2449 bp foi purificado em um gel agarose, tratado com Xbal e Sall, e clonado no vetor pMIV5JS que tinha sido tratado com as mesmas restrictases. A cepa B7AilvBNAilvGMAilvIH foi usada como o recipiente para clonagem. Construção da cepa B7ΔΠνΒΝΔϋvGMAi 1 vIH é descrita abaixo no exemplo de referência 2. O plasmídeo resultante pMIV- PívbL-ilvBN (Fig. 1) complementou o fenótipo AHAS" da cepa B7AilvBNAilvGMAilvIH.

Exemplo 2. Criação de mutantes resistentes a valina de acetolactato sintase isoforma I de E. coli (IlvBNValR) A cepa B7AilvBNAílvGMAilvIH/pMIV-PivbL-ílvBN descrita no Exemplo 1 contém somente um operon codificando AHAS (ilvBN operon).

Mutantes espontâneos resistentes a valina foram selecionados em placas com meio mínimo e suplementados com 1 g/1 de valina. A atividade de acetolactato sintase e resistência de enzimas a inibição de L-valina foram determinadas em extratos brutos pelo método de F.C. Stomer e H.E. Umbarger (Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592 (1964)). Para os extratos brutos, as células foram cultivadas em meio mínimo M9 até o final da fase logarítmica, lavadas com tampão 100 mM KH2PO4/K2HPO4 suplementado com 100 mM KC1, pH 7.0. Os extratos celulares brutos foram preparados por sonicação das células no mesmo tampão. Os plasmídeos isolados dos mutantes resistentes a valina selecionados foram usados para re-transformação da cepa deficiente em AHAS B7AilvBNAilvGMAilvIH. Como um resultado, o plasmídeo pMIV- PiVbL-ilvBNValR33 foi obtido, que forneceu o crescimento resistente a valina da cepa recipiente deficiente em AHAS. Este plasmídeo contém um operon codificando AHAS I resistente a inibição de valina. A atividade residual de AHAS na presença de L-valina lOmM foi medida. A atividade de AHAS residual é igual à atividade na presença de L-valina (nmol/min'mg) * 100% / a atividade na ausência de L-valina (nmol/min mg). Atividade de AHAS foi medida pelo método de F.C. Stormer e H.E. Umbarger (Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592 (1964)). Resultados da medida de atividade de AHAS para esta cepa são apresentados na tabela 1.

Exemplo 3. Seqüência de nucleotídeos do gene codificando AHAS I resistente a valina Cinco oligonucleotídeos foram usados para sequenciar o fragmento de DNA ilvBN clonado em pMIV-PivbL-ilvBN33: ML74 (SEQ ID NO: 5), LattRSl (SEQ ID NO: 6), ilvbS31 (SEQ ID NO: 7), ilvbS32 (SEQ ID NO: 8), e ilvbS33 (SEQ ID NO: 9). A estratégia de seqüenciamento é apresentada na Fig.2.

A seqüência resultante é mostrada como ilvBN33 (SEQ ID NO: 10) na Listagem de Seqüências. Comparação desta seqüência com programas de cálculo revelaram uma repetição direta de 34 nucleotídeos na região de codificação para a subunidade pequena. O gene mutante foi chamado z7vN33 (Fig. 3). Este rearranjo de DNA levou a uma terminação da tradução prematura, resultando na substituição da porção de N-término a jusante da isoleucina na posição 44 com argínina e fenilalanina, que forma a proteína truncada de 45 aminoácidos IlvN33 (SEQID NO: 11).

Exemplo 4. Integração do operon PivbL-UvBNVaIR33 no cromossomos de cepa deficiente em AHAS, seguido por eliminação do marcador cat 1. Integração dos genes cat-PiVbL-ilvBNVaIR33 no cromossomo Para integrar mini-Mu::cat-PjVbL-ilvBNValR33 no cromossomo bacteriano, procedimentos padrões foram usados. pMIV- PjvbL-ilvBNValR33 foi introduzido nas células B7AilvBNAilvGMAilvIH/pMH10. Mu transposase codificado por derivado de pMHIO (pACYC177 abrigando gene KmR, genes de fagos Mu- A e B codificando Mu transposase, gene cts62 codificando repressor Mu, e o gene repressor de fago-lambda cI857) (patente européia EP1149911) foram induzidos por incubação durante 20 min a 44°C imediatamente após a transformação.

Clones resistentes a cloranfenicol (CmR) foram selecionados a 30°C em placas de agar LB contendo 20 mg/1 cloranfenicol. Após eliminar ambos os plasmídeos por cultivo destes clones em LB, clones Cm Km Ap foram obtidos que eram capazes de crescer em meio mínimo sem adições.

Como um resultado, a cepa B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::cat-PiVbL-ilvBNValR33 contendo o cassete integrado mini-Mu::cat-PivbL-ilvBNVaiR33 em um locus cromossômico não identificado foi obtida. 2. Eliminação do marcador de resistência a cloranfenicol da cepa B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::cat-PiVbL-ilvBNValR33 Para eliminar o marcador de resistência a cloranfenicol de B7AilvBNAÍlvGMAilvIH, células mini-Mu::cat-PivbL-ilvBNValR33 foram transformadas com o plasmídeo pMW118-int-xis (ApR) (W02005/010175). Os clones ApR foram cultivados em placas de agar LB contendo 150 mg/1 ampicilina a 30°C. Várias dezenas de clones de ApR foram tomadas e testadas para sensibilidade a cloranfenicol. O plasmídeo pMWl 18-int-xis foi eliminado de células Cms por incubação em placas de agar LB a 42°C. Como um resultado, a cepa Β7Δΐ1νΒΝΔί1νΟΜΔΐ1νΙΗ mini-Mu::PivbL-ilvBNValR33 contendo o cassete integrado mini-Mu::PivbL- ilvBNValR33 em um locus cromossômico não identificado foi obtida. Atividade residual de AHAS na presença de lOmM L-valina foi medida. Resultados das medidas de atividade de AHAS para esta são apresentados na tabela 1.

Exemplo 5. Substituição do promotor nativo de operon ilvBNValR33 com uma região de regulador artificial 1. Modificação da região de regulador do operon ilvBNValR33 Modificação da região de regulador do operon ilvBNValR33, ou seja a substituído da região de promotor nativa do operon ilvBN com o promotor Pl, foi obtida pelo método primeiro desenvolvido por Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97(12), 6640-6645) chamado “Red-driven integration”. De acordo com este procedimento, os iniciadores de PCR ilvB-attRl (SEQ ID NO: 12) e ilvB-PLSD (SEQ ID NO: 13) foram construídos. Oligonucleotídeo ÍlvB-attRl (SEQ ID NO: 12) é homólogo à região a montante do gene ilvB e a região adjacente ao gene conferindo resistência a antibiótico presente no DNA cromossômico de BW25113 cat-PL-yddG. Oligonucleotídeos ilvB-PLSD (SEQ ID NO: 13) é homólogo a tanto a região ilvB como a região a jusante do promotor PL presente no cromossomo de BW25113 cat-PL-yddG. A obtenção de BW25113 cat-Pt-yddG foi descrita em detalhes (EP1449918Al, patente russa RU2222596). O DNA cromossômico de cepa BW25113 cat-PL-yddG foi usado como um gabarito para PCR. Condições para PCR foram as seguintes: desnaturação durante 3 min a 95 °C; perfil para os dois primeiros ciclos: 1 min a 95°C, 30 segundos a 34°C, 40 segundos a 72°C; perfil para os últimos 30 ciclos: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 50°C, 40 segundos a 72°C; etapa final: 5 min a 72°C. Como um resultado, o produto PCR foi obtido (SEQ ID NO: 14), purificado em gel agarose, e usado para eletroporação da cepa de E. coli B7AilvBNAilvGMAilvIHminÍ-Mu::PivbL-ilvBNValR33, que contém o plasmídeo pKD46 com uma origem de replicação sensível a temperatura. O plasmídeo pKD46 (Datsenko e Wanner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97:12:664045) inclui o fragmento de DNA 2,154 nt (31088-33241) de fago λ (número de acesso GenBank J02459), contendo os genes do sistema de recombinação homólogo λ Red (genes γ, β, exo) sob o controle do promotor de ParaB indutível por arabinose. O plasmídeo pKD46 é necessário para integração do produto PCR no cromossomo da cepa B7AilvBNAÍlvGMAilvIH mini-Mu::PivbL-ilvBNValR33.

As células eletrocompetentes foram preparadas como a seguir: E. coli cepa B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::PivbL-ilvBNValR33 foi cultivada durante a noite a 30°C em meio LB contendo ampicilina (100 mg/1), e a cultura foi diluída em 100 vezes com 5 ml de meio SOB (Sambrook et al, “Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a. ed.”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) com ampicilina e L-arabinose (1 mM). As células foram cultivadas com aeração a 30°C a um ODgoo de «0.6 e então tomadas eletrocompetentes por concentração de 100 vezes e lavagem três vezes com H2O deionizado resfriado em gelo. Eletroporação foi realizada usando 70 μΐ de células e «100 ng de produto PCR. Após a eletroporação, as células foram incubadas com 1 ml de meio SOC (Sambrook et al, “Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a. ed.”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) a 37 °C durante 2.5 h, colocadas em placas de L-agar, e cultivadas a 37 °C para selecionar recombinantes de CmR. Então, para eliminar o plasmídeo pKD46, 2 passagens em L-agar com Cm a 42 °C foram realizadas e as resultantes colônias foram testadas para sensibilidade a ampicilina.

2. Verificação da modificação da região de regulador ilvBN O clone B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::cat-PL-ilvBNValR33 foi obtido, que contém o cassete mini-Mu::cat-PL-ilvBNValR33 com o operon ilvBNValR33 mutante codificando o AHAS I resistente a realimentação sob o controle do promotor do fago lambda Pl, marcado com o gene de resistência a Cm. A substituição da região ilvBN nativa de regulador com o promotor Pl, marcado com o gene de resistência a Cm, foi verificada por PCR. O iniciador específico da fixação à direta do fago Mu MR74 (SEQ ID NO: 15) e o iniciador especifico para o gene cloranfenicol acetiltransferase Cm-test2 (SEQ ID NO: 16) foram usados em PCR para a verificação. Condições para verificação de PCR foram as seguintes: desnaturação durante 3 min a 94°C; perfil para os 30 ciclos: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C, 1 min a 72°C; etapa final: 7 min a 72°C. O produto PCR obtido usando as células de Β7Δΐ1νΒΝΔΐ1νΘΜΔί1νΙΗ mini-Mu::cat-PivbL-ilvBNValR33 como um gabarito foi 586 nt em comprimento (SEQ ID NO: 17). O produto PCR obtido usando as células de B7AÍlvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::cat-PL-ilvBNValR33 como um gabarito tinha 879 nt em comprimento (SEQ ID NO: 18). A atividade de AHAS residual na cepa B7AiIvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::cat-PL-ilvBNValR33 cepa na presença de lOmM L-valina foi medida. Resultados das medidas de atividade de AHAS para esta cepa são apresentados na tabela 1. Tabela 1.

Exemplo 6. Produção de L-valina pelas cepas de E. coli com AHAS I resistente a valina Ambas as cepas de E. coli B7AÍlvBNAilvGMAÍlvIH mini- Mu: :PivbL-ilvBNValR33 e B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::cat-PL-ilvBNValR33 foram cultivadas durante 18 horas a 37 °C em placas de L-agar. Então, as células de cerca de 0.5 cm2 da superfície da placa foram introduzidas no meio de fermentação (2ml) e cultivadas em tubos com aeração durante 72 horas a 32 °C. Para a cepa deficiente em AHAS auxotrófica B7AilvBNAüvGMAilvIH, o meio de fermentação foi adicionalmente suplementado com 100 pg/ml de cada dentre isoleucina e valina. A L-valina acumulada foi medida por TLC. Os resultados são apresentados na tabela 2. A composição do meio de fermentação (g/í): Glicose 60,0 (NH4)2S04 18,0 KH2P04 3H20 2,0 MgS047H20 1,0 CaC03 25,0 Tiamina 0,02 Mameno 4,0 Tabela 2.

Como mostrado em Tabela 2, expressão de AHAS I resistente a valina resultou na produção de valina. Operon PivbL-ilvBNValR33 é controlado por atenuação de transcrição e AMP cíclico. Substituição da região nativa de regulador do operon ilvBNValR33 (incluindo eliminação do gene (ivbL) codificando o peptídeo líder ) em cepa de E. coli B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::PivbL-ilvBNValR33 com o promotor PL de fago lambda aumentou a produção de L-valina em 1,5 vezes.

Exemplo 7. Novos mutantes resistentes a valina de E. coli AHAS I com expressão de ilvBN modificada A região de regulador nativo do operon ilvBN foi substituída com o promotor de fago lambda PL pelo mesmo método como descrito no Exemplo 5 em cepa B7 ΔΠνΙΗ AilvGM (ver Exemplo de referência 2, seção 5). Esta cepa tinha somente AHAS I. A cepa resultante B7 ΔϋνΙΗ ΔΐΙνθΜ cat-PL-ilvBN foi sensível a valina. Novos mutantes espontâneos resistentes a valina de AHAS I foram obtidos a partir desta cepa. Cepas que crescem melhor em 1 g/1 def valina foram caracterizadas (Tabela 3).

Tabela 3.

As mutações resistentes a valina que eram resistentes a isoleucina foram obtidas também. Variantes com uma atividade específica maior do que a de tipo selvagem foram obtidas. Como visto na Tabela 4, expressão de AHAS I resistente a valina resultou na produção de valina. O meio de fermentação continha 6 % glicose. As seqüências de nucleotídeos dos operons mutantes para os dois melhores mutantes, ilvBN ValRl e ilvBN ValR4, foram determinadas. Foi revelado que IlvBN ValRl continha uma mutação de um ponto em IlvN: A30P Ala-Pro (Ala na posição 30 é substituída com Pro; codon gcc correspondente foi substituído com ccc), e IlvBN ValR4 também continha uma mutação de um ponto em IlvN: N17K Asn-Lys (Asn na posição 17 é substituído com Lys; codon aac correspondente foi substituído com aag). Em ambos os casos, estas substituições foram raras. Tabela 4.

Exemplo 8. Produção de L-leucina pelas cepas de E. coli com AHAS I resistente a valina O cassete cat-PL-üvBN ValR4 foi introduzido em cepa 57 de E. coli produzindo L-leucina (patente russa RU 2140450, VKPM B-7386). Para este fim, a cepa E. coli 57 foi infectada com fago PIVir cultivado na cepa doadora B7 ΔΠνΙΗ AilvGM cat-PL-ilvBNValR4. Os transdutores foram selecionados em placas de L-agar suplementadas com cloranfenícol (20 pg/ml). A cepa 57 foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rússia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1) em 29 de maio de 1997 sob o número de acesso VKPM B-7386.

Ambas as cepas de E. coli 57 e 57 cat-PL,-üvBNValR4 foram cultivadas como mostrado em Exemplo 6. A L-leucina acumulada foi medida por TLC. Resultados são apresentados na tabela 5.

Tabela 5 Como mostrado na Tabela 5, cepa 57 cat-PL-ilvBNValR4 produziu uma maior quantidade de L-leucina.

Exemplo de referência 1. Construção do plasmídeo pMIV5JS PMIV-5JS foi construído de acordo com o seguinte esquema. Primeiro, plasmídeo pM12 foi construído por integração in vivo de um a cassete de integração derivado de Mu no plasmídeo pMWl, que é um derivado de pMW119 (Fig. 4). Duas seqüências de oligonucleotídeos terminadores complementares um a cada outro foram sintetizadas (SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20). Terminador thrL foi obtido por anelamento destes oligonucleotídeos sintéticos nas direções dianteira (SEQ ID NO: 19) e reversa (SEQ ID NO: 20). Terminador thrL· foi flanqueado com os sítios Hindlll e PVl. Então, plasmídeo pM12-ter(thr) foi construído por inserção da sequência de terminador sintético Ter(í/zr}em pM12 que tinha sido digerido com HindIII e Mphll03I (Fig. 5). O cassete integrativo intJS foi construído como a seguir (Fig. 6): a) um fragmento LattL 0,12 kbp foi obtido por amplificação PCR usando um iniciador a montante (SEQ ID NO: 21) (o sítio para Bglll é sublinhado), e um iniciador a jusante fosforilado (SEQ ID NO: 22). Plasmídeo pMW118-attL-tet-attR-ter_rmB foi usado como um gabarito (W02005/010175); b) um fragmento CmR 1,03 kbp foi obtido por amplificação PCR usando um iniciador a montante fosforilado (SEQ ID NO: 23), e um iniciador a jusante (SEQ ID NO: 24) (o sítio para Pstl é sublinhado). Plasmídeo pACYC184 foi usado como um gabarito; c) um fragmento LattR 0,16 kbp foi obtido por amplificação PCR usando um iniciador a montante (SEQ ID NO: 25) (o sítio para Rsíl é sublinhado), e um iniciador a jusante (SEQ ID NO: 26) (o sítio para Saci é sublinhado). Plasmídeo pMW118-attL-tet-attR-ter_rmB foi usado como um gabarito; d) fragmentos LattL e CmR foram ligados e o fragmento LattL-CmR 1.15 kbp resultante foi purificado; e) fragmentos LattL-CmR e LattR foram digeridos por Pstl, ligados, e o fragmento LattL-CmR-LattR 1,31 kbp resultante foi purificado; f) um fragmento DNA 70 bp duplo filamento contendo sítios de clonagem múltiplos (MCS) foi obtido por anelamento de dois oligonucleotídeos sintetizados: oligonucleotídeos tendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 27 e outros oligonucleotídeos tendo uma seqüência complementar a SEQ ID NO: 27; g) fragmentos LattL-CmR-LattR e MCS foram digeridos por Saci, ligados, e o cassete LattL-CmR-LattR-MCS 1,38 kbp resultante foi purificado;

Para a última etapa, o fragmento LattL-CmR-LattR-MCS foi digerido por BglII e HindIII e clonado em pM12-ter(thr) que tinha sido digerido com BamHI e HindIII para dar o plasmídeo pMIV-5JS (Fig. 7). Exemplo de referência 2. Construção de uma cepa com genes acetolactato sintases inativados 1. Deleção de operon ilvBN O operon ilvBN foi deletado pelo método primeiro desenvolvido por Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97(12), 6640-6645) chamado como “Red-driven integration”. De acordo com este procedimento, os iniciadores de PCR ilvBNl (SEQ ID NO: 28) e ilvBN2 (SEQ ID NO: 29) homólogos tanto à região adjacente ao operon ilvBN como ao gene conferindo resistência a cloranfenicol no plasmídeo de gabarito foram construídos. O plasmídeo pMW-attL-Cm-attR (Pedido PCT WO 05/010175) foi usado como um gabarito na reação PCR. Condições para PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação durante 3 min a 95°C; perfil para os dois primeiros ciclos: 1 min a 95°C, 30 segundos a 34°C, 40 segundos a 72°C; perfil para os últimos 30 ciclos: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 50°C, 40 segundos a 72°C; etapa final: 5 min a 72°C. O produto PCR 1713 bp resultante foi purificado em gel agarose e usado para eletroporação da cepa de E. coli MG 1655, que contém o plasmídeo pKD46 com uma origem de replicação sensível a temperatura. O plasmídeo pKD46 (Datsenko e Wanner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97:12:6640-45) inclui um fragmento de DNA 2,154 nt (31088-33241) de fago λ (número de acesso GenBarik J02459), que contém genes do sistema de recombinação homólogo λ Red (genes y, β, exo) sob o controle do promotor ParaB indutível a arabinose. O plasmídeo pKD46 é necessário para integração do produto PCR no cromossomo da cepa de E. coli MG 1655. Células eletrocompetentes foram preparadas como a seguir: cultura noturna de E. coli MG1655/pKD46 cultivada a 30 °C em meio LB, suplementado com ampicilina (100 mg/1), foi diluída em 100 vezes com 5 ml de meio SOB (Sambrook et al, “Molecular Cloning A Laboratory Manual,2a. ed.”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) com ampicilina e L-arabinose (1 mM). A cultura foi cultivada com aeração a 30°C a um ODgoo de «0.6 e então tomada eletrocompetentes por concentração de 100 vezes e lavagem três vezes com H2O deionizado resfriado em gelo. A eletroporação foi realizada usando 70 μΐ de células e «100 ng de produto PCR. As células após eletroporação foram incubadas coml ml de meio SOC (Sambrook et al, “Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a. ed. ”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) a 37 °C durante 2.5 h, colocadas em L-agar, e cultivadas a 37 °C para selecionar recombinantes CmR. Então, para eliminar 0 plasmídeo pKD46, 2 passagens em L-agar com Cm a 42°C foram realizadas e as colônias resultantes foram testadas para sensibilidade a ampicilina. Assim, a cepa mutante MG 1655 AilvBN::cat com um operon ilvBN inativado foi construída. 2. Verificação de deleção de operon ilvBN por PCR.

Mutantes com o operon ilvBN deletado e marcado com 0 gene de resistência a CM foram verificados por PCR. Inicíadores específicos de locus ilvBNC5 (SEQ ID NO: 30) e ilvBNCó (SEQ ID NO: 31) foram usado em PCR para a verificação. Condições para verificação PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação durante 3 min a 94°C; perfil para os 30 ciclos: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 53°C, 1 min a 72 °C; etapa final: 7 min a 72 °C. O produto PCR obtido na reação usando o DNA cromossômico de cepa ilvBN4-parental MG1655 como um gabarito tinha 2275 nt de comprimento. O produto PCR obtido na reação usando o DNA cromossômico de cepa mutante MG 165 5 AilvBN::cat como um gabarito tinha 1995 nt de comprimento (Figure 8).

3. Deleção de operon ilvlH O operon ÜvIH foi deletado pelos mesmos métodos como a deleção do operon ilvBN descrita em Seção 1. De acordo com este procedimento, os iniciadores PCR ilvIHl (SEQ ID NO: 32) e ilvIH2 (SEQ ÍD NO: 33) homólogos a tanto a região adjacente ao operon ilvIH como o gene conferindo resistência a cloranfenicol no plasmídeo de gabarito foram construídos. O plasmídeo pMW-attL-Cm-attR (pedido PCT WO 05/010175) foi usado como um gabarito na reação PCR. Condições para PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação durante 3 min a 95°C; perfil para os dois primeiros ciclos: 1 min a 95°C, 30 segundos a 34°C, 40 segundos a 72°C; perfil para os últimos 30 ciclos: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 50°C, 40 segundos a 72°C; etapa final: 5 min a 72°C. O produto PCR de 1713 bp foi purificado em um gel agarose e usado para eletroporação da cepa de E. coli MG1655/pKD46.

Recombinantes resistentes a cloranfenicol foram selecionados após eletroporação e verificados por meio de PCR com os iniciadores específicos de locus ilvIHC3 (SEQ ID NO: 34) e ilvIHC4 (SEQ ID NO: 35). Condições para verificação de PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação durante 3 min a 94°C; perfil para os 30 ciclos: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 53°C, 1 min 20 segundos a 72°C; etapa final: 7 min a 72°C. O produto PCR obtido na reação usando o DNA cromossômico de cepa IlvIHT parental MG1655B7 AüvBN::cat como um gabarito tinha 2491 nt de comprimento. O produto PCR obtido na reação usando o DNA cromossômico de cepa mutante MG1655B7 AilvBN::cat ΔϋνΙΗ: :cat como um gabarito tinha 1823 nt de comprimento. Como um resultado, a cepa MG 1655 AilvIH::cat foi obtida.

4. Deleção de operon ilvGM O operon ilvGM foi deletado pelos mesmos métodos que a deleção de operon ilvBN descrita em Seção 1. De acordo com este procedimento, os iniciadores de PCR, ilvGM 1 (SEQ ID NO: 36) e ilvGM2 (SEQ ID NO: 37), homólogos tanto à região adjacente ao operon ilvGMcomo o gene conferindo resistência a cloranfenicol no plasmídeo gabarito foram construídos. O plasmídeo pMW-attL-Cm-attR (pedido PCT WO 05/010175) foi usado como um gabarito na reação PCR. Condições para PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação durante 3 min a 95°C; perfil para os dois primeiros ciclos: 1 min a 95°C, 30 segundos a 34°C, 40 segundos a 72°C; perfil para os últimos 30 ciclos: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 50°C, 40 segundos a 72°C; etapa final: 5 min a 72°C. O produto PCR de 1713 bp foi purificado em um gel agarose e usado para eletroporação da cepa de E. coli MG1655/pKD46. Recombinantes resistentes a cloranfenicol foram selecionados após eletroporação e verificados por PCR com os iniciadores específicos de locus ilvGMC3 (SEQ ID NO: 38) e ilvGMC4 (SEQ ID NO: 39). Condições para verificação PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação durante 3 min a 94°C; perfil para os 30 ciclos: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 54°C, 1 min 30 segundos a 72°C; etapa final: 7 min a 72°C. O produto PCR obtido na reação usando o DNA cromossômico de cepa MG1655 parental como um gabarito tinha 2209 nt de comprimento. O produto PCR obtido na reação usando o DNA cromossômico de cepa MG1655 AilvGM::cat mutante como um gabarito tinha 1941 nt de comprimento. Como um resultado, a cepa MG1655 AilvGM::cat foi obtida. 5. Construção de cepas com os genes de acetolactato sintase inativados (Combinação de deleçoes de AilvBN, AilvIH e AilvGM).

Os genes ilvIH (AilvIH: :cat) foram deletados em cepa de tipo selvagem E. coli Kl2 (VKPM B-7) por transdução de PI (Sambrook et al, “Molecular Cloning A Laboratory Manual,2a. ed.”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). A cepa de E. coli MG1655 AilvIH::cat descrita em Seção 3 foi usada como uma cepa doadora, e transdutores CmR foram selecionados. Como um resultado, a cepa B7 AilvIH: :cat foi obtida. Para eliminar o marcador de resistência a cloranfenicol de B7 AilvIH: :cat, células foram transformadas com o plasmídeo pMW118-int-xis (ApR) (W02005/010175). Clones ApR foram cultivados em placas de agar LB contendo 150 mg/1 ampicilina a 30°C. Várias dezenas de clones ApR foram tomadas e testadas para sensibilidade a cloranfenicol. O plasmídeo pMWl 18-int-xis foi eliminado das células Cm por incubação em placas de agar LB a 42°C. Como um resultado, a cepa B7 AilvIH foi obtida.

Os genes ilvBN (AilvBN::cat) foram deletados na cepa de E. coli B7 AilvIH por transdução de Pl. A cepa de E. coli MG1655 AilvBN::cat descrita em Seção 1 foi usada como uma cepa doadora, e transdutores CmR foram selecionados. Como um resultado, a cepa B7 AilvIH AilvBN::cat foi obtida. O marcador de resistência a cloranfenicol foi eliminado de B7 AilvIH AilvBN::cat como descrito acima. Como um resultado, a cepa B7 AilvIH AilvBN foi obtida.

Os genes ilvGM genes (AilvGM::cat) foram deletados nas cepas de E. coli B7 AilvIH por transdução de Pl. A cepa de E. coli MG 1655 AilvGM::cat descrita em Seção 4 foi usada como uma cepa 'doadora, e transdutores de CmR foram selecionados. Como um resultado, a cepa B7 AilvIH AilvGM::cat foi obtida. O marcador de resistência a cloranfenicol foi eliminado de B7 AilvIH AilvGM::cat como descrito acima. Como um resultado, a cepa B7 AilvIH AilvGM foi obtida. A cepa B7 AilvIH AilvGM era prototrófica, assim a deleção de genes ilvGM genes não evitou a expressão dos genes distais do operon isoleucina-valina.

Os genes ilvGM (AilvGM: :cat) foram deletados nas cepas de E.coli B7 AilvIH AilvBN por transdução de Pl. A cepa de E. coli MG1655 AilvGM: :cat descrita em Seção 4 foi usada como uma cepa doadora; os transdutores de CmR foram selecionados. Como um resultado, a cepa B7 AilvIH AilvBN AilvGM::cat foi obtida. O marcador de resistência a cloranfenicol foi eliminado de B7 AilvIH AilvBN AilvGM: :cat como descrito acima. Como um resultado, a cepa B7 ΔίΙνΙΗ ΔίΙνΒΝ AilvGM foi obtida.

Apesar da invenção ter sido descrita em detalhes com referência a formas de realização preferidas da mesma, será evidente para os versados na arte que várias mudanças podem ser feitas, e equivalentes empregados, sem sair do escopo da invenção. Todas as referências aqui citadas são incorporadas como parte deste pedido por referência.

REIVINDICAÇÕES

Claims (14)

1. Subunidade pequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (AHAS I), caracterizada pelo fato de compreender uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo de: A) SEQ ID NO: 2, compreendendo a mutação A30P ou a mutação N17K, e B) SEQ ID NO: II, em que a referida subunidade pequena mutante de acetolactato sintase é dessenssibilizada para inibição por retroalimentação da valina.

2. Acetolactato sintase mutante, caracterizada pelo fato de compreender a subunidade pequena como definida na reivindicação 1.

3. Acetolactato sintase mutante de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende a subunidade grande da acetolactato sintase de Escherichia coli selvagem.

4. DNA, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo consistindo de: A) SEQ ID NO: 1, com mutação substituindo g na posição 88 por c ou com mutação substituindo c na posição 51 por g, e B) SEQ ID NO: 10, e em que o referido DNA codifica uma subunidade pequena mutante de acetolactato sintase como definida na reivindicação 1.

5. Bactéria da família Enterobacteriaceae, caracterizada pelo fato de conter o DNA como definido na reivindicação 4, e ter a capacidade de produzir L-aminoácidos de cadeia ramificada.

6. Bactéria de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que os referidos L-aminoácidos de cadeia ramificada são selecionados dentre o grupo consistindo de L-leucina, L-isoleucina e L-valina.

7. Bactéria de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a atividade da acetolactato sintase mutante é melhorada na bactéria.

8. Bactéria de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a bactéria pertence ao gênero Escherichia.

9. Bactéria de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a atividade da acetolactato sintase mutante é melhorada por aumento da expressão do gene acetolactato sintase mutante.

10. Bactéria de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a atividade da acetolactato sintase mutante é aumentada por um método selecionado dentre o grupo consistindo de: a) aumentar o número de cópias do gene de acetolactato sintase mutante, b) modificar uma seqüência de controle de expressão do gene, de modo que a expressão do gene é melhorada, e c) suas combinações.

11. Bactéria de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o número de cópias é melhorado pela integração de cópias múltiplas do gene acetolactato sintase mutante no cromossomo da bactéria.

12. Método para produzir um L-aminoácido de cadeia ramificada, caracterizado pelo fato de compreender cultivar a bactéria, como definida na reivindicação 5, em um meio de cultura, e coletar os L-aminoácidos de cadeia ramificada do meio de cultura.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a bactéria tem melhorada expressão de genes envolvidos em biossíntese de L-aminoácido de cadeia ramificada.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que referido L-aminoácido de cadeia ramificada é selecionado dentre o grupo consistindo de L-leucina, L-isoleucina e L-valina.